CN111808831A

CN111808831A - 一种重组锰过氧化物酶的制备方法及其在中草药木质素降解中的应用

Info

Publication number: CN111808831A
Application number: CN202010669529.8A
Authority: CN
Inventors: 陈华友; 崔周磊; 王洪成; 卢晨曦; 姚丹; 陈华撑
Original assignee: Zhejiang Kangxing Biotechnology Co ltd
Current assignee: Zhejiang Kangxing Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-07-13
Filing date: 2020-07-13
Publication date: 2020-10-23
Anticipated expiration: 2040-07-13
Also published as: CN111808831B

Abstract

本发明属于生物饲料领域，涉及种重组锰过氧化物酶的制备方法及其在中草药木质纤维素降解中的应用；首先将来源于Irpex lacteus的锰过氧化物酶基因序列进行偏爱性优化，以优化的基因为模板进行PCR扩增，与pREP连接后转化到大肠杆菌感受态细胞中，获得重组穿梭质粒并导入缺陷型粟酒裂殖酵母感受态细胞中，得到重组锰过氧化物酶酵母工程菌；培养后得到粗酶液，与中草药混合，再加入氯化钙、硫酸锰、漆酶、葡萄糖氧化酶和小分子物质激活剂进行多酶协同酶解反应；本发明提供的方法可以快速地获取大量锰过氧化物酶，实现锰过氧化物酶的工业化生产，制备良好稳定的过氧化物酶产品，实现中草药木质素的有效降解。

Description

一种重组锰过氧化物酶的制备方法及其在中草药木质素降解中的应用

技术领域

本发明属于生物饲料领域，具体涉及一种重组锰过氧化物酶的制备方法及其在中草药木质素降解中的应用。

背景技术

食品安全和大健康产业是今后的发展方向，养殖业是其重要的前提条件。近年来化学合成添加剂、抗生素和激素使得畜禽产品的品质、口感、营养及安全性备受质疑，高品质的饲料成为刚需。中华人民共和国农村农业部发布第194号公告，自2020年1月1日起，退出除中药外的所有促生长类药物饲料添加剂品种，自2020年7月1日起，饲料生产企业停止生产含有促生长类药物饲料添加剂(中药类除外)的商品饲料。中草药饲料添加剂将得到推广，畜禽饲料中添加中草药，有效发挥防病治病的效果，而且纯天然、毒副作用小、低残留、高安全性。比如，杜仲中含有丰富的绿原酸，有保胎安胎之功效；黄芪中含有丰富的黄芪多糖等，能显著提高免疫力。当下使用的中草药中有90％为植物类，而植物细胞内物质均被致密木质纤维素包裹，致使胞浆中有效成分和活性物质难以充分释放。在中草药发酵过程中加入多种纤维素酶、半纤维素酶可以降解细胞壁间组分物质，减小细胞壁、细胞间质等传质屏障作用，促进中草药有效物质向提取介质中扩散，提高活性物质的溶出率。减少煎、煮、熬、炼、蒸、浸等传统工艺中芳香类挥发油、维生素等对热敏感的活性成分的破坏，最大限度提取中草药活性成分或转化原成分，生成新组分，分解毒性物质。但是，木质素包被在纤维素的外层，这种紧密的网络结构能够阻碍酶与纤维素的接触，尤其在木本中草药中含有大量的木质素，直接影响发酵效果和有效物质的溶出率，所以中草药中木质素的降解就变得十分有必要。

合适的木质素降解方式可以提高孔隙率，扩大纤维素酶和半纤维素酶与底物之间相互作用区域。木质素的降解依靠木质素降解酶，其中重要的酶有木质素过氧化物酶(Lip)、锰过氧化物酶(MnP)、漆酶(Lac)、多功能酶(VP)以及其他协同酶。黄孢原毛平革菌Phanerochaete chrysosporium降解木质素的能力被发现以来，陆续开展了很多有关白腐真菌降解木质素的研究。白囊耙齿菌(Irpex lacteus，Genbank登录号GCA_001986395.2)，又名乳白耙齿菌，基因组分析显示Irpex lacteus有一整套木质素降解酶系统，可以产生木质素过氧化物酶、漆酶和锰过氧化物酶。其中锰过氧化物酶，既可以氧化木质素中的酚类结构单元又可以氧化非酚类的结构单元，是一种高效的木质素降解酶。但是由于真菌产酶的速度很慢，降解木质素过程中发酵时间长从而增加生产成本，限制了的工业上的应用推广。目前，市场上还没有商品化的锰过氧化物酶酶制剂，中草药提取或发酵过程中较重视纤维素酶法预处理，以木质素为突破口的工艺报道很少，尤其在发酵过程中联合多种木质素降解酶系、纤维素酶系、半纤维素酶系协同及离子、小分子物质复配促进的报道更加缺乏。

