CN112176012A - 一株贝莱斯芽孢杆菌及其在联产微生物多糖和γ-聚谷氨酸中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株贝莱斯芽孢杆菌，分类命名为贝莱斯芽孢杆菌LT‑2(Bacillus velezensis LT‑2)，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2019904，保藏日期为2019年11月7日。本发明还首次公开了贝莱斯芽孢杆菌在联产微生物多糖和γ‑聚谷氨酸中的应用。该菌株以菊芋粉和甘蔗汁中的一种或两种的混合物为碳源，胰蛋白胨为有机氮源，硫酸铵为无机氮源发酵合成微生物多糖和γ‑聚谷氨酸。在联产过程中培养基中积累的微生物多糖浓度最高可达29.16g/L，γ‑聚谷氨酸浓度最高可达6.96g/L。本发明所述操作方法简单，成本较低，极具工业化推广应用前景，同时为微生物多糖和γ‑聚谷氨酸的生物合成提供一种新工艺。

Description

一株贝莱斯芽孢杆菌及其在联产微生物多糖和γ-聚谷氨酸 中的应用

技术领域

本发明具体涉及一株贝莱斯芽孢杆菌及其在联产微生物多糖和γ-聚谷氨酸中的应用，属于微生物学、生物工程技术和化工技术领域。

背景技术

生物多糖(Biological polysaccharide)广泛存在于微生物、大型真菌、动物和植物中，是天然界最丰富的聚合物之一。随着生物技术的高速发展，微生物多糖功能的研究也日益完善，成为免疫学、生物学和药学的研究热点。研究表明，微生物多糖(Microbialpolysaccharide)由于其独特的化学结构、优越的物理化学性质、流变学特性以及本身的生物活性和营养价值，使其在各个领域均具有相关应用。此外，微生物多糖具有生产周期短、原料廉价、纯化简单以及可在人工控制下进行大规模工业化生产等动植物多糖所不具备的优势。因此，微生物多糖正迅速成为重要的新兴的生物材料。但由于目前大多数微生物多糖的合成均以昂贵的粮食原料为底物，造成微生物多糖生产成本较高，使其价格居高不下，限制了微生物多糖的应用。

γ-聚谷氨酸(γ-Polyglutamic acid,γ-PGA)是由500-5000个谷氨酸残基组成，呈直链纤维状，相对分子质量通常在100～1000kDa。由于其侧链上含有大量活性较高的游离羧基，使其具有吸水保湿、螯合元素等特点。因此，γ-聚谷氨酸在日化、食品、环保、农业和饲料工业等领域具有广泛的应用前景。

目前报道的生产菌株大多数是谷氨酸依赖型γ-聚谷氨酸合成菌株，如B.subtilis NX-2、B.subtilis RKY3和B.subtilis ZJU-7等均需在培养基中加入谷氨酸才能合成γ-聚谷氨酸，产物浓度为20-50g/L。但由于培养基中需加入大量谷氨酸，造成成本较高，使γ-聚谷氨酸价格高达3000元/kg，因此其用途主要局限在日化领域，限制了其在农业和饲料领域的应用。而另一类谷氨酸非依赖型γ-聚谷氨酸合成菌株由于不需要额外添加谷氨酸，大大降低了γ-聚谷氨酸发酵成本，如B.subtilis C10、B.methylotrophicusSK19.001和B.amyloliquefaciens LL3等，然而这类菌株的γ-聚谷氨酸产率极低，至今还未有用于生产的报道，是目前γ-聚谷氨酸微生物合成领域的研究热点。

经检索，目前未见有使用贝莱斯芽孢杆菌联产微生物多糖和γ-聚谷氨酸的专利报道。此外，目前报道的微生物多糖和γ-聚谷氨酸生物合成均存在原料利用率低和生产成本高等问题，因此难以大规模工业化生产，从而限制了微生物多糖和γ-聚谷氨酸的大规模开发与应用。而本发明首次报道了贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2能以非粮廉价原料菊芋粉或甘蔗汁为底物发酵联产微生物多糖和γ-聚谷氨酸的新方法，不仅可以改善“与民争粮”的现象，也可大大降低微生物多糖和γ-聚谷氨酸的发酵成本。此外，所使用的贝莱斯芽孢杆菌为食品安全性微生物，具有巨大的工业化应用价值。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的问题是提供一株能够利用非粮廉价原料菊芋粉或甘蔗汁联产微生物多糖和γ-聚谷氨酸的贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2。

本发明还要解决的技术问题是提供上述贝莱斯芽孢杆菌的应用。

技术方案：为解决上述问题，本发明采取的技术方案如下：

发明人筛选得到一株贝莱斯芽孢杆菌，分类命名为贝莱斯芽孢杆菌LT-2(Bacillus velezensis LT-2)，已保藏于“中国典型培养物保藏中心”(简称CCTCC)，保藏地址：湖北省武汉市，洪山区八一路，武汉大学山国典型培养物保藏中心，邮编：430072，保藏编号为CCTCC No：M2019904，保藏日期为2019年11月7日。以下内容均以此菌株作为生产菌株。

