CN1117855C - 生产β－1,3－葡聚糖的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明包括一种属于土壤杆菌、能生产β-1，3-葡聚糖并且是磷酸烯醇丙酮酸羧酸酶活性不足或缺乏的微生物和一种生产β-1，3-葡聚糖的方法，即在培养基中培养所述微生物，然后将其回收。本发明的方法可以以高产率(以碳水化合物计)和高效率生产β-1，3-葡聚糖。

Description

生产β-1，3-葡聚糖的方法
本发明涉及生产β-1，3-葡聚糖的方法和微生物。
可以由属于产碱菌或土壤杆菌属的微生物生产β-1，3-葡聚糖。一种上述葡聚糖产物(curdlan)是已知的[New Food Industry 20，49(1978)，美国专利3,754,925等]。
典型的所述微生物是粪产碱菌myxogenes变种(AgriculturalBiological Chemistry 30，196(1966)，等)。此外，已从该微生物得到了各种突变体，已报导的这些突变体包括尿嘧啶需要型菌株NTK-u(IFO 13140)和非尿嘧啶需要型自发突变体，即：ATCC31749和ATCC 31750(美国专利4,355,106)。
在这些文献中，未公开该微生物的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(carboxykinase)(该酶催化将草酰乙酸转化成磷酸烯醇丙酮酸的反应)的活性。
在IFO Research Communications  15，57-75(1991)和Listof Cultures 9th ed.(1992)(两者均由Institute forFermentation，Osaka(IFO)出版)中，粪产碱菌myxogenes变种10C3(IFO 13714)经分类分析，鉴定为土壤杆菌生物变种I(Agrobacterium Sp.biovar I)。
本发明的主要目的是提供生产β-1，3-葡聚糖的方法和微生物。
通过下列描述，该目的和其它目的以及本发明的优点对于本领域专业人员来说是显而易见的。
本发明的发明人想要得到一种具有工业化优点的，以高产率和高效率生产β-1，3-葡聚糖的方法。作为其研究结果，本发明人已发现：用化学诱变剂处理粪产碱菌myxogenes变种10C3K得到的突变菌株是磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性缺乏的，并且不能在含有以琥珀酸作为唯一碳源的培养基中生长，还发现用该突变菌株生产β-1，3-葡聚糖的方法具有高生产力和高产率。
因此，本发明涉及以高生产力和高产率生产β-1，3-葡聚糖的方法。
根据本发明，提供了：
1).一种属于土壤杆菌属的微生物，它能生产β-1，3-葡聚糖并且是磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性缺乏或缺陷的；
2).根据上述1)的微生物，其中所述微生物是磷酸烯醇丙酮酸活性为其亲本菌株的0％到约50％的突变体；
3).根据上述1)的微生物，其中，所述微生物属于土壤杆菌属，并能生产β-1，3-葡聚糖，但不能在含有琥珀酸作为唯一碳源的培养基中生长；
4).根据上述1)的微生物，其中所述微生物是土壤杆菌生物变种I；
5).根据上述4)的微生物，其中所述微生物是土壤杆菌生物变种IGA-27(FERM BP-4350)；
6).根据上述4)的微生物，其中所述微生物是土壤杆菌生物变种IGA-33(FERM BP-4351)；
7).一种生产β-1，3-葡聚糖的方法，包括在养基中培养1)的微生物以便生产β-1，3-葡聚糖，然后回收生产的β-1，3-葡聚糖；
