CN1027084C - 生产l-山梨糖的方法 - Google Patents
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Abstract
L-山梨糖是维生素C合成过程中的重要中间体,现在可以用微生物氧化作用从D-山梨醇得到高产量的L-山梨糖,所使用的的微生物是属于葡糖杆菌属中的细菌,该菌利用D-山梨醇作为单一碳源的生长能力比它的亲株降低了。
Description
本项发明是关于L-山梨糖的产生菌和L-山梨糖的生产方法,特别是使用既能从D-山梨醇产生L-山梨糖、又降低了利用D-山梨醇作为唯一碳源生长能力的葡糖酸杆菌属(Gluconobacter)的菌株生产L-山梨糖的方法。
本项发明的目的是提供一项在维生素C合成中的一个重要中间体L-山梨糖的工业上经济的生产方法。
现在L-山梨糖是用微生物氧化D-山梨醇生产的,所使用的微生物主要是葡糖酸杆菌属中的细菌。在用发酵法生产L-山梨糖的常规生产方法中,以D-山梨醇作为原料,L-山梨糖的产量超过90%,但副产品如:D-果糖,5-酮基果糖,2-酮基-D-葡萄糖酸和低分子有机酸也同时产生;从所希望的产率出发,这个方法不能认为是完美的。
因此,在维生素C的工业生产中,要减少原料的费用,一个很重要的问题是提高D-山梨醇到L-山梨糖的转化率。
在这种情况下,本项工作的发明者为提高L-山梨糖的发酵率做了许多研究工作,并发现:通常用于生产L-山梨糖的葡糖酸杆菌属的菌株经诱变后产生的菌株降低了用D-山梨醇作单一碳源生长的能力,并明显地提高了由D-山梨醇到L-山梨糖的转化能力,因而发展了本项发明。
本项发明中的一个目的是提供用具有降低了以D-山梨醇为单一碳源
生长能力的葡糖酸杆菌属的菌株生产L-山梨糖的方法。另外一个目的是提供用于上述生产方法中的L-山梨糖产生菌。
任何微生物,只要它们属于葡糖酸杆菌属,并具有产生L-山梨糖的能力和降低了利用D-山梨醇作单一碳源生长能力,都可以应用于包括在本项发明的生产方法中。这类微生物可以由葡糖酸杆菌属中产L-山梨糖的菌做亲株经诱变而得到。可以做为这类亲株的微生物菌种例示之可列成下表。
种名 菌株号
氧化葡糖酸杆菌 IFO3189,IFO12467
(Gluconobacter oxydans)
弱氧化葡糖酸杆菌 IFO3254,IFO3255
(Gluconobacter oxydans) IFO3256,IFO3257
IFO12528
生黑葡糖酸杆菌 IFO3292,IFO3293
(Gluconobacter melanoge- IFO3294
nus)
白色葡糖酸杆菌 IFO3250,IFO3253
(Gluconobacter albidus)
荚膜葡糖酸杆菌 IFO3462
(Gluconobacter capsulat-
us)
蜡色葡糖酸杆菌 IFO3263,IFO3264
(Gluconobacter cerinus) IFO3265
种名 菌株号
二氧丙酮葡糖酸杆菌 IFO3271,IFO3274
(Gluconobacter dioxyace-
tonicus)
葡萄糖酸葡糖酸杆菌 IFO3285,IFO3286
(Gluconobacter gluconic-
us)
工业葡糖酸杆菌 IFO3260
(Gluconobacter industrius)
非氧化葡萄糖酸葡糖酸杆菌 IFO3275,IFO3276
(Gluonobacter nonoxygluc-
onicus)
注:上述菌株都是已知菌,都列在“菌种目录”第七版,1984,
日本大阪发酵研究所(IFO)出版。
用于本项发明中的微生物可以很清楚的同它们的亲株区分开,因为它在含有D-山梨醇为单一碳源的无机盐培养基中生长特别慢。不管培养基是液体还是固体都是这样。当使用固体培养基时,平板复制培养法会很方便的把它们与亲株区分开。如果使用液体培养基,可将本项发明中涉及的微生物接种于以D-山梨醇为单一碳源的无机盐培养基中,其培养条件与亲株使用的条件相同,一般是在30℃,震荡培养1-3天。根据培养物的光吸收值,混浊度或者细胞的重量测定其培养结果即生长程度就可以很方便的把这些微生物同它们的亲株区分开。本项发明中所用的微生物也会生长,但其生长