发明内容

针对上述现有技术存在的不足，本发明的目的在于克服现有中草药提取或发酵技术中的问题，提供一种重组锰过氧化物酶的制备方法及其在中草药木质纤维素降解中的应用。本发明公开的重组锰过氧化物酶的制备方法可以快速地获取大量锰过氧化物酶产物，实现锰过氧化物酶的工业化生产，获得良好稳定的锰过氧化物酶酶制剂，用于木质素的降解，尤其对木本中草药中木质纤维素的降解具有较好的降解效率。

为实现上述发明目的，本发明采取的技术方案为：

(1)将来源于Irpex lacteus的锰过氧化物酶基因序列根据粟酒裂殖酵母密码子偏爱性进行优化，得到编码锰过氧化物酶的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)以步骤(1)中所述的编码锰过氧化物酶的基因为模板，进行PCR扩增，与穿梭质粒载体pREP连接后转化到大肠杆菌感受态细胞中，抽提获得重组穿梭质粒后，利用电转化法导入到缺陷型粟酒裂殖酵母感受态细胞中，得到重组锰过氧化物酶酵母工程菌，即S.pombe-pREP-mnp；

(3)培养步骤(2)中所述的重组锰过氧化物酶酵母工程菌收集菌液，所述菌液中包含重组酵母工程菌胞外分泌的锰过氧化物酶；得到的菌液以不同的方式制备保存、备用；

优选的，步骤(2)中所述重组穿梭质粒为pREP-mnp。

优选的，步骤(2)中所述的大肠杆菌是6-磷酸葡萄糖胺合成酶缺陷型大肠杆菌；需要在含有葡萄糖胺的培养基中生长，无抗性基因，具有生物安全性。

优选的，步骤(2)中所述的缺陷型粟酒裂殖酵母是6-磷酸果糖氨基转移酶缺陷型粟酒裂殖酵母；需要在含有葡萄糖胺的培养基中生长，具有生物安全性的食品级酵母菌。

优选的，步骤(3)中所述菌液以不同的方式制备保存为：直接保存菌液、或菌液固液分离后保存液体部分(即粗酶液)、或由粗酶液制备的浓缩制剂和粉制剂进行保存；所述的固液分离的方式包括高速碟式离心机或板框过滤。

重组锰过氧化物酶用于降解木本中草药木质素的用途：

取步骤(3)制备的菌液或菌液分离后的粗酶液与中草药混合，并添加CaCl₂、MnSO₄、漆酶、葡萄糖氧化酶、复合酶系和小分子物质激活剂进行多酶协同酶解反应，降解木本中草药木质素。

优选的，所述的粗酶液的适宜反应温度为20～50℃，适宜pH为2.0～5.0。

优选的，所述中草药与菌液或粗酶液的质量比为(1～5):1。

优选的，所述菌液或粗酶液中锰过氧化物酶的酶活力为15～20U/L。

优选的，所述CaCl₂的用量为中草药质量的0.1％～2％；所述MnSO₄的用量为中草药质量的0.1％～0.9％，葡萄糖氧化酶的用量为中草药质量的0.2％～1％，漆酶的用量为中草药质量的0.1％～2％，复合酶系的用量为中草药质量的0.1％～5％。

优选的，所述复合酶系由酸性纤维素酶、纤维二糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、果胶酶和β-葡聚糖酶组成。

所述酸性纤维素酶、纤维二糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、果胶酶和β-葡聚糖酶质量比为2:2:2:2:1:1；所述酸性纤维素酶的酶活为10 000U/g，纤维二糖酶的酶活为10000U/g，甘露聚糖酶的酶活为10 000U/g，木聚糖酶的酶活为180 000U/g，果胶酶的酶活为50 000 U/g，β-葡聚糖酶的酶活为50 000U/g。

优选的，所述小分子物质激活剂由草酸和Tween-80组成；菌液或粗酶液中草酸终浓度0.2～1mM；复配0.02％Tween-80，即Tween-80的用量为中草药质量的0.02％。

