利用枯草芽孢杆菌NX-2制备 γ-聚谷氨酸及其盐和谷胱甘肽及其前体
技术领域
本发明涉及-种高产γ-聚谷氨酸(γ-PGA)和高产γ-谷氨酰转肽酶(γ-GTP)的微生物菌株,以及将它用于γ-聚谷氨酸及其盐和谷胱甘肽及其前体的生产。
背景技术
γ-聚谷氨酸(γ-PGA)及其盐是一种生物可降解的对人和环境无害的高分子物质,可期待在食品、化妆品、农业、医药和水处理等领域有广泛用途。目前发现有许多细菌能产生γ-PGA,如B.licheniformic ATCC9945,B.subtilis IFO3335,B.subtilisF02-1等,但是尚存在耗用原料多,生产周期长,生产率低,生产成本高等问题,因此高效、低成本生产γ-聚谷氨酸仍有待发展。
谷胱甘肽即N-(N-L-γ-谷氨酰-L-半胱氨酰)甘氨酸(L-Glutathione、Glutathiol,简称为GSH),它是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸构成的三肽,其中谷氨酸是以γ-羧基与半胱氨酸形成肽键,其分子结构如下:
GSH是一种非常重要的氨基酸衍生物,具有非常广泛的应用前景。作为试剂,谷胱甘肽广泛用于生化、医学、生物学、化学的研究与测定。临床上,它可用于肝炎的辅助治疗,有机物及重金属的解毒,癌症辐射和化疗的保护,白内障、HIV的抑制,细胞膜的保护,性功能的改善等;在食品加工中,谷胱甘肽作为食品添加剂可提高营养,加强食品风味及防止变质;谷胱甘肽还可制成复合治疗和保健的药品用于人体保健。
GSH的制备方法有以下几种:
1、化学合成法:采用常规的肽类合成方法,由L-谷氨酸,L-半胱氨酸和甘氨酸经多步的基团保护,接肽和脱保护过程,合成GSH。
2、酵母提取法:从富含GSH的酵母细胞中萃取得到GSH。
3、酶法全合成:利用γ-谷氨酰-L-半胱氨酸合成酶和GSH合成酶分别的催化作用合成,在能量ATP存在下,由L-谷氨酸,L-半胱氨酸和甘氨酸合成GSH。
发明内容
本发明目的在于提供一种高产γ-聚谷氨酸(γ-PGA)和高产γ-谷氨酰转肽酶(γ-GTP)的微生物新菌株,将它用于γ-聚谷氨酸及其盐和谷胱甘肽及其前体的生产。
本发明的目的可以通过以下措施来达到:
本发明人实验室选育并保藏的微生物菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NX-2(以下简称为NX-2菌株),目前该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,其简称为CGMCC,登记入册的编号是:CGMCC No.0833保藏日期是:2002年11月18日。以此菌作为生产菌株。NX-2菌株具有下述性质
1、形态特征
在肉膏琼脂培养基上营养细胞为0.7-1.0×1.3-2.0μm大小的杆菌,30℃培养2-3天形成芽孢,芽孢大小为0.7-0.9×1.0-1.5μm,为长圆形或圆柱形。
2、在各种培养基上的特征:
(1)肉膏琼脂平板培养:25-45℃培养1-3天可大量生长。菌落呈污白色,粗糙有皱褶,不透明,不闪光,蔓延,边缘不规则。
(2)肉膏琼脂斜面培养:同(1)
(3)肉膏液体培养:在液体表面形成菌膜,液体内部透明。
(4)肉膏穿刺培养:菌体在表面生长,底部不生长。
3、生理生化性质:
NX-2菌株的生理生化性质见表1。表1:枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NX-2(CGMCC No.0833)生理生化性质
试验项目 结果 |
试验项目 结果 |
革兰氏染色 阳性细胞形状 杆状细胞直径>1微米 -形成芽孢 +芽孢膨大 -芽孢圆形 -伴孢晶体 -接触酶 +氧化酶 -厌氧生长 -甲基红试验 +VP试验 +pH<6.0 +pH>7.0 - |
从碳水化合物产酸葡萄糖 +阿拉伯糖 +木糖 +甘露糖 +从葡萄糖产气 -利用柠檬酸盐 +50℃生长 +pH<5.7生长 +7%NaCl生长 +液化明胶 +水解淀粉 +水解酪素 +硝酸盐还原 + |
根据中国科学院微生物研究所鉴定:NX-2菌株属于枯草芽孢杆菌。菌株培养
该菌株用于γ-聚谷氨酸及其盐生产时,将菌株经斜面活化,液体培养在含谷氨酸的培养基中,30~37℃培养,可生成30-50g/lγ-聚谷氨酸,生产率高达0.8~2.5g.h-1·l-1。
该菌株用于谷胱甘肽及其前体时,对NX-2菌株进行常规培养,培养基为:葡萄糖1~10%,酵母膏1~5%,玉米浆1~5%,MgSO40.01~0.5%,K2HPO40.01~0.5%,各组分的含量均为重量体积百分比,即g/100ml,以下同。pH6~9,装液量20~200ml/500ml三角瓶,100~120℃摇瓶培养20~50分钟。灭菌结束后,冷却,接种,接种量为1~10%,20~40℃摇瓶培养,转速100~220r/min。在上述条件下进行摇瓶发酵试验,培养20~50小时,产γ-谷氨酰转肽酶达1~5U/ml。
