FR2555198A1 - Procede d'amelioration d'une souche de micro-organismes pour la preparation de l-serine par fermentation, et souche obtenue - Google Patents
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Abstract
L'INVENTION CONCERNE UNE SOUCHE AMELIOREE D'UN MICRO-ORGANISME PRODUCTEUR DE L-SERINE. SELON L'INVENTION, CETTE SOUCHE PRESENTE 1 UNE NEGATIVITE A LA SERINE DESHYDRATASE, ET 2 UNE RESISTANCE A AU MOINS L'UN DES AMINOACIDES ANALOGUES, L'HYDROXAMATE DE SERINE, L'HYDROXAMATE DE GLYCINE ET L'HYDROXAMATE DE METHIONINE. L'INVENTION S'APPLIQUE NOTAMMENT A LA PREPARATION DE L-SERINE A PARTIR DE GLYCINE.
Description
2 555198
La présente invention se rapporte à un procédé de production de l'aminoacide L-sérine à partir de glycine par fermentation microbienne. Plus particulièrement, elle
se rapporte à l'amélioration de la souche d'un micro-
organisme producteur de L-sérine afin de produire des quantités commerciales de L-sérine en moins de temps et
avec un minimum d'aminoacides de contamination.
La L-sérine est un aminoacide non essentiel que l'on utilise principalement comme complément diététique dans la nutrition parentérale. La production commerciale de L-sérine est par fermentation de certains micro-organismes qui produisent et accumulent la L-sérine dans le bouillon de fermentation. Par exemple, le brevet US N 4 183 786 (Nakayama et autres) révèle un procédé de conversion de glycine en L- sérine en utilisant un milieu aqueux contenant de la glycine et des cellules microbiennes d'un mutant appartenant à Nocardia butanica. De même, on sait du brevet US N 3 623 952 (Kubota et autres),que la L- sérine peut être accumulée par mise en culture de certaines souches d'Arthrobacter citreus, Brevibacterium helvolum Corynebacterium sp.et Candida pulcherrima sur des milieux conventionnels contenant de la glycine. De plus, le brevet US No 3 880 741 (Kageyama et autres) révèle que des mutants induits artificiellement de Corynebacterium glycinophilum, qui nécessitent la leucine, l'isoleucine, la méthionine, le tryptophane, la sérine ou la glycine pour leur croissance, produiront de la L-sérine à partir de glycine à des rendements supérieurs que la souche parente qui ne nécessite pas de telles substances
nutritives.
La glycine est un précurseur coûteux et est diffi-
cile à séparer de la L-sérine. Pour ces raisons, des efforts considérables de recherche ont été effectués pour améliorer le taux et l'efficacité de la bioconversion, pour ainsi augmenter les rendements de L-sérine produite et diminuer les niveaux de glycine non convertie restant
après fermentation.
L'utilisation du procédé révélé ici pour améliorer les micro-organismes producteurs de L-sérine a pour résultat des fermentations caractérisées par de meilleurs taux de réaction et une meilleure efficacité de conversion ainsi que des rendements accrus du produit. Ces résultats
sont basés sur une amélioration des souches des micro-
organismes parents en induisant des mutations qui laissent les microorganismes négatifs àlasérine déshydratase et résistants à au moins l'un des trois aminoacides analog l'hydroxamate de sérine, l'hydroxamate de méthionine ou
l'hydroxamate de glycine.
La présente invention a pour objet principal un
procédé efficace et économique pour la production micro-
bienne de L-sérine.
La présente invention a pour autre objet la réduction des quantités de glycine non convertie présente dans le bouillon à la fin de la fermentation en améliorant
l'efficacité de la bioconversion de la glycine en L-sérine.
Elle a de même pour autre objet l'augmentation de
la productivité industrielle et de l'efficacité par réduc-
tion de la durée de fermentation requise pour obtenir une
accumulation maximale de L-sérine dans le bouillon.
Pour atteindre ces objectifs de base, l'invention cherche à améliorer les souches des micro-organismes connues comme convertissant la glycine en Lsérine en introduisant des mutations séquentielles chimiques et
naturelles pour obtenir les améliorations souhaitées.
La présente invention a pour autre objet un procédé microbien pour la bioconversion de la glycine en L-sérine qui n'a pas également pour résultat la production
de quantités sensibles d'aminoacides contaminants.
Par ailleurs, il est souhaitable d'induire des améliorations des souches qui diminuent la tendance des
micro-organismes à dégrader la L-sérine.