优选的，所述酶解反应的温度为30～40℃，酶解时间为5～72h。

优选的，所述菌液或粗酶液与中草药混合，其中中草药具体为中草药干粉。

优选的，所述中草药具体为黄芪或杜仲。

本发明制备的锰过氧化物酶浓缩制剂可应用于新鲜中草药湿料，具体步骤如下：

将重组锰过氧化物酶酵母工程菌置于发酵罐中培养，得到菌液后，通过高速碟式离心机固液分离后收集液体部分，即为粗酶液，再通过超滤浓缩-乙醇沉淀，收集乙醇沉淀后的蛋白，晾干后得到锰过氧化物酶浓缩剂。

优选的，所述的发酵罐为瑞典比欧3.7L微型发酵罐；发酵温度为30℃，转速为220rpm，时间为48～72h；所述离心的条件为3 000rpm，10min。

优选的，所述的超滤浓缩是粗酶液通过30kDa截留分子量的平板式超滤膜超滤分离，得到截留液；超滤时进口压力0.4MPa，出口压力0.5MPa，流速1.1～1.2L/h。

优选的，所述乙醇沉淀时乙醇与水的体积比为70％～90％。

优选的，锰过氧化物酶浓缩剂使用时，先按10～20％的体积分数溶于醋酸缓冲液(pH3.5)中。

优选的，所述的锰过氧化物酶浓缩制剂直接应用于新鲜中草药打浆后的湿料中，实现木质素的降解。

本发明制备的锰过氧化物酶粉制剂可应用于新鲜中草药湿料，具体步骤如下：

将重组锰过氧化物酶酵母工程菌置于发酵罐中培养，得到菌液后，通过高速碟式离心机固液分离后收集液体部分，即为粗酶液，再通过超滤浓缩-喷雾干燥，干燥后得到锰过氧化物酶粉制剂。

优选的，所述超滤液经喷雾干燥，选用麦芽糊精作为喷雾干燥时锰过氧化物酶的保护剂；所述喷雾的条件为：进风温度90-110℃，固形物含量3～15％。

优选的，所述锰过氧化物酶粉制剂使用时，按0.5～5％的质量分数添加至新鲜中草药打浆后的湿料中，实现木质素的降解。

本发明的有益效果是：

(1)本发明提供一种具有生物安全性食品级重组锰过氧化物酶酵母工程菌，可以快速地获取大量锰过氧化物酶，实现锰过氧化物酶的工业化生产，获得良好稳定的过氧化物酶产品，用于木质素的降解，尤其对木本中草药中木质素的降解具有较好的降解效率。

(2)本发明制备的锰过氧化物酶具有更为优良的耐酸性能；大量实验表明其联合CaCl₂、MnSO₄共同降解木质素时可以显著提高木质素的降解率，另外与葡萄糖氧化酶、漆酶、复合酶系和小分子物质激活剂等协同降解木质素时，显著提高对木质素的降解率，可以促进木本中草药中有效成分的释放，进一步提高中草药饲料的品质或中草药提取的效率。

(3)本发明所提供的制备方法成本低、工艺简单，解决了锰过氧化物酶不能大批量工业化生产的技术问题，具有广阔的工业化应用前景。

附图说明

图1是锰过氧化物酶基因的原始序列和密码子优化后序列比对。

图2是载体和目标基因PCR产物片段电泳图。

图3是构建的穿梭质粒pREP-mnp在粟酒裂殖酵母中表达分泌的胞外蛋白表达图。

具体实施方式

以下实施例中进一步定义本发明，根据以上的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种修改和改变，以使其使用各种用途和条件。下述实施例中所使用的实验原料如无特殊说明，均可通过商业途径得到；除特殊注明外，本发明所采用的均为该领域现有技术。

实施例1：

将NCBI中Irpex lacteus的锰过氧化物酶基因序列(GenBank:MH120207.1)，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；根据粟酒裂殖酵母中密码子偏爱性，需要对基因序列进行优化，密码子优化方法为：通过Graphical Codon Usage Analyser(http://gcua.schoedl.de/)在线系统，分析锰过氧化物酶(MnP)基因中密码子的使用频率，从而选择适合粟酒裂殖酵母的转录翻译系统的密码子。图1是锰过氧化物酶基因的原始序列和密码子优化后序列比对图，密码子优化后的重组MnP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

