CN1269951C - 枯草芽孢杆菌及其用于制备γ－聚谷氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种采用发酵制备γ-聚谷氨酸的方法，该方法将经过筛选得到的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)zju-7菌株，即CGMCC No.1250，在含有碳源、氮源、谷氨酸、MgSO4、NaCl和K2HPO4的培养基中培养，得到发酵液，再将发酵液通过有机溶剂沉淀、透析，得到γ-聚谷氨酸产品。本发明方法工艺简单，高效价廉，产量高。
Description
技术领域
本发明涉及一种高产γ-聚谷氨酸(γ-PGA)的微生物菌株，以及将其用于制备γ-聚谷氨酸的方法。
背景技术
γ-聚谷氨酸(Poly γ-glutamic acid，γ-PGA)是一种可以通过微生物合成的均氨基酸化合物。作为一种生物高分子材料，γ-PGA具有生物可降解性好、可食、对人体和环境无毒害的优点。因此，γ-PGA及其衍生物在食品、化妆品、医药和水处理等方面具有广泛的用途。
目前合成γ-PGA的方法主要有化学合成法、提取法和微生物合成法等。但是化学合成法合成路线长、副产物多、收率低，并且产物的分子量小、难于满足作为新型药物载体材料的要求，没有工业应用价值。而提取法由于γ-PGA浓度较低，且随条件不同，含量变化大。因此，提取工艺十分复杂，生产成本甚高，同样难以进行大规模的工业生产。
目前主要采用微生物发酵法生产γ-PGA。γ-PGA是1937年Ivanovics在Bacillus anthracis的荚膜中首先发现(Ivanovics G，Bruckner V.Immunitatsforch.1937，90，304～318)。韩国研究人员在2.5升发酵罐中对Bacilluslicheniformis ATCC9945a采用流加高密度培养的方法，发酵35小时后可达到35g/L的最终产量(Yoon SH，DO JH，Lee SY.Biotechnol.Lett，2000，22：585～588)。Ogawa对Bacillus subtilis MR 141的大规模生产进行的研究表明在30L的发酵罐中优化培养条件可使γ-PGA最大产量达到35g/L(Ogawa Y，YamaguchiF，Yuasa K.Biosci Biotec Biochem，1997，61：1684～1687)。Kubota在Osaka City University土壤中分离得到的一株Bacillus subtilis F201，该菌株在最佳发酵生产条件下可以达到50g/L的最高产量，这是文献报道的最高产产量(Kubota H.Biosci Biotec Biochem，1993：1212～1213)。该菌株已被Meiji Seika Kaisha公司成功用于工业化大规模生产γ-PGA(Tanaka T，Yaguchi T，Hiruta O，et al.Biosci Biotechnol Biochem，1993，57，1809～1810；Tanaka T，Hiruta O，Futamura T，et al.Biosci Biotechnol Biochem，1993，57，2148～2153)。
虽然γ-PGA的发酵生产取得了较大的进展，但是仍然存在耗用原料较多，生产周期较长，生产效率低下，生产成本较高的问题，因此，高效、低成本生产γ-PGA仍有待于进一步研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高产γ-聚谷氨酸(γ-PGA)的微生物菌株，以及用该微生物菌株制备γ-聚谷氨酸的方法。
本发明的目的通过以下措施达到：
使用的微生物
用于生产本发明所述γ-聚谷氨酸的微生物菌株是枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)zju-7，该菌株系从酱油生产废料中分离选育而得，于2004年11月15日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，保藏编号为：CGMCC No.1250。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)zju-7具有以下性质：
1.形态特征
在蛋白胨琼脂培养基上营养细胞为0.6～0.9×1.5～3.0μm大小的杆菌，40℃培养7天形成芽孢，芽孢大小为0.6～0.8×1.0～2.0μm，为长圆形或圆柱形。
2.在各种培养基上的特征：
(1)蛋白胨葡萄糖琼脂平板培养：30～40℃培养24小时可大量生长。菌落呈白色，菌落表面有菌膜，有皱褶，不透明，不闪光，边缘不规则。
(2)蛋白胨葡萄糖琼脂斜面培养：30～40℃培养24小时可大量生长。菌落呈白色，菌落表面有菌膜，有皱褶，不透明，不闪光，边缘不规则。
(3)蛋白胨葡萄糖液体培养：在培养液表面形成菌膜。
(4)蛋白胨葡萄糖穿刺培养：菌体在表面生长，底部不生长。
3.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)zju-7的生理生化性质见表1