8).根据上述7)的方法，其中所述微生物是磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性为其亲本菌株的0％到约50％的突变体；
9).根据上述7)的方法，其中所述微生物属于土壤杆菌属并能生产β-1，3-葡聚糖，但不能在含琥珀酸作为唯一碳源的培养基上生长；
10).根据上述7)的方法，其中所述微生物是土壤杆菌生物变种I；
11).根据上述10)的方法，其中所述微生物是土壤杆菌生物变种IGA-27(FERM BP-4350)；
12).根据上述10)的方法，其中所述微生物是土壤杆菌生物变种IGA-33(FERM BP-4351)；
13).根据上述7)的方法，其中所述β-1，3-葡聚糖是curdlan；
14).根据上述7)的方法，其中所述培养基是液体培养基；和
15).根据上述7)的方法，其中所述微生物是在有氧条件下培养的。
在本发明的上下文中，属于土壤杆菌属的微生物包括属于旧属名为产碱菌属的所有微生物。
本发明的β-1，3-葡聚糖是一种大部分以β-1，3-配糖键相连的葡萄糖单元组成的多糖，聚合度为约100到约20,000，优选约500到约10,000。其具体的实例是Curdlan，原生动物糖(paramylon)等。在本发明中，curdlan是优选的。
若本发明所用的微生物是磷酸烯醇丙酮酸(下文简称PEPCK)活性不足或缺陷的突变菌株，则所述微生物的PEPCK活性为其亲本菌株活性的0％到约50％，优选的是0％到约30％。可以用R.J.Hansen等人[Analytical Biochemistry  74，576，(1976)，参阅下文描述的参考实施例]的方法完成PEPCK活性的检测。若本发明的微生物不是突变菌株，则可将具有与上述突变体相同程度PEPCK活性的微生物用于本发明。例如，所述微生物包括PEPCK活性不超过约0.006(ΔE340/分/mg蛋白质)，优选的是不超过约0.004(ΔE340/分/mg蛋白质)的微生物。
本发明的微生物包括土壤杆菌生物变种I，这只是其中之一。作为优选的实施例，包括提到的土壤杆菌生物变种II GA-27(IFO15490，FERM BP-4350)和土壤杆菌生物变种II GA-33(IF015491，FERM BP-4351)，两者均可用下文实施例1中描述的方法生产。
本发明优选的微生物是属于土壤杆菌属的微生物，它有能力生产β-1，3-葡聚糖，但不能在含有琥珀酸作为唯一碳源的培养基中生长。该菌株也不能在含有除琥珀酸外的任何其他与TCA循环(三羧酸循环，柠檬酸循环)有关的有机酸(如苹果酸、富马酸、α-氧代戊二酸等)或任何与TCA循环有关的氨基酸(如谷氨酸、天冬氨酸等)作为唯一碳源的培养基中生长。
在本发明中，不能生长是指当在含有10g/l与所述TCA循环有关的有机酸或氨基酸作为唯一碳源的固体培养基(如下文描述的培养基B)中将特定的微生物在32℃培养48小时，则所述微生物几乎不生长。如用液体培养基作为试验培养基，则在含有所述有机酸或氨基酸作为唯一碳源的培养基(如下文描述的培养基B)，于32℃将所述微生物培养48小时，用去离子水将所得的培养液稀释5倍，并用分光光度计(如Perkin-E1mer Spectrophotometer 35，celldimensions 12×75mm，The Perkin-Elmer Corporation)测定其在590nm的光密度(OD)。若OD值不超过0.03，则认为该微生物不生长。
可以使其亲本菌株经本身已知的方法如用UV照射，或用化学诱变剂[如N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(称为NTG)或亚硝酸等]处理可得到本发明的微生物。
