DK172133B1

DK172133B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af L-sorbose

Info

Publication number: DK172133B1
Application number: DK065887A
Authority: DK
Inventors: Ikuo Nogami; Hideo Shirafuji; Takamasa Yamaguchi; Masahide Oka
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Priority date: 1986-02-11
Filing date: 1987-02-10
Publication date: 1997-11-24
Also published as: CN1027084C; EP0233050B1; DE3781699D1; IE870339L; DK65887D0; CN87100655A; IE60975B1; EP0233050A3; DE3781699T2; EP0233050A2; US4904588A; DK65887A

Description

DK 172133 B1

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af L-sorbose, nærmere betegnet en fremgangsmåde til fremstilling af L-sorbose under anvendelse af mikroorganismer hørende til slægten Gluconobacter og med 5 både evne til at producere L-sorbose ud fra D-sorbitol samt nedsat evne til at vokse med D-sorbitol som eneste kulstofkilde; opfindelsen angår tillige L-sorbose-produ-cerende bakterier.

Formålet med den foreliggende opfindelse er at til-10 vejebringe en industrielt økonomisk produktionsmetode for L-sorbose, et mellemprodukt som er betydningsfuldt ved syntese af vitamin C.

L-sorbose fremstilles nu om stunder ved oxidation af D-sorbitol under anvendelse af mikroorganismer, hoved-15 sageligt bakterier hørende til slægten Gluconobacter. Ved den konventionelle produktionsmetode til dannelse af L-sorbose ved gæring overstiger udbyttet af L-sorbose ud fra D-sorbitol som råmateriale 90%, men der dannes samtidig biprodukter såsom D-fruktose, 5-ketofruktose, 2-20 keto-D-glukonsyre og lavmolekylære organiske syrer. Denne fremgangsmåde kan ikke anses for en perfekt fremgangsmåde hvad angår udbyttet af det ønskede produkt.

Det er således ved industriel produktion af vitamin C meget betydningsfuldt at forbedre effektiviteten 25 af omdannelsen af D-sorbitol til L-sorbose for at nedsætte udgiften til råmaterialet.

Under disse betingelser er der af nærværende opfindere foretaget mange undersøgelser med henblik på forbedring af effektiviteten af gæringsprocessen til fremstil-30 ling af L-sorbose, og det har herved vist sig at bakteriestammer med nedsat evne til at vokse med D-sorbitol som den eneste kulstofkilde, induceret ud fra Gluconobacter-bakterier som bruges konventionelt til fremstilling af L-sorbose, har væsentligt forbedret evne til at omdanne D-35 sorbitol til L-sorbose, hvilket har ført til nærværende opfindelse.

Opfindelsen angår således en fremgangsmåde til fremstilling af L-sorbose, ved hvilken man oxyderer D-sorbitol mikrobiologisk ved hjælp af en mikroorganisme 2 DK 172133 B1 hørende til slægten Gluconobacter, hvilken mikroorganisme er ejendommelig ved at have en vækstgrad i minimumsmedium indeholdende D-sorbitol som den eneste kulstofkilde på mindre end 1/10 af dens moderstammes vækstgrad i 5 samme medium. Opfindelsen angår også L-sorbose-produce-rende mikroorganismer til anvendelse ved den ovennævnte produktionsmetode.

En hvilken som helst mikroorganisme kan bruges til fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse, blot 10 den hører til slægten Gluconobacter og har både L-sor- bose-producerende evne og nedsat evne til at vokse med D-sorbitol som den eneste kulstofkilde. Sådanne mikroorganismer kan induceres ud fra L-sorbose-producerende mikroorganismer hørende til slægten Gluconobacter som moder-15 stammer. Eksempler på mikroorganismearter af slægten

Gluconobacter som kan bruges som sådanne moderstammer er anført nedenfor.

