FR2584739A1 - Procede pour la preparation d'un melange de sucres a forte teneur en fructo-oligosaccharides, et produit obtenu par ce procede - Google Patents

Abstract

PROCEDE POUR PREPARER UN MELANGE DE SUCRES A FORTE TENEUR EN FRUCTO-OLIGOSACCHARIDES, DANS LEQUEL ON PROCEDE, SUR LE SACCHAROSE, A UNE REACTION DE TRANSFERT DU FRUCTOSE SOUS L'ACTION D'UNE ENZYME APPROPRIEE. ON ELIMINE LE GLUCOSE FORME EN SOUS-PRODUIT A L'AIDE DE MICROORGANISMES OU D'ENZYMES. CETTE ELIMINATION PEUT ETRE EFFECTUEE EN MEME TEMPS QUE LA REACTION DE TRANSFERT DU FRUCTOSE OU APRES CETTE REACTION.

Description

La présente invention se rapporte à un procédé pour

préparer un mélange de sucres à forte teneur en fructo-oligo-

saccharides, et au produit obtenu par ce procédé. De tels mélanges ont été utilisés dans l'industrie alimentaire en tant qu'agents édulcorants provoquant moins de caries dentaires, à faible pouvoir énergétique, et également en tant que facteur sélectif de la

prolifération des bactéries bifidus de l'intestin.

L'expression "fructo-oligosaccharides" telle qu'elle est utilisée dans la présente demande, désigne des trisaccharides constitués de saccharose auquel une molécule de fructose est reliée (en; régé ci-après GF2), des tétrasaccharides constitués de saccharose auquel deux molécules de fructose sont reliées (en abrégé ci-après GF3), des pentasaccharides constitués de saccharose auquel trois molécules de fructose sont reliées (en abrégé ci-après GF4), des hexasaccharides constitués de saccharose auquel quatre molécules de fructose sont reliées (en abrégé ci-après GF5) et

leurs méLanges.

Ces fructo-oligosaccharides causent moins de caries dentaires et sont peu digestibles par les enzymes de la digestion de l'organisme vivant. En outre, la demanderesse a trouvé qu'ils avaient un effet d'accélération spécifique sur la croissance des bactéries bifidus de l'intestin: cf. par exemple demandes de brevet japonais publiées sous n 154967/81, 53834/84 et d'autres encore. On a déjà préparé ces fructo-oligosaccharides à l'échelle industrielle, par exemple par une réaction de transfert

du fructose sous l'action d'une enzyme possédant l'activité corres-

pondante, provenant de végétaux ou de micro-organismes, sur le saccharose. Le mélange de sucres obtenu par ce procédé enzymatique contient habituellement 25 % en poids ou plus de monosaccharides et 10 % en poids ou plus de saccharose. Ainsi par exemple, sa composition en sucres est la suivante: 28 % en poids de glucose, 2 % en poids de fructose, 11 % en poids de saccharose, 28 % en poids de GF2, 25 % en poids de GF3 et 6 % en poids de GF4, ces proportions pouvant varier selon les conditions de réaction et

des facteurs analogues. Comme on l'a déjà signalé, dans la compo-

sition donnée ci-dessus, les abréviations GF2, GF3 et GF4 désignent respectivement des tri-, tétra- et penta-saccharides contenant 1, 2 ou 3 molécules de fructose reliées au saccharose. Par suite, ce procédé exige des opérations de purification compliquées si l'on veut obtenir un mélange de sucres à plus forte teneur en fructo-oligosaccharides. Avec les récentes découvertes faites sur les excellentes

activités des fructo-oligosaccharides, par exemple la basse diges-

tibilité, l'accélération de la croissance des bactéries bifidus, un effet sur la diminution des lipides dans l'organisme et des

effets analogues, les mélanges de sucres à forte teneur en fructo-

oligosaccharides et à basse teneur en monosaccharides et en

saccharose ont trouvé des applications de plus en plus larges.

Ainsi donc, il existe un besoin en un procédé pour la préparation d'un mélange de sucres à forte teneur en fructo-oligosaccharides,

à bas prix de revient à l'échelle industrielle.

