CN114075520A

CN114075520A - 一种产γ-聚谷氨酸的贝莱斯芽孢杆菌及其固体发酵生产γ-聚谷氨酸的方法

Info

Publication number: CN114075520A
Application number: CN202010836148.4A
Authority: CN
Inventors: 闫巧娟; 刘宏; 江正强; 骆珅; 杨绍青
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2020-08-19
Filing date: 2020-08-19
Publication date: 2022-02-22
Anticipated expiration: 2040-08-19
Also published as: CN114075520B

Abstract

本发明公开了一种产γ‑聚谷氨酸的贝莱斯芽孢杆菌及其固体发酵生产γ‑聚谷氨酸的方法。本发明提供了贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CAU263，其在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为CGMCC No.20318。本发明所提供的贝莱斯芽孢杆菌CAU263固体发酵法生产γ‑聚谷氨酸，发酵培养48h可使γ‑聚谷氨酸的产量达到152.1g/kg DW，且生产的γ‑聚谷氨酸分子量达到4020kDa，同时也产纳豆激酶280FU/g DW。本发明具有很好的工业化应用前景。特别是其中贝莱斯芽孢杆菌CAU263为天然菌株，还有可能进一步改造提升产量，具有很大的应用价值和工业化潜力。

Description

一种产γ-聚谷氨酸的贝莱斯芽孢杆菌及其固体发酵生产γ- 聚谷氨酸的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种产γ-聚谷氨酸的贝莱斯芽孢杆菌及其固体发酵生产γ-聚谷氨酸的方法。

背景技术

γ-聚谷氨酸(Poly-γ-glutamic acid,γ-PGA)是一种由D-谷氨酸和L-谷氨酸单体按照不同比例通过α-氨基和γ-羧基之间的γ-酰胺键聚合而成的聚氨基酸类环保型多功能生物可降解高分子阴离子多肽型聚合物(Hsueh et al.Poly-γ-glutamic acidsynthesis,gene regulation,phylogenetic relationships,and role infermentation.International Journal of Molecular Sciences,2017,18(12):2644)，通常由500～5000个谷氨酸单体组成，分子量为10kDa～10000kDa(Luo et al.Microbialsynthesis of poly-γ-glutamic acid:current progress,challenges,and futureperspectives.Biotechnology for Biofuels,2016,9:134)。γ-PGA的分子链上有大量的活性较高的游离侧链羧基，可在分子内部或分子间形成氢键，具有极佳的水溶性、生物可降解性、金属螯合性、生物相容性等。γ-PGA具有多功能性，所以备受人们的关注，也成为研究热点。γ-PGA应用领域广泛，包括农业、医药、环保、食品和化妆品等(Cao et al.Geneticand metabolic engineering for microbial production of poly-γ-glutamicacid.Biotechnology Advances,2018,36(5):1424-1433)。

自1937年Ivanovic和Bruckner等从炭疽芽孢杆菌中发现γ-PGA以来，γ-PGA的相关研究相继展开(Ogunleye et al.Poly-γ-glutamic acid:production,properties andapplications.Microbiology,2015,161:1-17)。γ-PGA的制备方法有化学合成法、提取法和微生物发酵法。微生物发酵法生产成本低、生产过程对环境污染小、产量高且合成的γ-PGA性能更加优良，受到各行各业更广泛的关注，所以主要采用微生物发酵法生产γ-PGA。目前已知产γ-PGA的菌株大多是芽孢杆菌属，主要包括枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)。其中枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌γ-PGA产量较高，近年来研究最多(Halmschlag et al.Tailor-made poly-γ-glutamic acid production.Metabolic Engineering,2019,55:239-248)。关于贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)产γ-PGA的研究仅有两篇文献报道。Zhu等(Zhu etal.Optimization ofγ-poly glutamic acid synthesis using response surfacemethodology of a newly isolated glutamate dependent Bacillus velezensisZ3.International Microbiology,2018,21(3):143-152)从土壤中分离得到一株贝莱斯芽孢杆菌Z3，通过对液体发酵培养基中谷氨酸钠、葡萄糖、酵母提取物和NaH₂PO₄的添加量进行优化，在250mL摇瓶中发酵65h后γ-PGA产量仅为5.58g/L。Moraes等(Moraes etal.Optimisation of poly(γ-glutamic acid)production by Bacillus velezensisNRRL B-23189in liquid fermentation with molasses as the carbon source withoutaddition of glutamic acid.International Review of Chemical Engineering,2012,4:618-623)利用贝莱斯芽孢杆菌NRRL-23189液体发酵生产γ-PGA，以糖蜜作为碳源，对糖蜜、柠檬酸和硫酸铵的添加量进行优化，在250mL摇瓶中发酵72h后γ-PGA产量仅达到4.82g/L。现已报道贝莱斯芽孢杆菌采用液体发酵生产γ-PGA文献中，γ-PGA的发酵周期长且产量很低，不利于γ-PGA大规模工业化生产及对其的广泛应用。

