FR2518988A1 - Procede pour preparer la l-threonine - Google Patents

Abstract

L'INVENTION DECRIT UN PROCEDE POUR PREPARER LA L-THREONINE SELON LEQUEL ON FAIT REAGIR DE LA D-THREONINE-ALDOLASE, OU DE LA D-THREONINE-ALDOLASE ET DE LA L-ALLOTHREONINE-ALDOLASE SUR UNE SOLUTION CONTENANT AU MOINS DE LA DL-THREONINE, DE FACON A OBTENIR DE LA L-THREONINE A PARTIR D'UN MELANGE CONTENANT AU MOINS DE LA DL-THREONINE.

Description

Procédé pour préparer la L-thréonine.

La présente invention concerne un procédé pour

préparer la L-thréonine par réaction de la D-thréonine-

aldolase ou de la D-thréonine-aldolase et de la L-allo-

thréonine-aldolase sur une solution contenant au moins la DL-thréonine. Plus particulièrement, la présente invention

concerne un procédé pour préparer la L-thréonine selon le-

quel on fait réagir la D-thréonine-aldolase sur la DL-

thréonine ou bien la D-thréonine-aldolase et la L-allo-

thréonine-aldolase sur un mélange de DL-thréonine et de DL-allothréonine de façon à obtenir de la L-thréonine à partir de la DL-thréonine ou du mélange de DL-thréonine et de DL-allothréonine par décomposition de Dthréonine,

de D-allothréonine et de L-allothréonine de façon asymé-

trique en glycine et acétaldéhyde.

La L-thréonine est l'un des acides aminés essen-

tiels pour l'homme et les animaux, et, étant donné sa te-

neur relativement faible en diverses protéines animales et végétales, le besoin potentiel en L-thréonine comme l'un des additifs utilisés dans les produits alimentaires est assez important Jusqu'à maintenant, on produisait la

L-thréonine par une méthode d'extraction à partir de substances na-

turelles ou une méthode de fermentation de substances naturelles, cependant, étant donné le coût relativement élevé de la L-thréonine ainsi produite, on recherche un

procédé pour produire celle-ci à un moindre coût -

Par ailleurs, bien que la L-thréonine soit fa-

cilement synthétisable à partir de glycine, etc, de la D-thréonine est sous-produite dans la même quantité que la L-thréonine tandis que se forment simultanément les

D-allothréonine et L-allothréonine, et leurs DL-isomères.

En conséquence, les étapes d'isolement et de purification

de L-thréonine à partir desproduits de réaction sont extra-

mement complexes Le rendement en L-thréonine est faible et le prix de la L-thréonine ainsi produite par synthèse est très élevé Par exemple, comme méthode de résolution

optique de la DL-thréonine, on connaît les méthodes décri-

tes dans Bull Soc Chim Vol 20, page 903 ( 1953) et ibid, Vol 23, page 447 ( 1956), cependant, ces méthodes

pour la résolution optique de la DL-thréonine sont extra-.

mement pénibles et ne fournissent de la L-thréonine qu'avec

un faible rendement De plus, pour éliminer les allothréo-

nines, on utilise de façon inévitable une méthode ineffi-

cace et très pénible telle que celle décrite dans la publi-

cation de brevet japonais n 36-19562 ( 1961), dans laquelle on utilise un complexe de bis(acétaldéhyde)thréonine-cuivre, ou bien la méthode décrite dans le brevet US n 2 461 847,

dans laquelle l'allothréonine et la thréonine sont conver-

ties en leurs sels sodiques dans l'éthanol, à l'aide d'éthy-

late de sodium, et les sels sont séparés grâce à la diffé-

rence existant entre leurs solubilités.

De plus, il y a d'autres inconvénients dans le procédé de synthèse en ce qu'il y a très peu de demandes pour la D-thréonine et l'allothréonine sur le marché, et que la racémisation de la D-thréonine en L-thréonine n'est

pas facilement réalisée.

A la suite de l'étude menée par la demanderesse

pour mettre au point un procédé de prénaration de L-thréo-

nine à faible co t par utilisation de réactions enzymati-

ques résolvant ainsi les problèmes techniques, la demande-

resse a trouvé une nouvelle enzyme qui catalyse la D-thréo-

nine et également la D-allothréonine en les convertissant en glycine et acétaldéhyde; cette enzyme est dénomnmée l'enzyme D-thréonine-aldolase A savoir, la demanderesse a trouvé de plus que dans le cas o l'on fait réagir la D-thréonine-aldolase avec le produit de la synthèse, c'est-àdire la DL-thréonine, ou dans le cas o l'on fait

réagir la D-thréonine-aldolase en association avec la L-

allothréonine-aldolase sur des produits plus complexes de synthèse, c'està-dire un mélange de DL-thréonine et de DL-allothréonine, on obtient de la L-thréonine avec le produit de décomposition utile, c'est-à-dire la glycine et l'acétaldéhyde Il en résulte que la préparation de

L-thréonine est facilement réalisée et que les sous-pro-

duits sont utilisables tandis que les problèmes ci-dessus

sont résolus.

Selon une modalité de la présente invention, on

fournit un procédé pour préparer la L-thréonine selon le-

quel on fait réagir de la D-thréonine-aldolase ou de la D-thréoninealdolase et de la L-allothréonine-aldolase sur une solution contenant au moins de la DL-thréonine Plus particulièrement, on fournit un procédé pour préparer la

L-thréonine selon le quel on fait réagir de la D-thréonine-

aldolase sur de la DL-thréonine ou on fait réagir de la D-thréoninealdolase et de la L-allothréonine-aldolase sur un mélange de DL-thréonine et de DL-allothréonine de façon à obtenir de la L-thréonine à partir de DL-thréonine ou du

mélange de DL-thréonine et de DL-allothréonine.

La présente invention concerne donc un procédé 9 our obtenir de la Lthréonine à partir de DL-thréonine ou

d'un mélange de DL-thréonine et de DL-allothréonine, compre-

nant l'étape de catalyse de DL-thréonine contenue dans une solution aqueuse avec de la D-thréonine-aldolase, ou la

catalyse d'un mélange de DL-thréonine et de DL-allothréo-

nine contenu dans une solution aqueuse avec un mélange de

D-thréonine-aldolase et de L-allothréonine-aldolase.

La D-thréonine-aldolase conforme à la présente

invention est une nouvelle enzyme qui décompose la D-thréo-

nine en glycine et acétaldéhyde et catalyse également la

D-allothréonine pour la décomposer en glycine et acétal-

déhyde Une enzyme produite par une souche de Alcaligenes faecalis, IFO 12669 (déposée à l'Institute for Fermentation Osaka, Japon), une enzyme produite par une souche de

Pseudomonas DK-2, (déposée au Fermentation Research Ins-

titute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japon, sous le numéro de dépôt FERM-P 6200), et une enzyme pro- duite par une souche d'Arthrobacter DK-19, (déposée aussi dans ce dernier Institut sous le numéro de dépôt FERM-P 6201)

possèdent respectivement une aptitude à décomposer-la D-

thréonine et la D-allothréonine et en conséquence, chacune d'entre elles peut être utilisée conformément au procédé

de la présente invention.