γ-谷氨酰转肽酶活力测定方法:在试管中依次加入0.1mol/lTris-HCl缓冲液(pH=8)1.2ml,0.1MGly-Gly0.4ml,5mmol/lγ-谷氨酰对硝基苯胺0.4ml,组成反应底物。发酵液稀释1~50倍,取0.2ml加入反应底物中,置于37℃恒温水浴30分钟,于721分光光度计(λ=410nm)测定吸光值。酶活力的单位定义:在上述条件下,每分钟生成1μmol对硝基苯胺的酶量,定义为1个酶活力单位(U)。
培养后的发酵液作为酶源,加入到以L-半胱氨酰L-甘氨酸或其前体和L-谷氨酸或L-谷氨酰胺组成的底物溶液中进行酶反应,生成谷胱甘肽及其前体。
或者,对发酵液进行酶分离纯化后得到γ-谷氨酰转肽酶的酶制剂,配成酶液。
或者,将γ-谷氨酰转肽酶的酶制剂进行固定化,固定化方法为:用生理盐水将γ-谷氨酰转肽酶配成酶溶液,与1.5~6%,1~5倍量的卡拉胶溶液在35~55℃下混匀,冷却后加KCl溶液硬化制成固定化酶,以此作为酶源进行反应。除了卡拉胶作为固定化载体包埋外,还可以用海藻酸钙、明胶、甲壳素等载体包埋的方法。固定化细胞可反复回用,进行多次酶反应。
酶转化反应:加入γ-谷氨酰转肽酶的酶量为50-1000mU/ml,酶反应温度20~50℃,pH6.0~11.0,时间0.5~30小时。
本发明采用化学-酶法工艺路线,通过化学合成法合成L-半胱氨酰L-甘氨酸或基团保护的前体,然后利用微生物产生的γ-谷氨酰转肽酶,以L-谷氨酸或L-谷氨酰胺为γ-谷氨酰基供体,酶法合成(L-γ-谷氨酰-L-半胱氨酰)甘氨酸,即谷胱甘肽。该路线避免了化学全合成途径中γ-谷氨酰基接肽过程需要对有关的-NH2,-COOH基团进行保护和脱保护,工艺路线大大简化。该路线同酶法全合成途径相比,不需要供给ATP这一昂贵的原料,很符合实用性要求。
具体实施方式
下面的实施例对本发明作详细说明,但对本发明没有限制。
实施例1
以葡萄糖1.5%,酵母膏0.5%,谷氨酸3%,KH2PO40.5%,MgSO4.7H2O0.05%,的比例制成培养基,灭菌前的pH为7.0~7.5。500ml容积的三角瓶中装液50ml,121℃灭菌20分钟,冷却。
将上述枯草芽孢杆菌NX-2菌株接种于该培养基中,37℃培养24h,摇瓶转速200r/ml。得到发酵液中γ-聚谷氨酸含量为30g/l,生产率为1.25g·h-1·l-1。
实施例2
培养基为葡萄糖1.5%,酵母膏1.0%,玉米浆1.0%,MgSO40.01%,K2HPO40.01%,pH7,装液量50ml/500ml三角瓶,120℃20分钟。灭菌结束后,冷却,接种,菌种为枯草芽孢杆菌NX-2菌株,接种量为1%,37℃摇瓶培养24小时,转速180r/min。培养液的γ-谷氨酰转肽酶活力为达3.0U/ml。
实施例3
由化学合成制备的L-半胱氨酰L-甘氨酸,用50ml水配制成20mmol/l浓度,再加入L-谷氨酸使其浓度为20mmol/l,混合作为酶反应底物,充N2待用。将实施例2中得到的发酵液加入到反应底物中,加酶量为0.5U/ml,置37℃恒温水浴反应2~10小时,每隔30分钟取样进行高效液相分析。反应10小时,生成谷胱甘肽6mmol/l,对L-半胱氨酰L-甘氨酸转化率30%。
实施例4
将实施例2中发酵液1000ml,离心去除细胞,硫酸铵梯度盐析,过夜,用透析袋对自来水透析过夜,得γ-谷氨酰转肽酶粗酶,该酶制剂活力为80U/g,将该酶制剂用作酶源。由化学合成制备得的S-苄基半胱氨酰甘氨酸甲酯(SBCGM)和L-谷氨酰胺配成底物溶液,SBCGM的浓度为100mmol/l,L-谷氨酰胺浓度为100mmol/l。加入γ-谷氨酰转肽酶粗酶液,加入酶量为0.5U/ml。置37℃恒温水浴反应2~10小时,每隔30分钟取样进行高效液相分析。反应6小时,生成S-苄基谷胱甘肽甲酯,对SBCGM摩尔转化率60%。
实施例5
将实施例3中得到的γ-谷氨酰转肽酶粗酶,取100mg在37-50℃溶于34ml蒸馏水中,又将1.8g卡拉胶溶于66ml生理盐水中,加热溶解后冷却到55℃保温。两者在55℃混匀,冷却后将凝胶切成3mm×3mm×3mm左右的小块,泡在2%KCl溶液中硬化处理过夜。将此固定化酶进行酶转化。酶转化底物为S-苄基半胱氨酰甘氨酸苄酯(SBCGB)和L-谷氨酸配成底物溶液,SBCGB的浓度为100mmol/l,L-谷氨酸浓度为200mmol/l。加入γ-谷氨酰转肽酶粗酶液,加入酶量为0.5U/ml,置37℃恒温水浴反应10小时,生成S-苄基谷胱甘肽苄酯,反复分批转化为8次,对SBCGB摩尔转化率见表2。
表2固定化酶反复分批转化结果
转化次数 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
转化率(%) |
62.3 |
62.1 |
62.5 |
61.8 |
61.5 |
60.2 |
59.3 |
59.2 |