微生物发酵法包括固体发酵和液体发酵。目前，国内外对γ-PGA的发酵生产工艺进行了广泛的研究，主要以微生物液体深层发酵生产为主，其优势在于发酵过程产率稳定、产物分子量可调控，从而得到相对分子量适宜和纯度较高的γ-PGA。但随着发酵的进行，发酵液粘度增大；发酵过程中产生大量泡沫，使发酵过程控制难度增加且易染菌；原料及加工成本高，大大增加了γ-PGA的生产成本且液体γ-PGA存储困难。相比较于液体发酵，固体发酵具有生产成本低、能源资源消耗少、污染小、产量高、存储方便、设备要求简单等优势。另外，固体发酵还可以利用工农业废弃物作为发酵基质，这种发酵方式不仅提高产品的生产效率，而且可以提高产品的附加值，实现社会效益和经济效益的双赢，是一种值得发展的生产模式。

中国发明专利(申请号：CN201710158450.7)公开了一种枯草芽孢杆菌KH2及其在生产γ-PGA中的应用，经7L发酵罐液体发酵48h，γ-PGA的产量为46g/L；中国发明专利(专利号：ZL201610705083.3)公开了一株解淀粉芽孢杆菌NX-2S及其在联产细菌纤维素γ-PGA中的应用，在7L发酵罐中发酵72h，γ-PGA浓度达到42g/L。中国发明专利(申请号：CN201711170540.4)公开了一种利用地衣芽孢杆菌TKPG091生产γ-PGA的方法，在20L发酵罐中发酵72h，γ-PGA产量为26g/L。目前关于国内贝莱斯芽孢杆菌生产γ-PGA的专利有两项。中国发明专利(申请号：CN201710623261.2)公开了一株可耐受高浓度谷氨酸钠和葡萄糖产γ-PGA的贝莱斯芽孢杆菌Z3，谷氨酸钠添加量为250g/L，葡萄糖添加量为40g/L时，经摇瓶液体发酵65h，γ-PGA的产量仅为6.32g/L。中国发明专利(申请号：CN201910305450.4)公开了一株贝莱斯芽孢杆菌PG1-2及其液体发酵生产γ-PGA的方法，在50L发酵罐中发酵72h后γ-PGA的产量为42.6g/L。可见，已公开的贝莱斯芽孢杆菌液体发酵生产γ-PGA的专利中，同样存在γ-PGA发酵周期长且产量低的问题。

中国发明专利(专利号：ZL200510091813.7)公开了一种利用农副产品固体发酵低成本生产γ-PGA的方法，将产γ-PGA的微生物菌种接种至以黄豆饼粉和麸皮为固体发酵基质的固体培养基中，250mL三角瓶中发酵30h，γ-PGA产量达到121g/kg。中国发明专利(专利号：ZL201510081839.7)公开了一种利用食用菌菌渣固体发酵产γ-PGA的方法，利用枯草芽孢杆菌PG-8作为生产菌株，以味精粕和食用菌菌渣包括平菇菌渣、金针菇菌渣，香菇菌渣混合作为固体发酵基质，5L抽滤瓶中发酵56h，γ-PGA产量达到168g/kg。中国发明专利(申请号：CN201910501148.6)公开了一种利用酱油渣固体发酵生产γ-PGA的方法，利用酱油渣和麸皮作为固体发酵基质，接种地衣芽孢杆菌固体发酵5d，γ-PGA产量为52.14g/kg。以上固体发酵生产γ-PGA，表现出了许多优势，但仍存在生产周期较长、产量较低等问题。

目前国内外尚未见到关于利用贝莱斯芽孢杆菌固体发酵生产γ-PGA的文献报道和专利。

发明内容

本发明首次提供了一种高产γ-PGA的贝莱斯芽孢杆菌CAU263及其快速固体发酵生产γ-PGA的方法。

第一方面，本发明要求保护一种贝莱斯芽孢杆菌。

本发明所要求保护的贝莱斯芽孢杆菌具体为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)CAU263，其在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为CGMCCNo.20318)

该菌株分离自发酵食品豆豉。

该菌株在LB固体培养基上于37℃下静置培养12～24h，菌落呈圆形，表面和边缘均光滑、湿润、黏稠、白色半透明状。

该菌株为革兰氏阳性菌，菌体为短小杆状，两端钝圆。

该菌株的16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

第二方面，本发明要求保护一种菌剂。

本发明所要求保护的菌剂，其活性成分为前文所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)CAU263。

所述菌剂中除了含有作为活性成分的所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)CAU263外，还含有辅料。所述辅料可根据需要选择。

第三方面，本发明要求保护前文所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CAU263或前文所述的菌剂在生产γ-聚谷氨酸中的应用。

第四方面，本发明要求保护一种生产γ-聚谷氨酸的方法。

本发明所要求保护的生产γ-聚谷氨酸的方法，可包括如下步骤：对前文所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CAU263进行固体发酵培养，从发酵产物中获得γ-聚谷氨酸。

