JPS5831995A - Ｌ−セリンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は■・−セリンの製造法に関し、更に詳しくはサ
ルシナ属１こ属し、■、−セリンデヒドラター−３− ゼ活性が低ドもしくは欠失（２，かつグリシンより１・
−セリンダ・生成する能力を有する微生物を用い、酵素
法１こよりグリシンよりＩ、−セリンを製造する方法１
こ関する。

その目的は安価なグリシンを１１ｎ木１として栄養−■
−あるいは医檗−１−広い用途を有する■・−セリンを
工業的有利（こ製造する方法を提供することにある。

従来、微生物を用いて発酵法又は酵素法によりＬ−セリ
ンを製造する方法としこは、アルスロバλ１ フタ−属（特公昭５２−１紺≠７３．特開昭５５−３７
１６９）、シコードモナス属（特開昭５２−１０５２８
７　、特開昭５５−２　ｆｉ　８７５　）　、コリネバ
クテリウム属（特公昭５Ｊ−６２３６，特開昭５５−１
１８３９５　）、ノカルジア属（特開昭５３−６９８８
３　、特開昭５３−７２８９４　、特開昭５３−７９０
９６　）、サルシナ属（特開昭５３−８１６９１）など
の細菌や放線菌を用いる方法が知られているが、これら
公知方法ではＬ−セリン生成量が必ずしも満足しうるも
のではなかった。

について鋭意研究を重ねた結果、先の発明（特開１１７
１５　：（−８１６９１）において用いられたサルシナ
属１こ属する微生物から■・−セリンをピルビン酸とア
ンモニアに分解する酵素、すなわちＬ−セリンデヒドラ
ターゼ（Ｅ、Ｃ，４，２，１，１３）の活性が低下もし
くは欠失した変異菌株を取得すること１こ成功すると共
１こ、該変異株が親株に比してより著量の１１−セリン
を生成せしめる能力を有しＣいることを見い出し９本発
明を完成するに至った。

すなわち１本発明はサルシナ属に属し、■、−セリンデ
ヒドラターゼ活性が低ドもしくは欠失し。

含む２．を質溶液と接触させ、生成したＬ−セリンを採
取することからなるＬ−セリンの製造法である。

本発明方法では、サルシナＩ１ｇ　Ｉこ属し。Ｌ−セリ
ンデヒドラターゼ活性が低下もしくは欠失し、かつグリ
シンより■・−セリンを生成する能力を有する微生物で
あればいかなる菌株をも用いうる。か＝　５− かる微生物ｊはグリシンより１・−セリンを生成する能
力を有するサルシナ属の微生物（例えば、→）−ルシナ
　アルビダＩ　Ａ　Ｍ　１　（ｌ　Ｉ　２　、）を紫夕
ｉ線照射。

薬剤処理などの公知の変異処理をはどこし、公知の選択
法を併用することにより取？１１することができる。こ
のようにして取（（すしｆ、’　ｌ’＋’目′にのｂＴ
　Ｍｒ　ｆｃ例として例えば、ナルシナ・アルビタｒ、
口ｃ　−：１４　（？：々工研菌寄第６０？φ号）　４
．Ｆ、けることができる。

゛本発明１こ係ノっる微生物を培秤するための培地とし
ては、戻素源、窒素源、無機物および必要１こ上り他の
栄養物を程よく含有する培地であれば９合成培地、天然
培地のいずれも使Ｔ１１できる。Ｊ′Δ地に使用する炭
素源としては９例えばグルコース、シュクロース、デキ
ストリンなどの炭水化合ＩＩ　、グリセロールの如き多
価アルコール、　ｌ１１′＋酸、フマール酸、クエン酸
なとの有機酸などが使用され、その量は通常培地中０．
１−１０％程度か適当である０窒素源としては１例えば
塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニ
ウムなどの４１（機アンモニウム塩、尿素その他の窒素
化合物、肉ニー　〇　− キス、酸１１エキス、コーンステープリカー、脱脂大豆
粕またはその消化物などの天然窒素源などがＪ５る。、
　’！Ｉｔ機物としては９例えばリン酸第−カリウム、
リン酸第二カリウム及びリン酸第三カリウムなどのリン
酸塩が０．１〜０．７−程度のｍ・で使用され、車番こ
ｋｌｉｊ酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫酸第一鉄な
どが適宜便用される。また、使用微生物が生育のために
他の栄養素を必要とする場合には、当然その要求を満足
させる栄養素を培地に添加排 される場合もある。尚、上記生成培地にグリシンを０，
１〜１チ程度含有させれば菌体のＬ−セリン生成能を助
長せしめることができ、酵素反応に際しＣ一層好ましい
効果が期待できる。培養は振とう培養の如き好気的条件
ド２５〜３７℃で実施するのが好ましい。

