CN101078006A - 一株高产四甲基吡嗪的短小芽孢杆菌 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株高产四甲基吡嗪的短小芽孢杆菌，名为Bacillus pumilus RX3－17，已于2006年4月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC M 206043；该菌株是从土壤中分离获得的，形态为棒杆状，长1.5～3.0微米，直径0.6～0.7微米，菌落颜色为乳白色；该菌株具有典型的短小芽孢杆菌的生理生化特征；该菌株的16S rDNA序列与其它多株短小芽孢杆菌的16S rDNA序列有99％的相似性。本发明属于生物技术领域，可以利用该菌株以葡萄糖为底物生产四甲基吡嗪，解决微生物发酵法生产四甲基吡嗪中菌种发酵产物浓度低的瓶颈问题。

Description

一株高产四甲基吡嗪的短小芽孢杆菌
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地说涉及一株新分离的高产四甲基吡嗪的短小芽孢杆菌。
背景技术
四甲基吡嗪(2，3，5，6-tetramethylpyrazine)是在1957年首先从Ligusticumwallichii中被分离出来的。四甲基吡嗪具有可可、咖啡、乳糖、洋酒、格蓬等香气，广泛用于食品、卷烟、酒类等香晶香料行业。四甲基吡嗪还是活血行气祛瘀中药川芎中起主要作用的一种活性生物碱。近些年来随着对其研究的深入，人们不断发现其在药学方面的宝贵价值，现已作为循环、中枢神经、呼吸及其它系统相关疾病的大宗用药，广泛应用于心脑血管疾病、呼吸系统疾病、肾小球疾病等的治疗。
四甲基吡嗪的生产方法可分为生物合成法、直接从植物中提取法和化学合成法三种。
利用生物工程技术，主要指微生物工程技术，包括菌种筛选诱变技术和发酵工程技术等等来生产四甲基吡嗪，目前尚未见国内研究报道，而国外研究则较多，主要集中在法、日、德、美等国。
四甲基吡嗪可由多种糖发酵得到。生物合成法生产四甲基吡嗪的研究现状介绍如下。
Kosuge等人最早证明了微生物能合成吡嗪类物质，他们发现枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)有产四甲基吡嗪的能力(1962)。现在人们知道一些细菌和真菌有合成不同烷基吡嗪的能力(Seitz，1994；Gallois，1984)。Yamaguchi等人曾经利用这些微生物来进行液体发酵，但结果发现发酵液中吡嗪浓度太低，未能达到工业化的要求(1993)。
Itohiki-natto由于具有独特的吡嗪风味而成为最流行的发酵食品之一。它是日本人利用一种被称为纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)的微生物在大豆固体培养基上发酵而成。然而，由于固体发酵所使用的主要是一些经验性的方法，发酵的结果并不太如人意，所得到的香料化合物产量湿重不超过22微克/千克(Kosuge等，1971)。
法国Besson等人在此领域做了大量工作，他们利用一株枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis IFO 3013)在大豆固体培养基上进行发酵实验，得到了0.58克/千克的产量(1998)。这是迄今为止所有文献报道的生物合成法生产四甲基吡嗪的最高产量，但仍尚需大量的工作才可能工业化生产。
从植物中萃取四甲基吡嗪的方法因原料来源有限，且原料中四甲基吡嗪的含量太低，提取成本太高，无法实现工业化；化学合成法普遍存在较严峻的环保问题，反应条件一般较剧烈，对设备要求较高，且产品不是天然的；生物合成法具有产品绿色天然、成本低、反应条件温和、环境污染小等等突出优点，是将来四甲基吡嗪合成研究的方向，有极好的发展前景，但从自然界中筛选四甲基吡嗪产生菌是一项十分艰巨的工作，筛选到的野生菌的产量又往往非常低，利用其它微生物技术的起点很低，所以目前国际上用生物合成法生产四甲基吡嗪的技术尚未成熟，未能进行产业化生产。
发明内容
本发明的目的在于针对现有生产四甲基吡嗪的技术难点，提供一株新分离的以葡萄糖为底物高产四甲基吡嗪的短小芽孢杆菌，可以用此菌株发酵生产四甲基吡嗪。
本发明涉及的短小芽孢杆菌名为Bacillus pumilus RX3-17，已于2006年4月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 206043。
上述Bacillus pumilus RX3-17 CCTCC M 206043菌株的生理生化特征如表1所示。
表1  Bacillus pumilus RX3-17 CCTCC M 206043菌株的生理生化特征
