JPS6314958B2

JPS6314958B2 -

Info

Publication number: JPS6314958B2
Application number: JP16279180A
Authority: JP
Inventors: Shozo Shiozaki; Hideaki Yamada; Yoshiki Tani; Akira Shimizu
Original assignee: Nippon Zeon Co Ltd
Current assignee: Zeon Corp
Priority date: 1980-11-19
Filing date: 1980-11-19
Publication date: 1988-04-02
Also published as: JPS5786298A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（以
下、SAMと略称する）の製造方法に関し、更に
詳しくは、アデノシン・三燐酸（以下、ATPと
略称する）及びメチオニンを微生物の菌体処理物
の存在下に反応せしめることによりSAMを効率
よく酵素合成する方法に関する。 SAMは生体内において脂肪、蛋白質、糖類な
どの代謝に関与する重要な生理活性物質である。
而して近時かかるSAMに肝血症、過度脂血症、
動脈硬化症、抑うつ病および神経病形の精神病発
現、変性関接症神経病痛覚、不眼症などに対する
治療効果のあることが見い出されており、その大
量生産が期待されている。従来、SAMの製造法としてはメチオニン含有
培地で酵母や糸状菌を培養し、該菌体からSAM
を抽出する方法が報告されている（例えば特公昭
47−37037号）。しかし、この方法は生産効率の面
で充分とは云えず、また菌体からSAMを抽出す
る方法も非常に煩雑で、工業的製造法とは言い難
い。最近、かかる培養法に代えて微生物の菌体処理
物を酵素源として用い、メチオニンとATPから
SAMを酵素合成する方法が開発されている（例
えば特開昭57−8794号、同55−81592号、同55−
96099号公報など）。この方法によれば簡単な操作
で効率よくSAMを製造することができる。しか
し、この方法に使用可能な微生物の種類は未だ限
定されており、他の有用な微生物の検索が期待さ
れていた。本発明者らは以上のような実状に鑑み、細菌に
関し種々検討を加えた結果、新たにアルカリゲネ
ス（Alcaligenes）属（以下、Al.と略称）、プロ
テウス（Proteus）属（以下、Pr.と略称）、セラ
チア（Serratia）属（以下、Ser.と略称）、アグ
ロバクテリウム（Agrobacterium）属（以下、
Ag.と略称）、アルスロバクター（Artrobacter）
属（以下、Ar.と略称）、セルロモナス
（Cellulomonas）属（以下、Cel.と略称）、ハフ
イニア（Hafinia）属（以下、Har.と略称）、エ
ルウイニア（Erwinia）属（以下、Er.と略称）、
シトロバクター（Citrobacter）属（以下、Cit.と
略称）に属する微生物の菌体処理物を酵素源とし
て用いた時にATPとメチオニンから効率良く
SAMが合成できることを見い出し、本発明を完
成した。本発明において酵素源として用いられる細菌類
は、上記の属に属し、菌体処理物の形態でメチオ
ニンおよびATPからSAMを合成する能力を有す
るものであればいずれでもよく、その具体例とし
ては、アルカリゲネス・フエカリス（Al.
faecalis）IFO 13111、プロテウス・ブルガリス
（Pr.vulgaris）IFO 3851、プロテウス・モルガニ
イ（Pr.morganii）IFO 3848、プロテウス・イン
コンスタンス（Pr.inconstans）IFO 12930、セ
ラチア・マルセツセンス（Ser.marcescens）IFO
3736、アグロバクテリウム・ラジオバクター
（Ag.radiobacter）IAM 1526、アルスロバクタ
ー・グロビフオルミス（Ar.globiformis）IFO
12137、セルロモナス・ビアゾテー（Cel.
biazotea）IAM 12106、セルロモナス・フイミ
（Cel.fimi）IAM 12107、ハフイニア・アルベイ
（Haf.alvei）IFO 3731、エルウイニア・カロト
ボラ（Er.carotovora）IFO 3830、シトロバクタ