例如，用适量的，约200到约500μg/ml的NTG将亲本菌株在32℃处理30分钟以诱导其突变，然后将处理过的细胞放在适当的培养基(如含有葡萄糖作为唯一碳源的琼脂培养基)上培养。然后，将所得的菌落复制平铺在含有琥珀酸作为唯一碳源的培养基上，并将在含有葡萄糖作为唯一碳源的培养基中生长，但在含有琥珀酸作为唯一碳源的培养基中不生长或生长迟缓的菌落(不利用琥珀酸的突变体)检出。也可以通过用与TCA循环(柠檬酸循环)有关的有机酸(如苹果酸、富马酸、α-氧代戊二酸等)或氨基酸(如谷氨酸、天冬氨酸等)代替琥珀酸，以此衍生不利用所述酸的突变体，从而得到本发明的微生物。
使因此得到的本发明微生物在培养基中生长。该培养基可以是液体培养基或固体培养基。使用液体培养基是优选的。
可用于所述培养基中的主要碳源包括葡萄糖、果糖、蔗糖、粗糖、糖蜜(如甜菜糖蜜、蔗糖蜜等)和各种淀粉的糖化产物(如木薯淀粉、西米棕榈淀粉、甜马铃薯淀粉、马铃薯淀粉、玉米淀粉等)，及其它。所用的上述碳源的浓度(以培养基计)为约3到约20％(w/v)，优选的为约5到约10％(w/v)。可以以任何适当的方式加入所述碳源，即在培养开始时一次加入所需的量或培养期间顺序或连续加入以达到必需的数量。
除上述特定的碳源外，对培养基的组成没有特别的限制，如氨源、无机盐的数量等。因此，例如氮源包括：无机氮源如氨、硫酸铵、氯化铵、脲、磷酸氢镀等；各种有机物质的镀盐(例如有机酸如琥珀酸、富马酸、α-氧代戊二酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸等的铵盐，以及酸铵盐如谷氨酸、天冬氨酸的铵盐等)；及中性氨基酸(如丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、组氨酸等)。磷酸盐的实例包括磷酸一氢钾、磷酸二氢钾或磷酸氢铵。可以单独或以适当的组合使用这些氮源和磷酸盐。
另外，可以单独或以适当的组合使用对于所述微生物生长所必需的无机盐，例如无机物质(如钙、钾、镁、锰、铁、锌、钴和铜)的硫酸盐、盐酸盐、碳酸盐或磷酸盐，及其他盐。
如果需要，可以单独或以适当的组合加入胨、肉膏、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白氨基酸、维生素等。此外，可以按需要加入消泡剂如硅油和其它添加剂。
优选的是在有氧条件下完成培养。培养温度为约20到约40℃，优选的是约25到约35℃、培养基的pH为约4到约9，优选的是约5到约7，并可以用酸或碱调整。
关于培养时间，连续培养直到β-1，3-葡聚糖产量达到最大值。因此，培养时间为约24小时到约10天，优选的是约48小时到约5天。
用本身已知的方法(如离心、过滤、超滤等)回收在培养基中积累的β-1，3-葡聚糖，并按需要纯化(如，美国专利3,754,925等)。
可以将按本发明得到的β-1，3-葡聚糖用于各种领域，包括食品、化学和民用工程工业。
用于食品，β-1，3-葡聚糖可作为增稠剂，粘度填充剂、粘合剂等。适宜的食品包括(但不限于)鱼肉产品(如Kamaboko、chikuwa、hampen、tempura、蟹腿kamaboko、鱼肠等)，动物肉产品(如香肠、成牛肉、烤火腿、汉堡包、肉丸子等)，熟食(如gyoza、烧麦(shao-mai)等)，面条(如粗的、蒸熟的或煮的中国面条，udon面条，方便面、soba，烤soba，harusame，米粉面条、通心面，意大利式细面条，gyoza卷，烧麦卷等)，大豆产品(如，tohu、冻tohu、aburaage、gammodoki等)，调味品(如味噌、酱油、番茄沙司、tare等)，饮料，糊状食品(如果酱、马莱兰、花生酱、面粉糊等)，豆酱、鲜美食品，乳品(如黄油、人造奶油、奶酪、搅打起泡沫的稀奶油等)，米丸子和饺子(如warabi mochi、mitarashi dango、botamoti，等)，大米和其它糕点及糖果(如arare、okaki、sembei、糖果、小甜饼、yokan、wanamagashi、煎饼、巴维利亚奶油、木斯、奶油泡夫、棉花软糖、口香糖、冰激淋、装饰果(肉)冻(aspicje1ly)等)，等等。