か（して得られる培養液或いは該培養液から遠心分離等
により分離した生菌体を酵素源とし、これにグリシンを
含有する基質溶液を接触させて酵−７− 累反応させることによりｊゾ応ｉｆｋ中蚤こ著量の（５
，セリンを生成蓄積させることができる。基質溶液中の
グリシンの心腹は特に制限されないが、般に１〜２０％
程度か好ましい。

本発明の酵素反応はｐ！Ｉ　Ｌｉ〜９稈度１こ４；いて
＋　７１１ｕｉ度２０〜５０℃程度で振とうちしくはか
（拌ト１こ実施するのが好ましい。尚１反応糸番こビリ
ドキザールリン酸を０．０１〜１ｍＭ程度存在させＣｉ
Ｊ　＜ことにより本酵素反応をより効率よ（実施するこ
とができる。又、微ｔの界曲活性剤９例えばポリオキシ
エラレンセナルアルコール−［−チル（ＮｊｋｋｏｌＢ
Ｌ−２０１□Ｘ）や、ポリオキシエチレンラノリンアル
コール誘尋体（Ｎ１ｋｋｏｌ　ＢｗＡ　−ｉ）　）等の
非イオン界面活性剤を存在させて１．５＜こと（より１
・−セリンの蓄積閂を増加さぜることかできる。。

上記酵素反応１こより反応中１こ著Ｍ　（、ＩＪ　Ｌ−
セリンが生成蓄積する。生成し１コト−セリンのｔｘｔ
　離精製は通常のイオン交換□樹脂処理法によって実施
することもできるか９反応液中１こはＬ−セリンのほか
に未反応のグリシンも多鼠に含抜れているため。

を効率よ（単離精製することが困難である。

そこで０本発明者らは酵素反応液より効率よくＬ−セリ
ンを単Ｎｉｌ精製する方法蚤こついて更に検討した結果
９反応液より得られるＬ−セリンとグリシンとの混合物
を適当な溶媒中山・キシレン−４−スルホン酸と反応さ
せれば、Ｌ−セリン・ｍ−キシレン−４−スルホン酸塩
及びグリシン・ｍ−キシレン−４−スルホン酸塩が生成
し、ここに生成した画壇の間には溶媒に対して大きな溶
解度差があり、前者の塩のみを選択的に析出させうるこ
とを見い出す１こ至った。ちなみにＬ−セリン・ｍ−キ
シレン−４−スルホン酸塩とグリシン・ｍ　−キシレン
−４−スルホン酸塩との水に対する溶解度を示せば下゛
５第１表の通りである。

＝　９−・ 第１表 上記の如き知見に基づいＣ１酵素反応終了後の反応液よ
りＬ−セリンを効率よ（単１ｉＩＩｌ精製する方法を確
立するに至っ１こ。

Ｘヶ すなわち１本発明によれば酵素反応終了ｈ　ｆｉ）反応
液よります１・−セリンとグリシンとの混合物を得、該
混合物を適当な溶媒中ｍ−キシレン−４−□〜 で該塩を脱塩すること番こよりＬ−セリンを取得するこ
とかできる。

上記方法を実施するに際して（Ｊ、まずｆ１￥累反応１
０− 液より得たＬ−セリンとグリシンとの混合物を溶媒に溶
解させ、これ１こｍ−キシレン−４−スルポン酸を加工
てＬ−セリン・ｍ−キシレン−４−スルホン酸塩とグリ
シン・ＩＩ＋−キシレン−４−スルポン酸塩とを生成さ
せる。添加するｍ−キシレン−４−スルホン酸の量は、
混合物中のし一セリンとグリシンの合計モル数と等モル
もしくはそれよりやや過剰を用いるのか好ましい。また
、溶媒としては水が最適である。上記の塩形成反応は７
゜゛Ｃ前後で実施するのが好ましい。ついで１反応液を
冷却ないし濃縮することによりＬ−セリン・ｍ−キシレ
ン−４−スルホン酸塩が選択的に結晶として析出しＣ（
るので、同相をろ過等の常法により分離することにより
Ｌ−セリン・ｍ−キシレン−４−スルホン酸塩を得るこ
とができる。該塩は、ついで常法により１例えば陽イオ
ン交換樹脂で分解することによりＬ−セリンとするこ　
とができる。