所属菌株具有下述性质：

1、菌落形态学特征与生理生化特性见表1。

表1菌落形态学特征与生理生化特性

2、16S rDNA序列分析：

测得菌株的16S rDNA基因的核苷酸序列长度为1396bp，其基因序列如SEQIDNo.1：所示。将所测序列从Gene Bank数据库中使用BLAST程序进行同源性比较，构建16SrDNA全序列为基础的系统发育树。结果表明：菌株与贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis zjt9达到100％同源性。根据菌株形态学观察和生理生化实验分析结果认定本发明所使用的是贝莱斯芽孢杆菌，具体为贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2。

上述贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2利用非粮廉价原料菊芋粉或甘蔗汁联产微生物多糖和γ-聚谷氨酸应用也在本发明的保护范围之内。将贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2接种于发酵培养基中进行好氧培养，制备微生物多糖和γ-聚谷氨酸。

具体的应用方法为，将贝莱斯芽孢杆菌LT-2接种于斜面固体培养基，然后转接到种子培养基，最后接种于发酵培养基中进行好氧培养，发酵液中富含微生物多糖和γ-聚谷氨酸。

本发明所述贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2及其所述菌在制备微生物多糖和γ-聚谷氨酸中的应用，依次包括以下步骤：

1.培养基配制：

(1)斜面培养基成分为：菊糖5g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉20g/L，溶剂为水，pH值7.0～8.0，优选为7.5；

(2)液体种子培养基为：菊糖5g/L，牛肉膏5g/L，磷酸二氢钾5g/L，硫酸镁0.5g/L，溶剂为水，pH值7.0～8.0，优选为7.5；

(3)固体种子培养基为：菊糖5g/L，牛肉膏5g/L，磷酸二氢钾5g/L，硫酸镁0.5g/L，琼脂粉20g/L，溶剂为水，pH值7.0～8.0，优选为7.5；

(4)发酵培养基：碳源10～80g/L，氮源5～20g/L，金属盐5.0～15.0g/L，溶剂为水，pH值7.0～8.0，优选为7.5。

其中所述碳源为甘蔗汁、菊芋粉、糖蜜、麦芽糖、果糖和葡萄糖的任意一种或几种的组合；优选甘蔗汁、菊芋粉中的一种或几种的组合物；甘蔗汁或菊芋粉添加后培养基中总糖浓度为10g/L～60g/L，优选总糖浓度为30g/L；

所述氮源包括有机氮源和无机氮源，所述的有机氮源为牛肉膏、大豆分离蛋白、胰蛋白胨、玉米浆、黄豆饼粉、花生饼粉和酵母粉，优选胰蛋白胨，所述胰蛋白胨的添加量优选为6g/L；所述的无机氮源为氯化铵、硫酸铵、尿素、磷酸氢二铵、磷酸二氢铵和硝酸铵的任意一种或几种的组合，优选硫酸铵，所述硫酸铵的添加量优选15g/L；

金属盐为硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸亚铁、硫酸锰和氯化钙中的一种或几种的组合，优选磷酸氢二钾和硫酸镁的组合物，更优选磷酸氢二钾5～20g/L，硫酸镁0.2～1.6g/L，最优选磷酸氢二钾12g/L，硫酸镁0.8g/L。

最优选的发酵培养基包含如下组分：菊芋粉(使培养基中总糖浓度为30g/L)、胰蛋白胨6g/L、硫酸铵15g/L，磷酸氢二钾12g/L，硫酸镁0.8g/L，硫酸锰0.003g/L，利用氨水将发酵液初始pH调至7.5。其中所述菊芋粉由新鲜菊芋晒干粉碎制得。

2.菌种选择：

选已保藏菌株贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2；

3.菌种活化：

将贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2菌种接种于斜面培养基，24～36℃静置培养16～20h，再次挑取单菌落划线到斜面培养基上，24～36℃培养16～20h，得到活化菌种备用；

4.种子液制备：

取步骤(4)中活化好的菌种，无菌条件下接种3环于种子液的摇瓶中，置于转速为200rpm的摇床上，温度为24～36℃培养12h，得到发酵种子液；

5.摇瓶发酵培养：

将步骤(5)中发酵种子液在无菌条件下以1％～8％(v/v)的接种量，将种子液接种于发酵培养基中，置于转速为200rpm的摇床上，24～36℃培养16～24h；当发酵液中微生物多糖和γ-聚谷氨酸浓度不再上升时，停止发酵；