La fermentation de certains micro-organismes dans
un milieu contenant de la glycine a pour résultat l'accumu-
lation de L-sérine dans le bouillon de fermentation. La bioconversion de la glycine en L-sérine comprend la condensation à l'aldol de la glycine et d'une unité à un carbone par l'enzyme sérine hydroxyméthyltransférase (E.C. 2.1.2.1). L'unité à un carbone peut être présente dans le milieu ou peut être forméSpar voie enzymatique par le micro-organisme. Les cofacteurs utilisés dans la condensation à l'aldol sont le tétrahydrofolate et le pyridoxal-5-phosphate. Afin d'obtenir les meilleurs rendements de L-sérine, le procédé révélé ici utilise des microorganismes dans lesquels les contrôles de la production de L-sérine ont été déréglés en induisant une résistance à au moins l'un des trois aminoacides analogues. De plus, le trajet de
dégradation de la L-sérine comprenant la sérine déshydra-
tase a été au moins partiellement inactivé dans les micro-
organismes de l'invention. On a pu montrer que chacun de ces aspects améliorait le taux de réaction, l'efficacité et/ou le rendement dans la bioconversion de glycine en L-sérine. Une souche de Corynebacterium glycinophilum (également connue sous le nom de Corynebacterium si.)connue pour produire la L-sérine et identifiée par ATCC 21341 a été obtenue à l'American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852. La fermentation de cette souche dans des ballons à secousses pendant 6 jours a eu pour résultat des niveaux de production de 1,5 à 2,0 grammes par litre de L-sérine. Au moyen de la séquence d'amélioration de la souche révélée ici, la production de L-sérine a été augmentée de quatre fois, à des rendements d'environ 8,0 ou plus grammes/litre et la
durée de fermentation a été écourtée à environ 4 ou 5 jours.
La description qui suit et les exemples sont en termes de
l'amélioration de Corynebacterium glycinophilum, mais le processus d'amélioration de la souche révélé ici peut être utile avec d'autres micro-organismes producteurs de L-sérine pour obtenir de meilleurs taux, rendements et/ou efficacité de réaction dans la conversion de glycine en L-sérine. Selon un aspect de l'invention, des mutations sont induites qui ont pour résultat une diminution de la
dégradation du produit final de L-sérine par les micro-
organismes. Cette dégradation de la L-sérine nuit de manière significative aux rendements potentiels du produit dans un processus commercial de fermentation. Par le procédé révélé ici, des-mutants peuvent être produits, qui font un usage interne minimum de L-sérine, donc la plus grande partie, sinon toute, la L-sérine produite
pendant la fermentation reste dans le bouillon de fermen-
tation et est disponible pour une récupération et une séparation. Selon un autre aspect de l'invention, des souches de micro-organismes appropriés sont améliorées en déréglant les contrôles métaboliques sur la production de L-sérine à partir de glycine. Ce dérèglement résulte de l'induction de mutations qui confèrent au micro-organisme, une résistance à des niveaux élevés de dérivés d'hydroxamate
de serine, méthionine et glycine. Dans le procédé d'amélio-
ration de la souche révélé ici, tous les analogues de L-sérine ne se sont pas révélés efficaces pour augmenter les rendements de fermentation de Lsérine. On a découvert que la résistance aux trois composés donnés était
particulièrement efficace dans ce procédé.
On a également trouvé que la combinaison de ces traits dans une seule souche améliorait considérablement les rendements du produit. En effet, des mutants peuvent être produits qui ont à la fois une capacité diminuée pour dégrader la L-sérine et qui résistent à des niveaux élevés d'hydroxamate de méthionine, d'hydroxamate de sérine et/ou d'hydroxamate de glycine. Il est préférable que le mutant soit résistant à chacun de ces trois analogues. Ces améliorations de la souche sont obtenues en faisant passer la souche de micro-organismes choisie à travers un protocole de mutations chimiques et spontanées o divers moyens de- pression sélective sont appliqués avec pour résultat une souche ayant les caractéristiques souhaitées. Des mutagènes que l'on peut utiliser dans l'invention comprennent la lumière ultraviolette ou tout mutagène chimique. Des mutagènes à spectre large, comme
la lumière ultraviolette et la N-méthyl-N'-nitro-N-
nitrosoguanidine ("NG"), créent des nombres importants de lésions et par conséquent auront un effet large et significatif sur les caractéristiques du mutant. Cependant, comme la dégradation génétique est répandue, ces mutagènes ont également une assez forte tendance à provoquer des changements néfastes. Des mutagènes spécifiques d'un site,
comme le sulfonate d'éthylméthane ("EMS"), créent des muta-
tions relativement pluscontrôlées ainsi que de mutations d'un type spécifique selon le mutagène. La dose ou les taux d'exposition du mutagène particulier choisi seront
déterminés en se référant à la pratique conventionnelle.
