CN110016446A - 一株贝莱斯芽孢杆菌及其生产聚谷氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株贝莱斯芽孢杆菌及其生产聚谷氨酸的方法，一株贝莱斯芽孢杆菌，其分类命名为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis PG1‑2，保藏编号为CGMCC No.15718，保藏单位为中国微生物菌种保藏中心。本发明提供一种生产聚谷氨酸的菌株，其分类命名为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis PG1‑2，所述菌株可以利用葡萄糖、蔗糖、淀粉和/或柠檬酸作为碳源生产聚谷氨酸，所产聚谷氨酸最高时超过40g/L，为其工业化应用提供了可能。

Description

一株贝莱斯芽孢杆菌及其生产聚谷氨酸的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一株贝莱斯芽孢杆菌及其生产聚谷氨酸的方法。
背景技术
γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是L-谷氨酸和D-谷氨酸通过酰胺键连接形成的多聚谷氨酸，具有水溶性、无毒性、可降解及高保水性等特点。γ-PGA目前已经被用于农业、化妆品、医药、环境治理等行业中，在农业生产中，γ-PGA可作为缓释剂保证农业、肥料的充分利用，并且能够促进作物增产增收。在化妆品中，γ-PGA作为保湿剂滋润肌肤。另外，γ-PGA还可作为药物载体应用于医药行业，作为金属离子螯合剂和絮凝剂应用于水体治理中。
γ-PGA可以通过化学合成、酶法转化及微生物发酵合成，并且微生物发酵法具有条件温和、生产周期短等特点，是目前唯一适合工业化生产的合成方法。目前关于能够发酵生产γ-PGA的微生物研究主要集中在芽孢杆菌属，如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、短小芽孢杆菌等(B.pumilus)。根据发酵培养基中是否需要添加谷氨酸，可将γ-PGA产生菌分为谷氨酸依赖型和非谷氨酸依赖型。
专利申请号：201710277707.0，专利名称：一种利用γ-聚谷氨酸产生菌制备γ-聚谷氨酸的方法。该发明公开了利用γ-PGA产生菌地衣芽孢杆菌CICC10099生产聚谷氨酸的工艺：在37℃，200rpm，pH 5-8条件下摇瓶发酵50h，γ-PGA产量可达到40g/L。
专利申请号：201410327118.5，专利名称：一种合成γ-聚谷氨酸的菌株以及利用其高效制备γ-聚谷氨酸的方法。该发明公开了一种γ-聚谷氨酸的合成菌株，分类命名为枯草芽孢杆菌NS-9，即Bacillus subtilis NS-9，中国典型培养物保藏中心保藏编号CCTCCNo.2014142。该发明还公开了上述的γ-聚谷氨酸的合成菌株高效制备γ-聚谷氨酸的方法。和现有生产γ-聚谷氨酸技术相比，本发明使用的枯草芽孢杆菌微生物菌株可以高效的发酵生产γ-聚谷氨酸；通过对枯草芽孢杆菌菌株培养条件的优化，特别是在发酵过程中补加碳源、无机盐及能量物质，使发酵液中的γ-聚谷氨酸的含量高达100～200g/L，从而提供一种高效廉价制备γ-聚谷氨酸的方法。
专利申请号：201711135486.X，专利名称：一种农业级γ-聚谷氨酸的生产方法。该发明涉及一种农业级γ-聚谷氨酸的生产方法，包括以下步骤：菌种活化：将地衣芽孢杆菌的原始菌株接种在斜面培养基上培养活化；种子液的制备；将种子液接种于发酵培养基中发酵；发酵结束后离心去菌体，醇沉析出聚谷氨酸，干燥，制备出黄色干粉状农业级聚谷氨酸。该发明通过实验室对农业级聚谷氨酸的发酵研究中发现钾盐类对农业级聚谷氨酸合成具有较大促进作用，而且在提高产量的同时相比化妆品级别的聚谷氨酸，其降低了后期聚谷氨酸提取的成本。
专利申请号：201210371783.5，专利名称：枯草芽孢杆菌高温发酵生产γ-聚谷氨酸的方法。该发明公开一种枯草芽孢杆菌高温发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，是以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)GXA-28，保藏编号为CCTCC No.2012347的菌株通过菌种活化、保藏、种子液制备、液体摇瓶发酵、γ-聚谷氨酸提取纯化制备γ-聚谷氨酸。该发明可广泛使用廉价的碳氮源，例如糖蜜、无机铵盐，其中可将无机铵盐作为唯一氮源使用，在40-50℃的高温发酵条件下高效生产γ-聚谷氨酸，发酵时间18-25h，产量最高可达20-30g/L，具有高效、低成本的优点。
专利申请号：201710576817.7，专利名称：γ-聚谷氨酸的发酵工艺。本发明公开了一种γ-聚谷氨酸的发酵工艺,包括：S1：制备枯草芽孢杆菌种子液；S2：将枯草芽孢杆菌种子液接种于液态发酵培养基中于37℃、120r/min摇瓶培养12-16h后,得发酵液：采用频率为1020KHz且功率为5W/ml的超声波处理发酵液3-5min后，其中，所述超声波处理的具体步骤为：每超声30s后，间隔30s再次超声；将超声波处理得到的发酵液低温保存并加入肽聚糖冷冻胶囊，补料，再继续37℃、120r/min摇瓶培养96h；S3：对发酵液进行提取、纯化，得到γ-聚谷氨酸。本发明具有节省成本、产率高的优点,可广泛应用于微生物发酵技术领域。