En général, on prépare couramment un mélange de sucres à forte teneur en fructo-oligosaccharides à partir d'un mélange de sucres qui a lui-même été obtenu par une réaction de transfert du fructose, au moyen d'opérations de chromatographie dans lesquelles

on utilise du charbon actif ou des résines échangeuses d'ions.

Toutefois, ces procédés classiques de purification ne permettent pas de séparer efficacement les monosaccharides, c'est-à-dire le

glucose et le fructose, les disaccharides, c'est-à-dire le saccha-

rose, les fructo-oligosaccharides du type trisaccharide ou saccha-

ride supérieur, en particulier GF2 qui est un trisaccharide. De sorte que les rendements en mélange de sucres à forte teneur en

fructo-oligosaccharides qu'on obtient par ces techniques de puri-

fication sont nécessairement bas.

Il existe donc toujours un besoin en un procédé applicable à l'échelle industrielle pour la préparation d'un mélange de sucres à forte teneur en fructo-oligosaccharides et à teneur

réduite en monosaccharides et disaccharides.

A la suite de recherches approfondies visant à améliorer les résultats décrits dans la demande de brevet japonais n 154967/81

précitée, la demanderesse a trouvé que te glucose obtenu en sous-

produit à la préparation des fructo-oligosaccharides par une réaction de transfert du fructose sur le saccharose sous l'action d'une enzyme possédant L'activité de transfert voulu, inhibait cette réaction de transfert du fructose, et elle a donc trouvé que si l'on éliminait ce glucose inhibiteur, on parviendrait à produire à l'échelle industrielle, de manière avantageuse, un mélange de sucres à forte teneur en fructooligosaccharides. La présente

invention est basée sur cette découverte.

L'invention concerne donc un procédé pour préparer un mélange de sucres à forte teneur en fructo-oligosaccharides, procédé qui se caractérise en ce que l'on procède sur le saccharose à une réaction de transfert du fructose sous l'action d'une enzyme possédant cette activité de transfert du fructose et on procède à

l'élimination du glucose formé en sous-produit.

La réaction servant à obtenir un mélange de fructo-

oligosaccharides à partir du saccharose sous l'action d'une enzyme possédant l'activité de transfert du fructose peut être illustrée par le schéma de réaction suivant: enzyme GF - G (a%) + F (b%) + GF (c%) + GF2 (d%) + GF3 (e%) + GF4 (f%) + GF5 (g%) dans laquelle G représente le glucose; F représente le fructose; GF représente le saccharose; GF2, GF3, GF4 et GF5 représentent les trisaccharides, les tétrasaccharides, les pentasaccharides et hexasaccharides contenant 1, 2, 3 et 4 molécules respectivement de fructose reliées au saccharose; et a, b, c, d, e, f et g

représentent la proportion en pourcent en poids du sucre corres-

pondant. Dans un mélange de sucres à la composition ci-dessus,

l'élimination des monosaccharides et du saccharose, sans décompo-

sition des fructo-oligosaccharides, conduirait à la production d'un mélange de sucres à forte teneur en oligosaccharides. A la suite de recherches visant à parvenir à ce résultat, on a maintenant trouvé qu'on pouvait préparer efficacement et à bas prix un mélange de sucres à forte teneur en fructo-oligosaccharides à condition

d'éliminer le glucose (1) par un procédé consistant à faire assi-

miLer le glucose par des micro-organismes ou bien (2) par un procédé

dans lequel on convertit le glucose sous l'action d'enzymes.

L'élimination du glucose est réalisée en même temps que la formation du mélange contenant les fructo-oligosaccharides à partir du saccharose ou après cette préparation; elle peut être effectuée simultanément à la réaction de transfert du fructose ou

après la préparation du mélange contenant les fructo-oligosaccharides.

Comme on l'a signalé ci-dessus, le mélange de sucres

obtenu par le procédé classique a une teneur en fructo-oligosaccha-

rides inférieure à 60 % en poids, le saccharose de départ subsistant dans une proportion de 10 à 12 % en poids. On a pu vérifier que si l'on éliminait le glucose, en particulier en parallèle avec la réaction de transfert du fructose, la vitesse de cette réaction

pouvait être considérablement accrue, conduisant à une teneur éton-

nante en fructo-oligosaccharides, pouvant atteindre 97 %. Le procédé selon l'invention permet donc non seulement d'obtenir un mélange de sucres à forte teneur en fructo-oligosaccharides efficacement et à bas prix mais il conduit également à une utilisation efficace du saccharose de départ, à une diminution de la durée de réaction

nécessaire et à d'autres avantages analogues.