以下、参考例及び実施例を挙げて説明するが。

実施例中生成したＬ−セリンの確認は薄層クロマ−１１
− トゲラム」−のニンしドリンク１色法により打なった（
１　マタ、ＴＪ４ｚ　’＋　７　）定’ｍ　ｆ、ｉ　Ｉ
’Ｊ　イ：：ｌ　／　：１．　ｌ−ツタ・メソセンチロ
イデスＰ　−ｆｊｏ　１こよるハ゛イオアッレイ法によ
り行なった。

参考例Ｊ （サルシナ・アルじダＭ　Ｅ　−３４の調製）→ノ゛ル
シナ・アルビグＴ　Ａ　Ｍ　ｌ　０１２の菌体を生理食
’ｊｘＡ　水ｔｃ　１．０７ｃｏｉｌｓ　／　ｍｅ　（
７）　ＺＡ”４度１こなるＪ：うに！ＯＱ故た。この懸
濁液ｆこＮ−ノナルー１□ｌ′−ニトロ−Ｎ　−ニトロ
ソグーｒニシンを最終洟１ｖＬ０．５　”／／ｍｅにな
るよう］こ添加し、３７”Ｃで１０分間静＋ｉＩ　Ｌだ
。静置後、膣液をよく洗浄［５，そのＩ）５　ｍｌをグ
ルコース１％　　、（ＮＨ４ン＋！；０４　ｏ、ｓ　　
％　　＊　内１１’１ＳＪ−ｒ、−１−ス０．２％　　
、　　■（２ＰＯ４０，１％、　ＫｇＨＰＯ４Ｑ、　ｌ
　％　、　ＭｇＳＯ４０，１，ｌ　５％カニ＞　ｆｉる
中間培地（ｐＨ７，０）にて、　３０　’Ｃで１８１１
１間培養した。この菌体を適当に希釈してグルー１−ス
０゜５％、ペプトン１チ、白玉４＝ス０．３％、酵１迂
工４−ス１％、　ＮａＣ１０，５襞、寒天１．５チから
なる栄養培地（ｐｔ１７．２）に塗布し、：３０°Ｃで
３〜４１１間培養した。生育したコロニーを常法によ−
）て釣菌し。

１４開０８５８−３１９９５　（４） その菌をグルコース０．５嘱、　（ＮＨ４）ＩＩＳＯ４
０，５襞、酵母エキス０．２　ＬＩＪ、　Ｋｎｇｐｏ＋
　ｔ）、　１％、　ＭｇＦＥＯ４・７ＨｇＯｏ、。

５％、Ｌ−アラニン０．１％、寒天１．５％からなる１
１５小培１，１１！　（、Ａ　Ｉ〆”＋　Ｉｎ！　＋　
Ｉ”’　７．’ｌ　）　、−１−記Ａ培地からし一アラ
ニンを除き、　（Ｎｏ、ｓ）ｇｓＯ４の代りに■・−セ
リン０．５％をｆＪＦ用した培Ｉｌｌ　（Ｂ培地、　ｐ
Ｈ７，０）及びＡＪ（＋’Ｈ地からＬ−アラニンを除き
、グルコースの代りにＩ、−セリン０５チを使用した培
地（Ｃ培地、ｐ１］７０）に塗布し、３０’Ｃで３〜４
日間培養し、ＡＩ”？い１１；（このみ生育し、Ｂ培地
及びＣ培地に生育できＬｌいコ「］ニーを釣菌すること
により、グリシンよりＬ　−−１！リンを生成する能力
の優れたサルシナ・アルビグＭ［Ｑ−３４・（微工研閑
寄第ｂρ３４号）を得た。