在以上查到的发明专利中，所用菌株主要为地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。目前尚未见到有关贝拉斯芽孢杆菌生产聚谷氨酸的报道，本发明提供一种能够生产聚谷氨酸的贝莱斯芽孢杆菌，并提供了其发酵生产聚谷氨酸的方法。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明提供一种生产聚谷氨酸的菌株，其分类命名为贝莱斯芽孢杆菌Bacillusvelezensis PG1-2，保藏编号为CGMCC No.15718，保藏单位为中国微生物菌种保藏中心。
该菌株是从土壤中，经平板培养基初筛、复筛，经检测聚谷氨酸含量后得到。
本发明还提供了所述贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis PG1-2发酵生产聚谷氨酸的方法，包括以下步骤：
S1.种子培养：将贝莱斯芽孢杆菌菌株转接至液体种子培养基中，30-37℃，150-200rpm震荡培养16-20h至对数生长中期；
S2.接种发酵：将步骤S1培养所得种子以5-10％的体积比接种到发酵培养基中，维持温度35-45℃，pH 6.0-7.0，通气量1.0-2.0vvm，搅拌速度150-250rpm，发酵48-72h，检测聚谷氨酸含量。
作为优选，所述步骤S1中液体种子培养基配方(g/L)：葡萄糖10，酵母粉5，蛋白胨5，K2HPO4 0.5，KH2PO4 0.5，MgSO4·7H2O 0.1，pH 7.2，115℃，灭菌30min。
作为优选，所述步骤S2中发酵培养基配方(g/L)：碳源40-120，氮源5-30，谷氨酸钠20-60，KH2PO4 1，K2HPO4 1，CaCl2 0.2，初始pH 7.0-7.2。
作为优选，所述碳源为葡萄糖、蔗糖、淀粉和柠檬酸中的一种或几种的混合物。
作为优选，所述氮源为蛋白胨、酵母粉和(NH4)2SO4中的一种或几种的混合物。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的生产聚谷氨酸的菌株，其分类命名为贝莱斯芽孢杆菌Bacillusvelezensis PG1-2，所述菌株可以利用葡萄糖、蔗糖、淀粉和/或柠檬酸作为碳源生产聚谷氨酸，所产聚谷氨酸最高时可超40g/L，为其工业化应用提供了可能。
附图说明
图1为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis PG1-2在平板上生长情况。
保藏信息说明
贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis PG1-2，保藏编号为CGMCC No.15718，保藏单位为中国微生物菌种保藏中心。
具体实施方式
以下实施例以便更好的理解本发明，并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
以下实施例中液体种子培养基配方(g/L)：葡萄糖10，酵母粉5，蛋白胨5，K2HPO40.5，KH2PO4 0.5，MgSO4·7H2O 0.1，pH 7.2，115℃，灭菌30min；
实施例1：菌株的筛选
菌株初筛平板培养基配方(g/L)：葡萄糖10，酵母粉5，蛋白胨5，K2HPO4 0.5，KH2PO40.5，MgSO4·7H2O 0.1，中性红0.06，琼脂粉15-20，pH7.2，115℃，灭菌30min；
菌株复筛平板培养基配方(g/L)：葡萄糖30，酵母粉2.5，K2HPO4 0.5，KH2PO4 0.5，MgSO4·7H2O 0.1，谷氨酸钠20，pH7.2，115℃，灭菌30min；
筛选方法包括以下步骤：
(1)菌株初筛：取5g土样放入灭菌三角瓶中，加入50ml灭菌水，室温下轻柔震荡30min，静置沉淀，取上清用无菌水稀释103-108倍，涂布在初筛平板上，37℃倒置培养；
(2)菌株复筛：从初筛平板培养基上挑选周边具有透明圈的菌落转接至复筛平板培养基，37℃，200rpm震荡培养48h后检测聚谷氨酸含量；
通过对菌株的初筛和复筛，得到聚谷氨酸产量最高的菌株PG1-2，已保藏于中国微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC No.15718。
实施例2：菌株的鉴定
(1)菌株的形态学分析
如图1所示，该菌株的菌落不透明，呈淡黄色，菌落边缘不整齐。
(2)生理生化鉴定
依据《常见细菌系统鉴定手册》对菌株PG1-2进行生理生化鉴定，结果表明：菌株PG1-2能够分解利用葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、甘露醇和麦芽糖，可水解淀粉，能利用葡萄糖产酸，其氧化酶反应和硝酸盐还原反应均呈阳性，甲基红试验呈阴性。
(3)分子生物学鉴定
