CN110655554B - 一种提高酿酒酵母增殖和乙醇耐受性的蛋白活性肽及其制备方法与应用 - Google Patents

一种提高酿酒酵母增殖和乙醇耐受性的蛋白活性肽及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高酿酒酵母增殖和乙醇耐受性的蛋白活性肽及其制备方法及应用。本发明以小麦面筋蛋白为原料，通过酶法水解，制备得到小麦面筋蛋白酶解液，再利用乙醇沉淀和反相高效液相色谱对其进行分离纯化得到七种新的能促进酵母增殖和提高酵母乙醇耐受性的活性肽，该方法制备得到的目标活性肽包括：Glu‑Pro、Leu‑Leu、Leu‑Trp、Leu‑Met‑Leu、Leu‑Leu‑Leu、Leu‑Leu‑Trp、Glu‑Phe‑Pro‑Leu。本发明所制得的小麦面筋蛋白肽能显著提高酿酒酵母的乙醇耐受性，将其应用于高浓度乙醇条件下，可有效促进酿酒酵母增殖以及提高细胞活性。

Description

一种提高酿酒酵母增殖和乙醇耐受性的蛋白活性肽及其制备 方法与应用
技术领域
本发明涉及蛋白肽技术领域，具体涉及一种提高酵母增殖和乙醇耐受性的小麦面筋蛋白活性肽及其制备方法与应用。
背景技术
酿酒酵母是一种非常重要的工业微生物，具有发酵速度快、乙醇产量高等特性，主要应用于乙醇和酿酒行业。然而随着发酵的进行，乙醇的积累会对酵母细胞产生毒害作用，进而影响细胞增殖、存活率和乙醇发酵，尤其是超高浓发酵。在超高浓发酵中，乙醇胁迫是酵母遭受的最主要胁迫。因此，为了改善酵母在超高浓发酵中的发酵效率，如何提高在高浓度乙醇条件下酵母增殖和对乙醇胁迫耐受性变得尤为重要和迫切。
小麦面筋蛋白是一种丰富、经济、具有潜力的优质植物蛋白，含有多种氨基酸。小麦面筋蛋白中蕴涵许多具有生物活性的氨基酸序列。但是由于小麦面筋蛋白某些功能特性局限性，尤其是其溶解能力较差，阻碍其它功能性发挥，限制面筋蛋白在食品和非食品行业应用。通过酶解扩大了小麦面筋蛋白在食品和食品生物技术产业中的用途。因为特异性的蛋白酶水解小麦面筋蛋白有可能释放出具有生物活性的肽段，从而提高小麦面筋蛋白的经济价值。
CN108342439A公开了以小麦面筋蛋白为原料，经超声、均质预处理、酶解、醇沉以及大孔树脂柱层析，制备得到能提高酿酒酵母乙醇耐受性的小麦面筋蛋白肽分离组分，但是该方法得到的是混合物，并未获得具体明确的多肽；同时CN108342439A采用了超声和均质增加了小麦面筋蛋白处理成本。
发明内容
为了克服高浓发酵中酵母增殖和代谢活性差的难题，本发明的目的在于提供了一种提高酵母增殖和乙醇耐受性的小麦面筋蛋白活性肽及其制备方法与应用。
本发明以小麦面筋蛋白为原料，提供一种利用食品级商业蛋白酶，酶解小麦面筋蛋白，并对酶解物进行分离纯化，制备得到七种在高浓度乙醇存在情况下能促进酿酒酵母细胞增殖和提高酵母乙醇耐受性的小麦面筋蛋白肽。
本发明的目的至少通过如下之一的技术方案实现。
一种提高酿酒酵母增殖和乙醇耐受性的小麦面筋蛋白活性肽制备方法，包括如下步骤：
（1）小麦面筋蛋白的酶解：将小麦面筋蛋白与水混合，再加入蛋白酶，恒温搅拌下进行酶解；酶解完成后，灭酶，冷至室温，离心，去除沉淀，得到小麦面筋蛋白酶解清液；
（2）小麦面筋蛋白酶解清液的醇沉处理：将小麦面筋蛋白酶解清液减压浓缩得到浓缩液后，加入无水乙醇进行醇沉除去大分子蛋白和多肽，上清液经冷冻干燥，得到小麦面筋蛋白醇沉清液冻干粉WP；
（3）反相高效液相分离：将冻干粉WP溶解于水后，用反相高效液相色谱进行分离纯化，得到的分离组分经冷冻干燥，得到所述提高酿酒酵母增殖和乙醇耐受性的小麦面筋蛋白活性肽。
进一步的，步骤（1）中，所述经小麦面筋蛋白与水质量比为1：8～1：10；加入占比小麦面筋蛋白量1 wt%～2 wt%的蛋白酶。
进一步的，步骤（1）中，酶解条件是在45～55℃进行18～22h；沸水灭酶10～30min。