Le mode de réalisation préféré, décrit en détail ci-dessous, utilise une séquence particulière de mutations pour créer la souche de microorganismes améliorée. D'abord, un mutagène à spectre large (NG) est utilisé pour le choix d'une souche mutante négative àlasérine déshydratase. On pense que les lésions produites par exposition à NG peuvent prédisposer les souches mutantes à des mutations
ultérieures conférant une résistance aux analogues.
Ensuite, les mutants qui sont également résistants aux trois dérivés d'hydroxamate sont choisis, soit en utilisant un mutagène spécifique du site comme EMS ou bien en reposant sur une mutation spontanée. On pense que cette séquence est la plus avantageuse pour créer une souche viable ayant les caractéristiques souhaitées. Dans d'autres modes de réalisation cependant, il peut être souhaitable
d'utiliser une séquence modifiée de sélection. En particu-
lier, une séquence modifiée peut être souhaitée pour
l'induction des résistances aux hydroxamates analogues.
Il peut également être souhaitable d'utiliser des mutagènes spécifiques du site un peu moins puissants dans tout le protocole. Comme première étape du protocole préféré, une
souche parente est choisie, qui est connue comme conver-
tissant la glycine en L-sérine. Par exemple, tout micro-
organisme révélé dans les brevets de Nakayama et autres et de Kubota et autres décrits ci-dessus peut être approprié. Le choix de la souche parente est dans la
connaissance de toute personne compétente.
Pour choisir une mutation qui laisse le micro-
organisme négatif à lasérinedeshydratase,on emploie la méthode préférée qui suit. Une culture saine de la souche
parente est obtenue et exposée au mutagène NG. Des micro-
organismes de cette culture sont placés sur un milieu riche, tel qu'un milieu donnant une série complète de substances nutritives, et on incube à des températures
conventionnelles pendant environ 2 à environ 5 jours.
Des colonies individuelles sont prélevées de ce milieu sur des plaques de milieux "minimum" et "complet" afin de choisir des colonies ne dégradant pas la L-sérine pour obtenir une source d'azote. Le milieu minimum contient suffisamment de substances nutritives pour supporter la croissance des micro-organismes. Dans le milieu complet,
la source d'azote est remplacée par la L-sérine.
Après incubation sur ces plaques pendant un temps suffisant pour déterminer la croissance ou le manque de croissance, environ 1 à environ 7 jours, des clones sont choisis qui croissent sur le milieu minimum mais ne croissent pas sur le milieu complet. Ces clones présentent la négativité à la sérine déshydratase, c'est-à-dire qu'ils sont incapables de dégrader la L-sérine pour une utilisation comme source d'azote. Les clones commenceront à apparaître à la première partie de la période de croissance. Cependant, comme tous les clones négatifs à la sérine déshydratase ne seront pas également des souches productrices de L-sérine, il est préférable d'incuber les plaques pendant au moins plusieurs jours afin de créer une masse plus importante de clones d'o l'on peut choisir des surproducteurs de L-sérine. Les clones les plus producteurs de Lsérine sont choisis pour le cycle suivant
de mutation et de sélection.
Pour établir la résistance à l'hydroxamate de méthionine, une population de cellules exposées au mutagène est incubée sur un milieu solide de croissance contenant de l'hydroxamate de méthionine en quantités suffisantes pour inhiber la croissance des micro-organismes non résistants. Des quantités appropriées d'hydroxamate de méthionine seront d'environ 0,1 à environ 1,0 mg par millilitre de milieu de croissance. La résistance aux analogue peut être obtenue soit par mutation spontanée ou par exposition de l'organisme à un mutagène chimique ou à la lumière ultraviolette avant placage sur le milieu contenant les analogues.Les plaques, après incubation
pendant environ 3 à 7 jours à des températures convention-
nelles, présenteront des colonies résistant àl'hydroxamate
de méthionine.
Dans le mode de réalisation préféré, ces colonies
doivent être également négatives à la sérine déshydratase.