Les propriétés bactériologiques de la souche de Pseudomonas DK-2 (FERM-P 6200) et de la souche d'Arthro

bacter DK-19 (FERM-P 6201) sont indiquées ci-dessous.

(a) Propriétés mornholoaiques.

Rubrique Pseudomonas DK-2 Arthrobacter DK-19 Forme des En forme de En forme de cellules bâtonnets bâtonnets Dimension des cellules (O 1,5 x 0,8 2,5 x 0,8

Pléiomorohisme Aucun Mélange de bâton-

nets linéaires or-

dinaires incurvés, en forme de V et cylindriques Mobilité Positive Positive très active monotriche péritriche Spore Aucune Aucune Gramcoloration Négative Ayant des granules gram-positives l'intérieur des cellules gram-négative Acido-résistance Aucune Aucune in (b) Etat de la croissance dans divers milieux de culture Rubrique Pseudomonas DK-2 Arthrobacter DK-19

Culture sur bouil Colonies circulaires Colonies circulai-

lon gélosé en semi-transparentes res, de couleur

boite avec protubérance crème, avec protu-

convexe circulai bérance convexe

re, brillantes circulaire, bril-

lantes Culture sur bouil Croissance mode Croissance modérée, lon gélosé incli rée, semi-transpa colonies semi-trans

né rente et brillante parentes, filifor-

mes, de couleur crème, brillantes

Culture sur bouil Croissance mode Croissance favora-

lon nutritif liquiderée ble, état floculeux

Culture sur bouil Croissance favora Croissance favora-

lon gélatineux en ble sur la surface ble sur la surface

piqûres du milieu de cul du milieu de cul-

ture ture, sous forme filiforme Lait de tournesol Changement en Décoloration sans couleur alcaline liquéfaction I A,

(c) Prorits hysiolo 7 iques.

(c) Propriétés iffysiolociicues.

Rubrique Pseudamonas DK-2 - Arthrobacter IDK-19 Réduction de nitrate Dénitrification Test MR Test VP Production d'indole Production de H 25 Hydrolyse de l'amidon

Utilisation d'acide ci-

trique dans le milieu: de Koser de Christensen Utilisation de source d'azote minérale: Nitrate Sel d'ammonium Production de colorant Activité comme uréase Activité comme oxydase Activité comme catalase Gamme de croissance: p H Température (OC) + + + (faible) + +

6 à 9,5

à 50 + + (faible) + +

4,5 à 9,5

de préférence

8 à 8,5

à 38 de préférence

28 à 30

(c) Propriétés physiologiques (suite) Rubrique Pseudomonas DK-2 Arthrobacter DK-1 Aérobisme Test O-F (méthode de Hush Leifson) Production d'acide et de gaz à partir de sucre

L-arabinose-

D-xylose D-glucose D-mannose D-fructose D-galactose Maltose Sacrose Lactose Tréhalose D-sorbitol D-mannitol Inositol Glycérol Amidon Raffinose Inuline D-ribose Dulcitol Sorbose Carboxyméthylcellulose Halotolérance dans: % en poids de solution aqueuse de chlorure de sodium oui oxydant acide gaz + (faible) se développe aci oui oxydant de gaz se développe / -

(c) Propriétés ohvsiologiques (suite).

Rubrique Pseudamonas DK-2 Arthrobacter DK-19 % en poids de solution ne se dévelop se développe aqueuse de chlorure de pe pas légèrement sodium Activité de décomposition vis-à-vis de la gélatine Activité comme DNA-ase

Vitamines essentielles Thiamine et Acide pantothé-

acide folique nique et acide nicotinique Source d'isolement Sol Sol En classant ces deux souches en fonction de leurs propriétés bactériologiques d'après le "Manual of Determinative Bacteriology, 8 e Ed ( 1974)" par Burgey, la souche DK-2 est identifiée comme appartenant au genre

Pseudomonas, parce qu'il s'agit d'un bâtonnet gram-néga-

tif, monotriche, et dont l'action est positive au test

d'activité à titre d'oxydase et de'dénitrification.

Par ailleurs, la souche DK-19 est identifiée comme appartenant au genre Arthrobacter, parce qu'il s'agit d'un bâtonnet faiblement gram-positif ayant un

oléiomorphisme, qui est péritriche et incapable d'utili-

ser des saccharides.

L'enzyme présentant à la fois l'activité de

D-thréonine-aldolase et l'activité de D-allothréonine-

aldolase conformément à la présente invention peut être produitenar culture, par exemple d'une des souches dans un milieu de culture nutritif, qui peut être identique à ceux qui sont utilisés ordinairement pour cultiver une quelconque souche de bactéries contenant des saccharides

tels que du glucose, du glycérol, des mélasses et similai-

res, ou un acide carboxylique organique tel que l'acide acétique, l'acide malique et similaires comme source de carbone, du sulfate d'ammonium, du chlorure d'ammonium, de l'urée ou similaires comme source d'azote, un extrait

de levure, de la peptone, un extrait de viande, de la'li-

queur de macération de mals, etc, comme élément nutritif

organique, et du magnésium, du fer, du manganèse, du po-

tassium, du phosphate, etc, comme ion minéral La culture

peut être réalisée dans les conditions classiques, c'est-à-

dire à un p H dans la gamme de 4 à lo pour le milieu de cul-

ture, à une température de 20 à 600 C pendant 1 à 3 jours

de culture aérobique après inoculation.

En cultivant l'une de ces souches dans les con-

ditions indiquées plus haut, on produit l'enzyme présen-

tant à la fois l'activité de D-thréonine-aldolase et 1;ac-

tivité de D-allothréonine-aldolase dans les éléments bacté-

riens dans lesquels elle s'accumule Afin d'isoler l'enzyme

à un état plus pur à partir du milieu de culture, les pro-

duits de Prolifération de la souche de microorganisme (dé-

nommés par la suite "cellulesbactériennes") sont détruits par une méthode connue telle-qu'une méthode mécanique, un traitement utilisant une enzyme et une méthode autolysante de façon à obtenir-un extrait brut de l'enzyme, et ensuite,

cet extrait brut est soumis à une purification par une as-

sociation convenable de précipitation par du sulfate d'am-

monium ou un solvant organique comme l'acétone ou le métha-

nol, et de chromatographie utilisant un échangeur d'ions

tel que du diéthylaminoéthyle (dénommé par la suite "DEAE")-

céphalose, DEAE-cephadex et gel de phosphate de calcium, etc, ou un adsorbant, etc Afin d'obtenir la manifestation de l'activité enzymatique de celui-ci, la présence d'une co-enzyme, le pyridoxal-5 '-phosphate, est nécessaire dans

-5 -

sa réaction, en une quantité ordinaire de 105 à 10-3 M. Les propriétés physico-chimiques de la nouvelle ll enzyme conforme à la présente invention sont expliquées de

la façon suivante.