On décrira maintenant les micro-organismes utilisables pour l'assimilation du glucose selon le procédé (1) conformément à l'invention. Dans les cas o l'opération d'élimination du glucose est effectuée simultanément à la réaction de transfert du fructose sur le saccharose (on dira ci-après qu'il y a procédé simultané), on peut utiliser des cellules microbiennes des micro-organismes (a), (b) et (c) ci-après: (a) les micro-organismes qui assimilent le glucose mais ne décomposent ni le saccharose, ni les fructo-oligosaccharides (on dira ci-après qu'ils ont une activité d'invertase); (b) les micro-organismes qui assimilent le glucose et ont une faible activité d'invertase. L'expression "ont une faible activité d'invertase" telle qu'elle est utilisée dans la présente demande, indique que l'activité de décomposition du saccharose et des 4. S5 fructo-oligosaccharides avec formation de glucose est plus faible que l'activité d'assimilation du glucose. On comprendra dans la pratique que les micro-organismes (b) sont ceux qui diminuent la teneur en glucose lorsqu'on les fait agir sur un substrat contenant du glucose, du saccharose et des fructo-oligosaccharides; (c) les micro-organismes qui assimilent le glucose et

dont l'activité de décomposition du saccharose et des fructo-

oligosaccharides est inhibée efficacement en présence d'une substance particulière, possédant cette activité d'inhibition sur cet effet de décomposition (on appellera ces substances ci-après "inhibiteurs d'invertase"). Dans la pratique, les micro-organismes (c) sont ceux qui diminuent la teneur en glucose lorsqu'ils agissent

sur un substrat contenant du glucose, du saccharose et des fructo-

oligosaccharides en présence d'un inhibiteur d'invertase.

D'autre part, dans les cas o l'élimination du glucose formé en sousproduit est effectuée après préparation d'un mélange de sucres constitué principalement de fructo-oligosaccharides par une réaction de transfert du fructose (on appellera ce procédé ci-après procédé en deux stades opératoires), les micro-organismes utilisables sont les micro-organismes (a) à (c) ci-dessus mais, en plus, les micro-organismes (d) qui assimilent le glucose et

n'ont pas d'activité de décomposition sur les fructo-oligosaccharides.

On peut sélectionner des cellules microbiennes des micro-organismes (a) à (d) à partir de cultures de levures, de mycètes et de bactéries. On utilise de préférence, entre autres, des cellules de levuresn'ayant pas d'activité d'invertase ou n'ayant qu'une faible activité d'invertase. Comme exemples particuliers de ces cellules de levures,on citera celles appartenant au genre Saccharomyces (par exemple, Pichia membranaefaciens, etc.), au genre Hansenula (par exemple, Hansenula mrakii etc.), au genre

Candida (par exemple, Candida krusei etc.) et d'autres encore.

On préfère spécialement, en tant que micro-organismes (a) ou (b), des cellules de levuresobtenues en soumettant des levures du commerce à des traitements chimiques tels qu'un traitement acide ou analogue, de manière connue en soi, et des souches de levures n'ayant pas d'activité d'invertase ou n'ayant qu'une faible activité d'invertase, qu'on peut obtenir par des opérations de sélection, telles que des opérations de mutation, des opérations de fusion de cellules, etc. Parmi les microorganismes (c), il y a ceux qui ont une activité d'invertase, s'ajoutant à la levure décrite ci-dessus, à faible activité d'invertase. Lorsqu'on utilise de tels micro-organismes ayant une activité d'invertase, il faut opérer en présence d'un inhibiteur d'invertase. Parmi les inhibiteurs d'invertase qu'on peut utiliser, on citera l'oligostatine (produite à partir de Streptomyces myxocenes nov. sp. SF 1130 X1, x2, décrite dans la demande de brevet japonais publiée sous n 46597/84), la

nojirimycine, la désoxynojirimycine, etc.; on préfère l'oligo-

statine. Parmi les micro-organismes (d) il y a non seulement les levures mentionnées ci-dessus, mais également les micro-organismes

capables d'assimiler le glucose sans décomposer les fructo-

oligosaccharides, par exemple les bactéries appartenant au genre Lactobacillus (par exemple, Lactobacillus fermentum, etc.), au genre Bifidobacterium (par exemple, Bifidobacterium bifidum etc.)

et les bactéries analogues.

