CN1346891A - γ－聚谷氨酸及其盐的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种制备γ－聚谷氨酸及其盐的方法。通过采用芽孢杆菌属菌株,如枯草芽孢杆菌,地衣芽孢杆菌,在含碳源、氮源、谷氨酸培养基上培养,生成高活力的γ－谷氨酰转肽酶,酶活力为1－10U/ml,从而可生成高浓度的γ－聚谷氨酸发酵液,进而用溶剂沉淀或化学沉淀法得γ－聚谷氨酸或其盐。

Description

γ-聚谷氨酸及其盐的制备方法

技术领域

本发明涉及γ-聚谷氨酸及其盐的制备方法。

背景技术

γ-聚谷氨酸(γ-PGA)及其盐是一种可生物可降解的高分子物质，可期待在医药、纺织、食品、化妆品、农业等领域广泛应用。

γ-聚谷氨酸可通过传统的多肽合成的方法将谷氨酸单体连接而成，然而，这种方法是没有工业应用价值的，因为聚合谷氨酸过程要经过许多步复杂反应。

另一方面，早在1937年，Ivanovics等人就发现γ-聚谷氨酸是炭疽芽孢杆菌的荚膜成分(Ivanovics G，Erdos Z.Immunt tsforsch，1937，90：5)，1942年Bovarnick等人开始研究采用能在培养基中蓄积γ-聚谷氨酸的微生物来发酵生产γ-聚谷氨酸(Bovarnick M.J Biol Chem.1942，145：415)，自此以后，发酵法生产γ-聚谷氨酸的研究一直在进行(Ito Y et al.Biosci.Biotech.Biochem.96，60：1239-42)，人们相信微生物发酵法较化学合成法更有优势。然而，γ-聚谷氨酸在培养液中的蓄积量很低，工业上大规模廉价生产γ-聚谷氨酸尚有困难，为此希望开发出高效的γ-聚谷氨酸制备方法。

发明内容

本发明目的在于提供一种高效的γ-聚谷氨酸及其盐的制备方法。

本发明的目的可以通过下列措施来达到：

本发明采用的微生物为芽孢杆菌属菌株，如枯草芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，这类菌株具有共同的特点，即在含碳源、氮源、谷氨酸培养基上培养，能生成高活力的γ-谷氨酰转肽酶(γ-GTP)，酶活力为1-10U/ml，从而可生成高浓度的γ-聚谷氨酸发酵液，进而用溶剂沉淀或化学沉淀法得γ-聚谷氨酸或其盐。菌株的性状如下：1、形态特征：在肉膏琼脂培养基上营养细胞为0.7-1.0×1.3-2.0μm大小的杆菌，30℃培养2-3天形成芽孢，芽孢大小为0.7-0.9×1.0-1.5μm，为长圆形或圆柱形。2、培养性质：(1)  肉膏琼脂平板培养：25-45℃培养1-3天可大量生长。菌落呈污白色，

粗糙有皱褶，不透明，不闪光，蔓延，边缘不规则。(2)  肉膏琼脂斜面培养：同(1)(3)  肉膏液体培养：在液体表面形成菌膜，液体内部透明。(4)  肉膏穿刺培养：菌体在表面生长，底部不生长。3、生理性质：(1)  革兰氏染色：阳性(2)  硝酸盐还原：阳性(3)  甲基红实验：阴性(4)  VP试验：阳性(5)  柠檬酸盐利用：阳性(6)  吲哚生成：阴性(7)  H₂S生成：阴性(8)  无机盐利用：能以铵盐为唯一氮源生长(9)  耐NaCl浓度：7％浓度上可以生长

归纳上述，本发明使用的是好气性芽孢杆菌，具体为Bacillus subtilis NX-2和Bacillus licheniformis B-2。

本发明使用的培养基含碳源、氮源、无机盐、谷氨酸或其盐等营养。

本发明对碳源并没有特别的限定，可以使用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、淀粉水解糖、糖蜜等，其中以葡萄糖、麦芽糖较合适。