进一步地，对所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CAU263进行所述固体发酵培养时，采用的固体发酵培养基由固体基质和外源添加物组成，所述固体基质可为工农业副产物，所述外源添加物由碳源、谷氨酸钠、K₂HPO₄和水组成。

更进一步地，在所述固体发酵培养基中，所述工农业副产物、所述碳源、谷氨酸钠、K₂HPO₄和水的配比可为1kg：50～200g：50～200g：0.01～0.5g：2～4L(如3L)。

其中，所述工农业副产物可为瓜尔豆粕、黄豆粕、棉籽粕、小麦麸皮、面包渣、啤酒糟、豆饼粉、芝麻饼粉中的任意一种或几种的混合物；优选瓜尔豆粕。

其中，所述碳源可为葡萄糖、甘油、蔗糖、可溶性淀粉中的任意一种或几种的混合物；优选蔗糖。

进一步地，组成所述固体发酵培养基中的所述工农业副产物需要经过包括如下步骤的预处理：粉碎过20目筛后，按1g所述工农业副产物：0.5～2mL(如1mL)水的比例加入水浸润12～24h。配制所述固体发酵培养基时，向经过上述预处理的体系中加入所述碳源、谷氨酸钠、K₂HPO₄和水，使得其中所述工农业副产物、所述碳源、谷氨酸钠、K₂HPO₄和水的配比为1kg：50～200g：50～200g：0.01～0.5g：2～4L(如3L)。注意：预处理时加入的水也算为所述固体发酵培养基中的水的量。

进一步地，对所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CAU263进行所述固体发酵培养时，培养温度可为30～37℃恒温，培养湿度可保持在50～70％，培养时间可为48～96h，每隔12～24h翻转培养物一次。

进一步地，从所述发酵产物中获得所述γ-聚谷氨酸可按照包括如下步骤的方法进行：将所述发酵产物60℃以下(如50℃)低温烘干至恒重，粉碎后过20目筛，取3～5g(如3g)粉末，加水提取1～2h(如1h)，所述粉末和水的比例为1g所述粉末加入10mL水，离心(如10000r/min离心10min)，上清液中加入1～4倍(如4倍)体积甲醇，静置12～24h(如24h)，离心(如10000r/min离心10min)，收集沉淀，用1～4倍(如4倍)体积甲醇洗涤，真空冷冻干燥，即得精制的γ-聚谷氨酸。

在本发明的一个具体实施方式中，所述固体发酵培养基由瓜尔豆粕、蔗糖、谷氨酸钠、K₂HPO₄和水组成；在所述固体发酵培养基中，瓜尔豆粕、蔗糖、谷氨酸钠、K₂HPO₄和水的配比为1kg：100g：150g：0.05g：3L。

在本发明的一个具体实施方式中，对所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)CAU263进行所述固体发酵培养时，培养温度为37℃恒温，培养湿度保持在70％，培养时间48h，每隔12h翻转培养物一次。

在将所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CAU263接种到固体发酵培养基前还可包括如下步骤：

(1)菌种活化：划线接种所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CAU263至LB固体培养基，35～37℃(如37℃)恒温倒置培养10～12h(如12h)；

(2)种子培养：将经LB固体培养基活化的所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)CAU263单菌落接种于LB液体培养基中，摇床温度30～37℃(如37℃)，转速150～280rpm(如200rpm)培养8～12h(如8h)至对数生长期。

然后将步骤(2)所得种子液接种到所述固体发酵培养基中，接种量为5～10％(ν/ω)(即每100g固体基质中接种5～10mL种子液)(如5％)。接种后，充分搅拌，使菌液均匀分布于培养基表面。

上述方法步骤(1)中所述LB固体培养基为：酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl10g/L，琼脂20g/L。

上述方法步骤(2)中所述LB液体培养基为：酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl10g/L。

在上述各方面中，所述γ-聚谷氨酸的分子量为1000kDa以上。

在本发明的具体实施方式中，所述γ-聚谷氨酸的分子量具体为4020kDa。

本发明提供了一株能够高效合成γ-聚谷氨酸的菌株贝莱斯芽孢杆菌CAU263。本发明采用固体发酵进行γ-聚谷氨酸的生产，其生产成本低、能源消耗少且便于存储运输，生产效率高，是一种经济绿色可持续的技术方法；以工农业副产物作为固体发酵基质，促进了农业副产物的综合开发、高值化利用。本发明通过对贝莱斯芽孢杆菌CAU263培养条件的优化，250mL三角瓶发酵48h可使γ-聚谷氨酸的产量达到152.1g/kg DW，且生产的γ-聚谷氨酸分子量达到4020kDa，同时也产纳豆激酶280FU/g DW。本发明具有很好的工业化应用前景。特别是其中贝莱斯芽孢杆菌CAU263为天然菌株，还有可能进一步改造提升产量，具有很大的应用价值和工业化潜力。