以酵母常用载体pREP为模版，设计引物扩增目的基因序列，正向引物序列如SEQID NO.3所示，反向引物序列如SEQ ID NO.4所示；进行PCR扩增目的基因片段(94℃30s， 60℃30s，72℃1min，30个循环)。同时，以载体pREP为模版设计引物，正向引物序列如SEQ IDNO.5所示，反向引物序列如SEQ ID NO.6所示；进行PCR扩增载体线性片段(98℃10s，60℃15s，72℃50s，30个循环)。割胶回收片段并纯化测定浓度。图2是载体和目的基因的PCR产物片段电泳图；按ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit 试剂盒连接的要求将优化后的MnP基因线性片段与pREP载体片段混合，37℃连接30min。将连接液转化6-磷酸葡萄糖胺合成酶缺陷型大肠杆菌中，在LB固体培养基(不含葡萄糖胺)上筛选，挑取转化子，提质粒送生物公司测序，以便确定是否正向插入和有无突变。将正向插入的未发生碱基突变的质粒命名为pREP-mnp，通过电转化法导入6-磷酸果糖氨基转移酶缺陷型粟酒裂殖酵母中，在YES固体培养基(不含葡萄糖胺)上筛选转化子，提取基因组后通过特异性引物，正向特异性引物序列如SEQ ID NO.7所示，反向特异性引物序列如 SEQ ID NO.8所示，进行菌落PCR(94℃30s，60℃30s，72℃1min，30个循环)验证正确后得到重组锰过氧化物酶酵母工程菌，即S.pombe-pREP-mnp，保存备用。

实施例2：

重组锰过氧化物酶的表达验证；

沾取-80℃中保存的S.pombe-pREP-mnp和对照组S.pombe-pREP菌液，平板划线，30℃恒温培养箱静止生长3天；分别挑取培养皿上大小均匀的单菌落接入50mL螺口尖底离心管中，管中YES培养液5mL，200rpm，30℃恒温震荡培养。待酵母培养至平台期，收集50mL的酵母细胞，8 000rpm高速离心，分四次取12mL上清培养液转移到蛋白浓缩住中浓缩胞外分泌蛋白；浓缩至最小量后，分两次加入12mL 20mM Tris-HCl(pH 7.0)清洗胞外分泌蛋白，除去上清培养液中的糖、离子和其他杂质；经SDS-PAGE电泳分析，实验组和对照相比有特异条带，锰过氧化物酶基因在粟酒裂殖酵母中表达的蛋白表观分子量约为43kDa。以每升培养液每分钟氧化1nmol愈创木酚所需的酶量为一个酶活力单位。测定发现，重组MnP的酶活力为17.46U/L。图3是构建的穿梭质粒pREP-mnp在粟酒裂殖酵母中表达分泌的胞外蛋白表达图。

实施例3：

称取中草药杜仲和黄芪，本实施例探讨重组MnP酶在不同的料液比、酶解时间、加酶量下对木质素的降解效果；培养重组锰过氧化物酶酵母工程菌的菌液经固液分离得到液体部分即为粗酶液；将粗酶液分别按一定的比例与杜仲、黄芪混合，放置40℃恒温恒湿培养箱中酶解反应24h，105℃烘干至衡重，用Van Soest法通过FIWE3/6纤维测定仪测定木质素的含量变化。

(1)料液比对木质素降解的影响；

按10:1、5:1、2:1、1:1、0.5:1的料液比分别称取不同质量的杜仲和黄芪与粗酶液混合，放置40℃恒温恒湿培养箱中酶解反应24h，105℃烘干至衡重。表1是不同料液比的降解率对比图。

表1.不同料液比的降解率对比图

由表1可见，重组MnP酶的粗酶液对杜仲、黄芪中的木质素均有较为优异的降解效果，其降解性能明显高于对木质素的降解率，尤其，当料液比为1:1时，杜仲和黄芪的木质素降解效率均为最好。

(2)CaCl₂的添加量对木质素降解的影响

称取杜仲、黄芪各5份，每份各1g，前4份每份按料液比1:1加入粗酶液，再加入CaCl₂，用量分别为杜仲或黄芪质量的0.1％、0.5％、1％和2％，第五份单独添加草药质量0.1％的CaCl₂作为对照，酶解条件和测定方法同上。

表2.不同CaCl₂添加量的降解率对比图

由表2可见，CaCl₂单独作用时，木质素几乎无降解效果，当协同重组MnP酶的粗酶液对杜仲、黄芪中的木质素均有明显的降解效果，杜仲和黄芪的木质素降解率可到达约50％。说明CaCl₂对重组MnP酶活力是有激活作用的，尤其，当CaCl₂的添加量为0.5％时，杜仲和黄芪的木质素降解效率均为最好。当CaCl₂添加量上升时，木质素的降解率仍然较高。