可将根据本发明得到的β-1，3-葡聚糖单独或与其它食品材料结合起来用于各种类型食品的生产，包括魔芋类食品、银耳类食品、各种果(肉)冻、模制的食品(如片状和somen类食品)装饰冻类食物、熟大米制成的成形食品、可食性薄膜、低卡路里食品、含纤维食品的食谱等。
在化学或民用工程工业方面，如可用本发明得到的β-1，3-葡聚糖作为用于液体组合物(如浸膏或胶泥)的分离还原剂。
本发明使得可以以高生产力和高产率(按碳水化合物计)及高效率生产β-1，3-葡聚糖。
下列参考实施例及操作实施例用于详细说明本发明。
已经于1994年5月7日将下列实施例1中得到的突变体，即土壤杆菌生物变种I GA-27和土壤杆菌生物变种I GA-33保藏在中国典型培养物保藏中心(中国武汉)，保藏号分别为CCTCC M94032和CCTCCM94033。参考实施例PEPCK活性的检测
由于PEPCK活性水平极低，所以培养土壤杆菌生物变种I10C3K(称为亲本菌株)并检测亲本菌株的PEPCK活性作为初步研究。
首先，使亲本菌株在含有谷氨酸作为唯一碳源(不包括琼脂)的液体培养基(实施例1下文描述的培养基B)中生长。从所得的培养液中，按如下步骤制备粗酶。将处于对数生长期亲本菌株的培养液离心以回收细胞。用0.1M Tris-盐酸缓冲液(pH7)洗涤这些细胞，并悬浮于相同的缓冲液中，用声处理破碎。将细胞悬浮液离心以除去细胞碎片。此后，逐渐加入硫酸铵达到80％的饱和度，然后将混合物放在4℃过夜。将混合物进一步离心，将沉淀溶解，对相同的缓冲液作透析。透析产物用作酶样品。
按照Hansen等人的方法，用分光光度计(Shimadzu Spectropho-tometer UV-160)测定在下文表1中所列的各不同反应系统中上述酶样品在340hm吸收值的改变(ΔE340/分)，结果列于表1。
上述Hansen等人的方法是基于PEPCK是一种催化磷酸烯醇丙酮酸+ADP+CO2→草酰乙酸+ATP的反应(以及该反应的逆反应)的酶(作为催化剂，Mn2+是必需的)。在苹果酸盐脱氢酶的存在下，由NADH将草酰乙酸盐还原为苹果酸盐。在该反应中，减少的NADH量用草酰乙酸盐量来化学计算。用其在340nm处吸收值的变化来测定NADH的降低率。
                        表1
反应系统     ΔE340/分/ml
完全系统(磷酸烯醇丙酮酸，ADP，HCO3 -，MnCl2) 0.239(100％)
除去磷酸烯醇丙酮酸除去ADP除去HCO3 -除去MnCl2加入IDP代替ADP加入GDP代替ADP加入MgCl2代替MnCl2加入丙酮酸代替磷酸烯醇丙酮酸去掉苹果酸脱氢酶     0.014(6％)0.012(5％)0.013(5％)0.013(5％)0.018(8％)0.020(8％)0.020(8％)0.016(7％)0.240(100％)
从上面的结果清楚地看出：该反应需要磷酸烯醇丙酮酸、ADP、HCO3 -和MnCl2，IDP或GDP均不能代替ADP、MgCl2不能代替MnCl2，丙酮酸也不能代替磷酸烯醇丙酮酸。因此，可以肯定该反应是由PEPCK催化。
在PEPCK活性的检测中，所用的酶样品未被完全纯化而含有苹果酸脱氢酶，因此，不必加入苹果酸脱氢酶。
PEPCK活性(ΔE340/分/mg蛋白质)是通过从表1中描述的完全系统的ΔE340/分/ml减去无ADP(除去ADP)系统的ΔE340/分/ml，然后将差转变成每克蛋白质活性值而得到的活性。用Lowry等人的方法(J.Biol.Chem.， 193，265(1851))测定酶中的蛋白质量。