On peut obtenir des cellules microbiennes de ces micro-

organismes par culture dans un milieu approprié, par exemple un milieu contenant 5,0 % de glucose et 2,0 % d'extrait de levure, à la température optimale, par exemple 25 à 30 C, pendant 5 à 72 heures, en faisant suivre, après la culture, d'une élimination du liquide de culture par filtration, centrifugation ou une

technique analogue.

Les enzymes qu'on peut utiliser pour l'élimination du glucose par conversion enzymatique selon le procédé (2) selon l'invention sont entre autres d'une manière générale les enzymes capables de convertir le glucose en d'autres composés. Les enzymes de ce type qu'on préfère sont les glucose-oxydases, capables d'oxyder le glucose. Parmi les glucoseoxydases qu'on utilise de préférence, on citera celles produites par des micro-organismes appartenant au genre Asperaillus, au genre Penicillium et à d'autres genres, en raison des facilités d'approvisionnement. Mais si on le désire, on peut également utiliser des glucose-oxydases provenant

d'algues, d'animaux ou de végétaux.

On peut obtenir comme décrit ci-dessus un mélange de sucres contenant de fortes proportions de fructo-oligosaccharides en procédant à une élimination du glucose par le procédé (1) ou le procédé (2) à la préparation de fructo-oligosaccharides par la réaction de transfert du fructose. Pour la mise en oeuvre de ce procédé, les conditions suivantes se sont révélées avantageuses à

l'égard d'une production industrielle.

La concentration du saccharose qu'on soumet à la réaction de transfert du fructose se situe de préférence entre 5 et 70 % en poids, et mieux encore entre 20 et 60 % en poids. Le pH dans la réaction et la température de réaction se situent de préférence respectivement entre 4,0 et 8,0 et entre 25 et 65 C mais ils peuvent varier selon l'origine des micro- organismes. La quantité d'enzyme utilisée pour la réaction de transfert du fructose est de préférence de 0,08 à 300 unités, et mieux encore de 1 à 50 unités par gramme de saccharose, l'unité en question étant définie comme la quantité d'enzyme produisant I mole de GF2 par minute lorsqu'on laisse réagir à 40 C pendant 30 min un mélange constitué de 1,0 ml d'une solution de saccharose à 25 % en poids, 0,5 ml d'un liquide contenant l'enzyme et 1,0 ml de la solution tampon de Mc Ilvain

(pH 5,0).

Dans les cas o l'opération d'élimination du glucose sous l'action de micro-organismes est effectuée simultanément à la réaction de transfert du fructose (procédé simultané), il est préférable d'ajouter les cellules microbiennes assimilant le glucose dans le milieu de la réaction de transfert du fructose dès le début de la réaction. La quantité de cellules microbiennes à ajouter

varie selon l'origine des micro-organismes mais elle est habituel-

lement de 0,01 à 10 g, et de préférence de 0,1 à 1 g, en produit humide, par gramme de saccharose. Lorsqu'on ajoute au milieu un inhibiteur d'invertase, la quantité de l'inhibiteur d'invertase à ajouter va de 0,01 à 100 mg et de préférence de 0,1 à 10 mg par gramme de saccharose, quoiqu'ici encore cette proportion puisse varier selon la nature des inhibiteurs. Lorsque la réaction a été terminée dans ces conditions, on chauffe le mélange de réaction afin de désactiver l'enzyme et les microorganismes. Les cellules microbiennes sont éliminées à l'aide d'une machine centrifuge ou analogue et les liqueurs mères sont décolorées par du charbon actif, débarrassées des sels minéraux à l'aide d'une résine échangeuse d'ions puis concentrées, ce qui donne le mélange de sucres recherché à forte teneur en fructo-oligosaccharides. Lorsque l'opération d'élimination du glucose à l'aide de micro-organismes est effectuée après la préparation d'un mélange de sucres constitué principalement de fructooligosaccharides par

