JPS5819276B2 - 末端にフラクト−スを結合したオリゴ糖類の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、固定化したシクロデキストリングルカノトラ
ンスフェラーゼ（Ｅ、Ｃ，２，４，１゜１９）に、液化
澱粉とフラクトースまたはシュクロースとを含有する混
合溶液を接触反応せしめることを特徴とする末端にフラ
クトースを結合したオリゴ糖類の製造方法に関するもの
である。

シクロデキストリスグルカノトランスフェラーゼは、例
えば特開昭４７−２０３７３号公報、特開昭５０−６３
１８９号公報、特開昭５０−８８２９０号公報、Ｈａｎ
ｓ Ｂｅｎｄｅｒ 、 Ａｒｃｈ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 、 Ｖｏｌ、 １１１ 、第２
７１〜’２８２頁（１９７７年）などに示されているよ
うに、バチルス・マセランス、バチルス・メガテリウム
、バチルス・サーキュランス、バチルス・ポリミキサ、
バチルス・ステアロサーモフィラスなどのバチルス属、
クレーブシーラ・ニューモニアエナトのクレーブシーラ
属などの細菌によって生産されることが知られている。

また、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ
溶液を、液化澱粉とフラクトースまたはシュクロースと
を含有する混合溶液に作用させて、フラクトースまたは
シュクｐ−スヘグルコース残基を転移反応させ末端に７
ラクトースを結合したグリニオ９ゴ糖類の製造方法も知
られている。

（例えば、特開昭４７−２０３７３号公報参照）さらに
、このようにして得られるオリゴ糖類が、甘味料として
広範囲の用途を持っていること、消化吸収されながらシ
ュクロースとは違って虫歯を起しにくい新しいタイプの
甘味料であることも特開昭５０−１２２７２号公報、特
公昭４９−４０９４９号公報、特公昭４９−４０９５０
号公報などにより知られている。

本発明者らは、この有用なオリゴ糖類の製造方法につい
て研究した結果、シクロデキストリングルカノトランス
フェラーゼ水溶液が液化澱粉とフラクトニスまたはシュ
クロースとを含有する混合溶液に作用して、末端に７ラ
クトースを結合したオリゴ糖類を生成するまでの複雑な
反応には、次に示す３つの反応が少なくとも起っている
ことを明らかにした。

すなわち、 反応■：液化澱粉からシクロデキストリンを生成する反
応。

反応ＩＩ：反応Ｉで生じたシクロデキストリンから、フ
ラクトースまたはシュクロースへグル コース残基を転移する反応。

反応■：液化澱粉から、直接フラクトースまたはシュク
ロースへグルコース残基ヲ転移ス る反応。

である。

本発明者らは、末端にフラクトースを結合したオリゴ糖
類を効率よく製造するためには、反応Ｉ、反応■による
遠回シの転移反応は不利であって、液化澱粉からフラク
トースまたはシュクロースへ直接反応させる反応■の方
法が効果的である点に着目して、その転移反応を有利に
進める方法を鋭意研究した。

その結果、シクロデキストリングルカノトランスフェラ
ーゼを公知の方法で固定化したところ、もとの溶性（ｎ
ａｔｉｖｅ ）酵素と比較して固定化酵素は、蛋白質量
当りの糊精化活性が大幅に低下するのに対して、α−シ
クロデキストリン分解活性はほとんど低下しないか、む
しろ増大することを見いだし、さらにこの固定化酵素を
液化澱粉とフラクトースまたはシュクロースとを含有す
る混合溶液に接触せしめたところ、フラクトースまたは
シュクロースへの転移活性が大幅に増大して、末端に７
ラクトースを結合したグルコオリゴ糖類が極めて容易に
生成することを見出した。

すなわち、シクロデキスト９ングルカノトランスフエラ
ーゼを公知である担体結合法、架橋法、包括法などの固
定化方法によって固定化することによって、その酵素の
蛋白質量当シに示す糊精化活性が約１０〜３０％と大幅
に低下するのに対して、α−シクロデキストリン分解活
性は約８０〜１３０％とほとんど低下しないかむしろ増
加すると言う現象を発見したのである。

その上、この固定化酵素を液化澱粉と７ラクトースまた
はシュクロースとを含有する同じ組成の基質に対して、
α−シクロデキスト９ン分解活性で同量、同条件で作用
させたところ、もとの溶性酵素を使用した場合よりも、
固定化酵素を使用した場合の方が酵素蛋白質量当りにお
ける転移反応の速度が異常に大きくなる現象をも見いだ
したのである。