(3)MnSO₄的添加量对木质素降解的影响

称取杜仲、黄芪各6份，每份各1g，前5份每份按料液比1:1加入粗酶液，再加入MnSO₄，其用量分别为杜仲或黄芪质量的0.1％、0.3％、0.5％、0.7％和0.9％，第六份单独添加0.1％的MnSO₄作为对照，酶解条件和测定方法同上。

表3.不同MnSO₄添加量的降解率对比图

从表3可见，MnSO₄单独作用时，木质素几乎无降解效果，当MnSO₄协同重组MnP 酶的粗酶液对杜仲、黄芪中的木质素均有促进杜仲和黄芪的木质素降解的效果，因为重组 MnP是锰离子依赖的过氧化物酶。尤其，当MnSO₄的添加量为0.5％时，杜仲和黄芪的木质素降解效率均为最好，当MnSO₄离子添加量升高时，木质素降解率趋于平缓，因此添加 0.5％的MnSO₄效果最佳。

(4)葡萄糖氧化酶的添加量对木质素降解的影响

称取杜仲、黄芪各6份，每份各1g，前5份每份按料液比1:1加入粗酶液，再加入葡萄糖氧化酶，其用量分别为杜仲或黄芪质量的0.2％、0.4％、0.6％、0.8％和1％，第六份单独添加0.2％的葡萄糖氧化酶作为对照，酶解条件和测定方法同上。表4是不同葡萄糖氧化酶添加量的降解率对比图。

表4.不同葡萄糖氧化酶添加量的降解率对比图

从表4可见，当葡萄糖氧化酶添加量为0.4％时，杜仲和黄芪的木质素降解效率均为最好，葡萄糖氧化酶消耗氧原子可以生成H₂O₂，重组酶MnP是过氧化物酶，因此对重组酶酶活力是有促进作用的，因此可以促进木质素降解。添加0.4％的葡萄糖氧化酶效果最佳。

(5)漆酶的添加量对木质素降解的影响

称取杜仲、黄芪各6份，每份各1g，前5份中每份按料液比1:1加入粗酶液；再加入漆酶，其用量分别为杜仲或黄芪质量的0.1％、0.5％、1％和2％，第六份单独添加1％的漆酶系作为对照，酶解条件和测定方法同上。表5是不同漆酶添加量的降解率对比图。

表5.不同漆酶添加量的降解率对比图

从表5可见，杜仲和黄芪的木质素的降解率随漆酶的添加量增加而增加，这是因为漆酶也是木质素降解酶，协同重组酶MnP作用后，效果更佳。在漆酶添加量达到0.5％后，木质素的降解率缓慢增加，考虑到经济因素，选择添加0.5％的漆酶较好，即可以实现杜仲黄芪的木质素降解，又可以降低经济开支。

(6)与复合酶系共同作用对木质素降解的影响

称取杜仲、黄芪各6份，每份1g，前5份中每份按料液1:1加入粗酶液，然后再加入复合酶系，其用量分别为杜仲或黄芪质量的0％、0.1％、0.5％、1％和5％(复合酶系为质量比例为2:2:2:2:1:1的酸性纤维素酶、纤维二糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、果胶酶与β- 葡聚糖酶混合组成)，第六份单独添加0.1％的复合酶系作为对照，酶解条件和测定方法同上。表6是不同复合酶系浓度的降解率对比图。

表6.不同复合酶系浓度的降解率对比图

由表6可见，随着复合酶系浓度的增加，杜仲以及黄芪中的木质素的降解率均有明显的提高，重组MnP酶可以与现有的混合酶系共同作用于杜仲、黄芪等中草药植物中木质素、纤维素及半纤维素的降解，具有显著的协同增效作用。可以从实际出发，综合考虑经济和效果选择重组MnP酶与1％复合酶系的添加比例。

(7)称取杜仲、黄芪各4份，每份各1g，每份按料液比1:1加入粗酶液，再分别加入不同终浓度(0.2、0.5、1、2mM)的草酸和用量为杜仲或黄芪质量的0.02％的Tween-80，酶解条件和测定方法同上。表7是不同小分子激活剂的降解率对比图。