la réaction de transfert du fructose (procédé en deux stades opé-

ratoires), l'opération est de préférence effectuée dans les con-

ditions suivantes: lorsque la réaction de transfert du fructose est terminée, on chauffe le mélange de réaction afin de désactiver

l'enzyme. On ajoute au mélange de sucres obtenu des cellules micro-

biennes assimilant le glucose pour une nouvelle réaction. La quantité

de cellules microbiennes à ajouter varie selon l'origine des micro-

organismes mais habituellement elle est de 0,01 à 10 g et de préfé-

rence de 0,1 à 1 g, en produit humide, par gramme de saccharose.

Dans les cas o on ajoute un inhibiteur d'invertase, celui-ci est utilisé en proportion de 0,01 à 100 mg et de préférence de 0,1 à 10 mg par gramme de saccharose quoique ces proportions puissent varier selon la nature de l'inhibiteur. La réaction complémentaire avec les micro-organismes assimilant le glucose peut être effectuée

à une température de 25 à 65 C et de préférence de 25 à 40 0C.

Lorsque la réaction est terminée, on désactive les micro-organismes par chauffage, on les sépare à l'aide d'une machine centrifuge ou d'une machine analogue. Les liqueurs mères sont décolorées par du charbon actif, débarrassées des sels minéraux à l'aide d'une résine échangeuse d'ions et concentrées; on obtient ainsi le

mélange de sucres recherché à forte teneur en fructo-oligosaccharides.

Lorsqu'on élimine le glucose par oxydation avec de la glucose-oxydase, celle-ci peut être ajoutée au milieu dès le début de la réaction de transfert du fructose (procédé simultané) ou bien elle peut être ajoutée au mélange de sucres après la fin de

la réaction de transfert du fructose (procédé en deux stades opé-

ratoires). Dans l'un ou l'autre de ces procédés, on ajoute la glucoseoxydase en proportion correspondant à 10 à 2 000 unités et de préférence 100 à 1 000 unités par gramme de saccharose. Dans un tel cas, il est souhaitable d'ajouter au mélange de réaction du carbonate de calcium en quantité de 1 à 5 % en poids et de préférence

de 2 à 3 % du poids du mélange de réaction.

L'unité de glucose-oxydase dont il est question ici a la signification suivante: on laisse réagir à 30 C pendant 10 min sous secousses un mélange constitué de 1 ml d'une solution de glucose à 2 % en poids, 3 ml de solution tampon de Mc Ilvain

(pH 6,0) et 1 ml d'un liquide contenant de la glucose-oxydase.

On introduit 1 ml du mélange de réaction dans unréactif du cuivre selon le mode opératoire de Somogyi afin d'arrêter la réaction enzymatique et on détermine la quantité de glucose résiduel selon la méthode de Somogyi. La quantité d'enzyme oxydant 14,48 mg de glucose en 1 min dans 5 ml du mélange de réaction, ce qui correspond

à une absorption d'oxygène de 1,0 ml, représente 1 000 unités.

Dans le procédé simultané dans lequel on ajoute la glucose-oxydase dès le début de la réaction de transfert du fructose, cette dernière réaction est effectuée dans les conditions décrites ci-dessus, de préférence sous agitation et avec aération. Lorsque la réaction est terminée, on désactive l'enzyme par chauffage et

on sépare le précipité. On purifie les liqueurs mères par décolo-

ration à l'aide du charbon actif et on la débarrasse des sels minéraux à l'aide d'une résine échangeuse d'ions puis on la concentre;

on obtient le mélange de sucres recherché à forte teneur en fructo-

oligosaccharideâ. Dans le cas du procédé en deux stades opératoires dans lequel on élimine le glucose après la réaction de transfert du fructose, on chauffe donc le mélange de réaction, lorsque cette réaction est terminée, de manière à désactiver l'enzyme, et on ajoute de la glucoseoxydase et du carbonate de calcium. On laisse le mélange réagir pendant encore un certain temps sous agitation et avec aération. Lorsque la réaction est terminée, on chauffe le mélange de réaction afin de désactiver la glucose-oxydase. On sépare le précipité, on décolore les liqueurs mères par du charbon actif, on la débarrasse de ses sels minéraux à l'aide d'une résine échangeuse d'ions puis on la concentre; on obtient ainsi le mélange

de sucres recherché à forte teneur en fructo-oligosaccharides.