Pour déterminer si cette dernière caractéristique a été retenue, il peut être souhaitable de replaquer les colonies sur les milieux minimum et complet comme on l'a décrit ci-dessus. Comme précédemment, les colonies négatives à la sérine déshydratase croîtront sur le milieu minimum et
non pas sur le milieu complet.
Pour établir la résistance à l'hydroxamate de sérine et à l'hydroxamate de glycine, les mêmes processus généraux sont utilisés que pour établir la résistance à l'hydroxamate de méthionine. Pour la résistance à
l'hydroxamate de sérine, des niveaux appropriés d'hydroxa-
mate de sérine seront d'environ 0,1 à environ 1,0 mg/ml.
Cependant, il semble que les micro-organismes présentent
une plus forte sensibilité à l'hydroxamate de glycine.
Par conséquent, il peut être souhaitable d'utiliser de plus faibles concentrations d'hydroxamate de glycine-dans le milieu pour garantir la survie d'un nombre adéquat de clones. Par exemple, on peut utiliser des niveaux
d'environ 0,01 à environ 0,8 mg/ml.
Comme on peut le voir, le protocole de mutation selon l'invention consiste à choisir en série des mutants de la souche parente qui présentent les caractéristiques souhaitées, c'est-à-dire des mutants qui sont négatifs à la sérine déshydratase et qui sont résistants à au moins l'un des aminoacides analogues, d'hydroxamate de sérine,
d'hydroxamate de glycine ou d'hydroxamate de méthionine.
Le terme "choisir en série" signifie que la souche mutante obtenue à chaque étape du protocole est utilisée dans l'étape qui suit. En effet, les mutations induites doivent être cumulatives. Par exemple, dans le mode de réalisation préféré décrit ci-dessus, la sélection en série des mutants est comme suit: Etape 1: La souche parente a été exposée au mutagène NG et aux mutants négatifs à
la sérine déshydratase choisis.
Etape 2: Les mutants obtenus par les processus de l'étape 1 ont été exposés à EMS et on les a fait croître sur un milieu contenant de 1 'hydroxamate de méthionine et les mutants résistant à l'hydroxamate
de méthionine ont été choisis.
Etape 3: On a fait croître les mutants obtenus par les processus de l'étape 2 sur un milieu contenant de l'hydroxamate de sérine et les mutants résistant à
l'hydroxamate de sérine ont été choisis.
Etape 4: On a fait croître les mutants obtenus par les processus de l'étape 3 sur un milieu contenant de 1 'hydroxamate de glycine et les mutants résistant à
l'hydroxamate de glycine ont été choisis.
En suivant ce protocole de sélection en série, on a obtenu des souches mutantes qui étaient négatives à la sérine déshydratase et qui étaient également résistantes aux trois aminoacides analogues(hydroxamate de méthionine,
hydroxamnate de sérine et hydroxamate de glycine).
Une fois que les souches présentant les caracté-
ristiques souhaitées sont obtenues, on peut y tester, dans des ballons à secousses ou fermenteurs, la production de L-sérine. De cette façon, on peut choisir une ou plusieurs souches améliorées qui présentent la ou les caractéristiques souhaitées: rendements très importants de produit, niveaux maximum du produit dans la plus courte durée de fermentation et/ou meilleure efficacité de conversion (c'est-à-dire le moins de glycine résiduelle
non convertie possible).
Cette fermentation d'essai peut être faite par des méthodes conventionnelles. Le milieu de culture peut être tout milieu de fermentation contenant une source de carbone, une source d'azote, des sels inorganiques et,
si on le souhaite, d'autres substances nutritives orga-
niques mineures. Comme source de carbone, on peut utiliser des sucres fermentables, des hydrolysats de protéine et des protéines. Comme source d'azote, l'urée, les sels d'ammonium d'acides organiques (comme l'acétate d'ammonium ou l'oxalate d'ammonium) et les sels d'ammonium d'acides inorganiques (comme le sulfate d'ammonium, le nitrate d'ammonium ou le chlorure d'ammonium) peuvent être satisfaisants. Les quantités des sources de carbone et d'azote dans le milieu sont comprises entre 0,001 et % poids/volume. Des éléments inorganiques (comme le phosphate de potassium ou le sulfate de magnésium) et/ou des vitamines (comme la biotine ou la thiamine) peuvent
également être ajoutés.