診考例　２ Ｆ　４弟２表に示す菌株をグルコース０，５％、ペプト
ン１ヂ１．肉エキス（１，１％、酵母エキス１チ。

１ｑハＣ］０５’メ３．寒天Ｌ５嘱からなる斜面培地（
ｐｌ（７゜Ｏ）に３０°Ｃで２４時間生育させた。この
−白金耳をグルコース１チ、　（ｒ鉗り１ｓ０４０．３
チ、ミースト１３− ２．０％、クリシン０，４チ、　ＫＩＩｇ［’０４０．
１％、　ＫＩＩｌｌＰＯ４０，１チ　、ＭｇＳＯ４・　
７　　＋１ｇ０　０．０　］　　Ｉ４．　　ＭｎＳＯ４
・４〜６ＨｇＯＯ，００１％、Ｆｅ３Ｏ３・７１１２０
０．０　＋）　０　］　俤からなる培地（ｐＨ７，０）
　　Ｉ　ｌ）　Ｏｍｔを含む５　（１Ｏｍ１客坂１」フ
ラスコに植菌し、３０℃で２８１１．′ｆ間振とう培養
を行１，１゛った。培養終了後＋　ｌｉ＋’、ｉ体を洗
浄し、　ｒ、　−セリンデヒドラターゼ活性を測定した
。１分間に］／１ｍｏＬθのピルビン酸を生成せしめる
活性を１単位としたところ、培近液１　ｍｌ当りの活性
はｑＳＳ土圧示す通りであった。

なお、使用菌のＩ・−セリンデヒドラターゼ活性の測定
は洗浄菌体を酵累源として１・−セリンと酵素反応を行
ない、生成したピルビン酸を定ｍする方法（Ａｇｒ、　
Ｈｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　、　３８　、５３１　（］　
９７１４− 第２表 実施例　１ （１）　　グルコース１チ、　（ＮＨ４）ｌｌｓＯ４ｏ
、　３嘱、ミースト２，０％、グリシン０，４条、　Ｋ
３ＰＯ４・３ＨＱＯＯ，５係。

ＭｇＳＯ４・７　ＨｇＯＯ，６９’％　、　ＭｎＳＯ４
・４〜６Ｈ！ＯＯ，００１％　、　”Ｃ９０４、７Ｈ２
０ｏ、　０００１　％　から成る組成の培地（ｐＨ７，
０，）ＩＤＯｄを入れた５００ｒｎｌ容坂ロフラスコに
、サルシナ・アルビグＭＥ−３４（微工研菌寄第　ｂρ
とψ号〕を１白金耳摺種し、３０℃１こ′Ｃ２８時間振
とう（１４０ｒｐｍ　、　７　ｃｍストローク）培養し
た。この培養液を遠心分離し、菌体を集め（該培養液３
０＋ｄより集菌した菌体を１倍閑体、該培養６０ｍ１よ
り集菌した菌体を２倍菌体、と称する。）、これをグリ
シン４，５ノ及びｌＱｍＭピリドキナールリン酸０．１
２ｒｎｌを含有する水溶液−１５− ３０ｒｎｌ　（ｐＨ７，０）に添加し、　５　ｆｌ　（
１ｍｅ容坂［１フラスコで３０℃にて３０間振とう反応
を行ｆ、ｒった。

反応液中に蓄積した■・−セリンのｆｉ、ｔは第３表の
通りであった。

第　３ｋ （２）反応終了後、２倍ｌ１４′ｊ　１４ｊ　’ａ”　
Ｉｌｌ　ｂｌ（打ちっム゛反応液を集め　その１／を酢
酸でｐ１ｉ４さし、’１０５）間煮沸Ｌ　、　／ｉｊ後
ろ過した。このろ液をアンバーライト”　−Ｉ　Ｓ：　
ｌ）　（肋）のカラムに導通し、水洗後５％ＮＨ４０１
＋で給出し、紘［Ｅ乾固して１．−セリン・クリシン混
合物１００９を得た。この粗結晶を水１１０ｄで再結晶
してグリシンの結晶４８９を回収した。又、このろ液を
減１１［乾固［、て、Ｌ−セリン２７２．グリシン２５
９の混合物を得、このＩ、−セリン・グリシン混合物に
ｍ−キシレン−４−スルホン酸］５０９を加え、水１０
５ｄを添加’ｆ−ｊｌ：！Ｉ１１＋：５８−、’ｔＨ］
１５　（５）して７０°Ｃで１０分間加熱し、−夜放冷
後、ろ過酸塩６２９を得た。この結晶を水３００　ｍｌ
に溶かし、　ｐＨを６に調整後、アンバーライトＩＲ−
１２０（Ｉ＋”）のカラムに心通し、水洗後、吸着した
Ｌ−セリンを５嗟アンモニア水で溶出し、減圧乾固した
徨、水から再結晶することによりＬ−セリンの結晶２２
１を得た。