6.发酵罐发酵培养：

将步骤(4)中发酵种子液在无菌条件下以1％～15％(v/v)的接种量，将种子液接种于发酵罐中，装液量为3L/5L，转速为200～500rpm，通气比为1.0～1.2VVM，培养温度为24～36℃，初始pH为7.0～8.0，培养16～48h；当发酵液中微生物多糖和γ-聚谷氨酸浓度不再上升时，停止发酵；

7.微生物多糖和γ-聚谷氨酸的提取：

(1)粗品制备：取步骤(6)或者(7)中贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2发酵液离心除去菌体，上清液在65℃条件下，旋转蒸发浓缩为原体积的1/5后加入3～5倍体积的无水乙醇，离心取沉淀，沉淀用无水乙醇洗涤，再高速离心收集沉淀恒温干燥后可获得微生物多糖和γ-聚谷氨酸混合物；

(2)脱蛋白：将步骤(1)所得的微生物多糖和γ-聚谷氨酸混合物溶解于双蒸水中，用草酸调pH至7.0，加入3％三氯乙酸，搅拌，12,000rpm离心10～15min，取上清；所得清液加入1/3体积的Sevag试剂，充分震荡脱去蛋白，得微生物多糖和γ-聚谷氨酸混合溶液；

(3)吸附：将步骤(2)所得微生物多糖和γ-聚谷氨酸混合溶液用0.22μm的滤膜过滤除去不溶物后，泵入DEAE

Fast Flow树脂柱中，经吸附处理后，得到吸附了微生物多糖和γ-聚谷氨酸的树脂柱；

(4)微生物多糖和γ-聚谷氨酸的制备：

(4a)除杂：

第一次洗脱：用0.25mol/L的NaCl水溶液以2BV/h的流速对步骤(3)得到的吸附了微生物多糖和γ-聚谷氨酸的树脂柱进行第一次除杂处理；

第二次洗脱：用0.8mol/L的NaCl水溶液以2BV/h的流速再对吸附了微生物多糖和γ-聚谷氨酸的树脂柱进行第二次洗脱处理，得到洗脱液I，洗脱液I中含有微生物多糖；

第三次洗脱：用1.5mol/L的NaCl水溶液以2BV/h的流速对树脂柱进行第三次洗脱处理，得到洗脱液II，洗脱液II中含有γ-聚谷氨酸；

(4b)脱盐：将步骤(4a)得到的洗脱液A和B分别用5000Da的透析袋透析脱盐，得到透析液Ⅰ和透析液IⅠ；

(4c)浓缩：透析液Ⅰ和透析液IⅠ分别在65℃条件下，旋转蒸发浓缩为原体积的1/5后，得到浓缩液Ⅰ和浓缩液II；

(4d)醇沉与干燥：向步骤(4d)得到的浓缩液Ⅰ和浓缩液II分别加入3～5倍体积的无水乙醇，离心取沉淀，沉淀用无水乙醇洗涤，再高速离心收集沉淀I和沉淀II，沉淀恒温干燥后可获得微生物多糖和γ-聚谷氨酸；

8.微生物多糖含量测定：

本发明利用苯酚硫酸法测定多糖含量：

精密称取干燥恒重的葡萄糖，分别配置成0.000、0.005、0.010、0.015、0.020、0.025、0.030、0.035、0.040、0.045、0.050mg/mL的标准液，同时配置一定浓度的多糖溶液。精密吸取各标准液和多糖溶液0.2mL，分别置于试管内，各加3.5％苯酚试剂0.1mL和浓硫酸0.5mL，立刻摇匀。沸水加热15min，冰浴，以0mg/mL的标准液作空白对照，在490nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程，并计算多糖的含量。

9.γ-聚谷氨酸含量测定：

通过凝胶渗透色谱法测定γ-聚谷氨酸的浓度：取步骤(6)或(7)中的发酵液稀释5倍，12,000rpm离心20min除去菌体，上清用0.22μm的滤膜过滤，置于进样瓶中待用。样品采用示差检测器检测，色谱柱：Superpose^TM 6；流动相：50mM NaCl：乙腈水溶液(4:1,v/v),流速：1.0mL/min；进样量：20μL；对照γ-聚谷氨酸标准品计算发酵液中γ-聚谷氨酸含量。

10.微生物多糖和γ-聚谷氨酸的鉴定

采用高压液相色谱仪、红外光谱仪和核磁共振仪来鉴定贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2发酵产物。

①产物水解组分的分析

分别取微生物多糖和γ-聚谷氨酸0.1g于水解瓶中，加3mL的72％的硫酸，混合，于32℃水浴60min，取出后加入84mL双蒸水稀释到3.5％，混匀。经过121℃，1h处理后，取出冷却，调节pH至6.5，得到微生物多糖和γ-聚谷氨酸水解液，将微生物多糖和γ-聚谷氨酸水解液分别进行液相色谱分析，确定其单糖和氨基酸组分。