ー・インターメデイウス（Cit.intermedius）
IFO13546、シトロバクター・フロインデイー
（Cit.freundii）IFO12681などが挙げられる。ま
たこれらの菌の天然及び人工変異菌であつても
SAM生成能を有するかぎり同様に使用すること
ができる。本発明における細菌類を培養する培地は、炭素
源、窒素源、無機塩、更に必要ならば有機微量栄
養源を含有する通常の培地でよく、細菌の種類な
どに応じて適宜選択して使用すればよい。例えば
炭素源としては、グルコース、シユクロース、フ
ラクトース、マルトース、ラクトース、セルロー
ス、デンプン等の糖類；メタノール、エタノー
ル、プロパノール、ブタノール、ソルビトール、
グリセリン、高級アルコール等のアルコール類；
クエン酸、フマール酸、グルコン酸、グリセリン
酸、安息香酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、高級
脂肪酸等の脂肪酸類；およびこれらの脂肪酸にて
構成されたエステル類；炭素数１ないし25のアル
カンおよびアルケン類；更にはこれらを含有する
澱粉加水分解液、糖蜜、大豆ホエー、果汁廃液、
魚加工廃液、発酵廃液、パルプ廃液なども使用で
きる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化
アンモニウム、硝酸アンモニウムなどのアンモニ
ウム塩、硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの硝
酸塩、アンモニア水、アンモニアガス、尿素、ア
ミノ酸などの通常の窒素源が使用できる。無機塩
としては燐酸カリウム、燐酸ナトリウム、燐酸カ
ルシウム、燐酸リチウムなどの燐酸塩、塩化カリ
ウムなどのカリウム塩、塩化ナトリウム、炭酸ナ
トリウムなどのナトリウム塩、硫酸マグネシウ
ム、塩化マグネシウムなどのマグネシウム塩、硫
酸マンガン、塩化マンガンなどのマンガン塩、硫
酸鉄、塩化鉄などの鉄塩、亜鉛塩、銅塩、コバル
ト塩などの通常の無機塩が必要に応じて適宜使用
することができる。有機微量栄養源としてはビタ
ミン、アミノ酸、これらを含有する酵母エキス、
肉エキス、麦芽エキス、コーンステイープリカ
ー、カザミノ酸、大豆粉、大豆加水分解物、ペプ
トン、トリプトン、カゼイン分解液などが必要に
応じて使用できる。本発明における培養方法は特に限定されない
が、集菌の容易な液体培養が好ましく、とくに浸
盪培養、通気撹拌培養が適切である。培養条件は
細菌の種類に応じて適宜選択すれば良く、通常15
℃から45℃、好ましくは25℃から40℃の範囲で１
ないし３日間培養すれば良い。このようにして得
た微生物菌体の集菌に際しては通常の方法、たと
えば濾過、遠心分離などの方法により培養液から
集菌すれば良い。集菌した微生物菌体を処理する方法は、SAM
合成酵素の活性を失なわせるような過激な条件で
なければ特に限定されるものではない。たとえ
ば、自然乾燥法（風乾）、減圧乾燥法、凍結乾燥
法、アセトン、メタノール、エタノールなどの親
水性有機溶媒による脱水法、トルエン、酢酸エチ
ルなどの溶剤によつて自己消化させる方法、界面
活性剤で処理する方法などが例示される。本発明におけるSAM合成反応は、ATPとメチ
オニンとを微生物菌体処理物の存在下に水性溶液
中で接触させることによつて行われる。反応に供
されるメチオニンとしては、Ｌ−メチオニンのほ
かD.L−メチオニン、Ｄ−メチオニンも例示され
るが、反応性の点でＬ−メチオニンがもつとも適
切である。また反応の条件は適宜選択すればよい
が、通常はATP濃度を５〜60ｍＭ、好ましくは
10〜20ｍＭ、メチオニン濃度を５〜60ｍＭ、好ま
しくは５〜20ｍＭ、基質溶液中の菌体処理物量を
１〜100mg／ml、好ましくは10〜80mg／mlとし、
系のPHを６〜９、好ましくは７〜８に調節して20
〜50℃、好ましくは30〜45℃の温度で0.5〜８時
間、好ましくは１〜６時間にわたつて実施され
る。また反応に際してカリウムイオン、アンモニウ
ムなどのごとき一価陽イオンやマグネシウムイオ
ン、マンガンイオンなどのごとき二価金属イオン
を共存させることが好ましく、さらに必要に応じ
てグルタチオンを添加することもできる。これら
添加剤の具体例としては、例えば塩化カリウム、