保藏说明

菌株名称：贝莱斯芽孢杆菌

拉丁名：Bacillus velezensis

参椐的生物材料(株)：CAU263

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2020年7月8日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.20318

附图说明

图1为贝莱斯芽孢杆菌CAU263的系统发育树。

图2为γ-聚谷氨酸标准品及本发明实施例6所获得的γ-聚谷氨酸高效液相色谱分析结果示意图。

图3为本发明实施例6所获得的γ-聚谷氨酸凝胶渗透色谱分析结果示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、贝莱斯芽孢杆菌CAU263的分离鉴定

其具体步骤如下：

(1)称取1g筛菌样(采集自四川省南充市售的豆酱、豆豉等)于LB液体培养基(酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L)中，在37℃，200rpm下富集培养24h后，取1mL富集液加入适量无菌生理盐水梯度稀释至合适浓度，震荡均匀后吸取100μL于纤维蛋白平板(5mL 10g/L琼脂糖水溶液，5mL 6g/L纤维蛋白原溶液(用50mmol/L硼砂缓冲液配制)，100μL10U/mL凝血酶置于90mm培养皿中)上，用涂布棒涂抹均匀，置于37℃恒温培养箱中培养24h。挑取菌落周围出现透明圈的菌株于LB固体培养基(酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl10g/L，琼脂20g/L)上划线培养至分离出单菌落，保存备用。

(2)将上述产生透明圈的单菌落接至LB液体培养基中，37℃，200rpm下培养12h作为种子液，按5％(ν/ω)(即10g固体基质中加入500μL种子液)的接种量接种于固体复筛培养基(10g浸泡12h后充分吸水膨胀的黄豆装入50mL三角瓶中，121℃蒸煮20min，冷却至室温备用)中，置于37℃恒温培养箱中发酵24h，发酵结束后放置4℃后熟12h获得样品，按1：2(ω/ν)比例加入20mL水提取1h，经10000r/min离心10min后，收集上清液进行γ-聚谷氨酸检测，检测方法采用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法(Kongklom et al.Production ofpoly-γ-glutamic acid by glutamic acid independent Bacillus licheniformisTISTR 1010using different feeding strategies.Biochemical Engineering Journal,2015,100:67-75)。CTAB溶液配制：在2％(ω/ν)(即2g/100mL)的NaOH溶液中加入0.07mol/LCTAB。准确取2mL待测样品加入2mL CTAB溶液，充分振荡后室温下反应3min，400nm测吸光度。将测定得到的吸光值代入γ-聚谷氨酸标准曲线计算得到待测样品中γ-聚谷氨酸含量。最终筛选得到一株高产γ-聚谷氨酸(产量为35.1g/kg)、易于培养并具有稳定的传代特性的菌株作为目标菌株，该菌株编号为CAU263。

(3)将步骤(2)筛选得到的目标菌株CAU263在LB固体培养基上于37℃下静置培养12～24h，观察菌落形态，挑取一环菌落进行革兰氏染色剂显微镜观察；按照《伯杰氏细菌学鉴定手册》(第八版)和《常见细菌鉴定手册》中的相关方法对目标菌株进行生理生化鉴定，包括MR-VP、明胶液化、淀粉水解、吲哚生成、生长检测、酶类、糖发酵实验等。上述目标菌株在LB固体平板上表现为菌落呈圆形，表面和边缘均光滑、湿润、黏稠、白色半透明状。经革兰氏染色后，菌体呈紫色，为革兰氏阳性菌，菌体为短小杆状，两端钝圆。上述目标菌株经生理生化鉴定(如表1所示)，该菌株的V-P测定、淀粉水解、明胶液化、尿素酶试验等呈阳性，M.R.试验、吲哚试验、β-半乳糖苷酶、氧化酶、精氨酸双水解酶、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、马尿酸水解酶呈阴性，不能利用丙酸盐，在8％、10％NaCl下不能生长，能利用L-阿拉伯糖、D-木糖、甘露醇、甘露糖、纤维二糖、蔗糖、七叶苷，不能利用鼠李糖、半乳糖、D-蜜二糖、果糖、乳糖、麦芽糖、水杨苷、山梨醇、棉子糖、菊糖。参照《伯杰氏细菌学鉴定手册》(第八版)和《常见细菌鉴定手册》初步判定该菌株CAU263属于芽孢杆菌属细菌。