( 1) Activité et spécificité du substrat.

La nouvelle enzyme conforme à la présente inven-

tion décompose à la fois la D-thréonine et la D-allothréo- nine en glycine et acétaldéhyde, et d'un autre côté, n'agit

pas du tout sur la L-thréonine et la L-allothréonine.

( 2) p H optimum.

En déterminant l'aldéhyde produit pari la nou-

velle enzyme à partir de la D-thréonine comme substrat, à 30 C pendant 10 minutes, à un p H d'une sérielon a constaté que le p H optimum de la nouvelle enzyme était dans la gamme de 7 à 9 Les solutions tampon respectives utilisées sont un tampon de phosphate 0,1 M pour la gamme

de p H de 4 à 7,5, un tampon de tris-H Cl 0,1 M pour la gam-

me de p H de 7 à 9 et un tampon de carbonate de sodium 0, 1 M

pour la gamme de p H de 9 à 11.

( 3) Gamme de p H dans laquelle la nouvelle enzyme est stable.

En déterminant l'activité restante de la nouvel-

le enzyme, après chauffage d'une solution de l'enzyme pen-

dant une heure à 300 C, à un p H d'une série, on a cons-

taté que la gamme de p H dans laquelle la nouvelle enzyme

pouvait exister à l'état stable allait de 6 à 9 La solu-

tion tampon respective utilisée dans la culture est un tampon de phosphate 0,1 M pour une gamme de p H de 4 à 7,5, un tampon de tris-H Cl 0,1 M pour une gamme de p H de 7 à 9, et un tampon de carbonate de sodium 0,1 M pour une gamme

de p H de 9 à 11.

( 4) Méthode de détermination de l'activité enzymatique.

On détermine selon la méthode de Paz (voir Arch Biochem Biophys, Vol 109, page 548 ( 1965)) la quantité d'acétaldéhyde formée lorsque 0,1 ml d'un liquide contenant la nouvelle enzyme est ajouté à 0,4 ml d'une solution tampon de tris-H Cl 0,1 M contenant 100 micromoles de D-thréonine à p H 8, 0 et que le mélange est chauffé à

C pendant 10 minutes; l'activité enzymatique correspon-

dant à la décomposition de -I micromole de D-thréonine à 30 C sert de référence, c'est-à-dire qu'elle constitue

une unité (U).

( 5) Gamme-de température optimum Dour l'activité. A partir de la détermination de la quantité d'acétaldéhyde produit par la nouvelle enzyme dans les conditions de p H optimum ( 8,0) à une température d'une

s ér ie pendant 10 minutes, en utilisant une so-

lution tampon de tris-H Cl 0,1 M, on a constaté que la gamme

de température optimum pour l'enzyme était de 40 à 50 C.

( 6) Stabilité à la chaleur de la nouvelle enzyme.

A partir de la détermination de l'activité res-

tante après chauffage d'une solution de la nouvelle enzyme dans une solution tampon de tris-H Cl 0,1 M à un p H de 8,0 pendant une heure, à une température d'une série, on

a constaté que la température à laquelle l'enzyme est sta-

ble est inférieure à 40 C.

( 7) Conditions d'inactivation de la nouvelle enzyme.

La nouvelle enzyme conforme à la présente inven-

tion est complètement inactivée à un p H inférieur à 5 et supérieur à 11 et également complètement inactivée après chauffage pendant une heure à une température supérieure à

700 C.

( 8) Agents inhibant, activant ou stabilisant l'activité.

La nouvelle enzyme est activée et stabilisée par le mercaptoéthanol, le sulfite de sodium, le sulfite acide

2 + 2 + 2 <'

de sodium, le dithiothréitol et les ions Mn 2 +, Co, Fe 2 + 2 + ou Mg, et d'un autre côté, l'activité de l'enzyme est inhibée par l'ion Ag+ monovalent, CU 2 +, Hg 2 +, Zn 2 +, Pd 2 +,

l'hydroxylamine et le p-chloromercuribenzoate.

( 9) Coenzyme.

La coenzyme de l'enzyme est le pyridoxal-5 '-

phosphate.

( 10) Poids moléculaire.

Le poids moléculaire de l'enzyme est dans la gamme de 100 000 à 150 000 déterminé par filtration sur gel,

sur Cephadex (dénomination commerciale) G-200.

( 11) Comoosition analytique élémentaire.

50,7 à 52,7 % de carbone, 6,8 à 8,8 % d'hydrogène et

14,7 à 16,7 % d'azote.

Comme la thréonine-aldolase et l'allothréonine-

aldolase connues ne décomposent que la L-thréonine et la L-allothréonine respectivement, et que les enzymes qui décomposent le D-isomère n'ont jamais été connues, chaque enzyme trouvée dans les souches respectivement est une

nouvelle enzyme présentant une nouvelle activité.

A savoir, toute enzyme présentant une activité D-thréonine-aldolase peut être utilisée dans le procédé conforme à la présente invention dans la mesure o cette enzyme peut décomposer à la fois la D-thréonine et la

D-allothréonine en les convertissant en glycine et acétal-

déhyde. La L-allothréonine-aldolase utilisée dans le procédé selon l'invention est une enzyme catalysant la

L-allothréonine en la convertissant en glycine et acétal-

déhyde, et la présence de celle-ci est connue dans le foie de mouton et la semence de mais en germination, cependant, la production microbiologique de cette enzyme n'est pas connue.

Cependant, la demanderesse a constaté que cer-

taines bactéries appartenant respectivement aux genres

Bacillus, Pseudomonas, Arthrobacter et Alcaliqenes produi-

sent l'enzyme, et elle a mis au point une méthode pour pro-

duire l'enzyme industriellement à grande échelle Comme

exemples Se microorganismescapablesde produire la L-allo-

thréonine-aldolase, on peut utiliser une souche de Bacillus DK-315 (déposée au Fermentation Research Institute, Agency

of Industrial Science and Technology, Ministry of Inter-

national Trade and Industry, Japon, sous le numéro de dépôt -FERM-P 6202 > isolée à partir d'un sol, une souche de Arthrobacter DK-19 (FERM-P 6201), la souche de Pseudomonas DK-2 (FERM-P 6200) et une souche d'Alcaliqenes faecalis (déposée à l'Institute for Fermentation Osaka, Japon sous

le numéro de dépôt IF 0-12669).