氮源包括有机氮源如酵母膏、蛋白胨、玉米浆、尿素，也可采用无机氮源如(NH₄)₂SO₄、NaNO₃、NH₄Cl，上述氮源可单独使用，也可混合使用。

本发明的培养基中使用谷氨酸，浓度为0.5-7％，最好在2-5％，加入量过少，γ-聚谷氨酸生成量减少，甚至完全不产生，但加入量过多，菌体生长变差，发酵液中剩余谷氨酸多，造成浪费。使用的谷氨酸也可以是盐的形式。

本发明采用的γ-聚谷氨酸分离纯化方法包括有机溶剂沉淀法和化学沉淀法。利用离心或絮凝菌体的方法除去发酵液中的菌体，在上清液中加入低级醇类，如乙醇、甲醇，也可以是丙酮，加入量为溶液的2-5倍，沉淀得到γ-聚谷氨酸。沉淀物用水溶解除去不溶物，透析去除小分子物质，滤液冷冻干燥得白色粉末结晶。也可以用饱和CuSO₄，(NH₄)₂SO₄，NaCl沉淀γ-聚谷氨酸。

本发明制备的γ-聚谷氨酸具有如下理化性质：(1)  本产品溶于水，不溶于乙醇、丙酮等有机溶剂；(2)  对茚三酮反应呈阴性，用6NHCl水解后对茚三酮反应呈阳性；(3)  6NHCl水解后，用HPLC、氨基酸分析仪或纸层析检测，发现水解液中

生成单一的氨基酸——谷氨酸，本产品为谷氨酸的高分子聚合物；(4)  将γ-谷氨酰转肽酶加入到本产品溶液液中40℃保温数分钟或更长时间，

可检测出谷氨酸的生成，这点辅证了本产品结构为一个分子谷氨酸的γ

-COOH和另一分子α-NH₂结合而聚合成的高分子γ-聚谷氨酸；(5)  分子量经SDS-PAGE凝胶电泳、凝胶过滤色谱柱等方法检测为50-100万；

本发明制备的γ-聚谷氨酸分子上有大量的游离羧基存在，因而具有良好的吸湿保湿性，用作食品的增稠剂，淀粉防老化剂，延长面包、糕点的货架期；在化妆品中可用作保湿因子。

本发明制备的γ-聚谷氨酸经辐射交联或化学交联后可制得高吸水性材料，吸水性按交联条件不同，可吸收自身重量的500-5000倍水，可望在卫生用品、农林园艺、医疗、土木建筑等多个行业中使用。

本发明相比现有技术具有如下优点：

本发明因筛选到优良的微生物菌株，可以高产率地发酵生产γ-聚谷氨酸；菌种的培养条件十分粗放，可使用任意一种氮源如无机氮源，使用这种氮源，培养基色泽浅，对产物的后提取十分有利，另一方面，由于它十分廉价，加之用量低，使γ-聚谷氨酸生产成本大幅度下降。本发明对培养基进行合理优化，尤其是添加谷氨酸或其盐，使发酵液中γ-聚谷氨酸浓度高达28g/L，从而提供了一种高效廉价制备γ-聚谷氨酸的方法。

附图说明

图1是本发明的红外光谱图。

具体实施方式以下是实施例，将对本发明作进一步说明，但对本发明没有限制。

实施例1

斜面培养基：蛋白胨1-2％，牛肉膏0.5-1％，NaCl0.5-1％，琼脂2％，pH7.0

摇瓶培养基：葡萄糖1.5％，酵母膏1％，谷氨酸2％，KH₂PO₄0.5％，MgSO₄.7H₂O0.05％，pH7.0。500ml容积的三角瓶中装液50ml，121℃灭菌20分种。

将纯化的枯草芽孢杆菌NX-2在斜面培养基上25-37℃培养24-48h，然后接一环此菌苔于摇瓶培养基中，37℃培养48h，摇瓶转速180r/ml。最后得到发酵液中γ-聚谷氨酸含量为15g/L。

实施例2

同实施例1的培养条件，采用地衣芽孢杆菌B-2，得到发酵液中γ-聚谷氨酸含量为10g/L。

实施例3

同实施例1，摇瓶培养基中葡萄糖用麦芽糖代替，结果得到发酵液中γ-聚谷氨酸含量为20g/L。

实施例4

同实施例1，用无机氮源(NH₄)₂SO₄、NaNO₃替代摇瓶培养基中酵母膏，结果如表1：

             表1无机氮源对γ-聚谷氨酸生成的影响氮源     浓度(％)    生长A₆₆₀   γ-GTP(U/ml)  γ-PGA生成量(g/L)(NH₄)₂SO₄0.2           0.31           1.6           13