亲本菌株酶中的蛋白质量是1.18mg/ml。该亲本菌株的PEPCK活性(ΔE340/分/mg蛋白质)为0.192[(0.239-0.012)/1.18＝0.192]。
实施例1
用200μg/ml NTG将土壤杆菌生物变种I10C3K(亲本菌株)在32℃处理30分钟以诱导突变，并将其放在由表2中培养基A栏所示的组合物组成的培养基(培养基A)中。确定生长后(32℃，2天)，将菌落复制平铺在在由表2培养基B栏所示的组合物组成的培养基(培养基B)中。
检出表现出不生长或仅仅生长迟缓的微生物(不利用谷氨酸的突变体)，命名为土壤杆菌生物变种IGA-27和土壤杆菌生物变种IGA-33。
                      表2
      组分    培养基A(g/l)   培养基B*3(g/l)
葡萄糖谷氨酸(NH4)2HPO4KH2PO4MgSO4·7H2OFeSO4·7H2OCaCl2·2H2OMnSO4·4-6H2OZnCl2CoCl2琼脂*1       10-1.51.00.50.050.050.020.0010.00120         -101.51.00.50.050.050.020.0010.00120
PH*2       7.0         7.0
*1在液体培养基的情况下除去掉琼脂
*2用氨水调整
*3用谷氨酸作为唯一碳源
用与参考实施中相同的方法检测每个得到的突变体的PEPCK活性。由于突变体几乎不在含有谷氨酸作为唯一碳源的培养基B中生长，所以应用通过在实施例2中描述的培养基C培养得到的细胞。结果列于表3。
                          表3
          菌株          PEPCK活性ΔE340/分/mg蛋白质
GA-27(FERM BP-4350)GA-33(FERM BP-4351)亲本菌株(10C3K)          0.0035(28％)0.0028(22％)0.0127(100％)
从上面的结果清楚地表明，若将亲本菌株的PEPCK活性作为100％，这些突变体，土壤杆菌生物变种I GA-27(FERMBP-4350，IFO 15490)和GA-33(FERM BP-4351，IFO 15491)的PEPCK活性分别低达28％和22％。
实施例2
制备表4中所列的种子培养基并以每个烧瓶20ml，将其分到200ml的锥形瓶中。将每个烧瓶在118℃高压灭菌10分钟，用一菌环实施例1得到的土壤杆菌生物变种I GA-27(FERM BP-4350)，土壤杆菌生物变种I GA-33(FERM BP-4351)或土壤杆菌生物变种I 10C3K的斜面培养物接种每个得到的培养基，并在32℃培养24小时以得到种子培养液。
作为主要培养基，制备表4中描述的培养基C并分散到200ml锥形烧瓶中。将每个烧瓶在118℃高压灭菌10分钟后，将另高压灭菌的葡萄糖加至含有主要培养基中的烧瓶中。
将2ml表现为完全生长的上述种子培养物转移到主要培养基中并在32℃培养96小时。培养完成后，以1N的终浓度加入氢氧化钠以便溶解培养液中生产的curdlan，然后经离心除去细胞。将得到的上清液适当地稀释，并用酚-硫酸法检测其全部的糖含量。此外，用葡萄糖检测盒(由Technikon生产的)测定培养基中残余的葡萄糖量。从全部的糖含量中减去残余的葡萄糖含量，用0.9乘以得到的数字，得到生产的Curdlan量。表5中列出了有关本发明突变体生产的Curdlan数量，残余的葡萄糖含量(表5中称为“残余的葡萄糖”)和按葡萄糖计算的Curdlan产率(表5中称为“以葡萄糖计的”Curdlan产率)。
                      表4
  组分    种子培养基     主要培养基(培养基C)