表1贝莱斯芽孢杆菌CAU263生理生化特性

注：“+”表示为阳性，“-”表示为阴性。

(4)按照Tiangen细菌DNA提取试剂盒方法提取步骤(2)筛选得到的目标菌株CAU263的总DNA，并进行PCR扩增16S rDNA，所用引物为通用引物，分别为：上游引物27F(5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)，下游引物1492R(5’-ACGGCTACCTTGTTA CGACTT-3’)；PCR反应体系：12.5μL 2×M5 Hiper plus Taq HiFi PCR Mix，1μL上游引物27F，1μL下游引物1492R，9.5μL水，1μL目标菌株总DNA。PCR反应程序：95℃预变性5min，95℃变性30s，51℃退火45s，72℃延伸1.5min，30个循环。将扩增产物送至北京博迈德公司进行测序。经过16S rDNA核苷酸序列分析测得菌株CAU263的16S rDNA核苷酸序列长度为1397bp(如SEQ ID No.1所示)，将目标菌株16S rDNA核苷酸序列拼接后在NCBI网站上通过Blast程序与GenBank数据库中已知菌种的16S rDNA核苷酸序列进行比对，利用Mega7软件构建系统发育树。通过NCBI网站上的Blast程序将该菌株的16S rDNA核苷酸序列与GenBank数据库中已知菌种的16S rDNA核苷酸序列进行比对，结果发现该菌株与芽孢杆菌属关系最近，其基因同源性均在99％以上。利用Mega7软件构建系统发育树(如图1所示)，其中同源性最高的为菌株NR116240.1Bacillus velezensis strain CBMB205。

鉴于以上对菌株CAU263的鉴定结果，确定该菌为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)。将该菌株于2020年7月8日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏编号为CGMCC No.20318。

实施例2、不同工农业副产物固体发酵生产γ-聚谷氨酸

其具体步骤如下：

(1)菌种活化：划线接种贝莱斯芽孢杆菌CAU263至LB固体培养基(酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，琼脂20g/L)，37℃恒温倒置培养12h。

(2)种子培养：将经LB固体培养基活化的贝莱斯芽孢杆菌CAU263单菌落接种于LB液体培养基(酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L)中，摇床温度37℃，转速200rpm培养8h至对数生长期。

(3)固体发酵培养：将下列各固体发酵培养基配制好后分别于121℃灭菌20min。冷却至室温以下时，将步骤(2)得到的种子液按5％(ν/ω)(即100g固体基质接种5mL种子液)接种量分别接种于各固体发酵培养基中，充分搅拌，使菌液均匀分布于培养基表面，接种后的培养箱保持37℃恒温，培养箱内湿度保持在70％，发酵48h，每隔12h翻转培养物一次。

固体发酵培养基A)：取10g瓜尔豆粕，粉碎过20目筛后装入250mL三角瓶中，按1：1(ω/ν)比例加入10mL水浸润24h，之后向体系中补加水，补水量为每1kg瓜尔豆粕补加2L水。

固体发酵培养基B)：将固体发酵培养基A)中的固体基质瓜尔豆粕替换为黄豆粕，其余不变。

固体发酵培养基C)：将固体发酵培养基A)中的固体基质瓜尔豆粕替换为棉籽粕，其余不变。

固体发酵培养基D)：将固体发酵培养基A)中的固体基质瓜尔豆粕替换为小麦麸皮，其余不变。

固体发酵培养基E)：将固体发酵培养基A)中的固体基质瓜尔豆粕替换为瓜尔豆粕和小麦麸皮，按1:1(ω/ω)进行配比(两者各5g)，其余不变。

固体发酵培养基F)：将固体发酵培养基A)中的固体基质瓜尔豆粕替换为面包渣，其余组分不变。

(4)γ-聚谷氨酸的提取与检测：发酵产物50℃低温烘干至恒重，磨碎打粉过20目筛，准确称取3g发酵产物粉末，按1：10(ω/ν)比例加入30mL水提取1h，经10000r/min离心10min后，收集上清液，加入4倍体积甲醇，静置24h，10000r/min离心10min收集沉淀，然后用4倍体积甲醇洗涤，真空冷冻干燥，得到精制的γ-聚谷氨酸。

γ-聚谷氨酸定量检测采用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法，CTAB溶液配制：在2％(ω/ν)(即2g/100mL)的NaOH溶液中加入0.07mol/L CTAB。准确取2mL待测样品加入2mLCTAB溶液，充分振荡后室温下反应3min，400nm测吸光度。将测定得到的吸光值代入γ-聚谷氨酸标准曲线计算得到待测样品中γ-聚谷氨酸含量(g/L)换算成g/kg DW(每kg干重的发酵产物中γ-聚谷氨酸的含量)。

发酵结束后，γ-聚谷氨酸的含量如表2所示，以瓜尔豆粕为基质固体发酵生产γ-聚谷氨酸最高达48.3g/kg DW。

表2添加不同固体基质γ-聚谷氨酸的含量

注：利用Tukey’s HSD检验显著性差异(p＜0.05)，以字母a～g表示。

实施例3、不同碳源固体发酵生产γ-聚谷氨酸

具体步骤如下：

(1)此实施例中关于菌种活化与实施例2中操作方法相同。

(2)此实施例中关于种子培养与实施例2中操作方法相同。

(3)固体发酵培养：将下列各固体发酵培养基配制好后分别于121℃灭菌20min。冷却至室温以下时将步骤(2)得到的种子液按5％(ν/ω)(即100g固体基质接种5mL种子液)接种量分别接种于各固体发酵培养基中，充分搅拌，使菌液均匀分布于培养基表面，接种后的培养箱保持37℃恒温，培养箱内湿度保持在70％，发酵48h，每隔12h翻转培养物一次。

