BRPI0608080B1 - Processes for manufacture of syrup and food or drink, syrup and composition of food or drink - Google Patents

Abstract

processos para fabricação de xarope substancialmente transparente e de alimento ou bebida, xarope e composição de alimento ou de bebida. são providos iqui, neste pedido de patente, métodos para a fabricação de um xarope substancialmente transparente compreendendo reagir um ou mais substratos em uma concentração de pelo menos 40% p/p com pelo menos uma enzima alternansucrase em uma temperatura de mais do que 45°c.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROCESSOS PARA FABRICAÇÃO DE XAROPE E DE ALIMENTO OU BEBIDA, XAROPE E COMPOSIÇÃO DE ALIMENTO OU DE BEBIDA".

Antecedentes São conhecidos xaropes de milho para uso na produção de bebidas (por exemplo, bebidas para esporte) e outras aplicações em alimentos. Seria desejável, no entanto, ter disponíveis para uso em bebidas e em outras aplicações em alimentos, como necessários, um produto tendo adoçamento e funcionalidade que seja similar ao xarope de milho, tendo ainda um índice glicêmico mais baixo.

Sumário São providos aqui, neste pedido de patente métodos eficientes para a fabricação de xaropes substancialmente transparentes baixo-glicêmico (LGS) que compreendem oligossacarídeos "alteman". Esses xaropes tem um índice glicêmico relativamente baixo e são, alem disso úteis em aplicações nas quais uma transparência aumentada é desejada. Essas qualidades são especificamente vantajosas em formulações de alimentos e de bebidas.

Em algumas modalidades os métodos para fazer os LGS substancialmente transparentes envolvem reagir um ou mais substratos (sacarose inicial e um ou mais aceitantes iniciais selecionados a partir de um açúcar ou álcool de açúcar tendo grupos hidroxila livres em uma ou mais das posições no carbono números 2, 3 e 6 que possam aceitar uma unidade de glicose a partir da sacarose) em uma concentração de pelo menos cerca de 40% com pelo menos uma enzima altemansucrase em temperaturas de mais do que 45°C. Em modalidades adicionais o substrato está em uma concentração de pelo menos cerca de 41,42,43,44,45,46,47,48,49, 50, 51, 52, 53, 54, ou 55% em peso. Em modalidades adicionais aqueles substrato e enzima podem ser reagidos em temperaturas maiores do que 46, 47, 48, 49, 50, ou 51°C.

Em algumas modalidades os métodos envolvem reagir um ou mais das alternansucrases com o substrato durante um período de tempo relativamente curto, tal como menos do que 12 horas, ou menos do que 11, 10,9,8 ou 7 horas. O LGS substancialmente transparente feito em temperaturas maiores do que 45°C e concentrações de substrato de pelo menos 40% em peso são tipicamente visualmente mais transparentes quando comparados com xaropes feitos em temperaturas mais baixas e em concentrações de substrato mais baixas. A transparência também pode ser determinada com a utilização do procedimento do teste descrito aqui, neste pedido de patente. Em algumas modalidades o LGS substancialmente transparente quando a-justado a uma concentração de 20% em peso irá exibir uma transmitância a 650 nm maior do que 93%, ou maior do que 94,95, 96, 97, 98 ou 99%.

Em algumas modalidades o LGS substancialmente transparente compreende menos do que 9,5% alteman que é maior do que DP 12 (graus de polimerização de unidades de glicose).

Em algumas modalidades os métodos proporcionam LGS substancialmente transparente que tem uma baixa viscosidade, tal como uma viscosidade de menos do que 14.000 cps a 26,7°C (80°F) e 77% de concentração de sólido seco. Em outras modalidades o LGS substancialmente transparente quando medido a 26,7°C (80°F) e 77% de concentração de sólido seco irá exibir uma viscosidade de menos do que 10000, 9000, 8000, 7000, 6000, 5000 ou 4,000 cps.