  葡萄糖琥珀酸氨水(NH4)2HPO4KH2PO4MgSO4·7H2OFeSO4·7H2OMnSO4·4-6H2OZnCl2CoCl2CaCO3CuSO4·5H2OCaCl2·2H2O     10.0g/l--1.5g/l1.0g/l0.5g/l0.1g/l0.02g/l1.0mg/l1.0mg/l3.0g/l----     75.0g/l2.5g/l3.5ml/l-1.0g/l0.5g/l0.005g/l-0.1mg/l0.1mg/l-0.1mg/l0.01g/l
  pH(氨水)     7.2     7.5
                              表5
        菌株     生产的Curdlan量(mg/ml)   残余的葡萄糖(μg/ml)  Curdlan产率*(以葡萄糖计)(％)
GA-27(FERM BP-4350)GA-33(FERM BP-4351)亲本(10C3K)      38.640.934.0     1.20.37.5     52.354.750.3
*：Curdlan产率(以葡萄糖计)＝(生产的Curdlan量/利用的葡萄糖)×l00
从表5可以看出，由两个突变体，GA-27和GA-33生产的Curdlan量均大于亲本菌株的生产量。用GA-33得到的Curdlan产率(以葡萄糖计)比亲本菌株大至少约4％，而这种差异对于商业上β-1，3-葡聚糖的生产有显著的经济意义。
实施例3
制备表6中描述的种子培养基，并以每个烧瓶20ml分散到200ml的锥形烧瓶中。将每个烧瓶在118℃高压灭菌10分钟。然后用一菌环土壤杆菌生物变种I 10C3K、土壤杆菌生物变种I GA-27(FERM BP-4350)或土壤杆菌生物变种I GA-33(FERM BP-4351)的斜面培养物接种培养基并在32℃培养24小时，产生种子培养液。
制备表6中描述的除去葡萄糖外的主要培养基，并倒入5升的罐发酵器中，然后灭菌。将葡萄糖单独灭菌，将葡萄糖加至培养基后，将125ml表现出完全生长的种子培养液转移到主要培养基中，并在700rpm搅拌，1.0l/分通气率，2.5l液体体积，及32℃的条件下培养，直到消耗完加入的葡萄糖。以1N的终浓度将氢氧化钠加到所得的培养液中，并用与实施例2中相同的方法测定生产的Curdlan量。结果列于表7。
此外，将100ml的1N氢氧化钠加到20ml上述培养液中，并将所得的混合物搅拌约1小时以溶解产物Curdlan。然后经离心(9000rpm，10分钟)除去细胞。用4N HCl中和，得到糊状的中和凝胶。将含凝胶的溶液离心，用去离子水洗涤沉淀部分并再次离心(9000rpm，10分钟)。将上述方法重复两次，以便足以脱盐，用丙酮洗涤沉淀，离心，减压干燥以回收粉末形式的Curdlan。将200mg的该Curdlan部分在10ml去离子水中溶胀，匀化，脱气，然后放入试验试管并在100℃加热10分钟。在该方法中，得到热可成胶产物(热凝结的凝胶)。用电流计(SUN Scientific Co.，Ltd.)检测该凝胶的凝胶强度。结果列于表7。
                         表6
组分     种子培养基     主要培养基
葡萄糖琥珀酸氨水KH2PO4MgSO4·7H2OFeSO4·7H2OMnSO4·4-6H2OZnCl2CoCl2CuSO4·5H2O消泡剂*       10.0g/l1.5g/l2.0ml/l1.0g/l0.5g/l0.1g/l0.02g/l0.001g/l0.001g/l----      75.0g/l2.5g/l3.5ml/l1.0g/l0.5g/l0.005g/l0.002g/l0.05mg/l0.05mg/l0.05mg/l1.0ml/l
pH(氨水)       7.6      7.5
*硅油(Shin-Etsu.Chemical.Co.，Ltd.)