〔α〕＋１−→−１４．３（Ｃ戴２　、　ＮＨＣ］、　
）実施例　２ 実施例１で得た１倍菌体反応１０１１１！を酢酸でｐＨ
４とし、１０分間煮沸し、冷後ろ過した。このろ液を実
施例１と同様に　バーライ）Ｉ　Ｒ−１２０（Ｈ”）カ
ラムで処理し、Ｌ−セリン・グリシン混合物１００９（
Ｌ−セリン・・・・・２２Ｆ、グリシン・・・７８））
を得た。この混合物を水１６ｄに溶かし１ｍ−キシレン
−４−スルホン酸２８０２１７− を加え、７０°Ｃで１０分間加熱した。−夜放冷後、ろ
過し、少幇の冷水で洗浄して川■、−セリン・ｍ−キシ
レン−４−スルポン酸”ＩＩＡ　４７．５９５・得り。

ざらに、し液を絨圧ｍ’４　ｔｌＭ　したのち水から「
［結晶して粗し−セリン・ｍ−；トシレンー４−スルポ
ン酸塩１２．８Ｐを得ｔこ。この粗結晶を合わせて、水
から再結晶して純Ｉ・−セリン・Ｉｎ−キシレン−４−
スルホン酸塩４１．８Ｆを１１す、以１・一実施例１．
！−同様にアンバーライトＩ　Ｒ−１２０（、Ｈ＋）の
カラ！・で処ＰＪ！を行い、■・−セリン１３．４Ｆを
得た。

実施例　３ 実施例１の培地中ミースト２チを酵１′Ｊエギス１チに
かえた培地を用いて実施例１と同様Ｉこ培賀したサルシ
ナ・アルビダＭＥ−３４（微工研蘭寄第ｂ　ｏ　ｇ　ｐ
　号）の培徨液１１！１こグリシン５０ノ、ピリドキサ
ールリン酸１０〜を加え、　ｐＨ７、５にコントロール
して、３０°′Ｃで７２時間反応したところ、７．８γ
ｄのＬ−セリンが蓄積した。この際、界面活性剤ニラコ
ールＤ　Ｃ−２０Ｔ　Ｘを０．５％添加して反応を行う
と７２時間で１（）１η／ｍｅ　Ｏ〕＋１−セリ１８− ンが蓄積した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　サルシナ属に属し、■・−セリンデヒドラターゼ
   活性が低Ｆもしくは欠失し、かつグリシンよりＬ−セリ
   ンを生成する能力をイイする微生物の培養液または該培
   養液から得られた生菌体をグリシンを採取することを特
   徴とするｒ・−セリンの製造法。 ２、微生物がＬ−セリンデヒドラターゼ活性が低下もし
   くは欠失し、かつグリシンより■、−七リンを生成する
   能力を有するサルシナ・アルビダである特許請求の範囲
   第１項記載の’ｉｆ！造法。 ３、　サルシナ属に１萬し、Ｌ−セリンデヒドラターゼ
   活性が低下もしくは欠失し、かつグリシンよりＬ−セリ
   ンを生成する能力を有する微生物の培養液または該培養
   液から得られた生菌体をグリシン　２− リンと未反応グリシンとの混合物を得、該混合物を溶媒
   中ｍ−キシレン−４−スルポン酸と反応さｌｊ：て、■
   、−セリン・ｍ−キシレン−４−スルホン耐塩及びグリ
   シン・ｍ−キシレン−４−スルボンホ二ンー酸−塩１ヅ
   １’：城１冊；両塩の溶媒に対する溶解度の差を利用（
   、て■・−セリン・ｍ−キシレン−４＝スルホン酸塩を
   同相として単離し、ついでこれを脱塩して■、−七リン
   とすることを特徴とするＬ　−−＋＝ニリン製造法 ４、　微生物がＬ−セリンデヒドラターゼ活性が低下イ
   ）シ＜は欠失し、かつグリシンよりＬ−セリンを生成す
   る能力を有するサルシブ・アルビダである特許に＋ｊｆ
   求の範囲第３項記載の製造法。