Les températures conventionnelles de fermentation sont comprises entre environ 20 C et environ 45 C, de
préférence d'environ 26 C à environ 34 C, selon le micro-
organisme. La plage du pHestd'environ 5 à 8, de préférence d'environ 6,5 à environ 7,5. La fermentation est accomplie en environ 16 à 176 heures, typiquement en 96 heures au niveau du ballon, et pendant ce temps la Lsérine s'accumule dans le bouillon de fermentation. Les cellules et autres composants solides de la culture peuvent être retirés du bouillon par des processus conventionnels
comme une filtration ou une centrifugation.
A la fin de la fermentation, ou en tout moment pendant la durée de la fermentation, les titres de L-sérine peuvent être déterminés par chromatographie liquide haute pression (HPLC) ou par toute autre méthode pratique. Les niveaux de glycine peuvent également être déterminés. A partir des résultats de ces analyses, on peut identifier le(s) clone(s) ayant les caractéristiques souhaitées. Lorsque l'on choisit un microorganisme pour le laboratoire, une installation pilote ou une fermentation
industrielle, la production de L-sérine peut être sensi-
blement accentuée en choisissant une souche améliorée ayant les caractéristiques ci-dessus décrites. Les procédés décrits ci-dessus pour les fermentations d'essai et ceux décrits dans les exemples qui suivent donneront des directives utiles pour la production de L-sérine avec les micro-organismes améliorés selon l'invention. Des souches mutantes de Corynebacterium glycinophilum ont été identifiées comme ayant les caractéristiques préférées: capacité diminuée pour dégrader la L-sérine et résistance à l'hydroxamate de sérine, l'hydroxamate de glycine et l'hydroxamate de méthionine. Deux de ces mutants ont été déposés irrévocablement à l'American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 30852, sans restriction concernant la disponibilité et sont identifiés par ATCC 39495 et ATCC 39496. Comme on l'a précédemment indiqué, le procédé de l'invention peut être utilisé de la même façon pour améliorer
d'autres souches productrices de L-sérine.
Les exemples qui suivent ne sont donnés qu'à titre d'exemple et ne doivent en aucun cas limiter l'invention décrite ici. Les abréviations qui suivent
ont été utilisées dans toute la description de l'invention:
1 1 c: degrés centigrades EMS: sulfonate d'éthylméthane g: grammes HPLC: chromatographie liquide haute pression 1: litres) M: molaire mg: milligramme(s) ml: millilitre(s) NG: N-méthyl-N2-nitro-N-nitrosoguanidine t/mn: tours par minute %: pourcent Les milieux de culture utilisés dans les exemples ont été préparés comme indiqué ci-dessous A. Milieu de mutation de nitrosoguanidine Glucose 0,5% Peptone 1,0% Extrait de viande 1,0% NaCl 0,5% Extrait de levure 0,5% Agar 2,0% Eau désionisée 94,5% Les ingrédients indiqués ont été chauffés à l'ébullition puis ont été stérilisés à la vapeur à 121 C pendant 15 minutes. Le mélange stérile a été versé dans
des boîtes de Petri et on a laissé décanter.
B. Milieu de semence de sérine Glucose 3,00% (NH4)2So4 0,30%
K2HP04 0,16%
KH2PO4 0,04%
MgS04'7H20 0,05% Extrait de levure 0,50% Peptone 2,00% Eau désionisée 93, 95% Les ingrédients indiqués ont été mélangés et le milieu a été passé à l'autoclave à 1210C pendant
minutes.
C. Bouillon de Luria Tryptone Bacto (Difco) 10,0 g Extrait de levure Bacto (Difco) 5,0 g NaCl 10,0 g 1,0 M NaOH 1,5 ml Les ingrédients ont été combinés dans 1 litre d'eau désionisée et ont été stérilisés à la vapeur à 121 C
pendant 15 minutes.
D. Milieu de production de sérine Glucose 50,00 g/l (NH4)2SO4 2,00 g/l NH4NO3 3,00 g/l KH2Po4 1,00 g/l MgSO4-7H20 0,50 g/l Glycine 20,00 g/l Acide L-glutamique 0,50 g/l L-méthionine 0,50 g/l L-valine- 0,50 g/l CaC03 25,00 g/l Biotine 0,20 mg/l Thiamine-HC1 1,00 mg/l Riboflavine 2,00 mg/l Acide folique 1,00 mg/l Pantothénate de calcium 1,00 mg/l Nicotinamide 1,00 mg/l Pyroxydine 1,00 mg/l Pyridoxal 0,20 mg/l PABA 1,00 mg/l Les neuf premiers ingrédients de la liste ont été mélangés aux quantités indiquées par litre d'eau désionisée et passés à l'autoclave à112 C pendant 12 minutes. CaCO3 a été passé à l'autoclave séparément à 112 C pendant 12 minutes. Les ingrédients restants ont été mélangés, stérilisés au filtre et ajoutés au milieu refroidi, en
même temps que CaC03.