Les propriétés bactériologiques de la souche de

Bacillus DK-315 (FERM-P 6202) sont les suivantes.

(a) Propriétés morphologiq ues.

( 1) Forme et dimensions des cellules i bâtonnets de o,8 x 2,0 micromètres, ( 2) Pléiomorphisme: aucun, ( 3) Mobilité: positive, multitriche, ( 4) Spore: configuration ellipsoidale existant en position extérieure au centre, ( 5) Gram-coloration: positive,

-( 6) Acido-résistance: aucune.

(b) Etat de la croissance dans divers milieux de culture.

( 1) Bouillon gélosé en boite: croissance favorable avec colonies circulaires,

( 2) Bouillon gélosé incliné: favorable, Éemi-transpa-

rent, avec lustre, ( 3) Bouillon de culture liquide: favorable,

( 4) Bouillon gélatineux en piqûre: favorable, fili-

forme à la surface du milieu de culture,

( 5) Lait de tournesol: décoloré=et liquéfié.

(c) Pro Driétés Dhysiologiques.

( 1) Réduction de nitrate + ( 2) Dénitrification: + ( 3) Test MR +(faible) ( 4) Test VP:

( 5) Production d'indole: -

( 6) Production de H 2 S: -

( 7) Hydrolyse de l'amidon: + ( 8) Utilisation d'acide

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citrique dans le milieu de Koser: de Christensen:

( 9) Utilisation d'azote -

minéral Nitrate: Sel d'ammonium: +

( 10) Production de colorant: -

( 11) Activité comme uréase: -

( 12) Activité comme oxydase: + ( 13) Activité comme catalase: +(faible) ( 14) Gamme de croissance p H: 5 à 12 Température: 5 à 40 OC ( 15) Aérobisme: oui ( 16) Test 0-F (méthode de Hush Leifson): F ( 17) Production d'acide et de gaz à partir de sucres: (acide) (gaz) Larabinose D-xylose D-glucose + + D-mannose + + D-fructose + + D-galactose + +

Maltose + -

Saccharose Lactose

Tréhalose + -

D-sorbitol

D-mannitol + -

Inositol Glycérol + +

Amidon + -

( 18) Halotolérance dans une solution de chlorure de sodium aqueuse à 5 %: ne se développe pas ( 19) Activité de décomposition vis-à-vis de la gélatine:+ ( 20) Activité à titre de DNA-ase: + ( 21) Vitamines essentielles: aucune A partir des propriétés bactériologiques indi-

* quées ci-dessus, en se référant au "Manual of Determinative-

Bacteriology",8 e Ed ( 1974) par Burgey, on identifie la souche DK-315 comme appartenant au genre Bacillus, parce

qu'il s'agit de bâtonnets gram-positifs, péritriches, ca-

pables de former des spores.

La L-allothréonine-aldolase peut être oroduite par la culture de chacune des souches indiquées plus haut dans un milieu nutritif qui est utilisé généralement pour la culture d'une souche bactérienne contenant un saccharide tel que du glucose, du glycérol et des mélasses ou un acide organique tel que l'acide acétique, l'acide malique et similaires comme source de carbone, du sulfate d'ammonium, du chlorure d'ammonium, de l'urée et similaires comme source d'azote, de l'extrait de levure, une peptone, un extrait de viande,

une liqueur de macération de blé et similaires comme source-

nutritive organique, et un sel de métal tel, que le magné-

sium, le fer, le manganese, le potassium,et des phosphates comme ion m in é r al généralement selon la méthode clas-' sique de culture des bactéries à p H 4 à 10 pendant un à trois'jours, de 20 à 60 C de façon aérobique, avec un p H

de culture dans la gamme de 4,0 à 10,0.

Ainsi, la L-allothréonine-aldolase est produite

et s'accumule dans les éléments bactériens, et en conse-

quence, dans le cas o on isole l'enzyme à partir du mi-

lieu de culture, les cellules bactériennes sont brisées par une méthode connue telle que des moyens mécaniques,

des moyens enzymatiques ou une méthode autolysante,et en-

suite, l'extrait brut de l'enzyme est préparé L'extrait

brut est traité par une association convenable d'une pré-

cipitation par du sulfate d'ammonium ou un solvant tel que

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l'acétone ou l'éthanol et une chromatographie utilisant des échangeurs d'ions tels que du DEAE-Cepharose, DEAE-Cephadex, du gel de phosphate de calcium ou des adsorbants, de façon

à fournir une enzyme de haute qualité Les Propriétés phy-

sico-chimiques simples de la L-allothréonine-aldolase ainsi

purifiée sont les suivantes.

( 1) PH optimum:8 à 9, ( 2) Température optimum: 60 à 700 C, ( 3) Conditions d'inactivation: Enzyme inactivée en une heure à 30 OC, à un p H dans la

gamme de 5 à 11, ou en une heure à une température su-

périeure à 50 C et à un p H de 8, ( 4) Eléments inhibants: Cu 2 +, Hg 2 + et Ag 1 +, ( 5) Stabilisants: mercaptoéthanol, dithiothréitol et sulfite de sodium,

( 6) Coenzyme: pyridoxal-5 '-phosphate.

Comme la L-allothréonine-aldolase requiert du pyridoxal-5 '-phosphate comme coenzyme pour manifester son activité, on fait coexister généralement 10 -3 a -5 10-5 M de pyridoxal-5 '-phosphate avec l'enzyme à chaque

fois que l'on fait réagir celle-ci.

( 7) Poids moléculaire: 100 000 à 150 000 déterminé par

filtration sur gel avec du Cephadex (dénomination com-

merciale) G-200.

( 8) Données d'analyse élémentaire: 51,4 à 53,4 % de carbone 6,5 à 8,5 % d'hydrogène et

14,2 à 16,2 % d'azote.

La L-allothréonine-aldolase utilisée conformé-

ment à la présente invention est suffisante pour le but recherché si elle décompose la L-allothréonine en glycine et acétaldéhyde, et il va sans dire que l'enzyme n'est pas

limitée à celles dérivées des microorganismes.

Les enzymes utilisées dans la présente invention,

c'est-à-dire la D-thréonine-aldolase et la L-allothréonine-

aldolase, suffisent respectivement pour le propos recherché dans le cas o elles se trouvent respectivement dans les conditions telles qu'elles sont capables de manifester leur activité enzymatique, et elles ne sont donc pas limitées à une condition isolée, et en conséquence, des produits semipurifiés, un extrait brut, de plus, le milieu de culture,

les cellules vivantes, les cellules lyophilisées, les cel-

lules séchées à l'acétone, les cellules broyées, du foie de mouton broyé et similaires peuvent être utilisés tels quels L'enzyme immobilisée ou les cellules immobilisées par des moyens connus peuvent être utilisées A titre de méthode d'immobilisation, on peut utiliser largement une

méthode de combinaison avec un support, une méthode de ré-

ticulation, une méthode de piégeage, une méthode d'aggluti-

nation et similaires.