Em algumas modalidades a enzima "altemansucrase11 usada pode ser feita a partir de métodos recombinantes tais como aqueles descritos na US 6,570,065., Em modalidades adicionais a enzima recombinante será menor ou truncada quando comparada à enzima de comprimento total "Characterization of altemansucrase from Leuconostoc mesenteroides NNEIL B- 1355: rational and random approach to design of novel glucansu-crase11 Gilles Joucla, Doctroal Dissertation, Ingenier INSA, Toulouse, France, 2003.

Em outro aspecto a invenção proporciona um método para a fabricação de um alimento ou bebida compreendendo a misturação de um ou mais ingredientes com um xarope substancialmente transparente feito através do contato de um ou mais substratos em uma concentração de pelo me- nos 40% em peso com pelo menos uma enzima "alternansucrase" em uma temperatura maior do que 46°C.

Esses e outros objetivos e vantagens da presente invenção se tornarão aparentes aqueles versados na técnica a partir da descrição detalhada e das reivindicações que se seguem, Descrição Detalhada l___________Método para a fabricação de xaropes. O LGS substancialmente transparente descrito aqui, neste pedido de patente, exibe uma variedade de características físicas. Mais especificamente, os oligossacarídeos “alternan" podem ser produzidos a partir de um aceitante e sacarose que são reagidos um com uma ou mais enzimas "alternansucrase" que irão transferir unidades de glicose a partir da sacarose para um carboidrato aceitante e irão liberar oligossacarídeos de frutose e de glicose de diversos comprimentos. O produto resultante pode ter um nível de adoçamento similar àquele do xarope de milho e um paladar e funcionalidade similares àquela do xarope de milho. Além disso, e mais significativamen-te com relação aos métodos presentes, o produto resultante pode ser caracterizado em algumas modalidades por ter um índice glicêmico mais baixo quando comparado à combinação dos substratos (sacarose e aceitantes) que não estão reagidos com a enzima. Esses xaropes são referidos como xaropes substancialmente transparentes baixo-glicêmicos (LGS). O aceitante pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em um açúcar ou um álcool de açúcar que tenha grupos hidroxila livres em uma ou mais posições de carbono números 2, 3 e 6 que possam aceitar uma unidade de glicose a partir da sacarose. O aceitante pode estar na forma de um xarope ou de sólidos de xarope. Os exemplos de xaropes ou de sólidos de xarope adequados para serem usados aqui, neste pedido de patente, são maltose, maltotriose, panose, alta maltose (acima de 40%) xarope de milho, média a baixa DE (equivalente de dextrose) xarope de milho, rafinose, celo-biose, maltitol, maltotriose, maltotetrose, glicose, isomaltose, isomaltitol, xarope de cevada e sólidos de xarope, xarope de arroz, sólidos do xarope, lac-tose, permeato de soro de leite, xarope de amido de tapioca e sólidos do xarope, nigerose, kojibiose, isomaltooligossacarídeo, xarope de amido hidro-genado, xarope de amido de batata e sólidos do xarope, xarope de milho e sólidos do xarope, e semelhantes. Os exemplos dos xaropes que são adequados para uso nas combinações são, porém não estão limitados a, SA-TINSWEET®, disponível da Cargill, Incorporated, que contém um mínimo de 55 até 70% em peso de maltose e de 45 até 30% em peso de glicose e outros oligômeros que contém glicose. Em uma modalidade, o xarope ou os sólidos do xarope usados compreendem uma quantidade de a partir de cerca de 2 até cerca de 99% em peso de maltose.

As enzimas "alternansucrase" que podem ser usadas na reação para a produção do LGS incluem, porem não estão limitadas a Leuconostoc Mesenteroides (LM) cepas NRRL B 1355, 23185, 23186, 23188, 23311, 21297, 30821, 30894 e outras enzimas providas aqui, neste pedido de patente. Essas enzimas podem ser ainda clonadas e expressas de forma re-combinante, tal como descrito em Giles Joucla, Doctroal Dissertation, Inge-nier INSA, Toulouse, France, 2003. Essas cepas podem ser cultivadas e as enzimas podem ser isoladas com a utilização de métodos conhecidos na técnica, tais como os métodos providos abaixo.