②红外光谱与核磁共振分析

利用红外光谱仪测定微生物多糖和γ-聚谷氨酸的红外光谱图：取样品0.2mg与少量KBr研磨压片制样，然后用红外光谱仪测定样品的红外图谱，扫描范围4000～400cm^-1。以D₂O为溶剂，对微生物多糖和γ-聚谷氨酸进行NMR¹H和NMR¹³C检测。

本发明得到微生物多糖的结构如下：

有益效果：本发明具有如下优势：

本发明首次筛选得到一株微生物多糖合成菌株贝莱斯芽孢杆菌B.velezensisLT-2；该菌株能够以菊芋粉、甘蔗汁为廉价碳源发酵合成微生物多糖，同时可以联产γ-聚谷氨酸，培养基中可积累微生物多糖的最高浓度为29.16g/L，γ-聚谷氨酸的最高浓度为6.96g/L，大大降低了生产成本，而且操作简单，这对于微生物多糖和γ-聚谷氨酸的生产、菊芋和甘蔗资源的拓展应用具有十分重要的社会与经济意义。

附图说明

图1为贝莱斯芽孢杆菌LT-2的16S rDNA PCR纯化琼脂糖凝胶电泳图(A)和贝莱斯芽孢杆菌LT-2的系统发育树(B)。

图2贝莱斯芽孢杆菌LT-2产微生物多糖水解后单糖组分高效液相色谱图(A)和贝莱斯芽孢杆菌LT-2产γ-聚谷氨酸水解后氨基酸组分高效液相色谱图(B)。

图3为贝莱斯芽孢杆菌LT-2产微生物多糖的红外光谱图(A)和贝莱斯芽孢杆菌LT-2产γ-聚谷氨酸的红外光谱图(B)。

图4为贝莱斯芽孢杆菌LT-2产微生物多糖的核磁共振图(NMR)¹H图谱(A)和贝莱斯芽孢杆菌LT-2产γ-聚谷氨酸的核磁共振图(NMR)¹H图谱(B)。

图5为贝莱斯芽孢杆菌LT-2产微生物多糖的核磁共振图(NMR)¹³C图谱(A)和贝莱斯芽孢杆菌LT-2产γ-聚谷氨酸的核磁共振图(NMR)¹³C图谱(B)。

图6碳源种类对贝莱斯芽孢杆菌LT-2合成微生物多糖的影响。

图7碳源浓度对贝莱斯芽孢杆菌LT-2合成微生物多糖的影响。

图8有机氮源种类对贝莱斯芽孢杆菌LT-2合成微生物多糖的影响。

图9有机氮源浓度对贝莱斯芽孢杆菌LT-2合成微生物多糖的影响。

图10无机氮源种类对贝莱斯芽孢杆菌LT-2合成微生物多糖的影响。

图11无机氮源浓度对贝莱斯芽孢杆菌LT-2合成微生物多糖的影响。

图12温度对贝莱斯芽孢杆菌LT-2合成微生物多糖的影响。

图13pH对贝莱斯芽孢杆菌LT-2合成微生物多糖的影响。

图14为贝莱斯芽孢杆菌LT-2摇瓶水平联产微生物多糖和γ-聚谷氨酸的进程曲线。

图15为50L发酵罐分批补料合成微生物多糖和γ-聚谷氨酸的进程曲线。

图16为1t发酵罐分批补料合成微生物多糖和γ-聚谷氨酸的进程曲线。

具体实施方式：

根据下列实施例可以更好的理解本发明，然而本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2的分离筛选。

该实施例所用培养基的组成如下：

(1)富集液体培养基：菊糖20g/L，酵母粉5g/L，磷酸氢二钾5g/L，溶剂为水，pH值7.0～8.0；

(2)固体筛选培养基：菊糖20g/L，酵母粉5g/L，磷酸氢二钾5g/L，硫酸镁0.5g/L，苯胺蓝0.05g/L，琼脂粉20g/L，溶剂为水，pH值调至7.0～8.0；

(3)发酵培养基：菊糖20g/L，酵母粉5g/L、磷酸二氢钾5g/L，硫酸镁0.8g/L，硫酸锰0.005g/L，溶剂为水，pH值7.0～8.0。

该实施例的具体操作过程如下：

筛选微生物多糖产生菌步骤如下：从36份酒曲中各取2g分别接入装有富集培养基的三角摇瓶中，装液量为80mL/500mL，在32℃、200rpm条件下富集培养24h。

取3mL培养液转接到相同的液体富集培养基中在相同条件下进行第二次富集培养，培养24h，再反复1次，即富集3次。在无菌条件下，将第三次富集的培养液稀释至10^-8和10^-9，各取200μL涂布于固体筛选培养基上，32℃培养24h。根据菌落表面湿润粘稠的程度和合成产物与苯胺蓝反应的颜色变化，筛选出阳性菌株并进行分离纯化，再接种到多糖发酵培养基中，在32℃，200rpm条件下培养24h，然后测定初筛菌株多糖的产量，获得产量最高的菌株。在后续各种生理生化测定的实验中，发现发酵液中含有一定量的γ-聚谷氨酸。