E. Milieu modifié de production de sérine Il a été préparé de la même façon que le milieu de production de sérine à l'exception que l'on a utilisé
3,0% de glucose au lieu de 5,0% de glucose.
F. Milieu minimum de production de sérine Glucose 0,500%
(NHL4)2S04 0,200%
KHaPO4 0,150%
K2HPO4 0,050%
MgS04 '7H20 0,050% NaCl 0,010% FeSO4.7H20 0,001% MnSO4'4H20 0,001% CaCl2. 2H20 0,001% Biotine 1O,./l Thiamine-HC1 1,0 mg/1 Agar 2,000% Les ingrédients ont été chauffés à l'ébullition dans 1 litre d'eau désionisée et passés à l'autoclave à 121WC pendant 15 minutes. Le mélange a été versé dans des
boites de Petri et on l'a laissé décanter.
G. Milieu complet de production de sérine On l'a préparé de la même façon que le milieu minimum de production de sérine à l'exception que l'on
a remplacé 0,2% de (NH4)2S04 par 0,2% de L-sérine.
EXEMPLE I
Une cuillerée de Corynebacterium Elycinophilum (a.k.a Corynebacterium sp.) ATCC 21341 a été inoculée d'une gélose inclinée nutritive réfrigérée (Difco) dans
5,0 ml de bouillon de Luria dans une éprouvette de 20 ml.
Le tube a été incubé à 32WC pendant 24 heures. Les cellules ont été centrifugées, lavées avec et remises en suspension dans 10 ml d'un tampon à 0,1M de phosphate de sodium
(pH 7,0) dans une éprouvette.
De la N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine ("NG") a été ajoutée aux cellules en suspension pour obtenir une concentration de 0,5 mg/ml. Le mélange NG-cellules-tampon
a été maintenu à la température ambiante pendant 30 minutes.
Les cellules ont alors été lavées avec 10 ml du tampon,
centrifugées et relavées avec le tampon cinq fois de plus.
Les cellules lavées ont été remises en suspension dans 5,0 ml du tampon. Ensuite, des portions de 100 des cellules en suspension ont été étalées sur des plaques d'un milieu de mutation de nitrosoguanidine. Les plaques
ont été incubées à 30 C pendant 2 jours.
Des colonies individuelles ont été prélevées de ces plaques sur des plaques d'un milieu minimum de production de sérine et d'un milieu complet de production de sérine pour tester la capacité de chaque ccRnie à utiliser la L-sérine comme source d'azote. Un clone, désigné par SWSER- 1, a été identifié qui croissait sur le milieu minimum et non pas sur le milieu complet. Ce clone contenait une mutation conduisant à sa diminution de
capacité de dégrader la L-sérine.
On a fait croître le clone SWSER-1 dans 5,0 ml d'un milieu de semence de sérine pendant 2 jours à 30 C et 260 t/mn. Une portion de 2,0 ml a été transférée à ml d'un milieu de production de sérine dans un ballon non découpé de Erlenmeyer de 250 ml et on l'a fait croitre pendant 5 jours à 30 C et 125 t/mn. Ce processus a été répété, en utilisant le microorganisme parent, souche ATCC 21341. A la fin de cette période, des échantillons du bouillon de fermentation de chaque souche ont été déterminés par HPLC. Le clone SWSER-1 avait produit 4,4 mg/ml de L-sérine et le ATCC 21341 parent avait
produit 1,6 mg/ml de L-sérine.
EXEMPLE II
De la gélose inclinée nutritivefralchedu clone SWSER-1 a été lavéeavec 10 ml d'un tampon à 0,1M de phosphate de potassium (pH 7,0) et la suspension résultante a été placée dans 20 ml d'un tube centrifuge stérile de 20 ml Corning (marque de fabrique). Du sulfonate d' éthylméthane ("EMS") a été ajouté à la suspension à une concentration de 0,06M EMS dans la suspension des cellules. La suspension
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a été soumise à un tourbillon pour mélanger les cellules
au mutagène puis incubée à 30 C pendant 18 heures.