Art Stamme 20

Gluconobacter oxydans IFO 3189, IFO 12467

Gluconobacter suboxydans IFO 3254, IFO 3255 IFO 3256, IFO 3257 IFO 12528

Gluconobacter melanogenus IFO 3292, IFO 3293 25 IFO 3294

Gluconobacter albidus IFO 3250, IFO 3253

Gluconobacter capsulatus IFO 3462

Gluconobacter cerinus IFO 3263, IFO 3264 IFO 3265 2Q Gluconobacter dioxyacetonicus IFO 3271, IFO 3274

Gluconobacter gluconicus IFO 3285, IFO 3286

Gluconobacter industrius IFO 3260

Gluconobacter nonoxygluconicus IFo 3275, IFO 3276

Note: Ovennævnte stammer er kendte stammer som er an- 35 ført i "List of Cultures, 1984, Seventh Edition", offentliggjort af Institute For Fermentation, Osa-ka (IFO), Japan. 1 DK 172133 B1 3

De mikroorganismer der bruges ifølge den foreliggende opfindelsen kan skelnes klart fra deres moderstammer ved,at deres vækst er yderst langsom i minimumsmedier indeholdende D-sorbitol som den eneste kulstofkilde. Det 5 betyder ikke noget om minimumsmediet er flydende eller fast. Når der bruges et fast medium er kopi-pladedyrk-ningsmetoden (replica-plating method) hensigtsmæssig til skelnen fra hovedstammen. Når der bruges et flydende medium er det hensigtsmæssigt at pode den involverede mikro-10 organisme ifølge opfindelsen til et minimumsmediet indeholdende D-sorbitol som den eneste kulstofkilde under de samme betingelser som der bruges til moderstammen, hvorefter man udfører rystekultur, sædvanligvis ved ca.

30°C i 1-3 dage. Den resulterende mikroorganisme kan 15 skelnes fra moderstammen ved måling hensigtsmæssigt af graden af dens vækst i den resulterende kultur på basis af enten den optiske absorption, uklarheden i kulturen eller vægten af bakteriecellerne i kulturen. De mikroorganismer der bruges i henhold til den foreliggende opfin-20 delse skal udvise en vækst hvis grad er mindre end vækstgraden af moderstammen; det foretrækkes i særlig grad at vækstgraden for mikroorganismen til anvendelse ved den foreliggende fremgangsmåde er under 1/10 af moderstammens vækstgrad.

25 Mikroorganismer der bruges i henhold til den fore liggende opfindelse kan let induceres og isoleres ved almindelige metoder.

Det betyder at den ønskede stamme let kan induceres ud fra moderstammen efter sædvanlig mutagenisk be-30 handling såsom bestråling med ultraviolet lys, røntgenstråler eller γ-stråler eller behandling med et kemisk mutagen såsom N-metyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin, metyl-metansulfonsyre eller salpetersyrling.

Disse mikroorganismer kan have forskellige auxo-35 trofier, lægemiddel-resistenser, følsomhed for lægemidler m.v. såvel som de ovenfor beskrevne egenskaber.

4 DK 172133 B1

Mikroorganismer som kan bruges ved den foreliggende opfindelse er blandt andet Gluconobacter suboxydans BL-9 (IFO 14489, FERM P-8632) og Gluconobacter suboxydans BL-115 (IFO 14490, FERM P-8631), der blev frembragt ud 5 fra Gluconobacter suboxydans IFO 3254, en L-sorbose-pro-ducerende bakterie, og Gluconobacter oxydans GO-10 (IFO

14537, FERM BP-1169) og Gluconobacter oxydans GO-14 (IFO

14538, FERM BP-1170), der frembragtes ud fra Gluconobacter oxydans IFO 12467, en anden L-sorbose-producerende bak- 10 terie.

De IFO-numre og FERM P-numre som er anført ovenfor angiver deponeringsnumre hos henholdsvis Institute for Fermentation, Osaka (IFO; 17-85, Juso-honmachi 2-chome, Yodogawa-ku, Osaka, Japan) og Fermentation Research In-15 stitute, Agency of Industrial Science and Technology,

Ministry of International Trade and Industry, Japan yatabemachi-higashi 1-chome, Tsukuba, Ibaragi, Japan); FERM BP-numrene repræsenterer deponeringsnumre under Bu-dapest-traktaten hos FRI. Nævnte stammer BL-9 og BL-115 20 blev deponeret hos IFO den 21. januar 1986 og hos FRI den 1. februar 1986; stammerne GO-10 og GO-14 blev deponeret hos IFO den 28. august 1986 og hos FRI den 5. september 1986.