                             表7
        菌株    培养时间(小时)    生产的Curdlan量(mg/ml)    凝胶强度(g/cm2)
GA-27(FERM BP-4350)GA-33(FERM BP-4351)亲本(10C3K)      908493     38.641.337.2     998102098.2
上述结果表明本发明突变体GA-27和GA-33的Curdlan生产能力远高于亲本菌株。
实施例4
制备表6中描述的种子培养基并以每个烧瓶20ml的量分至数个200ml的锥形瓶中。将每个烧瓶在118℃高压灭菌10分钟。然后，用-菌环土壤杆菌生物变种I 10C3K、土壤杆菌生物变种I GA-27(FERM BP-4350)或土壤杆菌生物变种I GA-33(FERM BP-4351)的斜面培养物接种培养基并在32℃培养24小时以得到种子培养液。
制备表6中描述的除去葡萄糖外的主要培养基，然后倒入5升的发酵罐中，灭菌。将葡萄糖单独灭菌。将一半量的葡萄糖加到培养基中，将125ml表现为完全生长的上述种子培养物转移至主要培养基，并于以800rpm搅拌率，1.0l/分通气率，2.5l液体体积和32℃的条件下培养。培养24小时后，加入剩余的一半葡萄糖并继续培养直到完全消耗完加入的葡萄糖。用与实施例2和3相同的方法测定生产的Curdlan量和凝胶强度。结果列于表8。
                              表8
        菌株   培养时间(小时)    生产的Curdlan量(mg/ml)    凝胶强度(g/cm2)
  GA-27(FERM BP-4350)GA-33(FERM BP-4351)亲本(10C3K)     857690     39.743.138.9      1010997990
上述结果表明甚至分两次加入葡萄糖，本发明突变体的Curdlan生产能力仍高于亲本菌株的能力。
实施例5
使实施例1中得到的土壤杆菌生物变种I GA-27、土壤杆菌生物变种I GA-33及其亲本菌株分别在表2描述的液体培养基、培养基B(各含有10g/l葡萄糖、琥珀酸、谷氨酸、富马酸、α-氧代戊二酸或苹果酸作为唯一碳源)中生长(32℃，48小时)。
为了研究每个培养基中菌株的生长程度，用去离子水将每个培养液稀释5倍，并用分光光度计(Perkin-ElmerSpectrophotometer35 cell 12×75mm The Perkin-Elmer Corporation)测定在590nm处的吸收值(光密度)。结果列于表9。
                            表9
    碳源 亲本菌株        GA-27(FERM BP-4350)       GA-33(FERM BP-4351)
葡萄糖琥珀酸谷氨酸富马酸α-氧代戊二酸苹果酸   0.1200.0900.1500.0920.1050.086       0.1100.0080.0100.0060.0120.009      0.1120.0050.0070.0050.0080.004
同样，在表2描述的固体培养基，培养基B(各含有表10中描述的10g/l葡萄糖、琥珀酸、谷氨酸、富马酸、α-氧代戊二酸和苹果酸作为唯一碳源)中生长(32℃，48小时)，用肉眼评估在不同培养基中每个菌株的生长程度。结果列于表10。
                            表10
       碳源  亲本菌株      GA-27(FERM BP-4350)        GA-33(FERM BP-4351)
  葡萄糖琥珀酸谷氨酸富马酸α-氧代戊二酸苹果酸     ++++++++++++         ++-±-±-          ++-----
++：生长良好
 +：生长
±：偶尔零星地生长
 -：不生长
上述结果表明，尽管亲本菌株在分别含有这些有机酸或氨基酸作为唯一碳源的培养基中生长，但本发明的突变体GA-27和GA-33并不是在任何培养基中均有可观察到的生长。

Claims (5)

1.一种属于土壤杆菌生物变种I的、能生产β-1，3-葡聚糖并且是磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性不足或缺乏的微生物，所述微生物选自土壤杆菌生物变种IGA-27，保藏号CCTCC M94032，或土壤杆菌生物变种IGA-33，保藏号CCTCC M94033。
2.一种生产β-1，3-葡聚糖的方法，它包括在培养基中培养权利要求1的微生物，生产β-1，3-葡聚糖，然后回收生产的β-1，3-葡聚糖。
3.根据权利要求2的方法，其中所述β-1，3-葡聚糖是Curdlan。
4.根据权利要求2的方法，其中所述培养基是液体培养基。
5.根据权利要求2的方法，其中所述微生物是在有氧条件下培养的。
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