进一步的，步骤（2）中，所述无水乙醇加入量为：使无水乙醇与浓缩液的混合液中，乙醇浓度达到70～90vol.%。
进一步的，步骤（2）中，所述减压浓缩是在温度40～50℃、真空度0.08 MPa～0.1MPa条件下，浓缩为原酶解液的0.2～0.6 倍。
进一步的，步骤（3）中，所述反相高效液相分离方法中：将冻干粉WP溶解于水后，用反相高效液相色谱进行纯化，以1～3 ml/min的流速进行梯度洗脱，条件为：0-5 min，10vol.%乙腈；5-35 min，10-60 vol.%乙腈；35-36 min，60 vol.%乙腈；36-40 min，60-10vol.%乙腈；41-42 min，10 vol.%乙腈。
进一步地，步骤（3）中，所述反相高效液相分离柱为BEH-C18制备柱（10 mm ⅹ 150mm，5 μm）。
进一步的，步骤（3）中，流动相为A相和B相，A相为含0.1 vol.%三氟乙酸的超纯水，B相为乙腈。
进一步的，步骤（3）中，所述通过反相高效液相进行进一步分离过程中，洗脱速度为1~3 mL/min。
上述制备方法得到的小麦面筋蛋白活性肽，所述小麦面筋蛋白活性肽包括Glu-Pro（245.1127）、Leu-Leu（245.1849）、Leu-Trp（318.1816）、Leu-Met-Leu（376.2277）、Leu-Leu-Leu（358.2702）、Leu-Leu-Trp（431.267）、Glu-Phe-Pro-Leu（505.2678）的活性肽段。
所述小麦面筋蛋白肽在提高高浓度乙醇胁迫条件下酿酒酵母细胞增殖和细胞活性中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
（1）本发明的制备方法以小麦面筋蛋白为原料，采用生物酶制剂降解小麦面筋蛋白，使蛋白中活性肽段得到充分释放，然后通过乙醇沉淀使酶解物中大分子物质降低，最后结合反相高效液相分离技术进一步使得小麦面筋蛋白肽得到分离富集，从而达到高效富集小麦面筋蛋白肽活性成分的目的；
（2）本发明制备方法操作简单、成本较低，安全性高，具有酶解分离效果好，提取率高的特点；
（3）本发明制备方法制得的小麦面筋蛋白肽具有提高酿酒酵母的乙醇耐受性的效果，可应用于提高高浓度或高密度发酵过程中酿酒酵母的乙醇耐受性、高乙醇浓度下的细胞增殖和细胞活力。
附图说明
图1为实施例2中经步骤3反相高效液相色谱分离纯化小麦面筋蛋白活性肽图谱；
图2为添加了实施例2半制备型反相高效液相色谱各分离组分小麦面筋蛋白肽和未添加任何试剂的10 vol.%乙醇YPD培养基中酿酒酵母的细胞的生长曲线图；
图3为添加了实施例2半制备型反相高效液相色谱各分离组分小麦面筋蛋白肽和未添加任何试剂的10 vol.%乙醇YPD培养基中酿酒酵母的细胞活性的影响曲线图；
图4为实施例2添加了各小麦面筋蛋白目标肽（Glu-Pro、Leu-Leu、Leu-Trp、Leu-Met-Leu、Leu-Leu-Leu、Leu-Leu-Trp和Glu-Phe-Pro-Leu）和未添加任何试剂的10 vol.%乙醇YPD培养基中酿酒酵母的细胞的生长曲线图；
图5为实施例2添加了各小麦面筋蛋白目标肽（Glu-Pro、Leu-Leu、Leu-Trp、Leu-Met-Leu、Leu-Leu-Leu、Leu-Leu-Trp和Glu-Phe-Pro-Leu）和未添加任何试剂的10 vol.%乙醇YPD培养基中酿酒酵母的细胞活性的影响曲线图。
具体实施方式
以下结合具体实施例及附图对本发明的技术方案作进一步详细的描述，但本发明的保护范围和实施方式不限于此。
以下实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件、实验室手册中所述的条件或按照制造厂商所建议的条件进行实验。