As características físicas dos xaropes produzidos podem ser alteradas pela utilização de condições de reação diferentes. Por exemplo, um LGS substancialmente transparente pode ser produzido através da reação de uma ou mais das enzimas "alternansucrase" em uma reação com uma concentração relativamente elevada de sacarose e aceitante. Além do mais, a eficácia da reação pode ser aumentada pela reação em uma temperatura maior do que 45°C. Isso permite que sejam necessárias menos enzimas com a finalidade de chegar a completação (quando o substrato restante é < 2% do total de carboidratos em base de peso) da reação e a reação pode ser completada em um período de tempo mais curto. Por exemplo, a reação pode ser executada em uma temperatura maior do que 45°C durante um período de menos do que 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, ou menos do que 20 horas. A temperatura aumentada também pode diminuir o risco de contaminação microbiana em algumas modalidades.

As características dos LGS podem ser alteradas através do controle da proporção da sacarose para o aceitante. Geralmente, o índice gli-cêmico do LGS substancialmente transparente irá decrescer na medida em que a proporção de sacarose para o aceitante aumenta até uma proporção i de cerca de 12:1. Por exemplo, é previsto que um produto feito com a utilização de uma proporção de 1:1 (de sacarose para aceitante) terá um índice glicêmico mais alto do que aquele de um produto feito com a utilização de uma proporção de 4:1 (de sacarose para aceitante). Em algumas modalidades uma proporção a partir de cerca de 8:1 até cerca de 11:1 é usada. Em i outras modalidades, os métodos compreendem a fabricação dos LGS com a utilização de proporções de sacarose para aceitante de pelo menos 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, e 10:1. Por conseqüência, a invenção também provê produtos de alimentos e de bebidas feitos através de tais métodos. O LGS também pode ser caracterizado através das ligações entre as moléculas de glicose no oligossacarídeo de glicose. Em algumas modalidades o oligossacarídeo de glicose tem ambas as ligações alfa 1,3 e alfa 1.6. Em algumas modalidades, o oligossacarídeo de glicose também contém outras ligações tais como a alfa 1,4, Em algumas modalidades aquele LGS terá pelo menos 20% de ligações alfa 1,3. Em outras modalidades, o LGS irá ter, pelo menos 20% de ligações alga 1,3 e pelo menos 20% de ligações alfa 1.6.

Em algumas modalidades, o LGS substancialmente transparente é em seguida processado para a remoção de uma parte da ou de toda a fru-tose, produzindo dessa forma um LGS que não contém frutose. A frutose pode ser removida a partir do LGS com a utilização de qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, através da utilização de cromatografia de coluna. Geralmente, o LGS contém menos do que 30% de frutose. O LGS substancialmente transparente e/ou o LGS isento da frutose podem ainda ser hidrogenados para a fabricação de um xarope de não redução.

Em outras modalidades, é provido um oligoalteran com um grau de polimerização de 7 a 12 que é um carboidrato de digestão lenta porém total que torna o LGS um adoçante único que oferece uma resposta glicêmi-ca baixa e energia continuada sem nenhum desconforto intestinal ou efeito colateral. As cepas NRRL B 30821 e NRRL B 30894 são mutantes constitutivos da cepa NRRL B 21297 {Leathers et al, 1997) geradas através de mu-tagênese química. Por consequência, a sacarose não é mais necessária para induzir a produção máxima de "alternansucrase" na cepa NRRL B 30821. I]_________Produtos e Combinações incluindo um xarope baixo-alicêmicos substancialmente transparente (LGS) O LGS substancial mente transparente descrito aqui, neste pedido de patente pode ser combinado com uma ou mais de uma variedade de outros ingredientes e pode ser vendido para formuladores como combinações, ou os componentes para combinações podem ser providos para o formulador separadamente e o formulados pode combinar os mesmos enquanto fazendo um produto alimentício final. O LGS substancialmente transparente pode ser combinado com um ou mais outros ingredientes tais como vitaminas, minerais, álcoois de açúcar, adoçantes de alta intensidade, aro-matizantes, aumentadores de aromatização, e outros adoçantes convencionais para prover o impacto nutritivo desejado bem como o aroma desejado. A criação de combinações com o LGS substancialmente transparente é presumida como aumentando a homogeneidade dos produtos finais.