Après incubation, les cellules ont été centrifugées, lavées deux fois avec 10 ml d'un tampon à 0,1M de phosphate de potassium et remises en suspension dans un tampon de
ml. Avec chaque lavage, les cellules ont été transfé-
rées à des tubes propres afin d'éliminer tout mutagène collant aux parois de l'éprouvette. La suspension de cellules lavées a été étalée par portions de 100 p1i sur des plaques de gélosenutriti-e contenant 0,5 mg/ml de l'aminoacide analogue,l'hydroxamate de méthionine. Ces plaques ont été incubées à 30 C pendant 5 jours. Des colonies croissant sur les plaques contenant l'hydroxamate de méthionine avaient la ou les mutations souhaitées conférant la résistance à cet analogue L'une de ces colonies, désignée par SWSER-1-23 a été choisie pour la production de L-sérine. On l'a fait croître pendant 24 heures dans 5,0 ml de milieu de semence de sérine à 30 C, 260 t/mn. Des portions de 2,0 ml ont alors été transférées à des ballons non découpés de Erlenmeyer de 250 ml contenant 50 ml d'un milieu de production de sérine et on a incubé pendant 6 jours à 30 C, t/mn. Ce processus a été répété en utilisant le
clone SWSER-1. Par analyse HPLC, le bouillon de fermenta-
tion de SWSER-1-23 s'est révélé contenir 4,8 mg/ml de L-sérine et le bouillon de SWSER-1 contenait 3,3 mg/ml
de L-sérine.
EXEMPLE III
Une gélose inclinée nutritivedu clone SWSER-1-23, la souche obtenue à l'exemple III, a été lavé avec et remise en suspension dans 10 ml d'un tampon à 0,1M de phosphate de potassium (pH 7,0). La suspension, par portions de ).l, a été étalée sur des plaques de gélose nutritive contenant 0,5 mg/ml d'hydroxamate de sérine. Les plaques ont été incubéesà 30 C pendant 5 jours. A la fin de la durée de l'incubation, il y avait une croissance sensible sur la plaque, indiquant que le clone SWSER-1-23 contenait une mutation l'ayant rendu résistant à l'hydroxamate de sérine.
EXEMPLE IV
Une gélose inclinée nutritive du clone SWSER-1-23, la souche obtenue à l'exemple III, a été-lavée avec 10 ml d'eau désionisée. Ensuite, des portions de 100,l de la suspension des cellules ont été étalées sur des plaques du milieu minimum de production de sérine contenant 0,5 mg/ml d'hydroxamate de glycine. Les plaques ont été incubées pendant 5 jours à 30 C. A la fin de la durée de l'incubation, les colonies croissant sur la plaque représentaient des souches ayant subi une mutation spontanée les laissant résistantes à l'hydroxamate de glycine. Deux de ces colonies, désignées par SWSER-1-23-18 (maintenant ATCC 39495) et SWSER-1-23-20 (maintenant ATCC 39496) ont été cultivées pendant une nuit dans 5,0 ml de milieu de semence de sérine à 31 C. Les cultures ont alors été placées dans 50 ml de milieu de production de
sérine et incubées pendant 6 jours à 31 C, 300 t/mn.
Ce processus a été répété en utilisant le clone SWSER-1-23.
Par analyse HPLC, le bouillon de fermentation de SWSER-1-23 -18 (ATCC N 39495) s'est révélé contenir 4,8 mg/ml de L-sérine, le bouillon de SWSER1-23-20 (ATCC 39496) contenait 5,2 mg/ml de L-sérine et le bouillon de
SWSER-1-23 contenait 2,7 mg/ml de L-sérine.
EXEMPLE V
Une gélose incline nutritive du clone SWSER-1-23-20 (ATCC 39496) a été lavéeavec 10,0 ml d'un tampon à 0,1M de phosphate de potassium (pH 7,0). Des portions de 2,Smlde la suspension résultante de cellules ont été placées dans des ballons non découpés de Erlenmeyer de 250 ml contenant ml d'un milieu de semence de sérine. Les ballons ont été incubés pendant une nuit à 31 C, 260 t/mn. Ensuite, 2,0 ml de la culture de semence ont été inoculés dans ml d'un milieu modifié de production de sérine dans un ballon non découpé de Erlenmeyer de 250 ml. Le ballon a été incubé pendant 5 jours à 31 C, 260 t/mn avec addition de 1% de glucose à 48 et à 72 heures. L'analyse par HPLC a révélé un titre de 8,8 mg/ml de L-sérine
à la fin de la durée de fermentation de 5 jours.