固体发酵培养基G)：取10g瓜尔豆粕，粉碎过20目筛后装入250mL三角瓶中，按1：1(ω/ν)比例加入10mL水浸润24h，之后向体系中补加水，补水量为每1kg瓜尔豆粕补加2L水。并加入葡萄糖、谷氨酸钠和K₂HPO₄，每1kg瓜尔豆粕加入100g葡萄糖、150g谷氨酸钠和0.05gK₂HPO₄。

固体发酵培养基H)：将固体发酵培养基G)中的葡萄糖替换为甘油，其余不变。

固体发酵培养基I)：将固体发酵培养基G)中的葡萄糖替换为蔗糖，其余不变。

固体发酵培养基J)：将固体发酵培养基G)中的葡萄糖替换成可溶性淀粉，其余不变。

(4)此实施例中关于γ-聚谷氨酸的提取与检测与实施例2中操作方法相同。

发酵结束后，γ-聚谷氨酸的含量如表3所示，以蔗糖为碳源固体发酵生产γ-聚谷氨酸最高达140.4g/kg DW。

表3添加不同碳源γ-聚谷氨酸的含量

注：利用Tukey’s HSD检验显著性差异(p＜0.05)，以字母a～c表示。

实施例4、不同蔗糖添加量固体发酵生产γ-聚谷氨酸

其具体步骤如下：

(1)此实施例中关于菌种活化与实施例2中操作方法相同。

(2)此实施例中关于种子培养与实施例2中操作方法相同。

固体发酵培养基K)：取10g瓜尔豆粕，粉碎过20目筛后装入250mL三角瓶中，按1：1(ω/ν)比例加入10mL水浸润24h，之后向体系中补加水，补水量为每1kg瓜尔豆粕补加2L水。并加入蔗糖、谷氨酸钠和K₂HPO₄，每1kg瓜尔豆粕加入50g蔗糖、150g谷氨酸钠和0.05gK₂HPO₄。

固体发酵培养基L)：将固体发酵培养基K)中蔗糖浓度替换为100g/kg(即每kg瓜尔豆粕中添加的蔗糖量为100g)，其余不变。

固体发酵培养基M)：将固体发酵培养基K)中蔗糖浓度替换为150g/kg(即每kg瓜尔豆粕中添加的蔗糖量为150g)，其余不变。

固体发酵培养基N)：将固体发酵培养基K)中蔗糖浓度替换为200g/kg(即每kg瓜尔豆粕中添加的蔗糖量为200g)，其余不变。

发酵结束后，γ-聚谷氨酸的含量如表4所示，以蔗糖100g/kg为碳源固体发酵生产γ-聚谷氨酸最高达141.6g/kg DW。

表4添加不同蔗糖浓度γ-聚谷氨酸的含量

注：利用Tukey’s HSD检验显著性差异(p＜0.05)，以字母a～d表示。

实施例5、不同谷氨酸钠添加量固体发酵生产γ-聚谷氨酸

具体步骤如下：

(1)此实施例中关于菌种活化与实施例2中操作方法相同。

(2)此实施例中关于种子培养与实施例2中操作方法相同。

固体发酵培养基O)：取10g瓜尔豆粕，粉碎过20目筛后装入250mL三角瓶中，按1：1(ω/ν)比例加入10mL水浸润24h，之后向体系中补加水，补水量为每1kg瓜尔豆粕补加2L水。并加入蔗糖、谷氨酸钠和K₂HPO₄，每1kg瓜尔豆粕加入100g蔗糖、50g谷氨酸钠和0.05gK₂HPO₄。

固体发酵培养基P)：将固体发酵培养基O)中谷氨酸钠浓度替换为100g/kg(即每kg瓜尔豆粕中添加的谷氨酸钠量为100g)，其余不变。

固体发酵培养基Q)：将固体发酵培养基O)中谷氨酸钠浓度替换为150g/kg(即每kg瓜尔豆粕中添加的谷氨酸钠量为150g)，其余不变。

固体发酵培养基R)：将固体发酵培养基O)中谷氨酸钠浓度替换为200g/kg(即每kg瓜尔豆粕中添加的谷氨酸钠量为200g)，其余不变。

发酵结束后，γ-聚谷氨酸的含量如表5所示，添加谷氨酸钠150g/kg固体发酵生产γ-聚谷氨酸最高达140.1g/kg DW。

表5添加不同谷氨酸钠浓度γ-聚谷氨酸的含量

实施例6、不同K₂HPO₄添加量固体发酵生产γ-聚谷氨酸

具体步骤如下：

(1)此实施例中关于菌种活化与实施例2中操作方法相同。

(2)此实施例中关于种子培养与实施例2中操作方法相同。

固体发酵培养基S)：取10g瓜尔豆粕，粉碎过20目筛后装入250mL三角瓶中，按1：1(ω/ν)比例加入10mL水浸润24h，之后向体系中补加水，补水量为每1kg瓜尔豆粕补加2L水。并加入蔗糖、谷氨酸钠和K₂HPO₄，每1kg瓜尔豆粕加入100g蔗糖、150g谷氨酸钠和0.01gK₂HPO₄。