すなわち、シクロデキスト９ングルカノトランスフエラ
ーゼを固定化することによって、酵素蛋白質量当りの末
端にフラクトースを結合したグルコオリゴ糖類の生成速
度が大幅に増大する事実を見いだしたのである。

換言すれば、固定化したシクロデキストリングルカノト
ランスフェラーゼを使用すると、末端にフラクトースを
結合したグルコオリゴ糖類の同じ生成率（本明細書では
この生成率を転移率で示す。

）を得るに必要な酵素蛋白質量が溶性酵素の場合の約１
／１．５〜１１５にも減少し得るのである。

さらに、本発明をより詳細に説明する。

本発明で使用するシクロデキストリングルカノトランス
フェラーゼ（Ｅ、Ｃ，２，４，１，１９）は、本酵素の
生産能を有する微生物、例えばバチルス属、クレブシー
ラ属などに属する細菌を炭素源、窒素源、ミネラル、ビ
タミンなどを含有する栄養培地に増殖させ、生成するシ
クロデキストリングルカノトランスフェラーゼを公知の
方法で採取すればよい。

例えば、培養液から菌体を分離し、この菌体から抽出し
た酵素を含有する上清、または酵素を含有する培養液上
清を採取してもよく、必要ならば公知の精製方法、例え
ば塩析、透析、澱粉への吸着、脱着、ゲル沢過、イオン
交換クロマトグラフィーなどを用いて精製してもよい。

このようにして得た溶性酵素を固定化させる方法として
は、担体結合法、架橋法、包括法などの公知の固定化方
法を自由に利用できる。

また、担体としては、セルロース、澱粉、寒天、アルギ
ン酸ソーダ、ゼラチンなどの天然高分子、またはそれら
の誘導体、或はポリアクリルアミド、ポリエチレングリ
コール、ポリアミノポリスチレン、ポリビニルアルコー
ルなどの合成高分子などの有機物や、粘土、アルミナ、
ガラス、セラミック、ステンレスなどの有機物などを採
用することができる。

固定化の方法は、常法に従ってシクロデキストリングル
カノトランスフェラーゼの安定ｐＨ、例えばｐＨ約４〜
１０、安定温度、例えば約７０℃以下の範囲で行えばよ
い。

このようにして得られた固定化酵素に、液化澱粉とフラ
クトースまたはシュクロースとを含有する混合溶液を回
分法で、または連続法で接触反応させれば、末端にフラ
クトースを結合したグルコオリゴ糖類を容易に製造でき
るのである。

この際、グルコシル基の供与体である澱粉の種類は何れ
でもより、トウモロコシ、小麦などからの地上澱粉であ
っても、サツマイモ、ジャガイモなどからの地下澱粉で
あっても自由に利用できるまた、液化澱粉は、とのらの
澱粉を酸まだはα−アミラーゼで処理して調整されるＤ
、Ｅ 、約３〜４０のものが通常使用される。

液化澱粉重量に対するフラクトース、５シユクロースな
どのケトースからなる受容体重量の比は、固形物当り約
０．２〜５が適している。

フラクトース、シュクロースなどの受容体は単一化合物
であっても、異性イ６糖や転化糖などのような混合化合
物であってもよい。

また、この受容体と供与体とを合わせた基質濃度は、約
１０〜５０ｗ／ｗ％が適している。

また基質溶液に約１０ ’Ｍ １０−２Ｍのカルシ
ウム塩を共存させることは、シクロデキストリングルカ
ノトランスフェラーゼを安定化させる上で好ましい。

また、反応条件としては、シクロデキストリングルカノ
トランスフエラー論が安定で、しかも充分に反応し得る
条件、例えばｐＨ約５〜１０．温度約３０〜７０℃の範
囲内で選ばれるのが好ましい。

さらに、使用酵素量は、後に述べるα−シクロデキスト
リン分解活性で液化澱粉固形物グラム当シ約１〜ｔｏｏ
ｏｏ単位、反応時間は約０．１〜１００時間などが通常
選ばれる。