表7.不同小分子激活剂的降解率对比图

从表7分析，添加0.2～1mM终浓度的草酸，并复配用量为杜仲或黄芪质量的0.02％的Tween-80，木质素降解率呈增长的趋势；当草酸的浓度为0.5mM时，木质素降解效果最好，故选择0.5mM浓度的草酸，复配用量为杜仲或黄芪质量的0.02％的Tween-80作为小分子物质激活剂。

(8)不同酶解时间对木质素降解的影响

称取杜仲、黄芪3份，每份3g，分别按料液1:1加入粗酶液和浓度为0.1％的复合酶系，分别设定12h、24h、48h、72h取样，测定方法同上。表8是不同酶解时间后的降解率对比图。

表8.不同酶解时间后的降解率对比图

由表8可见，在12h-48h中，木质素是迅速的，当酶解时间达到72h时，木质素的降解较48h时变化值不大，降解率增幅缓慢。因此，当酶解时间为12-48h时，具有较优的降解率。

实施例4：

称取杜仲、黄芪各1g，按料液比1:1加入粗酶液，按杜仲、黄芪的质量分数分别添加0.5％CaCl₂和0.5％MnSO₄固态发酵，0.4％的葡萄糖氧化酶、0.5％的漆酶、1％复合酶系、并添加终浓度0.5mM草酸和用量为杜仲或黄芪质量的0.02％的Tween-80作为复配小分子激活剂，混合均匀40℃酶解24h后，测定杜仲和黄芪木质素、纤维素和半纤维素的变化。表9为杜仲和黄芪木质纤维素酶解前后成分变化。

表9.杜仲和黄芪木质纤维素酶解前后成分变化

从表9分析，杜仲和黄芪中木质素的降解效果明显，木质素降解率分别达到54.41％和 53.40％；纤维素降解率分别为28.91％和26.49％；半纤维素降解率分别为23.57％和37.07％，木质纤维素有明显的降解效果。

实施例5：

制作锰过氧化物酶浓缩制剂和粉制剂：本发明利用乙醇沉淀蛋白法提取粟酒裂殖酵母胞外分泌的锰过氧化物酶以制备酶制剂粗成品，可以应用于中草药的木质素降解或直接添加于新鲜中草药的切割打浆过程中。不仅快速降解木质纤维素，同时可以保护中草药中的抗氧化物质、水溶性维生素。

(1)本实施例使用瑞典比欧3.7L微型发酵罐进行发酵，发酵条件为30℃，220rpm，发酵72h后放罐，通过高速碟式离心机3 000rpm、10min固液分离，取液体部分即为粗酶液；

(2)将步骤(1)中的粗酶液通过30kDa截留分子量的平板式超滤膜超滤分离，超滤至原粗酶液原体积的5～10％时；添加柠檬酸缓冲液至原粗酶液原体积的50％，继续超滤至原粗酶液原体积的3-5％，除去粗酶液中的糖分、杂质和部分色素。收集超滤后的截留液，超滤时进口压力0.4～0.5MPa，出口压力0.5～0.6MPa，流速1.1～1.2L/h。

(3)将截留液与无水乙醇4摄氏度预冷；

(4)调pH至目的蛋白的等电点(4.39)，在磁力搅拌器的搅拌下缓缓加入冰冷的乙醇, 乙醇终浓度为70％；

(5)4℃静置30min后,3 000rpm，10min离心，弃上清后晾干沉淀，沉淀物低温备用，得到锰过氧化物酶浓缩剂；

(6)将步骤2中的截留液，进行喷雾干燥，选用麦芽糊精作为喷雾干燥时锰过氧化物酶的保护剂，喷雾条件为进风温度90-110℃，固形物含量8-15％，在此条件下，最大锰过氧化物酶回收率为75.2％；

(7)锰过氧化物酶浓缩剂或干燥后获得锰过氧化物酶酶制剂粉剂，可以优先用于新鲜打浆的潮湿中草药。

说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。

本发明涉及序列如下：

1.SEQ ID NO.1

2.SEQ ID NO.2

3.SEQ ID NO.3

人工序列：5’-GCGTCGTATCCGCTCAGTTTATGGTGCGTCGTGTTACCTGC-3’；

4.SEQ ID NO.4

人工序列：5’-TCCTTTTACCCCCCGGATCCTTAGCTCGGCGGAACCGG-3’；

5.SEQ ID NO.5

人工序列：5’-GGATCCGGGGGGTAAAAGG-3’

