JPS58877B2 - ｌ↓−コロナミン酸の製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はｌ−コロナミン酸の製法に関する。

ｌ−コロナミン酸は生理活性物質として有用なコロナチ
ンの製造原料として、また、試薬としても有用な物質で
ある。

コロナミン酸は天然界では、シュードモナス・コロナフ
ァシェンス・バラエティ・アトロパープルエの生産する
トキシン（コロナチン）の中にｌ−コロナミン酸として
含有されている既知のアミノ酸であって、コロナチンの
生理作用としてイタリアンライグラスの葉に黄斑を生じ
たり、馬鈴薯塊茎の薄片を異常肥大させるなど興味ある
作用が知られている。

コロナチンはｌ−コロナミン酸とコロナファシェンスと
がアミド結合されたもので、その構造は式１に示すよう
に明らかにされている。

式１ コロナチンの構造 シュードモナス・コロナファシェンス・バラエティ・ア
トロパープルエによるコロナチンの生産量は極めて微量
（約０．２μｇ／ｍｌ培養液）であり工業的な生産は困
難である。

しかしコロナファシェンスはこれの約１０倍量生産され
ているところから、比較的簡単な構造のアミノ酸である
コロナミン酸を化学合成法で作り、これとコロナファシ
ェンスから半合成法でコロナチンを作ることが有利であ
ると考えられる。

実際に半合成法で得たコロナチンは天然界より得たもの
と同じ生理作用を示すことが報告されている。

しかしこの場合コロナチンは天然体と同じｌ−コロナミ
ン酸を含むもののみが生理作用を示すことが判明してい
るので、合成法で得られるｄｌ−コロナミン酸をｄ−及
びｌ一体に分離してからコロナチンの合成を行なわねば
ならない。

本発明者らは微生物を利用してｄｌ−コロナミン酸を光
学分割し、有用なｌ−コロナミン酸を採取する方法につ
いて研究した。

その結果アシラーゼ源として微生物菌体あるいはその処
理物を利用し、アシル化したコロナミン酸を反応させる
と微生物によっては、ｌ−コロナミン酸についたアシル
基のみを脱アシル化することを見出した。

その際とくにシュードモナス属及びコリネバクテリウム
属の微生物が目的とするアシラーゼ作用を示すことを発
見し、本発明を完成した。

本発明の目的は、ｌ−コロナミン酸の工業的に利用でき
る製法を供することにある。

本発明によるｌ−コロナミン酸の製法は、原料として、
Ｎ−アシル−ｄｌ−コロナミン酸を用い、Ｎ−アシル−
４−コロナミン酸を脱アシル化する能力を有する微生物
菌体または処理物の存在下、Ｎ−アシル−ｄｌ−コロナ
ミン酸の脱アシル化反応を行ない生成した、ｌ−コロナ
ミン酸を採取することを特徴としている。

次に本発明について詳しく説明する。

本発明に使用する菌株はシュードモナス属またはコリネ
バクテリウム属に属し、Ｎ−アシル−４−コロナミン酸
を脱アシル化できるものであればいずれの菌株でもよい
。

特に好適な菌株としてはシュードモナス・メラノゲナム
ＡＴＣＣ１４５３５、シュードモナス・クルジビニＡＴ
ＣＣ２１２８３、コリネバクテリウム・グルタミクムＡ
ＴＣＣ１３０３２、コリネバクテリウム・アセトグルタ
ミクムＡＴＣＣ１５８０６などがあげられる。

本発明に用いる微生物の培養に際しては、公知の通常の
培地が使用できる。

すなわち炭素源、窒素源、無機物その他使用菌株の必要
とする微量栄養源をほどよく含有するものであれば合成
培地、天然培地いずれも使用可能である。

炭素源としてはブドウ糖、果糖、蔗糖、糖蜜、酢酸等が
用いられる。

窒素源としては塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、
リン酸アンモニウム、尿素、グルタミン酸ナトリウム、
アスパラギン酸ナトリウム等が使用できる。