具体实施例中，采用的酿酒酵母为Saccharomyces pastorianus，于2010年12月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员普通微生物中心（地址：中国北京市朝阳区北辰西路中科院微生物研究所菌种保藏中心），保藏编号为CGMCC No.4466。
步骤3中测定各洗脱组分对应的改善酿酒酵母乙醇耐受性，具体是将培养好的酿酒酵母细胞分别接种在添加各洗脱组分（WP1、WP2、WP3、WP4和WP5）的含10wt%乙醇的酵母培养基（YPD培养基）中，且洗脱组分的浓度为0.3wt%，通过紫外分光光度计在OD600检测不同时间酵母生长曲线。同时，通过次甲基蓝检测不同时间下酵母细胞活性。
步骤5中测定活性肽对应的改善酿酒酵母乙醇耐受性，具体是将培养好的酿酒酵母细胞分别接种在添加所述多肽（Glu-Pro、Leu-Leu、Leu-Trp、Leu-Met-Leu、Leu-Leu-Leu、Leu-Leu-Trp和Glu-Phe-Pro-Leu）的含10wt%乙醇的酵母培养基（YPD培养基）中，且多肽的浓度为300 mg/L，通过紫外分光光度计在OD600检测不同时间酵母生长曲线。同时，通过次甲基蓝检测不同时间下酵母细胞活性。
通过定期取样检测酿酒酵母细胞的细胞增殖和细胞活性，具体的：
（1）采用分光光度计测量OD600值检测酿酒酵母细胞的增殖能力;
（2）细胞活性按照美兰染色法测定。
实施例1
能提高酿酒酵母乙醇耐受性，高浓度乙醇下细胞增殖和细胞活力的小麦面筋蛋白肽的制备方法，具体步骤如下：
（1）小麦面筋蛋白酶解物的制备：将小麦面筋蛋白与水按1：8（m/m）的比例加水混合，加入胰酶（以小麦面筋蛋白质量为计算基准，胰酶添加量为1 wt%），45℃恒温搅拌酶解18 h，然后在沸水中灭酶10 min，冷却至常温，6000 rpm离心15 min，去除沉淀，得到小麦面筋蛋白酶解清液；
（2）小麦面筋蛋白酶解液的醇沉处理：将小麦面筋蛋白酶解清液过滤，滤液于40℃、真空度0.08 MPa条件下，浓缩为原酶解液0.2倍，浓缩液加入无水乙醇醇沉（浓缩液与无水乙醇混合成的混合液中，乙醇浓度为70 vol.%）去除大分子蛋白和多肽，上清液经冷冻干燥，得到小麦面筋蛋白醇沉清液冻干粉WP；
（3）反相高效液相分离：将粉末WP溶于水后，用反相高效液相色谱进行分离纯化，得到5个分离组分，分离纯化条件为：色谱柱为BEH-C18制备柱（10 mm ⅹ 150 mm，5 μm），流动相为A相（含0.1 vol.%三氟乙酸的超纯水）和B相（乙腈），洗脱条件为：0-5 min，10 vol.%乙腈；5-35 min，10-60 vol.%乙腈；35-36 min，60 vol.%乙腈；36-40 min，60-10 vol.%乙腈；41-42 min，10 vol.%乙腈，流速为1 ml/min，检测波长为214 nm，测定各洗脱组分对应的改善酿酒酵母乙醇耐受性，收集得到活性最高的组分WP5，冷冻干燥，得到目标肽；
（4）步骤（3）得到的目标肽，通过UPLC-MS/MS 技术进行氨基酸序列分析，经二级质谱分析得到WP5具有活性肽Glu-Pro、Leu-Leu、Leu-Trp、Leu-Met-Leu、Leu-Leu-Leu、Leu-Leu-Trp和Glu-Phe-Pro-Leu。
（5）测试步骤（4）中鉴定的7种多肽Glu-Pro、Leu-Leu、Leu-Trp、Leu-Met-Leu、Leu-Leu-Leu、Leu-Leu-Trp和Glu-Phe-Pro-Leu改善酿酒酵母乙醇耐受性的能力，结果如图4和5所示，其中Leu-Leu添加最大程度改善了酿酒酵母乙醇耐受性。（实施例1中的测定数据与实施例2相差无几，相关数据请参见图1-5）
实施例2
能提高酿酒酵母乙醇耐受性，高浓度乙醇下细胞增殖和细胞活力的小麦面筋蛋白肽的制备方法，具体步骤如下：