La DL-thréonine ou un mélange de DL-thréonine et de DL-allothréonine peuvent être le produit obtenu par une quelconque méthode connue, et par exemple, une méthode dans

laquelle un acétoacétate est utilisé comme matière de dé-

part pour obtenir un ester d'acide alpha-amino-beta-hydroxy-

butyrique et l'amino-hydroxybutyrate est traité avec du chlorure de thionyle pour former un oxazoline-ester, puis

l'ester est hydrolysé en le produit recherché par chauf-

fage (voir J Am Chem Soc, 71, 1101 ( 1949)); ou bien

une méthode selon laquelle on utilise comme matière de dé-

part de l'acétate de vinyle que l'on soumet à hydroformy-

lation-par le procédé oxo pour obtenir l'alpha-acétoxy-

propionaldéhyde, on fait réagir l'aldéhyde avec du cyanure

d'hydrogène et de l'ammoniac pour obtenir de l'alpha-amino-

bêta-hydroxybutyronitrile, que l'on traite à son tour avec du phosgène pour former un dérivé d'oxazolidone, puis on soumet le dérivé à unehydrolyse pour obtenir le produit

(voir la publication du brevet japonais no 40-11608 ( 1965)).

Cependant, puisque dans le procédé selon la présente inven-

tion, le produit recherché est la L-thréonine et le sous-

produit est omposé de glycine et d'acétaldéhyde, on préf ère utiliser une méthode de synthèse qui produit les formes -allo en plus petite quantité et nécessite de la glycine et de l'acétaldéhyde comme matires de départ A ce propos, une méthode selcn laquelle un sel métallique est traité avec de la glycine pour obtenir un complexe métallique de gly cine, ensuite l'acétaldéhyde est condensé avec le complexe

métallique de glycine (voir publications de brevets japo-

nais n 36-19562 ( 1961) et 47-39093 ( 1972)), constitue une méthode convenable pour produire un mélange de DL-thréonine et de DLallothréonine La solution contenant le mélange peut être une solution aqueuse qui est obtenue par dissolu-

tion dans l'eau du produit une fois obtenu sous forme de cristaux, cependant, ce peut être le liquide obtenu par la synthèse, ou un quelconque liquide intermédiaire obtenu au cours de la préparation des cristaux du mélange En

bref, le liquide contenant la DL-thréonine et la DL-allo-

thréonine utilisé dans le procédé selon la présente inven-

tion peut être une solution contenant la DL-thréonine et

la DL-àllothréonine, et le rapport du D-isomêre au L-iso-

mère dans la solution ainsi que le rapport des thréonines

aux allothréonines dans la solution sont hors de la ques-

tion De plus, la solution peut renfermer toutes autres impure-

tés s'ajoutant à la DL-thréonine et à la DL-allothréonine.

Toute impureté inhibant la réaction enzymatique, s'il y en a, doit être éliminée au préalable Par exemple, dans le

cas o un ion métallique utilisé dans la synthèse est nui-

sible à la réaction enzymatique, on doit l'éliminer à l'aide d'une résine échangeuse de cations, etc, avant de

procéder à la réaction enzymatique.

Il n'y a aucune difficulté particulière dans le

traitement (catalyse) d'une solution contenant de la DL-

thréonine par la D-thréonine-aldolase ou le traitement

(catalyse) d'une solution contenant à la fois la DL-thréo-

nine et la DL-allothréonine avec le mélange de D-thréonine-

aldolase et de L-allothréonine-aldolase En bref, l'enzyme indiquée peut être présente dansla solution aqueuse de la substance indiquée La concentration en DL-thréonine et/ou DL-allothréonine dans la solution peut être telle qu'elle n'inhibe pas remarquablement l'activité enzymatique et elle est de préférence dans la gamme de 0,1 à 2 moles/litre 1

Le solvant du système de réaction enzymatique esten prin-

cipe de l'eau, cependant, un solvant organique peut être

compris dans celle-ci s'il n'inhibe pas la réaction enzyma-

tique Bien que le p H du système de réaction dépende de l'enzyme, il est préférable de travailler autour de p H 7 A

dans les cas o l'enzyme est obtenue dans les exemples dé-

crits Bien que la température de réaction déoende de l'en-

zyme, il est préférable de travailler à 30 à 45 o C dans le cas o l'on utilise l'enzyme préparée dans les exemples

décrits De plus, dans le cas o l'on utilise l'enzyme pré-

parée dans l'exemple, la réaction enzymatique peut être accélérée par l'apport d'une quantité molaire de 103 à -5 -5 de pyridoxal-5 '-phosphate dans le système à titre de coenzyme De plus, un agent tensio-actif peut être ajouté au système de réaction pour divers buts La réaction enzy

matique peut être effectuée de façon continue ou disconti-

nue La D-thréonine-aldolase et la L-allothréonine-aldolase

peuvent être ajoutées ensemble ou séparément.

La durée de réaction peut être choisie éventuel-

lement en fonction de l'utilisation finale prévue de la L-thréonine Par exemple, dans le cas o l'on cherche à

obtenir de la L-thréonine dans laquelle l'existence d'iso-

mère non décomposé est possible, la réaction peut être arrêtée avant l'achèvement de la décomposition enzymatique de l'isomère De toute façon, une durée de réaction de 5 à

heures est suffisante pour chaque enzyme.

Lorsque la réaction enzymatique est terminée, les substances en suspension dans le-mélange réactionnel

sont éliminées par centrifugation ou filtration, si néces-

18988

saire, et le mélange réactionnel résultant est purifié par

traitement sur une résine échangeuse d'ions et cristalli-

sation, et après décoloration de la solution de réaction

par du charbon actif, etc, la solution décolorée est con-

densée pour fournir les cristaux de L-thréonine à l'état

pur Le produit de réaction autre que la L-thréonine com-

prend de la glycine et de l'acétaldéhyde dans le cas o l'on utilise de la D-thréonine-aldolase et également dans le cas o l'on emploie de la Dthréonine-aldolase et de la L-allothréonine-aldolase; la glycine peut être séparée et isolée par chromatographie, par exemple avec une résine échangeuse d'ions Comme on constate une condensation non enzymatique de l'acétaldéhyde avec la glycine pendant la réaction enzymatique, ou la recombinaison avec la glycine par chaque enzyme, il peut être mieux de récupérer

l'acétaldéhyde pendant la réaction enzymatique par distil-

lation, etc.

Conformément au procédé selon la présente inven-

tion, l'élimination de D-thréonine ou de DL-allothréonine d'un mélange de thréonine qui était auparavant difficile

peut être effectuée au cours d'une étape simple et commode.