实施例2：贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2的鉴定。

利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2的基因组DNA，以上游引物27F和下游引物1492R PCR扩增16S rDNA序列如图1A所示，将PCR扩增后产物进行胶回收纯化，将胶回收纯化产物送至苏州金唯智生物科技有限公司进行测序。测序所得菌株的16S rDNA基因的核苷酸序列长度为1396bp，其基因序列如SEQID No.1所示。将测序结果与GeneBank数据库中已知16S rDNA序列进行BLAST比对，并使用BLAST程序进行同源性比较，构建16S rDNA全序列为基础的系统发育树。结果显示：该菌株与贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis zjt9达到100％同源性(图1B)。根据菌株形态学观察和生理生化实验分析结果认定本发明所使用的是贝莱斯芽孢杆菌，具体命名为贝莱斯芽孢杆菌B.velezensisLT-2。

实施例3：贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2发酵产物的鉴定

①水解产物分析

分别取0.1g提纯后的贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2发酵产物I和II于水解瓶中，加3mL的72％的硫酸，混合，于32℃水浴60min，取出后加入双蒸水稀释到3.5％，混匀。经过121℃，1h处理后，取出冷却，调节pH至6.5，分别得到两种发酵产物水解液。如图2所示：贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2发酵产物I共有1种单糖组分，且与葡萄糖标准品出峰时间一致，因此可以初步确定发酵产物I为葡聚糖。发酵产物II有1种氨基酸组分，且与谷氨酸标准品出峰时间一致，因此可以初步确定发酵产物II为γ-聚谷氨酸。

②红外光谱与核磁共振分析

利用红外光谱仪测定贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2两种发酵产物的红外图谱，取样品0.2mg与少量KBr研磨压片制样，然后用红外光谱仪测定样品的红外图谱，扫描范围4000～400cm^-1。以氘水为溶剂，对B.velezensis LT-2两种发酵产物进行一维核磁共振检测。结果如图3、图4和图5所示，红外光谱、NMR ¹H和NMR ¹³C所示贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2发酵产物I的特征峰均属于生物多糖特征峰，确定B.velezensis LT-2发酵产物I为微生物多糖即葡聚糖。发酵产物II的特征峰与标准γ-聚谷氨酸一致，确定B.velezensis LT-2发酵产物II为γ-聚谷氨酸。

实施例4：贝莱斯芽孢杆菌LT-2发酵联产微生物多糖和γ-聚谷氨酸碳源种类的优化

本实施例说明不同种类的碳源对菌株发酵制备微生物多糖和和γ-聚谷氨酸的影响，将种子培养液以3.5％(v/v)的接种量分别接种于含20g/L(发酵液中总糖浓度)甘蔗汁(SJ)、菊芋粉(JATP)、糖蜜(CM)、麦芽糖(Mal)、果糖(Frc)和葡萄糖(Glc)的发酵培养基中，初始pH值为7.0，于32℃，200rpm振荡培养，发酵培养基装液量为80mL/500mL三角摇瓶，发酵培养24h，分别取不同碳源发酵液进行步骤8和步骤9的操作，计算微生物多糖和γ-聚谷氨酸的含量。以菊芋粉和甘蔗汁为碳源所得微生物多糖产量最高(基本相同)。微生物多糖产量约为5.68g/L，生产速率高达0.24g/L/h；γ-聚谷氨酸产量约为1.55g/L，生产速率为0.06g/L/h，总糖转化率为36.13.5％(图6)。

注：以下实施例均以菊芋粉为碳源进行优化，并以微生物多糖为主产物、聚谷氨酸为副产物进行优化。

实施例5：贝莱斯芽孢杆菌LT-2发酵联产微生物多糖和γ-聚谷氨酸碳源浓度的优化

本实施例说明不同总糖(菊芋粉)浓度对菌株发酵制备微生物多糖和和γ-聚谷氨酸的影响，将种子培养液以3.5％(v/v)的接种量分别接种于总糖浓度为10g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L和60g/L的发酵培养基中，初始pH值为7.0，于32℃，200rpm振荡培养，发酵培养基装液量为80mL/500mL三角摇瓶，发酵培养24h，分别取不同糖浓度的发酵液，进行步骤8和步骤9的操作，计算微生物多糖和γ-聚谷氨酸的含量。当总糖的浓度为30g/L时，微生物多糖产量达到7.94g/L，生产速率为0.33g/L/h；γ-聚谷氨酸产量为3.18g/L，生产速率为0.13g/L/h，总糖转化率为37.07％。因此，选用30g/L的糖浓度为进行后续发酵(图7)。