De hos FRI deponerede BL-9 og BL-115 blev omdannet 25 til deponering under Budapest-traktaten den 22. december 1986 som deponeringsnumrene henholdsvis FERM BP-1241 og FERM BP-1240.

Fremgangsmåden til mikrobiologisk oxidation af D-sorbitol skal nu beskrives. Således kan D-sorbitol oxi-30 deres mikrobiologisk ved dyrkning af mikroorganisme hørende til slægten Gluconobacter og med evne til at producere L-sorbose og nedsat evne til at vokse med D-sorbitol som den eneste kulstofkilde, i et D-sorbitol-holdigt medium for i dyrkningsvæsken at akkumulere L-sorbose der derefter 35 opsamles.

D-sorbitol bør være til stede i dyrkningsmediet i en koncentration på omkring 10-50%, fortrinsvis 20-50%.

5 DK 172133 B1

Dyrkningsmedium bør enten være et beriget medium eller et syntetisk medium og bør indeholde mindst én kulstofkilde, mindst én nitrogenkilde, mineraler, vækstfaktorer og andre sædvanlige indholdsstoffer.

5 Der kan om nødvendigt tilsættes D-glukose, D-fruk- tose, D-mannitol, glycerol, ætanol, melasse, stivelseshydrolysat og andre kendte kulstofkilder. Når der fx dyrkes en mikroorganisme som næsten ikke vokser i et medium indeholdende D-sorbitol som den eneste kulstofkilde, fore-10 trækkes det i almindelighed at der tilsættes en kulstofkilde i en mængde på 0,1-10% af mængden af D-sorbitol. I tilfælde hvor mikroorganismen kan vokse i nogen grad i et sådant minimumsmedium, om end dens evne til at vokse med D-sorbitol som den eneste kulstofkilde er langt sværre 15 end den tilsvarende evne hos moderstammen, kan en del af råmaterialet D-sorbitol udnyttes som kulstofkilde, hvilket muliggør dyrkning uden nogen anden kulstofkilde.

Stoffer kan bruges som nitrogenkilder er bl.a.

n.ltrogenholdige organiske stoffer såsom majsstøbevand, 20 gærekstrakt, tørgær, fedtfrit sojabønnemel, kødekstrakt, pepton og kasaminosyrer; uorganiske nitrogenforbindelser såsom ammoniumsulfat, ammoniumnitrat, ammoniumklorid, ammoniumfosfat og ammoniakvand; aminosyrer såsom natrium-glutamat; karbamid; og ammoniumacetat. Der kan også til-25 sættes forskellige metaller, vitaminer, aminosyrer, nukleinsyrer, fosfater og andre stoffer som er essentielle for mikroorganismens vækst, til mediet.

Der anbefales af dyrkningen udføres under aerobe betingelser, og rystekultur og submergstyrkning foretræk-30 kes i særlig grad. Dyrkningstemperaturen bør være 15- 40°C, fortrinsvis 25-35°C; mediets pH-værdi bør være mellem 3,0 og 8,0, og fortrinsvis mellem 4,0 og 6,5; dyrkningstiden bør være 10-100 timer, fortrinsvis 15-40 timer .

35 L-sorbose i den resulterende kultur, vundet som be skrevet ovenfor, kan renses og fraskilles ved metoder der allerede er offentliggjort. Fx kan den resulterende kultur 6 DK 172133 B1 filtreres til fjernelse af bakterieceller, affarves ved hjælp af aktiviteret kul og derefter koncentreres under nedsat tryk, hvorpå L-sorbose udkrystalliseres ved hjælp af metanol, ætanol, acetone eller lignende opløsningsmid-5 ler til isolering deraf.