程度比它们的亲株要低;其生长程度比亲株的1/10还低,那就更好了。
本项发明中的微生物很容易通过一般的方法被诱变和分离。
这就是说将它们的亲株经过一般诱变处理之后,如,紫外线,X-射线或γ-射线照射,或化学诱变剂如N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍,甲基甲烷磺酸或亚硝酸处理,就可以很容易的诱变出所希望的菌株。
所说的微生物可能具有各种营养缺陷型,抗药性,药物敏感性以及上面所描述一些性状。
能够应用到本项发明中的微生物包括弱氧化葡糖酸杆菌(Gluconobacter suboxydans)BL-9(IFO14489,FERM P-8632)和弱氧化葡糖酸杆菌BL-115(IFO14490,FERMP-8631),它们是由一个产L-山梨糖细菌弱氧化葡糖酸杆菌IFO3254诱变而得的;氧化葡糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)Go-10(IFO14537,FERM BP-1169)和氧化葡糖酸杆菌Go-14(IFO14538,FERM BP-1170),它们是由另一个产L-山梨糖细菌即氧化葡糖酸杆菌IFO12467诱变而得的。
上面描述的IFO号码和FERM P号码分别代表保藏在大阪发酵所(IFO;17-85 Juso-honmachi 2-chome,Yodogawa-ku,Osaka Japan)和保藏在日本国际工商部工业科学技术社的发酵研究所(Yatabemachi-higashi 1-chome,Tsukuba,Ibaragi Japan)中的保藏菌株的编号。FERM BP号码是代表保藏在发酵研究所(FRI)中根据布达佩斯条约所编的保藏菌号。BL-9和BL-115菌株于1986年1月21日保藏在大阪发酵
所(IFO),并且在1986年2月1日保藏于发酵研究所(FRI)。Go-10和Go-14菌株于1986年8月28日保藏于大阪发酵所(IFO),于1986年9月5日保藏于发酵研究所(FRI)。
上述四个菌株还于1987年1月19日保藏于中国武汉中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏号分别为CCTCC No.86-179(BL-9),CCTCC No.86-180(BL-115),CCTCC No.86-181(GO-10)和CCTCC No.86-182(GO-14)。
现在描述微生物氧化D-山梨醇的方法。具体描述如下:在含有D-山梨醇的培养基中,D-山梨醇能够被微生物氧化,在培养液中积累L-山梨糖,L-山梨糖可以收集出来。所使用的微生物属于葡糖酸杆菌属,并且具有产L-山梨糖的能力和降低了利用D-山梨醇作单一碳源生长的能力。
在培养基中所含D-山梨醇的浓度大约是10-50%,最好是20-50%。培养基应该是富集培养基或者是合成培养基,并且至少含有一种碳源和一种氮源,以及无机盐和生长素等。
如果需要的话,D-葡萄糖,D-果糖,D-甘露醇,甘油,乙醇,糖蜜,淀粉水解物等都可以加入作为碳源。例如,当培养的微生物在含有D-山梨醇为单一碳源的培养基中几乎不长,那么,一般来说最好再加一种碳源,其浓度大约是山梨醇浓度的0.1-10%。假若在这种最低限度的培养基中微生物能够生长到一定程度,尽管利用D-山梨醇作单一碳源的生长能力比其亲株来要弱得多,但D-山梨醇原料的一部份仍可能被利用作为碳源,在这种情况下不加其他碳源,也能培养。
可以作为氮源的物质包括含氮的有机物质如:玉米浆,酵母浸出物,干酵母,脱脂大豆粉,肉膏,蛋白胨和酶解酪素氨基酸(Cas