さらに窒素源としてペプトン、肉エキス、酵母エキス、
コーンスチープリカー等の窒素含有天然物も使用できる
。

無機物としてはリン酸−カリウム、リン酸二カリウム、
リン酸二ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化カリウム
、塩化ナトリウム、塩化第二銅、硫酸第一鉄、硫酸亜鉛
、硫酸マンガン等が使用できる。

その他にビオチン、ビタミンＢ１等の微量栄養素を必要
に応じて使用する。

本発明における微生物の培養は、通常振盪培養あるいは
通気攪拌培養で行なう。

培養温度は２０〜６０℃が好適で、好ましくは２８〜３
２℃である。

培養経過中尿素液、アンモニア水、あるいは炭酸アンモ
ニウム溶液等を添加し培地のｐＨを４〜１０（好ましく
は６〜８）に調節する。

培養は好ましくは、微生物菌体中のアシラーゼ活性が最
大となった時点をもって終了するが、通常１〜７日で完
了する。

培養終了後Ｐ別、遠沈等によって菌体を集め、公知の緩
衝液（リン酸緩衝液０．０５ＭｐＨ７，０など）や脱イ
オン水で洗浄して培地から由来する不用成分を除去する
。

このようにして集めた菌体をそのままあるいは凍結乾燥
して粉状とし、又はアセトンなどの有機溶媒を低温下で
加えて粉末とし酵素標品を得ることができる。

さらに菌体を公知の方法で破砕し、アシラーゼ画分を公
知の酵素精製法たとえば硫安沈澱法、イオン交換セルロ
ースクロマト法、ゲル濾過法などを組合せて精製し、精
製酵素標品を取得し、これを酵素反応に用いることも可
能である。

これらの酵素源の中、凍結乾燥菌体を用いるのが最も簡
便であり、しかも酵素活性も安定で冷蔵庫（４℃）で長
期保存に耐えるのと有利である。

基質となるＮ−アシル−ｄｌ−コロナミン酸は既知物質
であり公知の化学合成法〔テトラヘドロンレター、Ｎｏ
、３、ｐ２６９−２７２（１９７７）〕で製造すること
ができる。

酵素反応は公知の緩衝液（ｐＨ５〜１０）又は中性の脱
イオン水中で２０〜６０℃の温度を保ちながら行なう。

このときの基質濃度は５〜５０ｍｇ／ｍｌの範囲で好適
に行なわれる。

反応に際して酵素活性発現に必要な金属類（ＣＯ２＋、
Ｍｇ２＋。

Ｍｎ２＋、Ｚｎ２十など）を必要に応じて添加する。

緩衝液としては公知のリン酸緩衝液、トリスアミノメタ
ン緩衝液、クエン酸緩衝液等が使用可能である。

反応は常温で１〜５日間で完了するがｌ−コロナミン酸
の生成増加が認められなくなった時点で停止させるとよ
い。

反応の停止は、加熱、有機溶媒添加などによる酵素蛋白
の変性、ゲルｐ過法による酵素蛋白の分離などによって
達成できる。

しかし反応停止を行なわず反応後遠心分離によって固型
物を除き、さらにセファデックスＧＩＯによって酵素蛋
白などを除去し、そのまま次の精製段階へと進めること
もできる。

Ｍｌ−コロナミン酸とＮ−アシル−ｄ−コロナミン酸の
分離はイオン交換樹脂等を用いる公知のアミノ酸分離法
を応用して行なうことができる。

たとえば公知の陽イオン交換樹脂のＨ＋型に先に得られ
た反応液をｐＨ７，０付近に調整して通塔し、ｌ−コロ
ナミン酸は吸着させ、Ｎ−アシル−ｄ−コロナミン酸は
水洗部に排出させる。

吸着されたｌ−コロナミン酸はアンモニア水などで溶出
して回収する。

このようにしてｌ−コロナミン酸とＮ−アシル−ｄ−コ
ロナミン酸を分離することができる。

実施例１ シュードモナス・メラノゲナムＡＴＣＣ１４５３５を肉
エキス１０ｇ／ｌ、酵母エキス１０ｇ／ｌ、塩化ナトリ
ウム５ｇ／ｌの組成の種培養用培地（殺菌前ｐＨ７，２
）で３０℃で２４時間振盪して種培養を行なう。