固体发酵培养基T)：将固体发酵培养基S)中K₂HPO₄浓度替换为0.05g/kg(即每kg瓜尔豆粕中添加的K₂HPO₄为0.05g)，其余不变。

固体发酵培养基U)：将固体发酵培养基S)中K₂HPO₄浓度替换为0.1g/kg(即每kg瓜尔豆粕中添加的K₂HPO₄为0.1g)，其余不变。

固体发酵培养基V)：将固体发酵培养基S)中K₂HPO₄浓度替换为0.5g/kg(即每kg瓜尔豆粕中添加的K₂HPO₄为0.5g)，其余不变。

发酵结束后，γ-聚谷氨酸的含量如表6所示，添加K₂HPO₄ 0.05g/kg固体发酵生产γ-聚谷氨酸最高达152.1g/kg DW。

表6添加不同K₂HPO₄浓度γ-聚谷氨酸的含量

注：利用Tukey’s HSD检验显著性差异(p＜0.05)，以字母a～b表示。

实施例7、γ-聚谷氨酸的定性及分子量测定

将实施例6生产的γ-聚谷氨酸(添加K₂HPO₄ 0.05g/kg组)进行定性及分子量测定，具体方法如下所述：γ-聚谷氨酸定性检测方法采用高效液相色谱(HPLC)法，测定色谱条件：安捷伦高效液相色谱仪1260；色谱柱：TSKgel GMPWXL(7.8×300mm)；流动相：纯水；检测器：紫外检测器；检测波长：210nm；流速：0.5mL/min；柱温：30℃。结果如图2所示，γ-聚谷氨酸标准品和本发明实施例6所获得的γ-聚谷氨酸样品(添加K₂HPO₄ 0.05g/kg组)主峰出峰位置(保留时间)是一致的，说明二者是同一物质，即所得样品为γ-聚谷氨酸。

γ-聚谷氨酸分子量检测方法采用凝胶渗透色谱(GPC)法，测定色谱条件：HW-2000GPC色谱工作站；色谱柱：TSKgel GMPWXL(7.8×300mm)；流动相：0.1mol/L NaNO₃水溶液中含有0.06％(ω/ν)(即0.06g/100mL)NaN₃；检测器：RID-20a示差折光检测器；流速：0.6mL/min；柱温：35℃。结果如图3所示，本发明实施例6所获得的γ-聚谷氨酸分子量为4020kDa。

实施例8、纳豆激酶酶活测定

将实施例6获得的发酵产物(添加K₂HPO₄ 0.05g/kg组)进行纳豆激酶酶活测定，具体方法如下所述：发酵产物真空冷冻干燥至恒重，磨碎打粉过20目筛，准确称取3g发酵产物粉末，按1：10(ω/ν)比例加入30mL水提取1h，经10000r/min离心10min后，收集上清液，稀释至合适浓度后待测。

将1.8mL 0.16％(ω/ν)(即0.16g/100mL)纤维蛋白原溶液(用50mmol/L硼砂缓冲液配制)放入37℃水浴锅中预热5min后加入0.1mL 20U/mL凝血酶，混匀后于37℃水浴锅中反应10min。实验组为取0.1mL待测样品于上述溶液中，混匀后37℃下反应60min，期间每隔20min振荡一次。反应结束时加入2mL 0.2mol/L的三氯乙酸溶液终止反应，然后于10000rpm下离心10min，取上清液在275nm处测定吸光值。对照组为先加入2mL 0.2mol/L三氯乙酸溶液，后加入0.1mL待测样品，其余步骤同上。纳豆激酶酶活定义：在275nm下，与对照相比，样品的吸光值每分钟增加0.01相当于一个酶活力单位，单位为FU/mL，再换算成FU/g DW(Huy,D.N.A.et al.Screening and identification of Bacillus sp.isolated fromtraditional Vietnamese soybean-fermented products for high fibrinolyticenzyme production.International Food Research Journal,2016,23(1):326-331)。计算公式如下：

式中，X：待测样品的纳豆激酶酶活，FU/mL；Ar：实验组吸光值；Ac：对照组吸光值；60：反应时间60min；0.1：反应样品体积0.1mL；N：稀释倍数。

结果显示：本发明实施例6获得的纳豆激酶酶活为280FU/g DW。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