amino acid);无机氮化合物如:硫酸铵,硝酸铵,氯化铵,磷酸铵和液氨;氨基酸如:谷氨酸钠;尿素;和醋酸铵。对微生物生长所必须的各种金属元素,维生素,氨基酸,核酸及磷酸盐等也可以加到培养基中。
一般推荐:在好氧条件下进行培养,也就是震荡培养、发酵缸深层培养等都是最合适的。培养温度应是15-40℃,最好在25-35℃;培养基的PH应在3.0-8.0之间,最好在4.0-6.5之间;培养时间应在10-100小时,最好在15-40小时之间。
依据上述,在最终培养液中产生的L-山梨糖,可以用一个已经在公开范围内发表过的方法把它纯化和分离出来。例如,将最终培养液过滤去掉细菌细胞,用活性炭脱色和减压浓缩,然后用甲醇,乙醇,丙酮等使L-山梨糖结晶以达到分离的目的。
同常规方法相比,本项发明能够提高用微生物氧化作用从D-山梨醇产生L-山梨糖的产率。也就是说,用常规方法从D-山梨醇得到L-山梨糖的产率最多是93%左右,而本项发明所使用的方法能提高2-3%以上;而且副产品如D-果糖、2-酮基葡糖酸和5-酮果糖的产率减少。因此,用本方法提供L-山梨糖,使维生素C生产中占总成本主要部分的原料成本,就会比以前常规方法降低。这样,广泛应用于医药和食品等方面的维生素C就能在较低成本的情况下进行生产。
在下文中,将以一些最佳实施方案为例,对本项发明做更具体的介绍。
实例1
弱氧化葡糖酸杆菌IFO3254,被接种到含有5毫升SCM培养基
(PH7.0)的试管中。培养基的成份含:D-山梨醇2.5%,蛋白胨1.0%,酵母浸出物1.0%。在30℃震荡培养过夜。取上述培养液0.25毫升转入含有25毫升相同培养基的200毫升三角瓶中,在30℃震荡培养6小时。将培养液离心(10000rPM,10分钟),用10毫升Tris-马来酸盐缓冲液(0.05M·PH6.0)将分离出的细胞洗二次。将洗过的细胞悬于5毫升Tris-马来酸盐缓冲液中(2×109细胞/毫升),缓冲液中含有100微克/毫升N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍,在30℃震荡30分钟。离心处理过的溶液,收集细胞并用10毫升0.85%的生理盐水洗二次。
将洗过的细胞转入5毫升SCM培养基中,培养基中要补加2.5的甘油,在30℃震荡培养1小时以促进突变体的分裂。经诱变处理的细胞悬液被涂布在含有甘油(2.5%)作单一碳源的无机盐培养基(表1)平板上,将平板放于28℃培养3天,每个平板上应该形成上百个菌落。
用平板复制培养法将形成的菌落转到含有2.5%D-山梨醇为单一碳源和含2.5%L-山梨糖为单一碳源的二种无机盐培养基平板上,28℃培养3天。这样就可以得到大量的突变体,这些突变体在含甘油为单一碳源的培养基中生长,但在含有D-山梨醇为单一碳源和(或)含有L-山梨糖为单一碳源的无机盐培养基中就不生长或者比起亲株IFO3254的生长要慢得多。
在这些突变体中,有27个是用与实例二中描述的相同方法测定了产L-山梨糖的能力;菌株BL-9和BL-115被选出来了,这两个菌株产L-山梨糖的能力比它们的亲株具有更显著优越性。
表1:无机盐培养基的成份
碳源 25克/升
※L-谷氨酸单钠 2克/升
KH2PO40.47克/升
CaCO30.18克/升
MgSO4·7H2O 0.10克/升
尼克酰胺 30毫克/升
泛酸钙 3毫克/升
对-氨基苯甲酸 1毫克/升
维生素B21毫克/升
FeSO4·7H2O 1.5毫克/升
MnSO4·7H2O 0.1毫克/升
琼脂(固体培养基时用) 20克/升
※注:一般来说,葡糖酸杆菌属的细菌在以谷氨酸为单一碳源时不能生长
表2表示,在具有不同含碳化合物作为单一碳源的各种无机盐培养基中,弱氧化葡糖酸杆菌BL-9(IFO14489,FERM BP-1241)和弱氧化葡糖酸杆菌BL-115(IFO14490,FERM BP-1240)和它们的亲株IFO3254之间生长程度的比较。在比较时使用了下列实验条件:
取上述三个菌株的细胞悬液各一滴,接种到5毫升各种无机盐培养基中,每种培养基的成份见表1,每种培养基含一种碳源(2.5%)见表2。使用试管振荡器(test tube shaker)于30℃培养
2天。向培养液中加0.1毫升1NHCl以溶解剩余的碳酸钙,然后根据溶液的光吸收值(在600nm)决定它们的生长程度。
表2
碳源(2.5%) 菌株
BL-9 BL-115 IFO3254
甘油 1.012 1.939 1.593
D-山梨醇 0.010 0.049 1.584
D-甘露醇 1.895 2.000 1.266
D-果糖 1.033 1.920 1.699
L-山梨糖 0.005 0.058 1.649
D-葡萄糖 0.984 0.840 0.466
表2清楚的表明,菌株BL-9和BL-115在含有山梨醇为单一碳源的培养基中的生长程度比它们的亲株IFO3254明显为更低。
实例2
弱氧化葡糖酸杆菌BL-9(IFO14489,FERM BP-1241)和弱氧化葡糖酸杆菌BL-115(IFO14490,FERM BP-1240)被作为种子。每个菌株都接种到含有20毫升第一代种子培养基(PH6.5)的200毫升的三角瓶中,培养基的成份是:D-山梨醇50克/升,甘油5克/升,L-谷氨酸-钠2克/升,酵母浸出物0.3克/升,KH2PO40.47克/升,MgSO4·7H2O 0.1克/升,CaCO30.18克/升,尼克酰胺30毫克/升,泛酸钙3毫克/升,维生素B21毫克/升,对氨基苯甲酸1毫克/升,FeSO4·7H2O 1.5毫克/升,MnSO4·7H2O 0.1毫克/升。
30℃培养24小时。得到的2毫升培养液被转到含有20毫升第二代种子培养基(修改的第一代培养基,D-山梨醇的浓度增加到200克/升)的200毫升三角瓶中,30℃震荡培养24小时,得到第二代种子培养液。
得到的1毫升第二代种子培养液被转到含有20毫升发酵培养基(PH6.5)的200毫升挡板三角瓶中。培养基的成份是:D-山梨醇300克/升,甘油1克/升,酵母浸出物0.3克/升,KH2PO40.47克/升,MgSO4·7H2O 0.1克/升,CaCO30.18克/升,醋酸铵0.29克/升,尼克酰胺30毫克/升,泛酸钙3毫克/升,维生素B21毫克/升,对氨基苯甲酸1毫克/升,FeSO4·7H2O 1.5毫克/升,和MnSO4·7H2O 0.1毫克/升。30℃,震荡培养24小时。亲株弱氧化葡糖酸杆菌IFO3254同时在相同的条件下培养作为对照。表3表示这些培养实验的结果。在所有的培养结果中,D-山梨醇完全被消耗掉了。
表3:L-山梨糖的产率
菌株 L-山梨糖的克分子产率
(与D-山梨醇的比)
BL-9 97.6%
BL-115 98.8%
IFO3254 93.4%
D-山梨醇和L-山梨糖的含量是用高效液相色谱测定的(流动相:PH2.2的稀硫酸;流动速率:0.5毫升/分钟;检测器:差示折射计),使用的柱子装有磺化聚苯乙烯胶(岛津公司(Shimadzu
Corp.),SCR-101H柱,7.9毫米×30厘米)。
实例3
弱氧化葡糖酸杆菌BL-115(IFO14490,FERM BP-1240)作为种子,用实例2中描述的相同方法进行培养得到第二代种子培养物。
把150毫升所得第二代种子培养液转到含有3升发酵培养基(与实例2中使用的相同)的5升发酵罐中,培养温度30℃,搅拌速率每分钟300转,通气率:2.4升/分钟,培养时间24小时。
在培养过程中,原料D-山梨醇被完全氧化;培养液中积累了L-山梨糖,L-山梨糖的产量对D-山梨醇的比是98.4%。亲株弱氧化葡糖酸杆菌IFO3254在相同的条件下同时培养,培养液中积累的L-山梨糖的量对D-山梨醇的比是93.7%。
实例4
将氧化葡糖酸杆菌IFO12467用N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍进行诱变处理,处理过程与实例1中使用的相同。将得到的细胞悬液涂布在含有甘油作单一碳源的无机盐培养基(表1)平板上,在28℃培养4天后会有上百个菌落形成。