实施例6：贝莱斯芽孢杆菌LT-2发酵联产微生物多糖和γ-聚谷氨酸有机氮源种类的优化

本实施例说明不同有机氮源对菌株发酵制备微生物多糖和和γ-聚谷氨酸的影响，将种子培养液以3.5％(v/v)的接种量分别接种于3g/L牛肉膏(BE)、大豆分离蛋白(SPI)、胰蛋白胨(TP)、玉米浆(CSL)、黄豆饼粉(SC)、花生饼粉(PM)和酵母粉(YEP)的发酵培养基中，初始pH值为7.0，于32℃，200rpm振荡培养，发酵培养基装液量为80mL/500mL三角摇瓶，发酵培养24h，分别取不同有机氮源发酵液进行步骤8和步骤9的操作，计算微生物多糖和γ-聚谷氨酸的含量。以胰蛋白胨为有机氮源时微生物多糖产量达到8.48g/L，生产速率为0.35g/L/h；γ-聚谷氨酸产量为3.29g/L，生产速率为0.14g/L/h，总糖转化率为39.23％。因此，选用胰蛋白胨作为最佳有机氮源(图8)。

实施例7：贝莱斯芽孢杆菌LT-2发酵联产微生物多糖和γ-聚谷氨酸胰蛋白胨浓度的优化

本实施例说明不同胰蛋白胨浓度对菌株发酵制备微生物多糖和和γ-聚谷氨酸的影响，将种子培养液以3.5％(v/v)的接种量分别接种于含2g/L、4g/L、6g/L、8g/L 10g/L和12g/L胰蛋白胨的发酵培养基中，初始pH值为7.0，于32℃，200rpm振荡培养，发酵培养基装液量为80mL/500mL三角摇瓶，发酵培养24h，分别取各个浓度胰蛋白胨发酵液进行步骤8和步骤9的操作，计算微生物多糖和γ-聚谷氨酸的含量。当胰蛋白胨浓度为6g/L时微生物多糖产量达到9.04g/L，生产速率为0.38g/L/h；γ-聚谷氨酸产量为3.33g/L，生产速率为0.14g/L/h，总糖转化率为41.25％。因此，选用6g/L胰蛋白胨进行后续发酵(图9)。

实施例8：贝莱斯芽孢杆菌LT-2发酵联产微生物多糖和γ-聚谷氨酸无机氮源种类的优化

本实施例说明不同无机氮源对菌株发酵制备微生物多糖和和γ-聚谷氨酸的影响，将种子培养液以3.5％(v/v)的接种量分别接种于5g/L氯化铵(A)、硫酸铵(B)、尿素(C)、磷酸氢二铵(D)、磷酸二氢铵(E)和硝酸铵(F)的发酵培养基中，初始pH值为7.0，于32℃，200rpm振荡培养，发酵培养基装液量为80mL/500mL三角摇瓶，发酵培养24h，分别取不同无机氮源发酵液进行步骤8和步骤9的操作，计算微生物多糖和γ-聚谷氨酸的含量。以硫酸铵为无机氮源时微生物多糖产量达到9.54g/L，生产速率为0.40g/L/h；γ-聚谷氨酸产量为3.41g/L，生产速率为0.14g/L/h，总糖转化率为43.17％。因此，选用硫酸铵为最佳无机氮源(图10)。

实施例9：贝莱斯芽孢杆菌LT-2发酵联产微生物多糖和γ-聚谷氨酸硫酸铵浓度的优化

本实施例说明不同硫酸铵浓度对菌株发酵制备微生物多糖和和γ-聚谷氨酸的影响，将种子培养液以3.5％(v/v)的接种量分别接种于含5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L和30g/L硫酸铵的发酵培养基中，初始pH值为7.0，于32℃，200rpm振荡培养，发酵培养基装液量为80mL/500mL三角摇瓶，发酵培养24h，分别取各个浓度硫酸铵发酵液进行步骤8和步骤9的操作，计算微生物多糖和γ-聚谷氨酸的含量。当硫酸铵浓度为15g/L时微生物多糖产量达到10.10g/L，生产速率为0.42g/L/h；γ-聚谷氨酸产量为3.52g/L，生产速率为0.15g/L/h，总糖转化率为45.40％。因此，选用15g/L的硫酸铵进行后续发酵(图11)。

实施例10：贝莱斯芽孢杆菌LT-2发酵联产微生物多糖和γ-聚谷氨酸温度的优化

本实施例说明不同温度对贝莱斯芽孢杆菌LT-2发酵制备微生物多糖产量的影响，将种子培养液3.5％(v/v)的接种量接种于发酵培养基，初始pH值为7.0，于32℃，200rpm振荡培养，培养温度分别为24℃、26℃、28℃、30℃、32℃和34℃，发酵培养基装液量为80mL/500mL三角摇瓶，发酵培养24h，分别取各个温度的发酵液进行步骤8和步骤9的操作，计算微生物多糖和γ-聚谷氨酸的含量。当温度为32℃时微生物多糖产量达到10.68g/L，生产速率为0.45g/L/h；γ-聚谷氨酸产量为3.58g/L，生产速率为0.15g/L/h，总糖转化率为47.55％。因此，选用32℃为最佳发酵温度(图12)。