4.通过细菌16s RNA比对，证明该微生物为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)
综上所述，本发明使用的是好气性芽孢杆菌，具体为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)zju-7。
表1枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)zju-7生理生化性质
| 试验项目 | 结果 | 试验项目 | 结果 |
| 革兰氏染色 | 阳性 | 从碳水化合物产酸 | |
| 菌体形状 | 杆状 | 葡萄糖 | + |
| 细胞直径＞1微米形成芽孢 | -+ | 蔗糖果糖 | ++ |
| 芽孢膨大 | - | 乳糖 | + |
| 芽孢圆形 | - | 利用柠檬酸盐生长 | + |
| 伴孢晶体 | - | 50℃生长 | + |
| 厌氧生长 | - | pH＜生长 | + |
| 甲基红试验 | + | 7％NaCl生长 | + |
| pH＜6.0 | + | 水解淀粉 | + |
| pH＞7.0 | - | 液化明胶 | + |
利用枯草芽孢杆菌制备γ-聚谷氨酸的方法，包括以下步骤：
1)将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)zju-7 CGMCC No.1250，在斜面培养基活化；
培养基为：葡萄糖1～10％，蛋白胨1～8％，谷氨酸2～6％，MgSO4 0.05～0.5％，NaCl 1～8％，K2HPO4 0.01～0.05％，各组分的含量均为重量体积百分比，即g/100ml，下同。活化8小时后，可见菌落生长。
2)配制培养基：碳源1～10％，氮源1～8％，谷氨酸2～15％，MgSO4 0.05～0.5％，NaCl 1～8％，K2HPO4 0.01～0.05％，各组分的含量均为重量体积百分比，pH6～7，装液量20～200ml/500ml摇瓶，灭菌后，冷却，接入活化后的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)zju-7，接种量为1～10％，20～40℃摇瓶培养，转速100～400rpm，在上述条件下进行摇瓶发酵，培养24～72小时；或装液于发酵罐中，灭菌，接入活化后的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)zju-7，接种量为1～10％，通气量为1.0～3.0vvm，于35～40℃温度下培养24～72小时；
3)离心去除发酵液中的菌体，用酸将上清液的pH值调至3～5，然后加入甲醇、乙醇或丙酮有机溶剂，加入量为上清液体积的2～5倍，沉淀，将沉淀物溶解于水中，过滤除去不溶物，透析除去小分子物质，干燥，得到γ-聚谷氨酸。
本发明中使用的碳源可以是葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉或淀粉，以葡萄糖和蔗糖较为合适；氮源可以是有机氮源蛋白胨、酵母膏或玉米浆；也可以是无机氮源NH4NO3或(NH4)2SO4，上述氮源可以单独使用，也可以混和使用。
上述培养基中，优选谷氨酸含量为7～12％，因为加入的谷氨酸太少，γ-聚谷氨酸生产量减少，甚至完全不生产；加入量过大，菌体生长变差，发酵液中的谷氨酸剩余过多，造成浪费。本发明中使用的谷氨酸也可以是其盐的形式。优选NaCl含量为3～5％，因为发酵液中的NaCl含量过低，在发酵过程中产生大量泡沫；NaCl含量过高，会抑制菌体的生长。
本发明得到的γ-聚谷氨酸具有以下理化性质：
1)本产品溶于水，不溶于甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂；
2)本产品茚三酮反应呈阴性，用6M HCl水解后茚三酮反应呈阳性；
3)6MHCl水解后用HPLC和薄层层析法检测，发现水解物中生成单一的氨基酸谷氨酸。证明本产品为谷氨酸的高分子聚合物；
4)通过SDS-PAGE和凝胶过滤色谱等方法证明本产物的分子量为200～1000KDa；
本发明制备的γ-聚谷氨酸分子上具有大量的游离羧基，因而具有良好的吸湿性能和保湿性能，可以作为难溶性药物载体、食品增稠剂、淀粉防老化剂和化妆品的保湿剂。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
(1)本发明使用的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)zju-7微生物菌株可以高效率的发酵生产γ-聚谷氨酸：
(2)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)zju-7菌株培养条件粗放，可以使用多种不同的碳源及氮源；
(3)培养基色泽较浅，有利于后期的产物分离纯化；