用平板复制培养法将所得到的菌落转到含有D-山梨醇作单一碳源的无机盐培养基平板上,并于28℃培养3天。结果得到了大量的突变体,这些突变体在以甘油为单一碳源的无机盐培养基中生长,但它们在含有D-山梨醇为单一碳源的无机盐培养基中或者不生长或者生长程度比它们的亲株IFO12467要慢很多。
在这些突变体中,有43个被测定了产L-山梨糖的能力,使用的方法与实例5中描述的相同。菌株GO-10(IFO14537,
FERM BP-1169)和GO-14(IFO14538,FERM BP-1170)被选出来了。这两个突变体产L-山梨糖的能力比它们的亲株要高很多。
表4表示,在含有不同含碳化合物作单一碳源的各种无机盐培养基上,氧化葡糖酸杆菌GO-10和氧化葡糖酸杆菌GO-14以及它们的亲株IFO12467之间生长程度的比较。取得这些结果所使用的实验条件与实例1相同。
表4 菌株生长程度比较
碳源(2.5%) 菌株
GO-10 GO-14 IFO12467
甘油 1.148 1.224 1.033
D-山梨醇 0.008 0.008 0.145
D-甘露醇 0.515 0.665 0.774
D-果糖 0.039 0.037 0.049
L-山梨糖 0.006 0.002 0.010
D-葡萄糖 0.739 0.681 0.616
表4很清楚的表明:菌株GO-10和GO-14在以D-山梨醇为单一碳源的无机盐培养基中几乎不长。但应当指出的是,亲株IFO12467以及所选出的菌株GO-10和GO-14在以L-山梨糖为单一碳源的无机盐培养基中也几乎都不长。
实例5
氧化葡糖酸杆菌GO-10(IFO14537,FERM BP-1169)和氧化葡糖酸杆菌GO-14(IFO14538,FERM BP-1170)作
为种子。每个菌都接种到含有20毫升原始培养基(PH6.5)的三角瓶中,培养基的成份如下:D-山梨醇50克/升,甘油5克/升,谷氨酸钠2克/升,酵母浸出物1克/升,KH2PO40.47克/升,MgSO4·7H2O 0.1克/升,CaCO30.18克/升,尼克酰胺30毫克/升,泛酸钙3毫克/升,维生素B21毫克/升,对氨基苯甲酸1毫克/升,FeSO4·7H2O 1.5毫克/升和MnSO4·7H2O 0.1毫克/升。30℃震荡培养24小时。
1毫升所得培养物被转到含有20毫升发酵培养基(修改的原始培养基,D-山梨醇的浓度增加到200克/升)的200毫升三角瓶中,30℃震荡培养40小时。亲株氧化葡糖酸杆菌IFO12467在相同条件下同时培养作为对照。表5是这些培养实验的结果。在最终的培养物中发现,D-山梨醇被完全消耗掉了。
表5 L-山梨糖的产率
菌株 L-山梨糖的克分子产率
(对D-山梨醇的比)
GO-10 96.5%
GO-14 96.3%
IFO12467 90.1%
D-山梨醇和L-山梨糖的含量用实例2中描述的方法测定。
Claims (3)
1、一种生产L-山梨糖的方法,该方法包括利用弱氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobater suboxydans)或氧化葡糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)用微生物学上的方法氧化D-山梨醇,所述微生物是通过突变处理从其亲代菌株中诱导的,该微生物在含D-山梨醇为单一碳源的最低培养基中生长程度低于其亲代菌株生长程度的1/10。
2、根据权利要求1的方法,其中所述微生物是弱氧化葡糖酸杆菌BL-9(CCTCC No.86-179)或弱氧化葡糖酸杆菌BL-115(CCTCC No.86-180)。
3、根据权利要求1的方法,其中该微生物是氧化葡糖酸杆菌GO-10(CCTCC No.86-18)或氧化葡糖酸杆菌GO 14(CCTCC No.86-182)。
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