燐酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシ
ウムなどが例示され、一価陽イオンの場合には５
〜500ｍＭ、好ましくは10〜200ｍＭ、二価金属イ
オンの場合には５〜1000ｍＭ、好ましくは８〜
200ｍＭの範囲で使用するのが適切である。さら
にグルタチオンを用いる場合には２〜20ｍＭ、好
ましくは５〜15ｍＭの範囲が適切である。また反応の形式は通常バツチ式が採用される
が、必要に応じて菌体処理物を固定床とする流通
式で行うこともできる。反応が終了したのち、生
成したSAMは常法に従つて反応液中から分離さ
れる。その分離法としては、例えばSAM含有液
を強酸性カチオン交換樹脂に接触させてSAMを
吸着したのち硫酸で溶出し、溶出液にリンタング
ステン酸を加えてSAMを沈殿させる方法、SAM
含有溶液にピクロロン酸の飽和水溶液または飽和
親水性有機溶媒溶液を加えSAMをピクロロン酸
塩として沈殿させる方法などが例示される。以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に
説明する。なお、実施例におけるSAMの定量は
次のようにして行つた。反応終了後、反応液を直
ちに０〜５℃に冷却し、遠心分離にて菌体残渣を
除去したのち所定量の上澄液を採取し、ペーパー
クロマトグラフイー（東洋紙No.53、展開溶
媒；エタノール／ｎ−ブタノール／水／酢酸／１
％ピロリン酸ナトリウム水溶液＝35／30／30／
１／１）及び高速液体クロマトグラフイー（日本
ウオーターズリミテツド製高速液体クロマトグ
ラフ、ALC／GPC244型カラム：
μBONDAPAKC₁₈、Detecter：UV254nｍ）を用
いることによりSAMの定量を実施した。実施例１グルコース１ｇ／dl、ペプトン1.5ｇ／dl、
K₂HPO₄0.3ｇ／dl、Nacl0.2ｇ／dl、MgSO₄・
7H₂O0.02ｇ／dl、酵母エキス0.3ｇ／dlからな
り、PH7.0に調整した培地５mlを試験管に入れ、
加熱滅菌した。この培地にアルカリゲネス・フエ
カリスIFO 13111を植菌し、28℃で１日振盪し前
培養を行つた。次にこの前培養液５mlを、２坂
口フラスコに入れた前培養と同じ組成の加熱滅菌
した培地500mlに植菌し、28℃で40時間振盪し本
培養を行つた。培養終了後、生理食塩水で一回洗
浄し、遠心分離にて集菌した。集菌した菌体は通
風下約15時間室温にて乾燥し、更に五酸化リンを
入れたデシケーター中５℃で１日減圧乾燥した。
次にこの乾燥菌体を乳針内で粉末状にすりつぶ
し、再びデシケーター中で減圧乾燥して乾燥菌体
を調整した。 10μmolATP、5μmolL−メチオニン、10μmol
塩化マグネシウム、5μmolグルタチオン、
100μmol燐酸カリウム緩衝液（PH7.0）を含む基
質溶液１mlに上記乾燥菌体50mgを加え、35℃で４
時間振盪して反応させた。SAMの収量は
0.42μmol／mlであつた。実施例２実施例１と同じ方法で得た第１表に示す各菌株
の乾燥菌体を用い、実施例１と同じ反応条件で反
応させた。SAM収量を第１表に示した。

【表】実施例３実施例１と同じ操作で調整した第２表に示す各
菌株の乾燥菌体を用い、緩衝液としてトリス塩酸
緩衝液（PH7.4）を用いること及び塩化マグネシ
ウムに塩化カリウム100μmolを加たものを用いる
こと以外は実施例１と同様にSAMを合成した。
その結果を第２表に示した。

【表】実施例４実施例１と同じ方法で調整したシトロバクタ
ー・インタ−メデイウスIFO 13546の乾燥菌体を
用い、第３表に示す反応条件でSAMを合成した。
その結果を第３表に示した。

【表】

【表】この結果から、反応条件を適宜選択することに
より収率向上を図りうることがわかる。

Claims

【特許請求の範囲】

１アルカリゲネス属、プロテウス属、セラチア
属、アグロバクテリウム属、アルスロバクター
属、セルロモナス属、ハフイニア属、エルウイニ
ア属またはシトロバクター属に属し、アデノシ
ン・三燐酸とメチオニンよりＳ−アデノシル−Ｌ
−メチオニンを合成する能力を有する微生物の菌
体処理物とアデノシン・三燐酸およびメチオニン
を水性溶液中で接触させて反応せしめることを特
徴とするＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンの製造
方法。