On peut déterminer le taux de conversion et La compo-

sition en sucres du mélange de sucres obtenu conformément à l'in-

vention par chromatographie de liquide à haute performance (HPLC) au moyen par exemple d'une colonne du produit Shimazu PNH2 ( de la firme Shimazu Seisakusho Ltd.) et d'un système solvant consistant

en acétonitrile/eau, 70: 30 en volume.

Parmi les fructo-oligosaccharides selon l'invention, on citera à titre d'exemples particuliers de GF2: les saccharides

suivants: O-3-D-fructofurannosyl-(2--1)-0-3-fructofurannosyl-

(2-->1)-a-D-glucopyrannoside, O-f-D-fructofurannosyl-(2-->6)-0-3-

glucopyrannosyl-(1--2)-3-D-fructofurannoside, O-9-D-fructofurannosyl-

(2-ú 6)-O- -fructofurannosyl-(2-3)-f-D-glucopyrannoside, etc. Comme

exemples particuliers de GF3, on citera les suivants: O-5-D-

fructofurannosyl-(2-->1-O-1-D-fructofurannosyl]2-1)-a-D-gluco-

pyrannoside, O-1-D-fructofurannosyl-(2-->6)-O[E-D-fructofurannosyl-

(2--6)]-O-a-D-glucopyrannosyl-(1l2)-1-D-fructofurannosyle, etc. Comme exemples particuliers de GF4, on citera les suivants:

O-3-D-fructofurannosyl-(2---[1-0-3-D-fructofurannosyl-2]3 3l)-

a-D-glucopyrannoside, etc. Afin de mettre en évidence les effets de l'invention dans la préparation de fructo-oligosaccharides par la réaction de transfert du fructose sur le saccharose sous l'action d'une

enzyme possédant cette activité, on a préparé des fructo-oligo-

saccharides dans des conditions variées indiquées dans le-tableau ciaprès. On trouvera également dans ce tableau les vitesses de production des fructo-oligosaccharides et les compositions en sucres des produits obtenus. La réaction de transfert du

fructose a été effectuée à l'aide de 25 unités d'une transfé-

rase par gramme de saccharose.

TABLEAU

Concentra-

tion en Essai saccharose, n % en poids Composition en sucres produits et résiduels, % en poids Agent d'élimination du glucose Procédé (durée de réaction)

G GF GF -GF

(% en 2 poids) Teneur en

fructo-oligo-

saccharides comparatif (24 h)

28 15 55

cellules microbiennes de S. cerevisiae procédé simultané (12 h)

ND* 14 56

procédé simultané (22 h) procédé en deux stades opératoires comparatif (16 h)

ND 3 56

ND 14 53

27 11 58

cellules microbiennes de S. cerevisiae procédé simultané (8 h) procédé simultané (16 h)

ND 2 62

glucose-oxydase procédé simultané (10 h)

3 5 48

Nota: ND*: non détecté.

néant Io *I néant

ND 11

-tJ uIj (A Les résultats rapportés dans le tableau ci-dessus montrent que, lorsqu'on procède à l'opération d'élimination du glucose, on atteint des teneurs en fructo-oligosaccharides (GF2-GF4) de 79 à 97 % en poids, ce qui est très supérieur celles que l'on obtient lorsqu'on procède uniquement à la réaction de transfert du fructose comme dans le procédé classique. Une aussi forte teneur en fructo-oligosaccharides peut être atteinte sans opérations de fractionnement telles que des chromatographies avec échange d'ions, etc., et par conséquent sans diminution de rendement due à des opérations de fractionnement. En outre, en comparant la vitesse de la réaction de transfert du fructose avec la quantité de saccharose restant dans le mélange de sucres obtenu, on constate que la réaction peut être nettement accélérée lorsqu'on utilise un agent d'élimination du glucose selon l'invention. Ainsi par exemple, dans l'essai n 1 dans lequel le substrat consiste en saccharose à 20 Z en poids, la durée de réaction nécessaire pour que le saccharose de départ tombe à 15 % en poids est de 20 h en l'absence d'un agent d'élimination du glucose alors qu'on peut parvenir à la même diminution de teneur en saccharose en 12 h en présence des cellules microbiennes de S. cerevisiae conformément à l'invention. La même observation peut être faite dans l'essai n 2

dans lequel le substrat utilisé est du saccharose à 40 % en poids.