实施例11：贝莱斯芽孢杆菌LT-2发酵联产微生物多糖和γ-聚谷氨酸pH的优化

本实施例说明不同pH值对菌株发酵制备微生物多糖和γ-聚谷氨酸的影响，将种子培养液以3.5％(v/v)的接种量接种于发酵培养基，于32℃，200rpm振荡培养，培养基装液量为80mL/500mL三角摇瓶，培养pH值分别为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0的发酵培养基中，取各pH值下的发酵液进行步骤8和步骤9的操作，计算微生物多糖和γ-聚谷氨酸的含量。当pH值为7.5时微生物多糖产量达到10.98g/L，生产速率为0.46g/L/h；γ-聚谷氨酸产量为3.65g/L，生产速率为0.15g/L/h，总糖转化率为48.77％。因此，选用pH值7.5为最佳发酵pH值(图13)。

实施例12：贝莱斯芽孢杆菌LT-2发酵联产微生物多糖和γ-聚谷氨酸的所需金属盐种类及其浓度的优化

本实施例说明不同金属盐及其浓度对菌株发酵制备微生物多糖的影响，将种子培养液以3.5％(v/v)的接种量分别接种于含有以下各金属盐浓度中，经过单因素变量实验如下：

硫酸亚铁：0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60g/L以及对照组，硫酸亚铁最佳浓度为0g/L(不添加)；

硫酸镁：0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2g/L以及对照组，硫酸镁最佳浓度为0.8g/L；

磷酸二氢钾：1、2、3、4、5、6、7、和8g/L以及对照组，磷酸二氢钾最佳浓度为0g/L(不添加)；

磷酸氢二钾：3、6、9、12、15、和18g/L以及对照组，磷酸氢二钾最佳浓度为12g/L；

硫酸锰0.001、0.002、0.003、0.004、0.005和0.006g/L以及对照组，硫酸锰最佳浓度为0.003g/L；

氯化钙：0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60g/L以及对照组，氯化钙最佳浓度为0g/L(不添加)。

对于不同实验组的发酵培养基，不同浓度的金属盐设置3组平行对照，初始pH值为7.5，于28℃，200rpm振荡培养，培养基装液量为80mL/500mL三角摇瓶，发酵培养24h，取各金属盐浓度下的发酵液进行步骤8和步骤9的操作，计算微生物多糖和γ-聚谷氨酸的含量。当在上述最优金属盐条件下，微生物多糖产量达到11.37g/L，生产速率为0.47g/L/h；γ-聚谷氨酸产量为3.98g/L，生产速率为0.17g/L/h，总糖转化率为51.17％(图14)。

实例13：50L发酵罐分批补料联产微生物多糖和γ-聚谷氨酸

将贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2菌种接种于斜面培养基，32℃静置培养16h，再次挑取单菌落划线到斜面培养基上，32℃培养16h，得到活化菌种备用；取活化好的菌种，无菌条件下接种2环于含有种子培养基的摇瓶中，置于转速为200rpm的摇床上，温度为32℃培养16h，得到发酵种子液；将种子液按体积比为5％的接种量接入无菌发酵培养基[菊芋粉(使培养基中总糖浓度为30g/L)、胰蛋白胨6g/L、硫酸铵15g/L，磷酸氢二钾12g/L，硫酸镁0.8g/L，硫酸锰0.003g/L，利用氨水将发酵液初始pH调至7.5]中，发酵罐总装液量为30L，发酵温度为32℃，搅拌转速200rpm，通气量为1.2VVM进行发酵；发酵初始pH值为7.5，发酵过程中开启pH自动控制装置，利用氨水或盐酸控制发酵液pH值在7.5左右；发酵时间为48小时。每隔4小时取样测定发酵液中的微生物多糖和γ-聚谷氨酸的浓度。测定分析：取上述发酵液，12,000rpm离心2分钟，取上清液稀释合适倍数检测发酵液中微生物多糖含量，发现经过一次补料微生物多糖产量达到27.59g/L，生产速率为0.63g/L/h；γ-聚谷氨酸产量为5.96g/L，生产速率为0.14g/L/h，总糖转化率为55.92％(图15)。

实例14：1t发酵罐分批补料联产微生物多糖和γ-聚谷氨酸

将贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2种子液按体积比为10％的接种量接入无菌发酵培养基中，发酵罐总装液量700L，发酵温度为32℃，搅拌转速220rpm，通气量为1.2VVM进行发酵；发酵初始pH值为7.5，发酵过程中开启pH自动控制装置，利用氨水或盐酸控制发酵液pH值在7.5左右；发酵时间48小时。每隔4小时取样测定发酵液中的微生物多糖和γ-聚谷氨酸的浓度。测定分析：取上述发酵液，12,000rpm离心2分钟，取上清液稀释合适倍数检测发酵液中微生物多糖产量达到29.16g/L，生产速率为0.73g/L/h；γ-聚谷氨酸产量为6.96g/L，生产速率为0.17g/L/h，总糖转化率为60.20％(图16)。