このように接触反応させて得られた末端にフラクトース
を含有するオリゴグルコ糖類を含有する水溶液は、公知
の方法で精製濃縮してシラツブ状の甘味料とし、さらに
乾燥粉末化して粉末状の甘味料として、各種の飲食物、
栄養物、嗜好物などのせ味付に、その他経口医薬品、歯
みがき、うがい薬などの化粧品、保健薬などのせ味付や
矯味剤などとして自由に用いることができる。

この甘味料は、非結晶性であって、適度の粘度を有して
おシ、体内において消化吸収されるにも力・かわらず、
シュクロースとは違って虫歯を起しにぐい特徴を有して
いる。

本発明に用いるシクロデキストリングルカノトランスフ
ェラーゼの活性表示は次の通シとする。

糊精化活性 ０、５５ ｗ／ｗ％可溶性澱粉（酢酸緩衝液でｐＨ５，
５に緩衝化）４．５ｒｎｌに酵素液０．５ｆｎｌを加え
、４０℃で１０分間反応させた後、その反応液から０、
５ｒ１１１をとって、０．０１Ｍｌ２−Ｋｒ溶液４ｍに
加え、さらに水を加えて全体を２０ゴとする。

この溶液の６６０ ｎｍの透過率を１係増加させる酵素
量を１単位とした。

α−シクロデキストリン分解活性 １ｗ／ｗ％α−シクロデキストリン２−および２、５
ｗ ／ ｗ％シュクロース２ｒＩｌｌに酵素液０．５１
ｎｌを加え、４０℃で一定時間反応させた後、その反応
液から０．５ｄをとって市販の結晶グルコアミラーゼ溶
液０．１ｙｄ（５単位、）を加え、４０℃で１時間反応
させ、α−シクロデキストリン以外のα−１，４グリコ
シド結合を持つオリゴ糖類をグルコースに加水分解した
後、５．その量をネルソンーンモジー法で定量した。

α−シクロデキストリン分解活性１単位は、この条件で
α−シクロデキストリンを１分間に１μｍｏｌｅ分解す
る酵素量とする。

以下、実施例で具体的に説明する。

実験 １ シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼの調製 フスマ １ ｗ／ｗ ｑ６、コーンステイープ９カー１
ｗ／ｖ％、ドライイースト ０．５ｗ／ｖ％、ポリペプ
トン １ｗ／ｖ％、硫安 ０．２５ｗｖ％、可溶性澱粉
４ｗ／ｖ％、尿素 ０．１ ｖｉ／ ｖ％、炭酸力化
シウム １． Ｏｗ／ ｖ ％を含む渡体培地を常法に
従って調製し、これにバチルス・メガテリウム Ｔ５
ＦＥＲＭ−Ｐ ４９３５を植菌し、３７℃で６０時
間通気攪拌培養した。

この培養液の上清は、糊精化活性で約４０単位／−を示
した。

この上清を約３℃に冷却し、その容量の約１／２容の冷
アセトンを攪拌混合してわずかに生じた白濁を遠心分離
で除去した。

得られた上清２０ノを３℃に保ち、硫安を３０％飽和に
なるように加え、わずかに生じた白濁を除去しコンスタ
ーチ３００１を加えてゆつくシ攪拌しつつ２０分間保っ
て懸濁液を得た。

この懸濁液を、予ｑめコンネタ−チア００ｔど砂礫±５
００ｆＩとを硫安の３０％飽和水で洗浄して調製した濾
過層に通して、本酵素を吸着した澱粉を沖果した。

これを、さらにアセトン３０ｖ／ｖ％冷水溶液で洗浄し
た後、Ｍ／ ３０ Ｎａ２ ＨＰ ０４で本酵素を脱
着溶溶出させた。

この溶出液に硫安を加えて、２５％飽和と４５係飽和と
の間に生じる白濁物を集めて精製酵素標品とした。

この酵素標品の糊精化活性による比活性は、培養液上清
の場合の約６０倍であって、その活性収率は約６５％で
あった。

実験 ２ シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼの固定
化 市販の臭化シアン活性化セファロース４Ｂ１０１（スエ
ーデン国、ファルマシア社）を１０’Ｍの塩酸水溶液２
０００−で洗浄する。

これに、予じめ実験１の方法で得た精製酵素標品を蛋白
質として１００■と０．５ Ｍ塩化ナトリウムとを含む
０．１ＭｐＨ８，３はう酸塩緩衝成約５０−溶液を加え
て、室温下で攪拌しつつ反応させた。