6.SEQ ID NO.6

人工序列：5’-AAACTGAGCGGATACGACGC-3’

7.SEQ ID NO.7

人工序列：5’-ACCTGTTTGACAACGGCCAGT-3’

8.SEQ ID NO.8

人工序列：5’-TTTGAAACGCCGCCTTGAACG-3’

序列表

<110> 浙江康星生物科技有限公司

<120> 一种重组锰过氧化物酶的制备方法及其在中草药木质素降解中的应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1035

<212> DNA

<213> 白囊耙齿菌(Irpex lacteus)

<400> 1

atggtgcgtc gtgttacctg cccggacggt gtgaacaccg cgaccaacgc ggcgtgctgc 60

agcctgtttg cggttcgtga cgatatccag caaaacctgt ttgacaacgg ccagtgcggc 120

gaggatgtgc acgaaagctt ccgtctgagc tttcacgacg cgatcggcat tagcccgaag 180

attgcggcga ccggtcaatt tggtggcggt ggcgcggatg gcagcatcat tctgttcgag 240

gaaattgaga ccaactttca cgcgaacatc ggtgtggacg agattgttga tgaacagaaa 300

ccgtttatcg cgcgtcacaa cattaccccg ggcgacttca tccaatttgc ggcggcggtg 360

ggcgttagca actgcccggg tgcgccgcgt ctggacttct ttctgggtcg tccggcggcg 420

acccagccgg cgccggataa gaccgtgccg gagccgttcg acaccgttga taccattctg 480

gaacgtttcg cggatgcggg taactttacc ccggcggaag tggttgcgct gctggttagc 540

cacaccattg cggcggcgga cgaagttgat ccgaccattc cgggtacccc gtttgacagc 600

accccggaag tgtttgatag ccagttcttt gttgaaaccc aactgcgtgg taccggtttt 660

ccgggtaccg cgggtaacca aggtgaggtg gaaagcccgc tggcgggtga actgcgtctg 720

caaagcgaca gcgaactggc gcgtgatgcg cgtaccgcgt gcgagtggca gagctttgtt 780

ggtaaccagc aaaagatcca gaccgcgttc aaggcggcgt ttcaaaaaat ggcggtgctg 840

ggcgttgaca ccagcaaaat ggtggattgc agcgagctga tcccggttcc gccggaactg 900

aagattaccg cggcgcactt cccggcgggt aaaaccaacg cggacgttga acaagcgtgc 960

gcgagcaccc cgtttccgac cctgagcacc gatccgggtc cggcgaccag cgtggcgccg 1020

gttccgccga gctaa 1035

<210> 2

<211> 344

<212> PRT

<213> 白囊耙齿菌(Irpex lacteus)