I sammenligning med de konventionelle metoder gør den foreliggende opfindelse det muligt at forøge udbyttet af L-sorbose ved fremstilling deraf ud fra D-sorbitol ved mikrobiologisk oxidation. Dvs. at udbyttet af L-sor-10 bose ud fra D-sorbitol opnået ved konventionelle metoder er højst ca. 93%, mens det ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse er mere end 2-3% højere; desuden nedsættes dannelse af biprodukter såsom D-fruktose, 2-ketoglukonsyre og 5-ketofruktose. Den foreliggende 15 fremgangsmåde tilvejebringer følgelig L-sorbose, i hvis fremstilling råmaterialeudgiften repræsenterer en afgørende del af de samlede udgifter ved fremstilling af vitamin C, på mindre kostbar måde end de konventionelle metoder. Som resultat heraf kan vitamin C, der bruges udstrakt i far-20 maceutiske midler, fødevarer og forskellige nydelsesmidler, fremstilles til nedsat pris.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen skal beskrives nærmere ved de følgende eksempler på en foretrukken udførelsesform.

25

Eksempel 1

Gluconobacter suboxydans IFO 3254 blev podet i et reagensglas indeholdende 5 ml SCM-medium (pH 7,0) bestå-20 ende af 2,5% D-sorbitol, 1,0% pepton og 1,0% gærekstrakt, og underkastedes rystedyrkning natten over ved 30°C. 0,25 ml af den resulterende dyrkningssuppe overførtes til en 200 ml stor konisk kolbe indeholdende 25 ml af samme medium og underkastedes rystekultur ved 30°C i 6 timer. Den resulterende dyrkningsvæske centrifugeredes (10.000 opm, 10 minutter) og de fraskilte celler vaskedes to gange med 10 ml tris-maleatpufferopløsning (0,05M, pH 6,0). De va- 9 7 DK 172133 B1 skede celler suspenderedes derefter (2 x 10 celler/ml) i 5 ml tris-maleatpufferopløsning indeholdende 100 pg/ml N-metyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin og rystedes ved 30°C i 30 minutter. Celler opsamledes fra den behandlede op-5 løsning ved centrifugering og vaskedes to gange med 10 ml 0,85%s kogesaltopløsning.

De vaskede celler overførtes derefter til 5 ml SCM-medium suppleret med 2,5% glycerol og underkastedes rystekultur ved 30°C i 1 time for at fremme segregering af mu-10 tanter. Den resulterende cellesuspension underkastedes mutagenisk behandling og udspredtes derpå på plader med et minimumsmedium indeholdende 2,5% glycerol som den eneste kulstofkilde (tabel 1), således at der ville blive dannet ca. 100 kolonier pr. plade og der dyrkedes ved 28°C 15 i 3 dage.

De resultater kolonier overførtes derefter ved ko-pi-pladedyrkningsmetoden til plader med et minimumsmedium indeholdende 2,5% D-sorbitol som den eneste kulstofkilde, og med et minimumsmedium indeholdende 2,5% L-sorbose 20 som den eneste kulstofkilde, og der dyrkedes ved 28°C i 3 dage. Som resultat vandtes der et stort antal mutanter som voksede i det minimumsmedium som indeholdt glycerol som den eneste kulstofkilde, men som enten ikke voksede eller voksede langt langsommere end moderstammen IFO 3254 25 i det minimumsmedium som indeholdt D-sorbitol som den eneste kulstofkilde og/eller i det minimumsmedium som indeholdt L-sorbose som den eneste kulstofkilde.

Blandt disse mutanter undersøgtes 27 for evne til at danne L-sorbose under anvendelse af samme fremgangsmåde 30 som er beskrevet i det følgende eksempel 2; stammerne BL-9 og BL-115 udvalgtes; de er begge udtalt mere fremragende med hensyn til L-sorbose-producerende evne end deres moderstammer.

35 8 DK 172133 B1

Tabel 1

Sammensætning af minimumsmedium

Kulstofkilde 25 g/1 5 *Mononatrium-L-glutamat 2 g/1 KH2P04 0,47 g/1

CaC03 0,18 g/1

MgS04.7H20 0,10 g/1

Nikotinamid 30 mg/1 10 Kalciumpantotenat 3 mg/1 £-Aminobenzoesyre 1 mg/1

Vitamin B2 1 mg/1

FeS04.7H20 1,5 mg/1

MnS04.7H20 0,1 mg/1 15 Agar (til faste medier) 20 g/1 *Note: I almindelighed kan baktier af slægten Gluconobac-ter ikke vokse med L-glutaminsyre som den eneste kulstofkilde.