得られた固定化酵素をＦ果した後、これをＩＭ ｐＨ
９，０エタノールアミン水溶液２００ゴに浸漬し、とき
どき攪拌しつつ２時間保った。

次いで、固定化さ五た酵素を済集して０．５Ｍ塩化ナト
リウムを含むｐＨ４，０の酢酸緩衝液と０．５Ｍ塩化ナ
トリウムを含む０．１Ｍ ｐＨ８，３のほう酸塩緩衝
液とで交互に充分洗浄した。

このようにして固定化した酵素は、Ｆ液或は洗浄液中に
流出した酵素蛋白質量の測定結果から約５０．８ｑであ
ることが判明した。

従って、酵素の固定化率は約５０．８％であうた。

この酵素溶液の固型化にともなって、その活性の発現は
酵素蛋白質量と比例せずに著しく変化することがわかっ
た。

その結果を第１表に示す。これらの結果から、シクロデ
キストリングルカノトランスフェラーゼは、固定化する
ことによって酵素蛋白質量当りの糊精化活性が大幅に低
下するのに対し、α−シクロデキ艮トリン分解活性はむ
しろ増大すると言う新しい現象を見いだ゛した。

この原因は定かではないが、前述したシクロデキストリ
ングルカノトランスフェラーゼの反応Ｉ゛、反応■、反
応■のうち、固定化することによって特に反応■が促進
されていることが予想される。

なお、このようにして得られた固定化酵素は；もとの溶
性の酵素と比較して、約６〜８の安定ｐＨが約５〜９に
拡大し、また約５０℃の耐熱性温度は約５５℃に上昇し
た。

実験 ３ 固定化されたシクロデキストリングルカノトランスフェ
ラーゼによる転移反応 各種り、Ｅ、の液化澱粉（供与体）５ｗ／ｗ％とシュク
ロース（受容体）５ｗ／ｗ％とを含有する混合基質溶液
５ｆｎｌずつに、実験１で得た溶−〇精製酵素、または
それを実験２の方法で固定化した酵素をα−フシクロデ
キスト９フ解活性（発現活性）で１３０単位（酵素蛋白
質量としては、溶性酵素の場合は約０．１９〜、固定化
酵素の場合は約０，１６■を使用した。

）ずつ加え、ｐＨ６，０、温度４０℃で振とり反応させ
、経時的にサンプリングし、ペーパークロマトグラフィ
ーで分析してシュクロスへのグルコシル基の転移率を求
めた。

転移率（４）は、（グルコシル基の転移を受けた受容体
量）÷（基質に用いた全受容体量）Ｘ１０’０＋求めた
。

その結果を第１図、第２図にグラフとして示した。

すなわち、第１図は溶性の精製酵素を使用した場合にお
ける対照実験の結果であり、第２図は固定化酵素を使用
した場合における本発明の実験結果である。

これらの結果から明らかなように、同じα−シクロデキ
ストリン分解活性（発現活性）を使用した、換言すれば
固定化酵素を使用した方が少ない酵素蛋白質量による反
応条件であるにもかかわらず、第２図に示すように転移
率が約２倍に高くなると言う驚くべき現象を見いだした
のである。

実験２でも考察したように、この原因は定かではないが
、本実験の結果からシクロデキストリングルカノトラン
スフェラーゼを固定化することによって、特に前述した
シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼの反応
■、すなわちグリコジル基の供与体である液化澱粉から
フラクトースまたはシュクロースなどの受容体に対する
グリコジル基の直接転移する反応をいちじるしく促進し
ていることが予想される。

また、使用酵素量と転移率とが比例関係にある状態、す
なわち転移率が２０チの場合の、一定時間内にその転移
率を得るに□必要な酵素量を求めるために、実験３の方
法に準じて酵素量を変身て反応させたところ、固定化酵
素の場合における必要蛋白質量は、溶性酵素の場合の約
１／２でその目的を達成し得ることがわかった。

このことは、固定化することによってシクロデキストリ
ングルカノトランスフェラーゼは、酵素蛋白質量当シの
転移反応活性が大幅に増大するのである。

従って、従来よシも反応時間を大幅に短縮させることも
容易となった。

さらに、シクロデキストリングルカノトランスフェラー
ゼをほとんど失活させることなく酵素訴白質として高濃
度に固定化すること、すなわち得られる固定化酵素の約
０．１〜１０ ｗ／ｗ ｑ６も固定化させ得ることがわ
かったことから、この固定化酵素の重量当シの活性が高
く、混合基質溶液を短時間接触させるだけで、本発明の
目的を蓉易に達成し得ることがわかったのである。