<400> 2

Met Val Arg Arg Val Thr Cys Pro Asp Gly Val Asn Thr Ala Thr Asn

1 5 10 15

Ala Ala Cys Cys Ser Leu Phe Ala Val Arg Asp Asp Ile Gln Gln Asn

20 25 30

Leu Phe Asp Asn Gly Gln Cys Gly Glu Asp Val His Glu Ser Phe Arg

35 40 45

Leu Ser Phe His Asp Ala Ile Gly Ile Ser Pro Lys Ile Ala Ala Thr

50 55 60

Gly Gln Phe Gly Gly Gly Gly Ala Asp Gly Ser Ile Ile Leu Phe Glu

65 70 75 80

Glu Ile Glu Thr Asn Phe His Ala Asn Ile Gly Val Asp Glu Ile Val

85 90 95

Asp Glu Gln Lys Pro Phe Ile Ala Arg His Asn Ile Thr Pro Gly Asp

100 105 110

Phe Ile Gln Phe Ala Ala Ala Val Gly Val Ser Asn Cys Pro Gly Ala

115 120 125

Pro Arg Leu Asp Phe Phe Leu Gly Arg Pro Ala Ala Thr Gln Pro Ala

130 135 140

Pro Asp Lys Thr Val Pro Glu Pro Phe Asp Thr Val Asp Thr Ile Leu

145 150 155 160

Glu Arg Phe Ala Asp Ala Gly Asn Phe Thr Pro Ala Glu Val Val Ala

165 170 175

Leu Leu Val Ser His Thr Ile Ala Ala Ala Asp Glu Val Asp Pro Thr

180 185 190

Ile Pro Gly Thr Pro Phe Asp Ser Thr Pro Glu Val Phe Asp Ser Gln

195 200 205

Phe Phe Val Glu Thr Gln Leu Arg Gly Thr Gly Phe Pro Gly Thr Ala

210 215 220

Gly Asn Gln Gly Glu Val Glu Ser Pro Leu Ala Gly Glu Leu Arg Leu

225 230 235 240

Gln Ser Asp Ser Glu Leu Ala Arg Asp Ala Arg Thr Ala Cys Glu Trp

245 250 255

Gln Ser Phe Val Gly Asn Gln Gln Lys Ile Gln Thr Ala Phe Lys Ala

260 265 270

Ala Phe Gln Lys Met Ala Val Leu Gly Val Asp Thr Ser Lys Met Val

275 280 285

Asp Cys Ser Glu Leu Ile Pro Val Pro Pro Glu Leu Lys Ile Thr Ala

290 295 300

Ala His Phe Pro Ala Gly Lys Thr Asn Ala Asp Val Glu Gln Ala Cys

305 310 315 320

Ala Ser Thr Pro Phe Pro Thr Leu Ser Thr Asp Pro Gly Pro Ala Thr

325 330 335

Ser Val Ala Pro Val Pro Pro Ser

340

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcgtcgtatc cgctcagttt atggtgcgtc gtgttacctg c 41

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tccttttacc ccccggatcc ttagctcggc ggaaccgg 38

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggatccgggg ggtaaaagg 19

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aaactgagcg gatacgacgc 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

acctgtttga caacggccag t 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tttgaaacgc cgccttgaac g 21

Claims

1.一种重组锰过氧化物酶的制备方法，其特征在于，步骤如下：

(1)将来源于Irpex lacteus的锰过氧化物酶基因序列根据粟酒裂殖酵母密码子偏爱性进行优化，得到编码锰过氧化物酶的基因；

(3)培养步骤(2)中所述的重组锰过氧化物酶酵母工程菌收集菌液，所述菌液中包含重组酵母工程菌胞外分泌的锰过氧化物酶；得到的菌液以不同的方式制备保存、备用。

2.根据权利要求1所述的重组锰过氧化物酶的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述重组穿梭质粒为pREP-mnp；所述的大肠杆菌是6-磷酸葡萄糖胺合成酶缺陷型大肠杆菌。

3.根据权利要求1所述的重组锰过氧化物酶的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的缺陷型粟酒裂殖酵母是6-磷酸果糖氨基转移酶缺陷型粟酒裂殖酵母。

4.根据权利要求1所述的重组锰过氧化物酶的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述菌液以不同的方式制备保存为：直接保存菌液或菌液固液分离后保存液体部分，即粗酶液；或由粗酶液制备成浓缩制剂和粉制剂进行保存。

5.根据权利要求1～4任意一项所述的方法制备的重组锰过氧化物酶用于降解中草药木质素的用途，其特征在于，步骤如下：取菌液或菌液分离后的粗酶液与中草药混合，并添加CaCl₂、MnSO₄、漆酶、葡萄糖氧化酶、复合酶系和小分子物质激活剂进行多酶协同酶解反应，实现中草药木质素的降解；所述复合酶系由酸性纤维素酶、纤维二糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、果胶酶和β-葡聚糖酶组成。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述中草药与菌液或粗酶液的质量比为(1～5):1；所述菌液或粗酶液中锰过氧化物酶的酶活力为15～20U/L。

7.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述CaCl₂的用量为中草药质量的0.1％～2％；所述MnSO₄的用量为中草药质量的0.1％～0.9％，葡萄糖氧化酶的用量为中草药质量的0.2％～1％，漆酶的用量为中草药质量的0.1％～2％，复合酶系的用量为中草药质量的0.1％～5％。

8.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述酸性纤维素酶、纤维二糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、果胶酶和β-葡聚糖酶质量比为2:2:2:2:1:1；所述酸性纤维素酶的酶活为10000U/g，纤维二糖酶的酶活为10 000U/g，甘露聚糖酶的酶活为10 000U/g，木聚糖酶的酶活为180 000U/g，果胶酶的酶活为50 000U/g，β-葡聚糖酶的酶活为50 000U/g。

9.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述小分子物质激活剂由草酸和Tween-80组成；菌液或粗酶液中草酸终浓度0.2～1mM；复配0.02％Tween-80，即Tween-80的用量为中草药质量的0.02％；所述酶解反应的温度为30～40℃，酶解时间为5～72h。

10.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述中草药具体为黄芪或杜仲。