注：本实施例中发酵培养基是优化后的最佳培养基，但碳源进行补料了，因此得到了更高产量的微生物多糖和γ-聚谷氨酸。

最后，还需注意的是，以上列举仅是本发明的具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 常熟理工学院

<120> 一株贝莱斯芽孢杆菌及其在联产微生物多糖和γ-聚谷氨酸中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1396

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gagcggacag atgggagctt gctccctgat gttagcggcg gacgggtgag taacacgtgg 60

gtaacctgcc tgtaagactg ggataactcc gggaaaccgg ggctaatacc ggatgcttgt 120

ttgaaccgca tggttcagac ataaaaggtg gcttcggcta ccacttacag atggacccgc 180

ggcgcattag ctagttggtg aggtaacggc tcaccaaggc gacgatgcgt agccgacctg 240

agagggtgat cggccacact gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag 300

tagggaatct tccgcaatgg acgaaagtct gacggagcaa cgccgcgtga gtgatgaagg 360

ttttcggatc gtaaagctct gttgttaggg aagaacaagt gccgttcaaa tagggcggca 420

ccttgacggt acctaaccag aaagccacgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac 480

gtaggtggca agcgttgtcc ggaattattg ggcgtaaagg gctcgcaggc ggtttcttaa 540

gtctgatgtg aaagcccccg gctcaaccgg ggagggtcat tggaaactgg ggaacttgag 600

tgcagaagag gagagtggaa ttccacgtgt agcggtgaaa tgcgtagaga tgtggaggaa 660

caccagtggc gaaggcgact ctctggtctg taactgacgc tgaggagcga aagcgtgggg 720

agcgaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgagtgc taagtgttag 780

ggggtttccg ccccttagtg ctgcagctaa cgcattaagc actccgcctg gggagtacgg 840

tcgcaagact gaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt 900

ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc aggtcttgac atcctctgac aatcctagag 960

ataggacgtc cccttcgggg gcagagtgac aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt 1020

cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tgatcttagt tgccagcatt 1080

cagttgggca ctctaaggtg actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca 1140

aatcatcatg ccccttatga cctgggctac acacgtgcta caatgggcag aacaaagggc 1200

agcgaaaccg cgaggttaag ccaatcccac aaatctgttc tcagttcgga tcgcagtctg 1260

caactcgact gcgtgaagct ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat 1320

acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccacga gagtttgtaa cacccgaagt 1380

cggtgaggta accttt 1396

Claims (8)

1.贝莱斯芽孢杆菌在联产微生物多糖和γ-聚谷氨酸中的应用，其特征是，所述贝莱斯芽孢杆菌的分类命名为贝莱斯芽孢杆菌LT-2(Bacillus velezensis LT-2)，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2019904，保藏日期为2019年11月7日。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，将贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2接种于发酵培养基中进行好氧培养，制备微生物多糖和γ-聚谷氨酸。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的发酵培养基包括如下组分：碳源10～80g/L，氮源5～20g/L，金属盐5.0～15.0g/L，溶剂为水，pH值7.0～8.0。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，其中所述的碳源为甘蔗汁、菊芋粉、糖蜜、麦芽糖、果糖和葡萄糖中、任意一种或几种的组合；

所述的氮源为牛肉膏、大豆分离蛋白、胰蛋白胨、玉米浆、黄豆饼粉、花生饼粉和酵母粉、氯化铵、硫酸铵、尿素、磷酸氢二铵、磷酸二氢铵、硝酸铵的任意一种或几种的组合；

所述的金属盐为硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸亚铁、硫酸锰、氯化钙中的一种或几种的组合。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基包含如下组分：菊粉10～60g/L、胰蛋白胨2～12g/L、硫酸铵5～30g/L，磷酸氢二钾5～20g/L，硫酸镁0.2～1.6g/L，硫酸锰0.002～0.008g/L，利用氨水调节pH至6.5～9.0。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述碳源为菊芋粉或甘蔗汁，其中所述甘蔗汁由新鲜甘蔗压榨得到。

7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的好氧培养条件是：初始pH为7.0～8.0、培养温度为28～32℃；

当好氧培养为摇瓶培养时，摇瓶接种量为每100mL发酵液接种1～8mL种子液，培养时间为12～24h；

当好氧培养为发酵罐培养时，发酵罐接种量为每100mL发酵液接种1～15mL，发酵方式为分批补料法，通气比为1.0～1.4VVM，培养时间为24～48h。

8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2合成的微生物多糖结构如下：

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