En conséquence, la présente invention a résolu le gros problème qui a empêché la séparation de l'isomère et a fourni une méthode pour produire la L-thréonine à un faible

prix à partir de thréonine, qui est produite par synthèse.

En particulier, il est plus avantageux de combiner le pro-

cédé avec une méthode de synthèse de production de thréo nine à partir de glycine et d'acétaldéhyde, parce que les

sous-produits de la réaction enzymatique peuvent être ré-

utilisés comme matières-e départ.

La présente invention est davantage expliquée

à l'aide des exemples ci-après.

Cependant, la présente invention n'est pas li-

mitée à ces exemples A partir de la description ci-dessus,

le spécialiste saura déterminer les caractéristiques essen-

2518 8988

tielles de cette invention, et sans sortir du cadre de celle-ci, envisager divers changements et modifications

de façon à l'adapter à divers usages et conditions.

De plus, tous les pourcentages indiqués sont en poids L'activité de la Dallothréonine-aldolase et celle de la L-allothréonine-aldolase sontmesuréesde la même façon que celle de la D-thréonine-aldolase, si ce n'est que le substrat est modifié en fonction de chaque enzyme On évalue le titre de l'activité en attribuant la valeur d'une unité ( 1 U) à l'activité correspondant à Ia décomposition d'une micromole d'allothréonine, le substrat,

en une minute.

Exemple 1 de préparation.

Production d'une enzyme ayant l'activité de D-thréonine-

aldolase et l'activité de D-allothréonine-aldolase.

On prépare un milieu de culture dont le p H est

ajusté à 7,5, comprenant 0,5 % de polypeptone, 0,2 % d'ex-

trait de levure, O,1 % de sulfate diacide de potassium, 0,05 % de sulfate de magnésium, 0,1 % d'acide L-glutamique et 0,5 % de D-thréonine; dans un récipient de culture de litres, on introduit 3 litres de ce milieu de culture,

puis on stérilise celui-ci à 120 C pendant 10 minutes.

Dans le milieu de culture ainsi stérilisé, on inocule une souche d'Arthrobacter DK-19 (FERM-P 6201) et on cultive pendant 20 heures à 300 C en assurant une aération et une agitation. Lorsque la culture est terminée, les cellules sont receuillies à partir du liquide de culture par centrifugationy et après lavage des cellules avec une solution aqueuse à 0,9 % de chlorure deesodium, les cellules humides sont mises en suspension dans 100 ml d'une solution tampon de phosphate 0,1 M contenant 10 m M de mercaptoéthanol et 0,1

a M de pyridoxal-5 '-phosphate Après traitement de la sus-

pension de cellules ainsi obtenue par des ultrasons à 20 k Hz pendant 5 périodes de 5 minutes, la suspension est centrifugée et le liquide surnageant recueilli On ajoute du sulfate de protamine au liquide surnageant pour éliminer l'acide nucléique, on fractionne le liquide avec du sulfate

d'ammonium pour recueillir une fraction contenant une en-

zyme ayant l'activité de D-thréonine-aldolase.

On soumet la fraction ayant l'activité de D-

thréonine-aldolase à une dialyse vis-à-vis d'un tampon de phosphate 0,01 M contenant 10 m M de mercaptoéthanol et 0,1 m M de pyridoxal-5 '- phosphate à p H 7,5; le dialysat est envoyé à travers une colonne garnie de 100 ml de DEAE-Cephadex (dénomination commerciale) A-50, puis la fraction adsorbée sur la colonne est soumise à une élution

fractionnée selon une méthode dans laquelle la concentra-

tion en chlorure de potassium se fait graduellement, de façon à recueillir la fraction contenant l'enzyme ayant

l'activité de D-thréonine-aldolase En condensant la frac-

tion par une méthode d'ultrafiltration, on recueille 10 ml d'une solution de D-thréonine-aldolase purifiée L'activité

de D-thréonine-aldolase et l'activité de D-allothréonine-

aldolase de la solution ainsi obtenue sont respectivement

de 5 U/ml et 12,5 U/ml.

Exemple 2 de préparation.

Production d'enzymes ayant l'activité de D-thréonine-aldo-

lase et l'activité de D-allothréonine-aldolase.

On cultive respectivement une souche de Pseudomonas DK-2 (FERM-P 6200) et une souche d'Aicaligenes faecalis IFO 12669 dans la même sorte de milieu de culture,

selon les méthodes décrites dans l'exemple 1 de prépara-

tion, et à partir du milieu ainsi cultivé, on recueille

des fractions de 10 ml-d'une solution de D-thréonine-aldo-

lase-purifiée selon les méthodes décrites dans l'exemple 1 de préparation L'activité de D-thréonine-aldolase et l'activité de D-allothréoninealdolase de l'enzyme obtenue par culture de la souche de Pseudomonas DK-2 sont de 4,5 U/ml et de 10,8 U/ml respectivement, et celles obtenues par culture de la souche d'Alcaliaenes-faecalis sont de

4,2 U/ml et de 9,5 U/ml respectivement.

Exemple 3 de préparation.

Production de L-allothréonine-aldolase.

Une souche de Bacillus DK-315 (FERM-P 6202) est cultivée dans le même milieu de culture et selon la méthode décrite dans-l'exemple 1 de préparation-; on obtient 10 ml de solution aqueuse de L-allothréoninealdolase purifiée selon les méthodes d'isolement et de purification décrites

dans l'exemple 1 de Préparation L'activité de L-allothréo-

nine-aldolase de la solution ainsi obtenue est de 4,5 U/ml,

et la solution ne présente aucune activité sur la D-allo-

thréonine et la D-thréonine.

Exemple 1 de synthèse.

Synthèse-de la DL-thréonine.

Dans 5 litres d'eau chaude, on dissout 75 g de glycine et on ajoute lentement 100 g de carbonate de cuivre basique à la solution, et on fait réagir le mélange en le chauffant Lorsque la réaction est terminée, on élimine par filtration de la solution chaude l'excès de carbonate de

cuivre basique, et après condensation du filtrat sous pres-

sion réduite, le filtrat concentré est refroidi et fournit

g de complexe de cuivre-glycine cristallin.

Dans un litre d'eau, on ajoute 58 g de sel de cuivre de glycine, 40 g d'une résine échangeuse d'anions SA 21 A (type HCO 3) et 45 ml d'acétaldéhyde et l'on fait réagir le mélange en le chauffant à 40 C pendant 2 heures sous agitation Lorsque la réaction est terminée, On laisse reposer le mélange réactionnel tel quel à 50 C pendant 24

heures pour obtenir les cristaux séparés de complexe de cui-

vre-bisacéta Ldéhyde-thréonine On recueille les cristaux

avec le catalyseur en les filtrant, puis on met les matiè-

res solides en suspension dans 0,6 litre d'une solution aqueuse à 3 % d'ammoniaque et filtre la suspension Le filtrat est envoyé à travers une colonne garnie de 1,2

litre d'une résine chélatante, la Dowex (dénomination com-

merciale) A-1 (type NH 4), pour éliminer le cuivre du fil-

trat, puis la fraction réagissant positivement à la ninhy-

drine est recueillie et condensée sous pression réduite.