         0.5           0.36           1.6           12

         0.2           0.44           1.8           14NaNO₃

         0.5           0.48           1.8           13

实施例5

在葡萄糖1.5％，酵母膏1％，KH₂PO₄0.5％，MgSO₄.7H₂O 0.05％组成的培养基中，加入谷氨酸钠1-7％，调整pH7.0，于容积为500ml的三角瓶中装液50ml，121℃灭菌20分种。接入B.subtilis NX-2菌苔，同实施例1培养，结果见表1所示。不加谷氨酸钠的对照瓶中γ-聚谷氨酸不生成，添加3％谷氨酸钠的培养液中生成24g/L聚谷氨酸。

        表2、培养基中谷氨酸添加量对γ-聚谷氨酸生成的影响Glu浓度(％)   pH    A₆₆₀ γ-GTP(U/ml)  γ-PGA生成量(g/L)不添加      6.0   0.26      0.5               -0.5        7.5   0.26      1.7               41          8.0   0.29      1.8               102          8.0   0.28      2.4               153          8.0   0.24      2.5               244          8.0   0.22      2.6               185          7.5   0.21      2.0               126          7.5   0.21      1.7               127          7.5   0.17      1.5               12

实施例6

将葡萄糖30g，酵母膏20g，谷氨酸钠60g，尿素6g，KH₂PO₄4g，MgSO₄.7H₂O1g，用NaOH调pH7.0，装入一个5升玻璃搅拌发酵罐，121℃蒸汽灭菌15分种。将枯草芽孢杆菌NX-2用种子培养基37℃培养16h，种子培养基配方为：葡萄糖1.0％，酵母膏0.5％，谷氨酸钠1％，KH₂PO₄0.5％，MgSO₄.7H₂O 0.05％，pH7.0。将种子液100ml接入到发酵罐中，37℃培养，(通风比为1∶1vvm，搅拌速度为300r/ml)，随着培养时间延长，培养液中的γ-聚谷氨酸不断增多，到24h后，发酵液中含γ-聚谷氨酸28g/L。

将发酵液离心去除细胞，缓慢加入无水乙醇，形成粘性沉淀，收集沉淀物，溶于水，对蒸馏水透析，冷冻干燥，共得44.8g γ-聚谷氨酸钠。产品的红外光谱图见图1。

Claims (7)

1、一种γ-聚谷氨酸及其盐的制备方法，其特征在于采用芽孢杆菌属菌株，在含

   碳源、氮源、谷氨酸培养基上培养，生成高活力的γ-谷氨酰转肽酶并获得γ

   -聚谷氨酸发酵液，用溶剂沉淀或化学沉淀法得γ-聚谷氨酸或其盐。

2、根据权利要求1所述的γ-聚谷氨酸及其盐的制备方法，其特征在于采用的菌

   株为枯草芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌。

3、根据权利要求1所述的γ-聚谷氨酸及其盐的制备方法，其特征在于培养基的

   碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、淀粉水解糖、糖蜜。

4、根据权利要求1所述的γ-聚谷氨酸及其盐的制备方法，其特征在于培养基的

   氮源可采用有机氮源酵母膏、蛋白胨、玉米浆、尿素；也可采用无机氮源

   (NH₄)₂SO₄，NaNO₃，上述氮源可单独使用也可混合使用。

5、根据权利要求1所述的γ-聚谷氨酸及其盐的制备方法，其特征在于培养基中

   添加谷氨酸或其盐，其浓度为0.5-7％。

6、根据权利要求1所述的γ-聚谷氨酸及其盐的制备方法，其特征在于采用的溶

   剂可以是低级醇类也可以是丙酮，加入量为溶液的2-5倍。

7、根据权利要求1所述的γ-聚谷氨酸及其盐的制备方法，其特征在于采用的沉

   淀剂为CuSO₄，(NH₄)₂SO₄，NaCl。

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