従って、この固定化酵素を、例えばカラム状の反応容器
に詰めるなどして、連続反応させることも容易であり、
末端にフラクトースを結合したグルコオリゴ糖類を安価
に大量生産するのに極めて有利となった。

なお、第１図、第２図からも明らかなように、使用する
液化澱粉のり、Ｅ、が低い程より高い転移率が得られる
。

しかしながら、Ｄ、Ｅ、が約２未満となると液化澱粉が
極めて老化しやすくなり、かえって転移反応が進みにく
くなる。

また、液化澱粉のり、Ｅ、が高く４０を越えるようにな
ると転移率が低く目的とする末端にフラクトースを結合
したグルコオリゴ糖の生産量が少なくなる。

次に、２〜３の実施例を示す。

実施例 Ｉ Ｄ、Ｅ、５の液化澱粉２０ｗ／ｗ％とシュクロースＬｏ
ｗ／ｗ％とを含有する混合液に、実験２で得た固定化酵
素をα−シクロデキストリン分解活性で液化澱粉ダラム
当り３０単位加えてｐＨ６，０１温度５０℃で４８時間
ゆっくり攪拌しつつ回分法で反応させた。

反応液から固定化酵素を沖別したろ液の精製は極めて容
易で、通常の糖類の精製方法、すなわち活性炭にて脱色
した後、Ｈ型イオン交換樹脂とＯＨ型イオン交換樹脂と
を使用して脱塩精製すれば充分であった。

次いで減圧濃縮し、水分が２０係で、転移率約６０チの
末端にフラクトースを結合したグルコオリゴ糖類のシラ
ツブを固形物換算で９０チの収率で得た。

このシラツブはまろやかな甘味を有する高粘度のシラツ
ブであった。

また、この工程中、固定化酵素を沢別したｐ液から分け
たオリゴ糖類の溶液に、市販のα−アミラーゼ、□β−
アミラーゼを少量作用させたものから、同様に精製し、
濃縮して得たシラツブは、転移率においては先に得たシ
ラツブとほぼ同じであったけれども、粘度においては約
２／３に低下し取シ扱いが容易であった。

実施例 ２ コーンステイープリカー１ｗ／ｖ％、可溶性澱粉１ｗ／
ｖ係、硫安０．５ ｗ／ ｖ転炭酸カルシウム０．５
ｗ／ ｖ ％を含む液体培地にバチルス・バセランスＩ
Ｆ０３４９０を植菌し、温度３７℃で３日間通気攪拌培
養した。

この培養液を遠心分離して得たシクロデキストリングル
カノトランスフェラーゼを含有する酵素液を実験２の方
法に従って精製した。

得られた酵素標品の糊精化活性による比活性は、培養液
上清の場合の約３０倍に上昇しその活性収率は約７０％
であった。

別に、約６０℃に加熱して調製した約１０ｗ／ｗ％のゼ
ラチン水溶液を約４０℃に冷却した後、前記の酵素標品
を蛋白質濃度で約０’、５ｗ／ｗ係になるように添加し
て混合溶解した。

この溶液を予じめ４℃に冷却しておいたトルエン中に注
入してゼラチンをビーズ状に固まらせた後に沢果し冷ｎ
−プロピルアルコールで洗浄し、さらに冷水で洗浄した
。

このようにして得たビーズ状の固形物１０グを、２．５
ｗ／ｗ％ゲルタールアルデヒド水溶液１５０−中に浸漬
して室温のもとて３０分間静置して包括架橋させた後、
大量の水で洗浄して過剰のゲルタールアルデヒドを除い
て固定化酵素とした。

ｐ液、洗浄液中に蛋白質がほとんど検出されないことか
ら、固定化率はは１２１００％でろ、つた。

また、このようにして固定化した酵素の活性発現率は、
糊精化活性で約２１％であシ、α−シクロデキスト９ン
分解活性で約１０２％であった。

また、実験３の方法に準じて転移率２０％を得るに必要
な酵素蛋白質量を比較したところ、本固定化酵素の約１
／１５であった。

この固定化酵素を直径と高さの比が１：３のカラムに詰
め、これにＤＥ、１０の液化澱粉１５ｗ／ｗ％とフラク
トース１０ｗ／ｗ％とを含有する混合溶液を温度５０℃
。

ｐＨ６，０でＳ■２の流速で流し、１週間連続して反応
させたところ、転移率の低下はほとんど起らず約５５％
であった。

得られた末端にフラクトースを結合したグルコオリゴ糖
類は、実施例１と同様に精製、濃縮し、凍結乾燥して粉
末化することにより、白色の粉末甘味料を固形物当り約
９３チの収率で得た。