Par addition de méthanol au condensat, on obtient des cristaux

que l'on recristallise dans une solution méthanolique aqueu-

se et recueille 41 g de DL-thréonine ne contenant pas du

tout d'allothréonine.

Exemple 2 de synthèse.

Synthèse d'un mélanae de DL-thréonine et de DL-allothréonine.

Dans 5 litres d'eau chaude, on dissout 75 g de

glycine et on ajoute lentement à la solution 100 g de car-

bonate de cuivre basique, puis on fait réagir le mélange en le chauffant Lorsque la réaction est terminée, l'excès de carbonate de cuivre basique est éliminé par filtration de la solution chaude et après condensation du filtrat sous pression réduite, le filtrat concentré est refroidi, pour

fournir 110 g de complexe de cuivre-glycine cristallin.

Dans 0,8 litre de méthanol contenant 6 g d'hydro-

xyde de potassium, on introduit 58 g du complexe de cuivre-

glycine et 50 g d'acétaldéhyde que l'on fait réagir à à 600 C pendant 1,5 heure sous agitation Lorsque la réaction est terminée, le mélange réactionnel est filtré pour éliminer une petite quantité de matière non dissoute, et après addition de 6,4 g d'acide acétique au filtrat,

il est soumis à distillation sous pression réduite pour éli-

miner le solvant Le composé brut de cuivre-thréonine reste

sous forme de résidu de distillation, on le lave suffisam-

ment avec de l'eau, puis on dissout le composé cristallin dans 0,5 litre d'une solution aqueuse 6 N d'ammoniaque, et envoie la solution à travers une colonne garnie de 2 litres de Dowex (dénomination commerciale) A-1 (type NH 4), une résine chélatante, pour éliminer le cuivre de la solution

et recueillir la fraction contenant la thréonine La frac-

tion est condensée,sous une pression réduite,,à 100 ml, et

400 ml de méthanol sont ajoutés au condensat, puis le mé-

lange est refroidi pour obtenir des cristaux qui sont en-

suite recristallisés dans une solution méthanolique aqueuse et fournissent 38 g de DL-thréonine cristalline contenant 10 % de DL- allothréoniné.

Exem Dle 1.

Dans 20 ml d'une solution aqueuse contenant 10 -6

mole de pyridoxal-5 '-phosphate, 10-4 mole de mercaptoétha-

nol, 10-3 mole de chlorure de manganèse et 2,38 g des cris-

taux de DL-thréonine qui sont obtenus dans l'exemple 2 de synthèse et qui contiennent 10 % de DL-allothréonine, on ajoute 10 ml de la solution contenant l'enzyme purifiée qui est obtenue dans l'exemple 1 de préparation et présente à la fois l'activité de D-thréonine-aldolase et l'activité' de D-allothr 6 onine-aldolase, et 10 ml de la solution de Dallothréonine-aldolase purifiée qui est obtenue dans l'exemple 3 de préparation; tout en soumettant le mélange à une distillation sous pression réduite pour éliminer et récupérer l'acétaldéhyde formé dans la réaction de l'enzyme, on fait réagir le mélange à 30 C pendant 24 heures Le p H du mélange réactionnel pendant la réaction est maintenu

dans la gamme de 7,5 à 8,5 par addition de solution d'hy-

droxyde de sodium 0,1 N. Lorsque la réaction est terminée, le mélange réactionnel est neutralisé avec de l'acide chlorhydrique dilué et le produit de neutralisation est envoyé à travers

une colonne garnie de 100 ml de Dowex (dénomination commer-

ciale) 50 Wx-8 (type H+) La colonne est lavée à l'eau et la thréonine, la glycine, etc qui ont été adsorbées sur -la colonne, sont éluées avec une solution aqueuse 0,2 N d'ammoniaque L'éluat est condensé à sec sous pression réduite, la substance solide résiduelle est dissoute dans ml d'eau et le p H de la solution ainsi obtenue est ajusté à 3 à l'aide d'acide chlorhydrique dilué; puis la solution est renvoyée à travers une colonne garnie de 1 O Oml

de Dowex (dénomination commerciale) 50 WX-8 du type H±.

Après lavage de la colonne à l'eau, une solution aqueuse d'ammoniaque 0,1 N est envoyée à travers la colonne pour éluer une fraction contenant la thréonine et l'éluat est séché à sec sous pression réduite La matière solide est dissoute dans 4 ml d'eau et 10 ml d'éthanol sont ajoutés lentement à la solution pour obtenir des cristaux qui sont isolés Le poids à sec descristaux est de 0,9 g et l'analyse par chromatographie sur papier confirme qu'il s'agit bien de cristaux de thréonine pure La rotation spécifique du cristal est de 27 = _ 28,7 o (dans l'eau), ce qui coincide avec là rotation déterminée sur un specimen authentique de

L-thréonine pure.

La solution aqueuse 0,1 N d'ammoniaque est pas-

sée à nouveau dans la colonne restante pour éluer une frac-

tion contenant la glycine L'éluat est séché à sec sous pression réduite et la matière solide est dissoute dans 1 ml d'eau En ajoutant 4 ml d'éthanol lentement à la solution, des cristaux apparaissent dans la solution, qui sont isolés

et séchés; on recueille 0,65 g de glycine après confirma-

tion par chromatographie sur papier.

Par ailleurs, l'acétaldéhyde récupéré pendant

la réaction sous pression réduite représente 0,34 g.

Exemple 2.

En procédant de la façon décrite dans l'exemple 1 si ce n'est que l'on utilise 10 ml de la solution de D-thréonine-aldolase purifiée obtenue à nartir de

Pseudomonas DK-2 FERM-P 6200 dans l'exemple 2 de prépara-

tion à la place de la solution de D-thréonine-aldolase purifiée ob-

tenue dans l'exemple 1 de préparation, on réalise la décom-

position de la DL-thréonine contenant 10 % de DL-allothréo-

nine pour obtenir 0,91 g de cristaux de thréonine ne conte-

nant pas du tout d'allothréonine, 0,66 g de glycine cris-

talline et 0,34 g d'acétaldéhyde La rotation spécifique de la thronine cristaline est de = 28,727 (dans de la thréonine cristalline est de ZJ 28, 7 O, (dans l'eau), ce qui montre que les cristaux ne sont constitués

que de L-thréonine.

Exemple 3.