（1）小麦面筋蛋白酶解物的制备：将小麦面筋蛋白与水按1：9（m/m）的比例加水混合，加入胰酶（以小麦面筋蛋白质量为计算基准，胰酶添加量为1.5 wt%），50℃恒温搅拌酶解20 h，然后在沸水中灭酶20 min，冷却至常温，6000 rpm离心15 min，去除沉淀，得到小麦面筋蛋白酶解清液；
（2）小麦面筋蛋白酶解液的醇沉处理：将小麦面筋蛋白酶解清液过滤，滤液于45℃、真空度0.09 MPa条件下，浓缩为原酶解液0.4倍 ，浓缩液加入无水乙醇醇沉（浓缩液与无水乙醇混合成的混合液中，乙醇浓度为80 vol.%）去除大分子蛋白和多肽，上清液经冷冻干燥，得到小麦面筋蛋白醇沉清液冻干粉WP；
（3）反相高效液相分离：将粉末WP溶于水后，用反相高效液相色谱进行分离纯化，得到5个分离组分（图1），分离纯化条件为：色谱柱为BEH-C18制备柱（10 mm ⅹ 150 mm，5 μm），流动相为A相（含0.1%三氟乙酸V/V的超纯水）和B相（乙腈），洗脱条件为：0-5 min，10vol.%乙腈；5-35 min，10-60 vol.%乙腈；35-36 min，60 vol.%乙腈；36-40 min，60-10vol.%乙腈；41-42 min，10 vol.%乙腈，流速为2 ml/min，检测波长为214 nm，测定各洗脱组分对应的改善酿酒酵母乙醇耐受性，结果如图2和3，收集得到活性最高的组分WP5，冷冻干燥，得到目标肽；图中WP和未添加组的测试方法与上面基本相同，除了WP组为未经反相高效液相色谱分离纯化的组分，未添加组是指未添加含蛋白肽组分，即仅含有乙醇的酵母培养基；
（4）步骤（3）得到的目标肽，通过UPLC-MS/MS 技术进行氨基酸序列分析，经二级质谱分析得到WP5具有活性肽Glu-Pro、Leu-Leu、Leu-Trp、Leu-Met-Leu、Leu-Leu-Leu、Leu-Leu-Trp和Glu-Phe-Pro-Leu。
（5）测试步骤（4）中鉴定的7种多肽Glu-Pro、Leu-Leu、Leu-Trp、Leu-Met-Leu、Leu-Leu-Leu、Leu-Leu-Trp和Glu-Phe-Pro-Leu改善酿酒酵母乙醇耐受性的能力，结果如图4和5所示，其中Leu-Leu添加最大程度改善了酿酒酵母乙醇耐受性。图中control组的测试方法与上面基本相同，除了control组是未添加任何含蛋白肽组分，即仅含有乙醇的酵母培养基。
实施例3
能提高酿酒酵母乙醇耐受性，高浓度乙醇下细胞增殖和细胞活力的小麦面筋蛋白肽的制备方法，具体步骤如下：
（1）小麦面筋蛋白酶解物的制备：将小麦面筋蛋白与水按1：10（m/m）的比例加水混合，加入胰酶（以小麦面筋蛋白质量为计算基准，胰酶添加量为2 wt%），55℃恒温搅拌酶解22 h，然后在沸水中灭酶30 min，冷却至常温，6000 rpm离心15 min，去除沉淀，得到小麦面筋蛋白酶解清液；
（2）小麦面筋蛋白酶解液的醇沉处理：将小麦面筋蛋白酶解清液过滤，滤液于50℃、真空度0.10 MPa条件下，浓缩为原酶解液0.6倍，浓缩液加入无水乙醇醇沉（浓缩液与无水乙醇混合成的混合液中，乙醇浓度为90 vol.%）去除大分子蛋白和多肽，上清液经冷冻干燥，得到小麦面筋蛋白醇沉清液冻干粉WP；
（3）反相高效液相分离：将粉末WP溶于水后，用反相高效液相色谱进行分离纯化，得到5个分离组分，分离纯化条件为：色谱柱为BEH-C18制备柱（10 mm ⅹ 150 mm，5 μm），流动相为A相（含0.1 vol.%三氟乙酸的超纯水）和B相（乙腈），洗脱条件为：0-5 min，10 vol.%乙腈；5-35 min，10-60 vol.%乙腈；35-36 min，60 vol.%乙腈；36-40 min，60-10 vol.%乙腈；41-42 min，10 vol.%乙腈，流速为3 ml/min，检测波长为214 nm，测定各洗脱组分对应的改善酿酒酵母乙醇耐受性，收集得到活性最高的组分WP5，冷冻干燥，得到目标肽；