なお、本実施例の酵素を含有するゼラチン溶液を、公知
の方法によって、他の形状、他えば繊維、フィルム、チ
ューブなどに形成した固定化酵素にすることも容易であ
り、これらのどの形状の固定化酵素であっても、本実施
例のビーズ状をした固定化酵素の場合と同様に、末端に
フラクトースを結合したオリゴ糖類の製造に対して自由
に利用できる。

実施例 ３ 可溶性澱粉２ｗ／ｖ％、塩化アンモニウム０．５ｗ／
ｖ ％、リン酸二カリ、ウム０．０５ｗ／ｖ％％硫酸マ
グネシウム・７水塩０． Ｏ２５ｗ／ ｖ ％ 、炭酸
カルシウム０．５ｗ／ｖ％を含む液体培地に、バチルス
・ステアロサーモフィラスＴＣ−６０（ＦＥＲＭ Ｐ
Ａ２２２２）を植菌し、５０℃の温度で通気攪拌培
養をした。

この培養液を遠心分離して得たシクロデキストリングル
カノトランスフェラーゼを含有する酵素液を実験２の方
法に従って精製した。

得られた酵素標品の糊精化活性による比活性は、培養液
上清の場合の約５０倍に上昇し、その活性収率は約９０
係であった。

別に酸化アルミニウム（γ−ＡＩ２０３）粉末（粒径約
９．１〜０．５ｍ）を、温度９０℃の５ｗ／ｗ％硝酸水
溶液中に２時間保った後、蒸留水でよく洗浄し、さらに
メタノール、エーテルの順で洗浄して風乾し、得られる
活性化酸化アルミニラムラ１０ ｖ／ｖ ％、３−アミ
ノプロピルトリエトキシシランのトルエン溶液中で５時
間加熱還流して反応させた。

生成上た酸化アルミニウムアルキルアミンをＦ果してト
ルエン、エーテルの順で洗浄し、風乾した。

この酸化アルミニウムアルキルアミン（ｍ体）１０００
グをｐＨ７，０の０．１Ｍリン酸塩緩衝液で緩衝化した
１、２５ｗ／ｗ％ゲルタールアルデヒド水溶液に浸漬し
、室温のもとて１時間静置した後、沢果して充分に水洗
した後、これを先きに調整した酵素標品１００グを含有
するｐＨ６，０の０．１Ｍ酢酸塩緩衝液に加え、温度８
℃で１６時間静置して固定化させた。

このようにして得た固定化酵素は、水で洗浄した後、次
の転移反応に利用した。

Ｆ液、洗浄液に流出した蛋白質量から算出される固定化
率は約７５チであった。

またこのようにして得た固定化酵素の活性発現率は糊精
化活性で約１７チであシ、α−シクロデサスト９ン分解
活性で約１２５％であった。

また、実験３の方法に準じて転移率２０チを得るに必要
な酵素蛋白質量を比較したところ、本固定化酵素は固定
化前の酵素の約１／３であった。

この固定化酵素を直径と高さの比が１：１０であるカラ
ムに詰め、これにり、Ｅ、８の液化澱粉２０ｖ／ｗ係と
シュクロース２０ｗ／ｗチおよび１０−３Ｍの塩化カル
シウムとを含有する混合溶液をｐＨ６，０、温度６５℃
でＳＶ４の流速で７週間連続して反応させたところ、転
移率の低下はほとんど起らず約６０％であった。

得られた末端にフラクトースを結合したグルコオリゴ糖
類は、実施例１と同じように精製、濃縮し、噴霧乾燥し
て粒径のよくそろった白色でまろやかな甘味を釘する粉
末１士味叫を固形物当り約９１係の収率で得た。

実施例 ４ 多孔性ガラス粉末（米国Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製、商品名Ｂ
ｉｏ −Ｇｌａｓ ５００ ）を実施例３の高純度酸化
アルミニウムに代えて実施例３と同様に処理することに
よシ多孔性ガラスアルキルアミン粉末を調整し、次いで
この５０２を実験２で得た酵素標品３グを含むゲルター
ルアルデヒド水溶液に浸漬して固定化酵素を得た。