Ainsi donc, l'invention revendique un avantage de durée de réaction plus courte à l'échelle industrielle, combiné avec les fortes

teneurs en fructo-oligosaccharides auxquelles on parvient.

L'invention sera maintenant décrite plus en détail en référence aux exemples qui suivent mais qui ne sauraient limiter son cadre. Dans ces exemples, les indications de pourcentage

s'entendent en poids sauf mention contraire.

Exemple 1

On inocule par Asperqillus niger (FERM-P5886) 350 ml d'un milieu contenant: bouillon en poudre: 2,0 %; saccharose: ,0 % et CMC: 0,5 % dans un erlenmeyer et on cultive à 28 C pendant

h afin d'obtenir une culture d'ensemencement.

Dans un fermenteur à jarre d'un volume de 30 l, on introduit 15 l d'un milieu contenant 5,0 % de saccharose, 3,6 % d'extrait de levure et 0,5 % de CMC, on règle à pH 6,5 et on stérilise à 120 C pendant 30 min. On inocule ce milieu par 350 ml

de la culture d'ensemencement préparée ci-dessus dans des con-

ditions stériles puis on cultive à 28 C pendant 72 h. Après la culture, on centrifuge; on obtient 2,8 kg de cellules micro- biennes contenant une enzyme brute dont l'activité de transfert

du fructose est de 1 580 unités par gramme des cellules microbiennes.

A une solution aqueuse de saccharose à 20 % contenant

g de saccharose (pH 5,5), on ajoute 1,58 g des cellules enzy-

matiques brutes (25 unités/g de saccharose) et 50 g de levure (0,5 g/g de saccharose), levure qui a été obtenue en traitant de la levure de boulanger du commerce par de l'acide sulfurique 0,25 N

à 30 C pendant 20 min (activité de décomposition des fructo-oligo-

saccharides: 1 unité/g de levure sèche; on appellera cette levure ciaprès "levure traitée à l'acide") et on laisse réagir à 400C pendant 22 h. On chauffe ensuite le mélange de réaction à 100 C pendant 10 min afin d'arrêter la réaction enzymatique puis on

sépare les cellules microbiennes par filtration.

On traite le filtrat par du charbon actif pour décoloration de la manière habituelle puis on débarrasse des sels minéraux à l'aide d'une résine échangeuse d'ions; on obtient un mélange de sucres pesant 59 g (matières sèches). Ce mélange de

sucres contient 95 % de GF2, GF3 et GF4 et 5 % de saccharose.

Lorsqu'on arrête la réaction après 12 h de réaction et qu'on traite le mélange de réaction comme décrit ci-dessus,

on obtient 70 g d'un mélange de sucres, toujours en matières sèches.

Ce mélange de sucres contient 80 % de GF2-GF4 et 20 % de saccharose.

D'autre part, on répète les opérations ci-dessus mais on n'utilise pas de levure traitée à l'acide et on porte la durée de réaction à 24 h. On obtient 98 g d'un mélange de sucres (matières sèches) contenant 55 % de GF2-GF4, 15 % de saccharose

et 28 % de glucose.

ExemDle 2 On procède à la réaction de transfert du fructose comme décrit dans l'exemple 1 mais sans utiliser de levure traitée à l'acide et en faisant réagir pendant 24 h. On arrête la réaction en chauffant le méLangede réaction à 100 C pendant 10 min. On ajoute au mélange de réaction 50 g de la levure traitée à L'acide, la même que dans l'exemple 1 (0,5 g/g du saccharose initial). On agite le mélange de réaction à 40 C pendant 10 h puis on chauffe à 100 C pendant 10 min. Après refroidissement, on sépare les cellules microbiennes par filtration. On décolore le filtrat par le charbon actif de la manière habituelle puis on le débarrasse de ses sels minéraux à l'aide d'une résine échangeuse d'ions; on obtient 67 g (matières sèches) d'un mélange de sucres contenant des fructo-oligosaccharides. Ce mélange de sucres contient 79 %

de GF2-GF4 et 21 % de saccharose.