    特征     结果
    棒杆状直径长芽孢椭圆体肿胀孢子囊VP反应VP反应的pH利用糖产酸葡萄糖阿拉伯糖木糖甘露醇果糖利用葡萄糖产气水解反应酪蛋白明胶     +0.6～0.7μm1.5～3.0μm++-+5.0+++++++
    淀粉吐温80七叶灵利用柠檬酸盐利用丙酸盐降解酪氨酸苯丙氨酸脱氨酶NO3到NO2吲哚pH 5.7时生长不同NaCl浓度时生长2％ NaCl5％ NaCl7％ NaCl10％ NaCl不同温度时生长45℃50℃55℃0.001％溶菌酶时生长精氨酸脱氢酶     -+-+-----+++++++-+-
上述Bacillus pumilus RX3-17 CCTCC M 206043菌株的16S rDNA序列与其它多株短小芽孢杆菌的16S rDNA序列有99％的相似性。
上述Bacillus pumilus RX3-17 CCTCC M 206043菌株，用于以SV发酵培养基发酵生产四甲基吡嗪。所述SV发酵培养基配方为：1升蒸馏水中含：200克葡萄糖，50克大豆蛋白胨，30克(NH4)2HPO4，15毫升的维生素混合液。其中维生素混合液组成为：1升蒸馏水中含：1.0毫克生物素，1.0毫克维生素B1，5.0毫克维生素B2，25毫克维生素B6，50毫克对氨基苯甲酸，100毫克泛酸钙，100毫克烟酸。
上述Bacillus pumilus RX3-17 CCTCC M 206043菌株，用于以SV发酵培养基发酵生产四甲基吡嗪时，发酵温度为37℃，在500毫升的锥形瓶中装50毫升发酵液，置于摇床上以120转/分钟的转速培养96～120小时，可得到成熟的四甲基吡嗪发酵液。
本发明提供的高产四甲基吡嗪的短小芽孢杆菌解决了微生物发酵法生产四甲基吡嗪中菌种发酵产物浓度低的瓶颈问题。微生物发酵法生产四甲基吡嗪具有原料价廉易得、反应条件温和、产品绿色天然、成本较低、环境友好等优点。
附图说明
本发明涉及的短小芽孢杆菌名为Bacillus pumilus RX3-17，已于2006年4月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 206043。
附图1为本发明的Bacillus pumilus RX3-17 CCTCC M 206043菌株放大2700倍的电镜照片。
具体实施方式
实施例一：
步骤1：Bacillus pumilus RX3-17 CCTCC M 206043菌株的诱变筛选：
从苹果园、葡萄园等地取得土样，用生理盐水悬浮后在80℃条件下加热10分钟，然后划线涂布到营养琼脂培养皿中，在37℃条件下培养。营养琼脂培养基配方为：1升蒸馏水中含：蛋白胨10克，牛肉膏3克，氯化钠5克，琼脂18克。培养基的初始pH值为7.2，灭菌温度为121℃，灭菌时间为15分钟。
挑出单菌落后，接种于营养肉汤培养基中，在37℃条件下置于120转/分钟的摇床上培养。待长至对数生长中期后，将菌体悬浮于0.05摩尔/升的Tris-马来酸缓冲液(pH 6.0)中，用0.5毫克/升的亚硝基胍处理30分钟。采用稀释法结束诱变过程后，将诱变培养物置于摇床上培养5小时，然后适当稀释并涂布于营养琼脂培养皿中培养，用做进一步的筛选。营养肉汤培养基制备方法与上述营养琼脂培养基的制备方法相同，只是不加入琼脂。
由生理生化鉴定实验表明，通过上述实验得到的菌株形态为棒杆状，长1.5～3.0微米，直径0.6～0.7微米，菌落颜色为乳白色，产芽孢，VP反应呈阳性，可利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇、果糖产酸，可水解酪蛋白、明胶、吐温80，可利用柠檬酸盐，可在质量百分比为10％的NaCl中生长，可在50℃下生长，其16S rDNA序列与其它多株短小芽孢杆菌的16S rDNA序列有99％的相似性。
该菌株定名为Bacillus pumilus RX3-17，已于2006年4月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 206043。
步骤2：制备上述Bacillus pumilus RX3-17 CCTCC M 206043菌株的细胞液体培养物：
挑取用营养琼脂培养基斜面培养的Bacillus pumilus RX3-17 CCTCC M 206043菌株一环，接种在装有已灭菌的25毫升营养肉汤培养基的300毫升锥形瓶中，于37℃、120转/分钟在摇床上培养12小时，即制得Bacillus pumilus RX3-17 CCTCC M 206043菌株的细胞液体培养物。
步骤3：利用上述Bacillus pumilus RX3-17 CCTCC M 206043菌株，以含160克/升葡萄糖的SV发酵培养基获得成熟的四甲基吡嗪发酵液：