涙液、洗浄液に流出した蛋白質量から算出される固定化
率は約８０％であった。

また、その活性発現率は糊精化活性で約１１％であり、
α−シクロデキストリン分解活性で約１０８％であった
。

また、実験３の方法に準じて転移率２０チを得るに必要
な酵素蛋白質量を比較したところ、本固定化酵素は固定
化前の酵素の約１／２であった。

この固定化酵素を直径と高さの比が１：８であるカラム
に詰め、これにり、Ｅ、２０の液化澱粉２０ｗ／ｗ％と
グルコース異性化糖（グルコース約１２ｗ／ｗ％とフラ
クトース約８ｗ／ｗ％とを含む）２０ｗ／ｗ％とを含有
する混合溶液をｐＨ゛６．５、温度５０℃でＳＶ２の流
速で５週間連続して反応させたところ、転移率はフラク
トースに対して約４５チでほぼ一定であった。

′得られた末端にフラクトースを結合したグ
ルコオリゴ糖類は、実施例１と同様に精製、濃縮し、真
空乾燥して粉末化し、白色でまろやかな甘味を有する粉
末甘味料を固形物当り約９５％の収率で得た。

実施例 ５ 実施例４で調製した多孔性ガラスアルキルアミン粉末（
担体）５０１をｐ−ニトロベンゾイルクロ９ド５０１、
トリエチルアミン８０−、クロロホルム１１７０ｍから
なる溶液中で５時間加熱し還流した。

次いで、この担体をクロロホルム、エーテ化の順で洗浄
し、風乾した後、５ｗ／ｗ％ハイドロサルファイドナト
リウム水溶液中で４時間沸騰させ、水洗した。

得られたアリルアミノ化多孔性ガラスを２Ｎ−塩酸水溶
液１０００ｍ／中に加え、水浴中で０℃に保ちつつ攪拌
しながら固形の亜硝酸ソーダ５ｖを添加させて反応させ
た。

反応後、担体を沖果し、過剰の酸と亜硝酸ソーダを氷水
で洗浄除去してジアゾ化した多孔性ガラスアリルアミン
粉末を得た。

この粉末４０ｆＩ−を、予じめ調整しておいた実施例３
で得た酵素―品１ｗ／ｗ％を含有する Ｈ８，５の０．
１Ｍ炭酸塩緩衝液４０００−に加えて、０℃で５時間ゆ
つクシ攪拌しつつ固定化反応させた。

、反応後、水で充分洗浄して次に示す転移反応に用いた
。

Ｅ液、洗浄液中の蛋白質量から算出される固定化率は約
６８チであった。

また、その活性発現率は糊精化活性で９％であシ、α−
シクロデキストリン分解活性で９８ヂであった。

また、実験３の方法に準じて転移率２０チを得るに必要
な酵素蛋白質量を比較したところ、本固定化酵素は固定
化前の酵素の約１／３であった。

この固定化酵素を直径と高さの比が１：１０であるカラ
ムに詰め、これにり、Ｅ、５の液化澱粉１０ｗ／ｗチと
シュクロース３０ｗ／ｗ％および１０−３Ｍの塩化カル
シウムとを含有する混合溶液をｐＨ６，０，温度６５℃
でＳｖ３の流速で５週間連続して反応させたところ、途
中で転移率の低下はほとんど起らず約２５％であった。

得られた末端にフラクトースを結合したグルコオリゴ糖
類はＪ実施例１と同様に精製、濃縮し、水分的Ｌ７ｗ／
ｗ％め非結晶性で甘味の強いシララフ搭固形物当ち約９
４％の収率で得た。

【図面の簡単な説明】

図において之第１図は対照である溶性のシクロデキスト
リングルカノトランスフェラーゼを用いた場合の実験結
果を示すグラフ、第２図は本発明の固定化したシクロデ
キストリングルカノトランスフェラーゼを用いた場合の
実験結果を示すグラフである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 固定化したシクロデキストリングルカノトランスフ
   ェラーゼに、液化澱粉とフラクトースまたはシュクロー
   スとを含有する混合溶液を接触反応せしめることを特徴
   とする末端にフラクトースを結合したオリゴ糖類の製造
   方法。