通过PCR扩增其16S rDNA序列，其序列如序列表SEQ ID NO.1所示；在NCBI上对其同源性进行比对分析，其16S rDNA序列与Bacillus velezensis相似性达100％；
根据形态学分析、生理生化和分子生物学鉴定结果，将PG1-2鉴定为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis。
实施例3：接种发酵生产聚谷氨酸
发酵培养基配方(g/L)：蔗糖60，酵母粉20，谷氨酸钠60，KH2PO4 1，K2HPO4 1，CaCl20.2，初始pH 7.0-7.2；
发酵生产聚谷氨酸的方法：
S1.种子培养：将贝莱斯芽孢杆菌菌株转接至液体种子培养基中，37℃，200rpm震荡培养16h至对数生长中期；
S2.接种发酵：将步骤S1培养所得种子以5％的体积比接种到装有30L发酵培养基的50L发酵罐中，维持35℃发酵，发酵pH 6.5；发酵前期：0-36h，维持通气量1.0vvm，搅拌速度150rpm；发酵后期：36-72h，维持通气量调整为2.0vvm，搅拌速度调整为250rpm，发酵至72h停止；检测聚谷氨酸含量为42.6g/L。
实施例4：接种发酵生产聚谷氨酸
发酵培养基配方(g/L)：蔗糖60，酵母粉10，(NH4)2SO4 5，谷氨酸钠60，KH2PO4 1，K2HPO4 1，CaCl2 0.2，初始pH 7.0-7.2；
发酵生产聚谷氨酸的方法：
S1.种子培养：将贝莱斯芽孢杆菌菌株转接至液体种子培养基中，37℃，200rpm震荡培养16h至对数生长中期；
S2.接种发酵：将步骤S1培养所得种子以5％的体积比接种到装有30L发酵培养基的50L发酵罐中，维持45℃发酵，发酵pH 6.5；发酵前期：0-24h，维持通气量1.0vvm，搅拌速度150rpm；发酵后期：24-48h，维持通气量调整为2.0vvm，搅拌速度调整为200rpm，发酵至48h停止；检测聚谷氨酸含量为23.6g/L。
实施例5：接种发酵生产聚谷氨酸
发酵培养基配方(g/L)：淀粉60，酵母粉10，蛋白胨5，谷氨酸钠60，KH2PO4 1，K2HPO41，CaCl2 0.2，初始pH 7.0-7.2；
发酵生产聚谷氨酸的方法：
S1.种子培养：将贝莱斯芽孢杆菌菌株转接至液体种子培养基中，37℃，200rpm震荡培养16h至对数生长中期；
S2.接种发酵：将步骤S1培养所得种子以5％的体积比接种到装有30L发酵培养基的50L发酵罐中，维持40℃发酵，发酵pH 6.5；发酵前期：0-36h，维持通气量1.0vvm，搅拌速度150rpm；发酵后期：36-60h，维持通气量调整为2.0vvm，搅拌速度调整为200rpm，发酵至60h停止；检测聚谷氨酸含量为35.6g/L。
实施例6：接种发酵生产聚谷氨酸
发酵培养基配方(g/L)：柠檬酸60，蛋白胨15，谷氨酸钠60，KH2PO4 1，K2HPO4 1，CaCl2 0.2，初始pH 7.0-7.2；
发酵生产聚谷氨酸的方法：
S1.种子培养：将贝莱斯芽孢杆菌菌株转接至液体种子培养基中，37℃，200rpm震荡培养16h至对数生长中期；
S2.接种发酵：将步骤S1培养所得种子以5％的体积比接种到装有30L发酵培养基的50L发酵罐中，维持35℃发酵，发酵pH 6.5；发酵前期：0-36h，维持通气量1.0vvm，搅拌速度150rpm；发酵后期：36-60h，维持通气量调整为2.0vvm，搅拌速度调整为250rpm，发酵至60h停止；检测聚谷氨酸含量为21.6g/L。
上述实施例3-6分别利用蔗糖、淀粉、柠檬酸作为碳源生产聚谷氨酸，生产的聚谷氨酸量分别为：42.6g/L、23.6g/L、35.6g/L和21.6g/L。
可知本发明贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis PG1-2所产聚谷氨酸最高时超过40g/L，这也为其的工业化应用提供了可能。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
序列表
<110> 广西鼎好农业科技有限公司
<120> 一株贝莱斯芽孢杆菌及其生产聚谷氨酸的方法
<130> 2019
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1458
<212> DNA
<213> Bacillus velezensis
<400> 1
gggcaagcgg gcggcgtgct atacatgcaa gtcgagcgga cagatgggag cttgctccct 60
gatgttagcg gcggacgggt gagtaacacg tgggtaacct gcctgtaaga ctgggataac 120
tccgggaaac cggggctaat accggatggt tgtctgaacc gcatggttca gacataaaag 180
gtggcttcgg ctaccactta cagatggacc cgcggcgcat tagctagttg gtgaggtaac 240
ggctcaccaa ggcgacgatg cgtagccgac ctgagagggt gatcggccac actgggactg 300