20

Tabel 2 viser en sammenligning med hensyn til graden af vækst i forskellige medier indeholdende forskellige kulstofholdige stoffer som de eneste kulstofkilder, mellem Gluconobacter suboxydans BL-9 (IFO 14489, FERM BP-1241) 25 og Gluconobacter oxydans BL-115 (IFO 14490, FERM BP-1240) samt deres moderstamme IFO 3254. Til denne sammenligning anvendtes der følgende forsøgsbetingelser: Én dråbe af cellesuspensionen af hver af de nævnte 3 bakteriestammer blev podet i 5 ml af hver af de mini-30 mumsmedier som har den i tabel 1 angivne sammensætning og som indeholder én af de i tabel 2 viste kulstofkilder, (2,5%,) og dyrkedes ved 30°C i 2 dage under anvendelse af en reagensglasryster. Til den resulterende dyrkningsvæske sattes der 0,1 ml 1N saltsyre for at opløse tilbageværende 35 kalciumkarbonat, hvorefter vækstgraden bestemtes på basis af den optiske absorption (ved 600 nm) i opløsningen.

9 DK 172133 B1

Tabel 2 ‘ Stamme

Kulstofkilde, 5 2,5% BL-9 BL-115 IFO 3254

Glycerol 1,012 1,939 1,593 D-sorbitol 0,010 0,049 1,584 D-mannitol 1,895 2,000 1,266 10 D-fruktose 1,033 1,920 1,699 L-sorbose 0,005 0,058 1,649 G-glukose 0,984 0,840 0,466

Som det tydelig ses af tabel 2 har stammerne BL-15 9 og BL-115 begge udtalt lavere vækstgrad i et medium som indeholder D-sorbitol som den eneste kulstofkilde end moderstammen IFO 3254.

Eksempel 2 20

Gluconobacter suboxydans BL-9 (IFO 14489, FERM BP-1241) og Gluconobacter oxydans BL-115 (IFO 14490, FERM BP-1240) brugtes som podeorganismer· Hver af stammerne podedes i en 200 ml stor konisk kolbe indeholdende 20 ml af 25 et første udsædsmedium (pH 6,5) indeholdende 50 g/1 D-sorbitol 5 g/1 glycerol, 2 g/1 mononatrium-L-glutamat, 0,3 g/1 gærekstrakt, 0,47 g/1 KH2P04, 0,1 g/1 MgS04-7H20, 0,18 g/1 CaC03, 30 mg/1 nikotinamid, 3 mg/1 kalciumpantotenat, 1 mg/1 vitamin B2, 1 mg/1 £-aminobenzoesyre, 1,5 mg/1 30 FeS04-7H20 og 0,1 mg/1 MnS04-7H20 og dyrkedes i 30°C i 24 timer. 2 ml af den resulterende dyrkningsvæske overførtes til en 200 ml stor konisk kolbe indeholdende 20 ml af et andet udsædsmedium (modificeret i forhold til første medium ved forøgelse af koncentrationen af D-sorbitol til 35 200 g/1) og underkastedes rystekultur ved 30°C i 24 timer til frembringelse af en anden udsæds-dyrknings væske.

Én ml af den resulterende anden dyrkningsvæske over- 10 DK 172133 B1

førtes derpå til en 200 ml stor skærmplade forsynet konisk kolbe indeholdende 20 ml af et gæringsmedium (pH

6,5) indeholdende 300 g/1 D-sorbitol, 1 g/l glycerol, 0,3 g/1 gærekstrakt, 0,47 g/l KH2PC>4, 0,1 g/l MgS04-7H20, 5 0,18 g/1 CaC03, 0,29 g/1 ammoniumacetat, 30 mg/1 nikotin amid, 3 mg/1 kalciumpantotenat, 1 mg/1 vitamin B2, 1 mg/1 p-aminobenzoesyre, 1,5 mg FeSC>4.7H20 og 0,1 mg/1 MnS04.7H20 og underkastedes rystekultur ved 30°C i 24 timer. Moderstammen Gluconobacter suboxydans IFO 3254 dyr-10 kedes samtidig som kontrol under de samme betingelser.

Tabel 3 viser resultaterne af disse dyrkningsforsøg. I alle de resulterende kulturer viste D-sorbitol sig at være fuldstændig forbrugt.