Claims (11)
1.- Procédé d'amélioration d'une souche de micro-
organismes pouvant convertir la glycine en L-sérine,
caractérisé en ce qu'il consiste à introduire des muta-
tions dans la souche forçant les micro-organismes à présenter, comme caractéristiques: (1) la négativité à la sérine déshydratase et (2) une résistance à au moins l'un des aminoacides analogues(a) l'hydroxamate de sérine, (b) l'hydroxamate de glycine ou (c) l'hydroxamate de méthionine, o les caractéristiques choisies sont obtenues en choisissant, en série, dans tout ordre, les mutants d'une souche parente, des sélections faites d'un groupe comprenant: A. la sélection d'un mutant caractérisé par la négativité à la sérine déshydratase, B. la sélection d'un mutant caractérisé par la résistance à l'hydroxamate de sérine, C. la sélection d'un mutant caractérisé par la résistance à l'hydroxamate de glycine, et D. la sélection d'un mutant caractérisé par la résistance à l'hydroxamate de méthionine, à condition que la sélection A soit choisie comme
l'une des sélections en série.
2.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'au moins l'une des mutations est induite par exposition à l'un des mutagènes chimiques, sulfonate
d'éthylméthane ou N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine.
3.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la sélection A consiste à: (a) prélever des colonies sur une plaque de milieu minimum, (b) prélever les colonies sur une plaque de milieu identique à celui de l'étape (a) à l'exception qu'il contient la L-sérine à la place de la source d'azote, (c) incuber les plaques des étapes (a) et (b) à environ 20 à 450C pendant environ 1 à environ 7 jours, et (d) choisir des colonies croissant sur la plaque de l'étape (a) mais non pas sur la plaque
de l'étape (b).
4.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la sélection B consiste à: (a) plaquer les cellules sur un milieu solide de croissance comprenant environ 0,1 à 1,0 mg/ml d'hydroxamate de sérine, (b) incuber la plaque de l'étape (a) à environ à 450C pendant environ 1 à environ 7 jours et (c) choisir des colonies croissant sur ladite plaque.
5.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la sélection C consiste à: (a) plaquer les cellules sur un milieu solide de croissance comprenant environ de 0,01 à 0,8 mg/ml d'hydroxamate de glycine, (b) incuber la plaque de l'étape (a) à environ à 450C pendant environ 1 à 7 jours, et (c) choisir des colonies croissant sur ladite
plaque.
6.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la sélection D consiste à: (a) plaquer les cellules sur un milieu solide de croissance comprenant environ 0,1 à environ 1,0 mg/ml d'hydroxamate de méthionine, (b) incuber la plaque de l'étape (a) à environ à 450C pendant environ 1 à environ 7 jours, et (c) choisir des colonies croissant sur ladite
plaque.
7.- Procédé de préparation de L-sérine par fermentation qui consiste à mettre en culture, en
conditions aérobies, une souche améliorée d'un micro-
organisme capable de convertir la glycine en L-sérine, ladite souche améliorée étant caractérisée par (1) une négativité à la sérine déshydratase et (2) une résistance à au moins l'un des aminoacides analoguesl'hydroxamate de sérine, l'hydroxamate de glycine et l'hydroxamate
de méthionine.
8.- Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la souche améliorée a les caractéristiques
d'identification de ATCC 39495 ou ATCC 39496.
9.- Souche améliorée d'un micro-organisme producteur de L-sérine, caractérisée par (1) une négativité à la sérine déshydratase et (2) une résistance à au moins l'un des aminoacides analogues,l'hydroxamate de sérine, l'hydroxamate de glycine et l'hydroxamate de méthionine.
10.Souche améliorée selon la revendication 9, caractérisée en ce que ladite souche présente une résistance à au moins 1'un des analogueslorsque l'analogue est présent à une concentration d'environ 0,1 à environ 1,0 mg/ml pour l'hydroxamate de sérine ou l'hydroxamate de méthionine ou environ 0,01 à environ 0,8 mg/ml pour
l'hydroxamate de glycine.
11.- Souche selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'elle appartient au genre Corynebacterium.
Applications Claiming Priority (1)
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Publications (1)
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Family
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Family Applications (1)
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