（4）步骤（3）得到的目标肽，通过UPLC-MS/MS 技术进行氨基酸序列分析，经二级质谱分析得到WP5具有活性肽Glu-Pro、Leu-Leu、Leu-Trp、Leu-Met-Leu、Leu-Leu-Leu、Leu-Leu-Trp和Glu-Phe-Pro-Leu。
（5）测试步骤（4）中鉴定的7种多肽Glu-Pro、Leu-Leu、Leu-Trp、Leu-Met-Leu、Leu-Leu-Leu、Leu-Leu-Trp和Glu-Phe-Pro-Leu改善酿酒酵母乙醇耐受性的能力，其中Leu-Leu添加最大程度改善了酿酒酵母乙醇耐受性。（实施例3中的测定数据与实施例2相差无几，相关数据请参见图1-5）
对比例
CN109097427A公开从小麦面筋蛋白分离制备小麦面筋蛋白肽，经检测为富含L(I)D、AL(I)D、AQP、ENG、SSR、L(I)R、L(I)M、L(I)PPY和PPY的小麦面筋蛋白肽组分。在高浓发酵条件下，该小麦面筋蛋白肽组分能有效地提高酿酒酵母细胞的生物量、细胞活性和发酵性能。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种提高酿酒酵母增殖和乙醇耐受性的小麦面筋蛋白活性肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）小麦面筋蛋白的酶解：将小麦面筋蛋白与水混合，再加入蛋白酶，恒温搅拌下进行酶解；酶解完成后，灭酶，冷至室温，离心，去除沉淀，得到小麦面筋蛋白酶解清液；所述小麦面筋蛋白与水质量比为1：8～1：10；加入占比小麦面筋蛋白量1 wt%～2 wt%的胰酶；酶解条件是在45～55℃进行18～22h；沸水灭酶10～30 min；
（2）小麦面筋蛋白酶解清液的醇沉处理：将小麦面筋蛋白酶解清液减压浓缩得到浓缩液后，加入无水乙醇进行醇沉除去大分子蛋白和多肽，上清液经冷冻干燥，得到小麦面筋蛋白醇沉清液冻干粉WP；所述无水乙醇加入量为：使无水乙醇与浓缩液的混合液中，乙醇浓度达到70～90vol.%；
（3）反相高效液相分离：将冻干粉WP溶解于水后，用反相高效液相色谱进行分离纯化，得到的分离组分经冷冻干燥，得到所述提高酿酒酵母增殖和乙醇耐受性的小麦面筋蛋白活性肽；所述小麦面筋蛋白活性肽包括氨基酸序列为Glu-Pro、Leu-Leu、Leu-Trp、Leu-Met-Leu、Leu-Leu-Leu、Leu-Leu-Trp和Glu-Phe-Pro-Leu的活性肽段；
所述反相高效液相分离方法中：将冻干粉WP溶解于水后，用反相高效液相色谱进行纯化，色谱柱为BEH-C18制备柱，以1～3 ml/min的流速进行梯度洗脱，条件为：0-5 min，10vol.%乙腈；5-35 min，10-60vol.%乙腈；35-36 min，60 vol.%乙腈；36-40 min，60-10vol.%乙腈；41-42 min，10 vol.%乙腈；流动相为A相和B相，A相为含0.1 vol.%三氟乙酸的超纯水，B相为乙腈；
通过反相高效液相进行分离过程中，洗脱速度为1~3 mL/min。
2.根据权利要求1所述的一种提高酿酒酵母增殖和乙醇耐受性的小麦面筋蛋白活性肽的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述减压浓缩是在温度40～50℃、真空度0.08 MPa～0.1 MPa条件下，浓缩为原酶解液的0.2～0.6 倍。
3.由权利要求1所述的制备方法得到的小麦面筋蛋白活性肽，其特征在于，所述小麦面筋蛋白活性肽包括氨基酸序列为Glu-Pro、Leu-Leu、Leu-Trp、Leu-Met-Leu、Leu-Leu-Leu、Leu-Leu-Trp和Glu-Phe-Pro-Leu的活性肽段。
4.权利要求3所述小麦面筋蛋白肽在提高高浓度乙醇胁迫条件下酿酒酵母细胞增殖和细胞活性中的应用。
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