15 Tabel 3

Udbytter af L-sorbose

Stamme Molært udbytte af L-sorbose (i forhold til D-sorbitol) 20 BL-9 97,6% BL-115 98,8% IFO 3254 93,4%

Indholdet af D-sorbitol og L-sorbose bestemtes ved højtydende væskekromatografering (HPLC; mobil fase: for-25 tyndet svovlsyre med pH 2,2; strømningshastigheden 0,5 ml/minut; detektor: differentialt refraktometer) under anvendelse af kolonner pakket med sulfoneret polystyrengel (fra Shimadzu Corp., SCR-101H kolonne, 7,9 mm x 30 cm) .

30

Eksempel 3

Gluconobacter suboxydans BL-115 (IFO 14490, FERM BP-1240) som podemateriale dyrkedes på samme måde som be-25 skrevet i eksempel 2 til frembringelse af en anden usædskultur.

11 DK 172133 B1 150 Ml af den resulterende anden udsaedskulturvæske overførtes derefter til en 5 1 stor gæringsbeholder indeholdende 3 1 af samme gæringsmedium som anvendt i eksempel 2 og dyrkedes ved 30°C med en omrøringshastighed 5 på 300 opm og en luftning på 2,4 1/minut idet dyrkningen skete i 24 timer.

Under dyrkningen blev råmaterialet D-sorbitol fuldstændig oxyderet; L-sorbose var akkumuleret i dyrkningssuppen til et udbytte af 98,4%, regnet på mængden af D-10 sorbitol. Moderstammen Gluconobacter suboxydans IFO 3254 dyrkedes samtidig under de samme betingelser; L-sorbose viser sig herved at være akkumuleret i dyrkningsmediet til et udbytte på 93,7%, regnet på mængden af D-sorbitol.

15 Eksempel 4

Gluconobacter oxydans IFO 12467 underkastedes mu-tagenisk behandling med N-metyl-N'-nitro-N-nitrosoguani-din med samme fremgangsmåde som beskrevet i eksempel 1.

2Q Den resulterende cellesuspension blev derefter udspredt på plader med minimumsmedium (tabel 1) indeholdende glycerol som den eneste kulstofkilde, således at der ville blive dannet ca. 100 kolonnier pr. plade efter inkube-ring ved 28°C i 4 dage.

25 De resulterende kolonnier overførtes ved kopi- pladedyrkningsmetode til plader med et minimumsmedium indeholdende D-sorbitol som den eneste kulstofkilde og dyrkedes ved 28°C i 3 dage. Som resultat opnåedes der et stort antal mutanter som voksede i minimumsmediet inde-2Q holdende glycerol som den eneste kulstofkilde, men som enten ikke voksede eller voksede langt langsommere end moderstammen IFO 12467 i minimumsmediet indeholdende D-sorbitol som den eneste kulstofkilde.

Blandt disse mutanter undersøgtes 43 for evne til 25 at producere L-sorbose under anvendelse af den fremgangsmåde der er beskrevet i eksempel 5; stammerne GO-10 (IFO 14537, FERM BP-1169) og GO-14 (IFO 14538, FERM BP-1170) DK 172133 Bl 1 2 blev udvalgt, idet de begge havde udtalt højere produktionsevne for L-sorbose end deres moderstamme.

Tabel 4 viser sammenligning af vækstgraden i forskellige minimumsmedier indeholdende forskellige kulstof-5 holdige stoffer som de eneste kulstofkilder, idet sammenligningen gælder Gluconobacter oxydans GO-10 og Gluconobacter oxydans GO-14 og moderstammen IFO 12467. Disse resultater opnåedes ved hjælp af samme forsøgsbetingelser som anvendt i eksempel 1.

10

Tabel 4

Kulstofkilde, Stamme 2,5% GO-10 GO-14 IFO 12467 15 Glycerol 1,148 1,224 1,033 D-sorbitol 0,008 0,008 0,145 D-mannitol 0,515 0,665 0,774 D-fruktose 0,039 0,037 0,049 L-sorbose 0,006 0,002 0,010 20 D-glukose 0,739 0,681 0,616

Som det tydeligt fremgår af tabel 4 kan stammerne GO-10 og GO-14 næppe nok vokse i minimumsmediet indeholdende D-sorbitol som den eneste kulstofkilde. Det skal be-25 mærkes at både moderstammen IFO 12467 og de udvalgte stammer GO-10 og GO-14 knap nok vokser i minimumsmediet indeholdende L-sorbose som den eneste kulstofkilde.