得られた種培養液を３０１ジャーファーメンタ−中の下
記組成の本培養用培地１５１に５％（容量）の割合で植
菌する。

肉エキス５ｇ／ｌ、酵母エキスｌＯｇ／ｌ、ポリペプト
ン１０ｇ／１１グルタミン酸ソーダ５ｇ／ｌ、塩化ナト
リウム２．５ｇ／ｌ（殺菌前ｐＨ７，２）。

培養は３０℃で３５Ｏｒｐｍの攪拌と毎分１５１の無菌
空気を通気しつつ行なう。

培地のｐＨは培養中調節しなかった。

ｐＨは培養に伴い徐々に上昇し、培養終了時にはｐＨ８
，０であった。

培養は６時間行ないただちに水を投入して冷却し、４℃
で遠心分離して菌体を集めた。

菌体は脱イオン水で２回洗浄し、さらに少量の脱イオン
水でペースト状となし、凍結乾燥して粉末酵素標品とし
た。

畳量は１００ｇであった。

次にＮ−アセチル−ｄｉ−コロナミン酸１ｇと塩化コバ
ルト１００ｍｇを５０ｍ１の水に加え、６Ｎカセイソー
ダでｐＨ７，０に調整した。

これに上記において得られた酵素標品０．２５ｇを加え
３９℃、３日間時々振盪させながら攪拌し反応させた。

反応後酵素の不活化処理を行なわずに、遠心分離（１０
，００Ｏｒｐｍ、２０分）後、上清を２５０ｍ１の陽イ
オン交換樹脂アンバーライトＩＲＣ１２０〔Ｈ十型〕に
通塔し、流出液が中性になるまで水洗、次いで２Ｎアン
モニア水でアミノ酸を溶出した。

水洗液の酸性部をまとめて減圧下に乾固し、反応しなか
ったＮ−アセチル−誘導体を得た。

これを乾燥後メタノールから再結晶化し４５０ｍｇの結
晶を得た。

本物質の赤外吸収曲線はＮ−アセチル−ｄ−コロナミン
酸の標品のものと完全に一致３．３ 、ＭｅＯＨ）であ
り、標品によく一致した。

アンモニア水溶出部のニソヒドリン陽性画分を集め、４
８０ｍｇのアミノ酸を得た。

このものの赤外吸収曲線はｌ−コロナミン酸と完全に一
致した。

またあり、標品の値とよく一致した。

実施例２ シュードモナス・クルジビニＡＴＣＣ２１２８３を用い
たこと以外は、実施例１と全く同じ方法で反応を行なわ
せた。

酵素反応はｐＨ８，５、温度４０℃で行なった。

反応波精製を行ない、Ｎ−アセチル−ｄ−コロナミン酸
、ｌ−コロナミン酸をそれぞれ４００ｍ９．３８０ｍｇ
得た。

実施例３ コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２
を用い実施例１と同様の方法で菌体を得た。

ただし種培地にはビオチン３０μｇ／ｌを加え、また本
培養培地にはビオチン３０μｇ／ｌ。

糖蜜４０ｇ／ｌをグルタミン酸ソーダの代りに加え、培
養中ｐＨをアンモニア水で７．０に調整しながら３日間
培養した。

このようにして得られた菌体は２５０ｇであった。

酵素反応も実施例１と同様に行なった。

ただしｐＨ８，０、温度４０℃で行なった。

反応波精製して得られたｌ−コロナミン酸は２５０■で
あった。

実施例４ コリネバクテリウム・アセトグルタミクムＡＴＣＣ１５
８０６を用い実施例３と同様の方法で菌体を得た。

ただし種培地、本醗酵培地の両者にビタミンＢ１ｍｇ／
ｌを補添した。

反応精製後ｌ−コロナミン酸３００■を得た。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ シュードモナス属またはコリネバクテリウム属に属
   し、Ｎ−アシル−４−コロナミン酸を脱アシル化する能
   力を有する微生物の菌体またはその処理物の存在下、Ｎ
   −アシル−ｄｌ−コロナミン酸の脱アシル化反応を行な
   い、生成したｌ−コロナミン酸を採取することを特徴と
   するｌ−コロナミン酸の製法。