(4)通过对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)zju-7菌株培养条件的优化，特别是通过在培养基中加入谷氨酸及其盐，使发酵液中的γ-聚谷氨酸的含量高达50～60g/L，从而提供了一种高效廉价制备γ-聚谷氨酸的方法。
具体实施方式
下面的实施例对本发明作详细说明，但对本发明没有限制。
实施例1
将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)zju-7经37℃斜面活化，斜面培养基：葡萄糖1.5％，蛋白胨1％，谷氨酸3％，MgSO4 0.1％，NaCl 1％，K2HPO4 0.01％，活化8小时。
摇瓶培养基：葡萄糖2％，蛋白胨1.5％，谷氨酸3％，MgSO4 0.1％，NaCl 1％，K2HPO4 0.01％，pH7，装液量50ml/500ml摇瓶，115℃灭菌20分钟。
灭菌结束后，冷却，接种上述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)zju-7，接种量为3％，37℃摇瓶培养，转速200rpm，在上述条件下进行摇瓶发酵实验，培养24小时。
发酵结束后，离心去除发酵液中的菌体，将发酵液中的菌体除去，用盐酸将上清液的pH值调至4，然后加入4倍体积甲醇，沉淀。将沉淀物重新溶解在100倍体积水中，过滤除去不溶物，然后透析除去小分子物质，最后将溶液冷冻干燥得到白色粉末状物质，此白色物质为γ-聚谷氨酸，产量可达到15g/L。
实施例2
将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)zju-7 CGMCC No.1250，在斜面培养基活化，同实施例1；
摇瓶培养基：葡萄糖2％，蛋白胨2％，谷氨酸5％，MgSO4 0.2％，NaCl 2％，K2HPO4 0.05％，pH7，装液量30/250ml摇瓶，115℃灭菌20分钟。灭菌后冷却，接种，接种量为3％，菌种为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)zju-7，37℃培养24小时，摇瓶转速为200rpm。
发酵结束后，同实施例1分离纯化γ-聚谷氨酸，产量可达到18g/L。
实施例3
将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)zju-7 CGMCC No.1250，在斜面培养基活化，同实施例1；
以葡萄糖2％，蛋白胨2％，谷氨酸8％，MgSO4 0.1％，NaCl 2％，K2HPO4 0.05％为摇瓶培养基，pH7，装液量30ml/200ml摇瓶，115℃灭菌20分钟，灭菌结束后，冷却，接种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)zju-7，接种量为3％，37℃摇瓶培养，200rpm，培养24小时，
发酵结束后，按照实施例1的方法分离纯化γ-聚谷氨酸，其产量可达到23g/L。
实施例4
同实施例3，将摇瓶培养基中的葡萄糖以蔗糖代替，结果得到发酵液中的γ-聚谷氨酸浓度为28g/L。
实施例5
将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)zju-7 CGMCC No.1250，在斜面培养基活化，同实施例1；
以葡萄糖10％，蛋白胨8％，谷氨酸15％，MgSO4 0.2％，NaCl 5％，K2HPO4 0.05％为培养基，pH7，装液量50/500ml摇瓶，115℃灭菌20分钟。灭菌后冷却，接入枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)zju-7，37℃培养24小时，摇瓶转速为200rpm。
发酵结束后，离心去除发酵液中的菌体，按照实施例1所叙述的方法分离纯化得到-聚谷氨酸，产量可达到54g/L。
实施例6
将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)zju-7 CGMCC No.1250，在斜面培养基活化，同实施例1；
以葡萄糖1％，蛋白胨1％，谷氨酸2％，MgSO4 0.05％，NaCl 1％，K2HPO4 0.01％为培养基，pH 7，装液量50ml/500ml摇瓶，121℃灭菌20分钟，灭菌结束后，冷却，接入枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)zju-7，接种量为1％，37℃摇瓶培养，转速100～400rpm，在上述条件下进行摇瓶发酵实验，培养24小时。
发酵结束后，按照实施例1的方法分离纯化γ-聚谷氨酸，其产量可达到15g/L。
实施例7
将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)zju-7 CGMCC No.1250，在斜面培养基活化，同实施例1；
以蔗糖5％，蛋白胨5％，谷氨酸5％，MgSO4 0.1％，NaCl 2％，K2HPO4 0.05％为摇瓶培养基，pH7，装液量50ml/200ml摇瓶，115℃灭菌20分钟，灭菌结束后，冷却，接入枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)zju-7，接种量为3％，37℃摇瓶培养，200rpm，培养48小时。