Exemple 3

A une solution aqueuse de saccharose à 40 % contenant

g de saccharose (pH 5,5) on ajoute 1,58 g des cellules enzy-

matiques brutes obtenues dans l'exemple I (25 unités/g de saccharose) et 50 g de la levure traitée à l'acide, la même que dans l'exemple 1 (0,5 g/g de saccharose) et on laisse le mélange réagir à 40 C pendant 16 h. On traite ensuite comme décrit dans l'exemple I; on obtient 64 g en matières sèches d'un mélange de sucres contenant des fructo-oligosaccharides, qui est constitué de 97 % de GF2-GF4

et 3 % de saccharose.

On répète les mêmes opérations mais en travaillant avec une durée de réaction de 8 h. On obtient 76 g en matières sèches d'un mélange de sucres constitué de 86 % de GF2-GF4 et

14 % de saccharose.

On répète encore l'opération décrite ci-dessus mais sans utiliser de levure traitée à l'acide; on obtient 97 g en matières sèches d'un mélange de sucres constitué de 58 % de GF2-GF4,

11 % de saccharose et 27 % de glucose.

Exemple 4

A une solution aqueuse de saccharose à 10 % contenant

g de saccharose (pH 5,5) on ajoute 0,16 g des cellules enzy-

matiques brutes préparées dans l'exemple 1, 5 000 unités de glucose-

oxydase (500 unités/g de saccharose) et 2,5 % par rapport à la quantité totale du mélange, de carbonate de calcium, et on laisse le mélange réagir à 40 C pendant 20 h sous aération. A l'expiration de cette période, on chauffe le mélange de réaction à 100 C

pendant 10 min pour arrêter la réaction. On sépare par centri-

fugation le précipité et les cellules microbiennes et on décolore les liqueurs mères par du charbon actif puis on élimine les sels minéraux à l'aide d'une résine échangeuse d'ions; on obtient ,6 g d'un mélange de sucres contenant des fructo-oligosaccharides,

constitué de 86 % de GF2-GF4, 9 % de saccharose et 5 % de glucose.

L'invention ayant été décrite en détail en référence à des modes de réalisation particuliers, il est clair que le technicien en la matière peut procéder à des modifications variées

sans sortir de son cadre.

Claims (14)

REVENDICATIONS

1. Procédé de préparation d'un mélange de sucres à forte teneur en fructooligosaccharides, caractérisé en ce que l'on procède sur Le saccharose à une réaction de transfert du fructose sous l'action d'une enzyme possédant L'activité de transfert du fructose et on élimine le glucose formé en sous- produit.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'éLimination du glucose formé en sous-produit est effectuée

simultanément à La réaction de transfert du fructose.

3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'élimination du glucose formé en sous-produit est réalisée

après obtention d'un mélange de sucres contenant des fructo-

oligosaccharides par la réaction de transfert du fructose.

4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'élimination du glucose formé en sous-produit est réalisée

par assimilation du glucose à l'aide d'un micro-organisme.

5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'élimination du glucose formé en sous-produit est réalisée

en présence d'un inhibiteur d'invertase.

6. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'élimination du glucose formé en sous-produit est réalisée

par assimilation du glucose et du saccharose à l'aide d'un micro-

organisme.

7. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le micro-organisme n'a pas d'activité de décomposition du

saccharose ni des fructo-oligsaccharides.

8. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le microorganisme a une faible activité de décomposition du

saccharose et des fructo-oligosaccharides.

9. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce

que le micro-organisme en question est une levure.

10. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le microorganisme en question est une levure n'ayant pas

d'activité d'invertase.

11. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce

que le micro-organisme en question est une bactérie.

12. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que L'élimination du glucose formé en sous-produit est réalisée par conversion du glucose sous l'action d'une enzyme.

13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que l'opération d'élimination du glucose formé en sousproduit

est réalisée par oxydation de ce sucre sous l'action d'une glucose-

oxydase

14. Mélange de sucres à forte teneur en fructo-

oligosaccharides, obtenu par un procédé selon l'une quelconque

des revendications 1 à 13.