En procédant de la façon indiquée dans l'exemple i si ce n'est que l'on utilise 10 ml de la solution de D-thréonine-aldolase purifiée obtenue àpartird'Alcalicenes faecalis IFO 12669 dans l'exemple 2 de préparation, à la place de la solution de D-thréonine-aldolase obtenue dans l'exemple l

de préparation, on effectue la décomposition de la DL-thréo-

nine contenant 10 % de DL-allothréonine puis son isolement.

Ainsi, on recueille 0,91 g de thréonine cristalline ne con-

tenant pas du tout d'allothréonine, 0,66 g de glycine cris-

talline et 0,34 g d'acétaldéhyde La rotation spécifique de la thréonine cristalline est de 2 a-7 = _ 28,76 (dans l'eau), ce qui montre que les cristaux ne sont constitués

que de L-thréonine.

Exemple 4.

Dans 30 ml d'une solution aqueuse contenant

2,38 g de DL-thréonine obtenue dans l'exemple 1 de syn-

thèse, 10-6 mole de pyridoxal-5 '-phosphate, 10-4 mole de mercaptoéthanol, 10-3 mole de chlorure de manganèse, on

ajoute 10 ml de la solution de D-thréonine-aldolase puri-

fiée obtenue dans l'exemple 1 de préparation et en élimi-

* nant et récupérant l'acétaldéhyde formé pendant la réac-

tion enzymatique, on fait réagir le mélange à 300 C pen-

dant 24 heures Le p H du système de réaction est maintenu dans la gamme de 7,5 à 8,5 par addition d'une solution aqueuse 0,1 N d'hydroxyde de sodium Lorsque la réaction est terminée, on neutralise le mélange réactionnel avec de l'acide chlorhydrique dilué et on envoie ce mélange à travers une colonne garnie de ml de Dowex (dénomination commerciale) 50 WX-8 (type H) Après lavage de la colonne à l'eau, la thréonine et la glycine adsorbées sur la colonne sont éluées avec une solution aqueuse 0, 2 N d'ammoniaque L'éluat est séché à sec sous pression réduite, la matière solide est dissoute dans 20 ml d'eau, puis le p H de la solution est ajusté à 3 par addition d'acide chlorhydrique dilué et cette solution est envoyée à travers la colonne garnie de 100 ml de Dowex (dénomination commerciale) 50 WX-8 (type H+) Après lavage de la colonne à l'eau, une solution aqueuse O,1 N d'ammo niaque est envoyée à travers la colonne lavée pour éluer la fraction contenant la thréonine L'éluat est séché à sec sous pression réduite, puis la matière solide est dissoute dans 4 ml d'eau En ajoutant 10 ml d'éthanol lentement à la

solution, on constate l'apparition de cristaux dans la so-

lution, lesquels sont isolés et séchés Les cristaux ainsi recueillis nèsent 0,95 g et l'analyse confirme qu'il s'agit de thréonine pure ayant une rotation spécifique de h D 27 = -28,7 (dans l'eau), ce qui coïncide avec la valeur

obtenue pour un specimen authentique de L-thréonine.

La solution d'ammoniaque 0,1 N est à nouveau envoyée à travers la colonne sus-mentionnée pour éluer la fraction contenant la glycine, et l'éluat est condensé à sec

sous pression réduite Après dissolution de la matière so-

lide dans 1 ml d'eau, 4 ml d'éthanol sont ajoutés lentement

à la solution pour que les cristaux se séparent Après sé-

chage, l'analyse par chromatographie sur papier indique que

les cristaux pesant 0,6 g consistent uniquement en glycine.

Par ailleurs, l'acétaldéhyde récupéré pendant la réaction

sous pression réduite représente 0,3 g.

Exem Dle 5.

On répète les méthodes de réaction-enzymatique et de séparation des produits telles que décrites dans

l'exemple 1 si ce n'est que l'on n'effectue pas de distil-

lation sous pression réduite pendant la réaction enzymati-

que Il en résulte que l'on recueille 0,8 g de thréonine

cristalline contenant 10 % d'allothréonine, 0,3 g de gly-

cine cristalline et 0,05 g d'acétaldéhyde.

Exem Dle 6 La souche de Pseudomonas DK-2 (FERM-P 6200) est cultivée dans les conditions indiquées dans l'exemn 1 e 1 de préearation et la fraction ainsi obtenue représentant 10 ml ayant une activité de D-thréoninealdolase ainsi que la fraction ainsi obtenue représentant 10 ml ayant une acti- vité de-L-allothréonine-aldolase, sont respectivement con densées par ultrafiltration pour obtenir deux sortes de

solutions, contenant respectivement la D-thréonine-aldo-

lase et la L-allothréonine-aldolase.

En ajoutant les deux sortes de solutions ainsi obtenues à un mélange de 2 g de DL-thréonine et 1 g de

DL-allothréonine dans les conditions décrites dans l'exem-

ple 1 si ce n'est que la température est de 350 C au lieu de 30 C dans l'exemple 1, on obtient 0,85 g de L-thréonine cristalline ne contenant ni D-thréonine ni DL-allothréonine, 1,01 g de glycine et 0,51 g d'acétaldéhyde La rotation spécifique de la L-thréonine ainsi obtenue est de 27 = -28,6 (dans l'eau)

Z Lt ID 28,60 (dans l'eau).

25.18988

Claims (9)

REVENDICATIONS

1 Procédé pour préparer la L-thréonine, carac-

térisé en ce que l'on fait réagir de la D-thréonine-aldo-

lase ou de la D-thréonine-aldolase et de la L-allothréonine-

aldolase sur une solution contenant au moinsdela DL-thréo- nine.

2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé

en ce que cette solution est une solution de DL-thréonine.

3 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que cette solution est une solution d'un mélange de

DL-thréonine et de DL-allothréonine.

4 Procédé selon la revendication 2, caractérisé

en ce que cette solution est traitée avec de la D-thréonine-

aldolase.

5 Procédé selon la revendication 4, caractérisé

en ce que cette solution est traitée avec de la D-thréonine-

aldolase et de la L-allothréonine-aldolase.

6 Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la D-thréoninealdolase est une enzyme ayant une

activité telle qu'elle décompose la D-thréonine et la D-

allothréonine de façon asymétrique en glycine et acétal-

déhyde.

7 Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la Lallothréonine-aldolase est une enzyme

ayant une activité telle qu'elle décompose la L-allothréo-

nine de façon asymétrique en glycine et acétaldéhyde.

8 Procédé selon la revendication 6, caractérisé

en ce qu e l'enzyme est un produit d'une souche de mi-

croorganisme appartenant au genre Arthrobacter, Pseudomonas

ou Alcaligenes.

9 Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la Lallothréonine-aldolase est un produit d'une souche de microorganisme appartenant au genre Bacillus,

Arthrobacter, Pseudomonas ou Alcaliqienes.