发酵结束后，按照实施例1的方法分离纯化γ-聚谷氨酸，结果见表2。
实验结果表明：不加谷氨酸的对照瓶中不生成γ-聚谷氨酸，并且随着谷氨酸及其钠盐加入量的增加，发酵液中γ-聚谷氨酸的含量随之增加，在发酵培养基中谷氨酸的含量超过10％，培养液中最终生成50g/L的γ-聚谷氨酸。
表2谷氨酸含量对γ-聚谷氨酸产量的影响
| 谷氨酸浓度(％) | γ-聚谷氨酸生成量(g/L) |
| 不添加 | 0 |
| 2 | 14 |
| 4 | 21 |
| 6 | 25 |
| 8 | 28 |
| 10 | 50 |
实施例8
将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)zju-7经37℃斜面活化，斜面培养基为：葡萄糖1％，蛋白胨2％，谷氨酸2％，MgSO4 0.05％，NaCl 1％，K2HPO4 0.01％，活化12小时。
在斜面上挑取单菌落至一级种子培养基中，一级种子培养基为：葡萄糖2％，蛋白胨2％，谷氨酸3％，MgSO4 0.05％，NaCl 1％，K2HPO4 0.1％，pH.7，装液量10ml/100ml摇瓶，115灭菌15～30分钟，灭菌结束后，冷却，接种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)zju-7，接种量为3％，37℃转速200rpm培养12h。
以蔗糖1％，蛋白胨1％，谷氨酸4％，MgSO4 0.1％，NaCl.0.5％，K2HPO4 0.05％为二级种子培养基，pH7，装液量100ml/1000ml摇瓶，115℃灭菌20分钟，灭菌结束后，冷却，接入枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)zju-7，接种量为3％，37℃摇瓶培养，200rpm，培养12小时。
以蔗糖5％，蛋白胨5％，谷氨酸10％，MgSO4 0.1％，NaCl 3％，K2HPO4 0.05％为培养基，pH7，装液量3L/5L发酵罐，115℃灭菌20分钟，接入上述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)zju-7的二级种子，接种量为1％，控制发酵液pH值为6.5~7.0，通气量为3.0vvm，温度为37℃，培养36h。
发酵结束后，按照实施例1的方法分离纯化γ-聚谷氨酸，实验结果表明，γ-聚谷氨酸产量达到51.3g/L，生产率达到1.425g·h-1·L-1。
Claims (6)
1.枯草芽孢杆菌，其特征是该菌为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)zju-7，于2004年11月15日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.1250。
2.用权利要求1所述的枯草芽孢杆菌制备γ-聚谷氨酸的方法，其特征是包括以下步骤：
1)将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)zju-7 CGMCC No.1250，在斜面培养基活化；
2)配制培养基：碳源1～10％，氮源1～8％，谷氨酸2～15％，MgSO4 0.05～0.5％，NaCl 1～8％，K2HPO4 0.01～0.05％，各组分的含量均为重量体积百分比，pH6～7，装液量20～200ml/500ml摇瓶，灭菌后，冷却，接入活化后的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)zju-7，接种量为1～10％，20～40℃摇瓶培养，转速100～400rpm，在上述条件下进行摇瓶发酵，培养24～72小时；或装液于发酵罐中，灭菌，接入活化后的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)zju-7，接种量为1～10％，通气量为1.0～3.0vvm，于35～40℃温度下培养24～72小时；
3)离心去除发酵液中的菌体，用酸将上清液的pH值调至3～5，然后加入甲醇、乙醇或丙酮有机溶剂，加入量为上清液体积的2～5倍，沉淀，将沉淀物溶解于水中，过滤除去不溶物，透析除去小分子物质，干燥，得到γ-聚谷氨酸。
3.根据权利要求2所述的制备γ-聚谷氨酸的方法，其特征是步骤2)培养基中的NaCl含量为3～5％。
4.根据权利要求2所叙述的方法，其特征是在培养基中谷氨酸含量为7～12％。
5.根据权利要求2所述的制备γ-聚谷氨酸的方法，其特征是培养基中的碳源是葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉或淀粉。
6.根据权利要求2所述的制备γ-聚谷氨酸的方法，其特征是培养基中的氮源是有机氮源蛋白胨、酵母膏、玉米浆，或是无机氮源NH4NO3或(NH4)2SO4。
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