Eksempel 5 30

Gluconobacter oxydans GO-10 (IFO 14537, FERM BP- 1169) og Gluconobacter oxydans GO-14 (IFO 14538, FERM BP- 1170) brugtes som podemateriale. Begge stammerne podedes i hver sin koniske kolbe indeholdende 20 ml af et oprin- 35 deligt medium (pH 6,5) indeholdende 50 g/1 D-sorbitol, 5 g/1 glycerol, 2 g/1 mononatrium-L-glutamat, 1 g/1 gærekstrakt, 0,47 g/1 KH2P04, 0,1 g/1 MgS04.7H20, 0,18 g/1 13 DK 172133 B1

CaCO^, 30 mg/1 nikotinamid, 3 mg/1 kalciumpantotenat, 1 mg/1 vitamin , 1 mg/1 p-aminobenzoesyre, 1,5 mg/1 ' FeSO^. 7H20 og 0,1 mg/1 MnS04.7H20 og underkastedes ryste dyrkning ved 30°C i 24 timer.

5 Én ml af den resulterende kultur overførtes til en 200 ml stor konisk kolbe indeholdende 20 ml gæringsmedium (modifikation af det oprindelige medium ved forøgelse af D-sorbitol-koncentrationen til 200 g/1) og underkastedes rystekultur ved 30°C i 40 timer. Moderstammen 10 Gluconobacter oxydans IFO 12467 dyrkedes samtidig som kontrol under anvendelse af samme betingelse som ovenfor. Tabel 5 viser resultaterne af disse dyrkningsforsøg. I den resulterende kultur viste D-sorbitol sig at være blevet fuldstændigt forbrugt.

15

Tabel 5

Udbytter af L-sorbose

Stamme Molært udbytte af L-sorbose regnet på mængde D-sorbitol 20 - GO-10 96,5% GO-14 96,3% IFO 12467 90,1% 25 Indholdet af D-sorbitol og L-sorbose bestemtes ved den i eksempel 2 beskrevne metode.

30 35

Claims

1. Fremgangsmåde til fremstilling af L-sorbose, ved hvilken man oxyderer D-sorbitol mikrobiologisk ved hjælp af en mikroorganisme hørende til slægten Glucono- 5 bacter, kendetegnet ved, at mikroorganismen har en vækstgrad i minimumsmedium indeholdende D-sorbitol som den eneste kulstofkilde på mindre end 1/10 af dens moderstammes vækstgrad i samme medium.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet 10 ved at mikroorganismen hører til arten Gluconobacter sub- oxydans.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved at mikroorganismen hører til arten Gluconobacter oxydans.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet 15 ved at mikroorganismen er Gluconobacter suboxydans BL-9 (FERM BP-1241) eller Gluconobacter suboxydans BL-115 (FERM BP-1240).

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved at mikroorganismen er Gluconobacter oxydans GO-10 20 (FERM BP-1169) eller Gluconobacter oxydans GO-14 (FERM BP-1170}.

6. Mikrooganisme af slægten Gluconobacter, kendetegnet ved at den er Gluconobacter suboxydans BL- 9 (FERM BP-1241) Gluconobacter suboxydans BL-115 (FERM 25 BP-1240), Gluconobacter oxydans GO-10 (FERM BP-1169) el ler Gluconobacter oxydans GO-14 (FERM BP-1170) og har nedsat evne til at vokse med D-sorbitol som den eneste kulstofkilde.

7. Biologisk ren kultur af en mikroorganisme hørende 30 til slægten Gluconobacter, kendetegnet ved at den har egenskaber identificerbare med egenskaberne af FERM BP-1241, FERM BP-1240, FERM BP-1169 eller FERM BP-1170, hvilken kultur har evne til at oxydere D-sorbitol til L-sorbose i et dyrkningsmedium indeholdende assimi-35 lerbar kulstofkilde og fordøjelig nitrogenkilde.