agacacggcc cagactccta cgggaggcag cagtagggaa tcttccgcaa tggacgaaag 360
tctgacggag caacgccgcg tgagtgatga aggttttcgg atcgtaaagc tctgttgtta 420
gggaagaaca agtgccgttc aaatagggcg gcaccttgac ggtacctaac cagaaagcca 480
cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgttg tccggaatta 540
ttgggcgtaa agggctcgca ggcggtttct taagtctgat gtgaaagccc ccggctcaac 600
cggggagggt cattggaaac tggggaactt gagtgcagaa gaggagagtg gaattccacg 660
tgtagcggtg aaatgcgtag agatgtggag gaacaccagt ggcgaaggcg actctctggt 720
ctgtaactga cgctgaggag cgaaagcgtg gggagcgaac aggattagat accctggtag 780
tccacgccgt aaacgatgag tgctaagtgt tagggggttt ccgcccctta gtgctgcagc 840
taacgcatta agcactccgc ctggggagta cggtcgcaag actgaaactc aaaggaattg 900
acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt 960
accaggtctt gacatcctct gacaatccta gagataggac gtccccttcg ggggcagagt 1020
gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa 1080
cgagcgcaac ccttgatctt agttgccagc attcagttgg gcactctaag gtgactgccg 1140
gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc 1200
tacacacgtg ctacaatgga cagaacaaag ggcagcgaaa ccgcgaggtt aagccaatcc 1260
cacaaatctg ttctcagttc ggatcgcagt ctgcaactcg actgcgtgaa gctggaatcg 1320
ctagtaatcg cggatcagca tgccgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc 1380
cgtcacacca cgagagtttg taacacccga agtcggtgag gtaaccttta ggagccagcc 1440
gccgaaggtg acagatcg 1458

Claims (6)

1.一株贝莱斯芽孢杆菌，其特征在于，其分类命名为贝莱斯芽孢杆菌Bacillusvelezensis PG1-2，保藏编号为CGMCC No.15718，保藏单位为中国微生物菌种保藏中心。
2.根据权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌生产聚谷氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.种子培养：将贝莱斯芽孢杆菌菌株转接至液体种子培养基中，30-37℃，150-200rpm震荡培养16-20h至对数生长中期；
S2.接种发酵：将步骤S1培养所得种子以5-10％的体积比接种到发酵培养基中，维持温度35-45℃，pH6.0-7.0，通气量1.0-2.0vvm，搅拌速度150-250rpm，发酵48-72h，检测聚谷氨酸含量。
3.根据权利要求2所述的贝莱斯芽孢杆菌生产聚谷氨酸的方法，其特征在于，所述步骤S1中液体种子培养基配方(g/L)：葡萄糖10，酵母粉5，蛋白胨5，K2HPO4 0.5，KH2PO4 0.5，MgSO4·7H2O0.1，pH 7.2，115℃，灭菌30min。
4.根据权利要求2所述的贝莱斯芽孢杆菌生产聚谷氨酸的方法，其特征在于，所述步骤S2中发酵培养基配方(g/L)：碳源40-120，氮源5-30，谷氨酸钠20-60，KH2PO4 1，K2HPO4 1，CaCl2 0.2，初始pH7.0-7.2。
5.根据权利要求4所述的贝莱斯芽孢杆菌生产聚谷氨酸的方法，其特征在于，所述碳源为葡萄糖、蔗糖、淀粉和柠檬酸中的一种或几种的混合物。
6.根据权利要求4所述的贝莱斯芽孢杆菌生产聚谷氨酸的方法，其特征在于，所述氮源为蛋白胨、酵母粉和(NH4)2SO4中的一种或几种的混合物。
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