<110> 中国农业大学

<120> 一种产γ-聚谷氨酸的贝莱斯芽孢杆菌及其固体发酵生产γ-聚谷氨酸的方法

<130> GNCLN201254

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1397

<212> DNA

<213> Bacillus velezensis

<400> 1

gatgggagct tgctccctga tgttagcggc ggacgggtga gtaacacgtg ggtaacctgc 60

ctgtaagact gggataactc cgggaaaccg gggctaatac cggatggttg tttgaaccgc 120

atggttcaga cataaaaggt ggcttcggct accacttaca gatggacccg cggcgcatta 180

gctagttggt gaggtaacgg ctcaccaagg cgacgatgcg tagccgacct gagagggtga 240

tcggccacac tgggactgag acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtagggaatc 300

ttccgcaatg gacgaaagtc tgacggagca acgccgcgtg agtgatgaag gttttcggat 360

cgtaaagctc tgttgttagg gaagaacaag tgccgttcaa atagggcggc accttgacgg 420

tacctaacca gaaagccacg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc 480

aagcgttgtc cggaattatt gggcgtaaag ggctcgcagg cggtttctta agtctgatgt 540

gaaagccccc ggctcaaccg gggagggtca ttggaaactg gggaacttga gtgcagaaga 600

ggagagtgga attccacgtg tagcggtgaa atgcgtagag atgtggagga acaccagtgg 660

cgaaggcgac tctctggtct gtaactgacg ctgaggagcg aaagcgtggg gagcgaacag 720

gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acgatgagtg ctaagtgtta gggggtttcc 780

gccccttagt gctgcagcta acgcattaag cactccgcct ggggagtacg gtcgcaagac 840

tgaaactcaa aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga 900

agcaacgcga agaaccttac caggtcttga catcctctga caatcctaga gataggacgt 960

ccccttcggg ggcagagtga caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg 1020

ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ttgatcttag ttgccagcat tcagttgggc 1080

actctaaggt gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat 1140

gccccttatg acctgggcta cacacgtgct acaatggaca gaacaaaggg cagcgaaacc 1200

gcgaggttaa gccaatccca caaatctgtt ctcagttcgg atcgcagtct gcaactcgac 1260

tgcgtgaagc tggaatcgct agtaatcgcg gatcagcatg ccgcggtgaa tacgttcccg 1320

ggccttgtac acaccgcccg tcacaccacg agagtttgta acacccgaag tcggtgaggt 1380

aacctttagg agccagc 1397

Claims

1.贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CAU263，其在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为CGMCC No.20318。

2.一种菌剂，其活性成分为权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CAU263。

3.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CAU263或权利要求2所述的菌剂在生产γ-聚谷氨酸中的应用。

4.一种生产γ-聚谷氨酸的方法，包括如下步骤：对权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CAU263进行固体发酵培养，从发酵产物中获得γ-聚谷氨酸。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：对所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)CAU263进行所述固体发酵培养时，采用的固体发酵培养基由固体基质和外源添加物组成，所述固体基质为工农业副产物，所述外源添加物由碳源、谷氨酸钠、K₂HPO₄和水组成。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：在所述固体发酵培养基中，所述工农业副产物、所述碳源、谷氨酸钠、K₂HPO₄和水的配比为1kg：50～200g：50～200g：0.01～0.5g：2～4L。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述工农业副产物为瓜尔豆粕、黄豆粕、棉籽粕、小麦麸皮、面包渣、啤酒糟、豆饼粉、芝麻饼粉中的任意一种或几种的混合物；和/或

所述碳源为葡萄糖、甘油、蔗糖、可溶性淀粉中的任意一种或几种的混合物；和/或

组成所述固体发酵培养基中的所述工农业副产物需要经过包括如下步骤的预处理：粉碎过20目筛后，按1g所述工农业副产物：0.5～2mL水的比例加入水浸润12～24h。

8.根据权利要求5-7中任一所述的方法，其特征在于：对所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CAU263进行所述固体发酵培养时，培养温度为30～37℃恒温，和/或培养湿度保持在50～70％，和/或培养时间48～96h，和/或每隔12～24h翻转培养物一次。

9.根据权利要求5-8中任一所述的方法，其特征在于：从所述发酵产物中获得所述γ-聚谷氨酸是按照包括如下步骤的方法进行的：将所述发酵产物60℃以下低温烘干至恒重，粉碎后过20目筛，取3～5g粉末，加水提取1～2h，所述粉末和水的比例为1g所述粉末加入10mL水，离心，上清液中加入1～4倍体积甲醇，静置12～24h，离心，收集沉淀，用1～4倍体积甲醇洗涤，真空冷冻干燥，即得γ-聚谷氨酸。

10.根据权利要求5-9中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述固体发酵培养基由瓜尔豆粕、蔗糖、谷氨酸钠、K₂HPO₄和水组成；在所述固体发酵培养基中，瓜尔豆粕、蔗糖、谷氨酸钠、K₂HPO₄和水的配比为1kg：100g：150g：0.05g：3L；

和/或

对所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CAU263进行所述固体发酵培养时，培养温度为37℃恒温，和/或培养湿度保持在70％，和/或培养时间48h，和/或每隔12h翻转培养物一次；和/或

所述γ-聚谷氨酸的分子量为1000kDa以上；

进一步地，所述γ-聚谷氨酸的分子量为4020kDa。