将通过实施例2的方法获得的Bacillus pumilus RX3-17 CCTCC M 206043菌株的细胞液体培养物以体积百分比为6％的接种量接种到装有已灭菌的50毫升SV发酵培养基的500毫升锥形瓶中，于37℃、120转/分钟在摇床上培养。在第96小时四甲基吡嗪的浓度达到1.50±0.07克/升，即得成熟的四甲基吡嗪发酵液。
上述含160克/升葡萄糖的SV发酵培养基配方为：1升蒸馏水中含：160克葡萄糖，50克大豆蛋白胨，30克(NH4)2HPO4，15毫升维生素混合液，调节pH至7.0。其中维生素混合液组成为：1升蒸馏水中含：1.0毫克生物素，1.0毫克维生素B1，5.0毫克维生素B2，25毫克维生素B6，50毫克对氨基苯甲酸，100毫克泛酸钙，100毫克烟酸。
实施例二：利用上述实施例一步骤1和2的方法获得的Bacillus pumilus RX3-17 CCTCCM 206043菌株，以含180克/升葡萄糖的SV发酵培养基获得成熟的四甲基吡嗪发酵液：
与上述实施例一的步骤3相同，所不同的只是将葡萄糖浓度改为180克/升。在第104小时得到成熟的发酵液，其中四甲基吡嗪的浓度达到1.79±0.08克/升。
实施例三：利用上述实施例一步骤1和2的方法获得的Bacillus pumilus RX3-17 CCTCCM 206043菌株，以含200克/升葡萄糖的SV发酵培养基获得成熟的四甲基吡嗪发酵液：
与实施例一的步骤3相同，所不同的只是将葡萄糖浓度改为200克/升。在第112小时得到成熟的发酵液，其中四甲基吡嗪的浓度达到2.22±0.06克/升。
实施例四：利用上述实施例一步骤1和2的方法获得的上述Bacillus pumilus RX3-17CCTCC M 206043菌株，以含220克/升葡萄糖的SV发酵培养基获得成熟的四甲基吡嗪发酵液：
与实施例一的步骤3相同，所不同的只是将葡萄糖浓度改为220克/升。在第120小时得到成熟的发酵液，其中四甲基吡嗪的浓度达到1.67±0.05克/升。

Claims (6)

1.一株高产四甲基吡嗪的短小芽孢杆菌，其特征在于：该短小芽孢杆菌名为Bacilluspumilus RX3-17，已于2006年4月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 206043，该Bacillus pumilus RX3-17 CCTCC M 206043菌株的细菌学特征是：形态为棒杆状，长1.5～3.0微米，直径0.6～0.7微米，菌落颜色为乳白色，产芽孢，VP反应呈阳性，可利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇、果糖产酸，可水解酪蛋白、明胶、吐温80，可利用柠檬酸盐，可在质量百分比为10％的NaCl中生长，可在50℃下生长，所述Bacillus pumilus RX3-17CCTCC M 206043菌株的16S rDNA序列与其它多株短小芽孢杆菌的16S rDNA序列有99％的相似性。
2.如权利要求1所述的高产四甲基吡嗪的短小芽孢杆菌，其特征在于：所述Bacilluspumilus RX3-17 CCTCC M 206043菌株，用于发酵法生产四甲基吡嗪。
3.如权利要求2所述的高产四甲基吡嗪的短小芽孢杆菌，其特征在于：所述Bacilluspumilus RX3-17 CCTCC M 206043菌株用于发酵法生产四甲基吡嗪以SV发酵培养基发酵生产四甲基吡嗪。
4.如权利要求3所述的高产四甲基吡嗪的短小芽孢杆菌，其特征在于：用所述Bacillus pumilus RX3-17 CCTCC M 206043菌株以SV发酵培养基发酵生产四甲基吡嗪，所述SV发酵培养基配方为：1升蒸馏水中含：160～220克葡萄糖，50克大豆蛋白胨，30克(NH4)2HPO4，15毫升维生素混合液。
5.如权利要求4所述的高产四甲基吡嗪的短小芽孢杆菌，其特征在于：所述SV发酵培养基配方中维生素混合液组成为：1升蒸馏水中含：1.0毫克生物素，1.0毫克维生素B1，5.0毫克维生素B2，25毫克维生素B6，50毫克对氨基苯甲酸，100毫克泛酸钙，100毫克烟酸。
6.如权利要求2或3所述的高产四甲基吡嗪的短小芽孢杆菌，其特征在于：用所述Bacillus pumilus RX3-17 CCTCC M 206043菌株以SV发酵培养基发酵生产四甲基吡嗪，发酵温度为37℃，在500毫升的锥形瓶中装50毫升发酵液，置于摇床上以120转/分钟的转速培养96～120小时，可得到成熟的四甲基吡嗪发酵。
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