As vitaminas que podem ser combinadas com o LGS substancialmente transparente inclui qualquer uma de um grupo de outras substancias orgânicas que não proteínas, carboidratos, gorduras, minerais e sais orgânicos que são essenciais para o metabolismo, crescimento e desenvolvimento normal do corpo. As vitaminas incluem compostos tais como A, D, E, I, biotina, colina, ácido fólico, e ácido nicotíníco.

Os compostos minerais que podem ser combinados com o LGS substanciaimente transparente incluem compostos inorgânicos de elementos minerais, que constituem os constituintes minerais do corpo. Os sais minerais e água são excretados diariamente a partir do corpo e, por esse motivo, necessitam ser reabastecidos. Esses devem ser substituídos através da ingestão de alimentos ou de suplementos. Os exemplos de minerais incluem Ca, Fe, P, Na, Cu, K, e Mg.

Os aromatizantes e/ou os aumentadores de aromatização também podem ser combinados com o LGS. Por exemplo, o ácido diidroxiben-zóico (DHB, incluindo todos os isômeros) bem como aromas tais como de hortelã-pimenta, cacau e baunilha. Álcoois de açúcar também podem ser combinados com o LGS e usados para conferir adoçamento a um produto alimentício específico e em muitos casos o álcool de açúcar não contribui de forma tão grande com relação ao conteúdo calórico do produto quando comparado com os adoçantes convencionais. Os álcoois de açúcar são caracterizados pela presença de um grupo hidroxila sobre um açúcar de cetona ou um açúcar de hexose. Os exemplos de álcoois de açúcar que podem ser combinados com os adoçantes LGS descritos aqui, neste pedido de patente, incluem o sorbitol manitol, xilitol, maltitol, isomalte, hidrolizado de amido hidrogenado e eritritol.

Os LGS descritos aqui, neste pedido de patente também podem ser combinados com adoçantes de alta intensidade. Os adoçantes de alta intensidade são agentes que exibem forças de adoçamento em concentrações muito baixas. Os exemplos de adoçantes de alta intensidade que podem ser combinados com as composições de LGS descritas aqui, neste pedido de patente incluem sacarina, ciclamato, aspartame, monatína, alítame, acessulfame de potássio, sucralose, taumatina, esteviosídio e glicinizina.

Os exemplos adicionais de usos e de produtos que podem ser feitos com a utilização do LGS substancialmente transparente estão incluídos nas WO 2004023894A1 e WO 2005089483A2,as quais são incorporadas aqui, neste pedido de patente, por referencia.

Os exemplos que se seguem proporcionam modalidades especificas de uma pessoa de habilidade comum na técnica irá reconhecer que esses exemplos são dados somente com a finalidade de ilustração não sendo considerados, de qualquer forma, como limitativos do âmbito do que é reivindicado.

Exemplos Exemplo 1. Métodos para fazer a solução de enzima.

As preparações de enzima foram geradas pelo cultivo de Leuco-nostoc Mesenteroides NRRL B 30821 ou NRRL B 30894, em meio contendo 10 g/l extrato de levedura, 5 g/l de fosfato de potássio, 0,2 g/l sulfato de magnésio (heptaidrato), 0,1 g/l sulfato de manganês (monoidrato), 0,02 g/l cloreto de cálcio, 0,01 g/l cloreto de sódio, 0,01 g/l sulfato ferroso (heptaidrato) e 20 - 40 g/l glicose de várias origens. A cultura de Leuconostoc Mesenteroides NRRL B 21297 foi cultivada no mesmo meio, exceto com 2% de sacarose e 2% de xarope de milho alta maltose (65% maltose) como a fonte de carbono. As culturas foram cultivadas a 27 a 30°C e com controle do pH a 6,0 (com 10% NaOH) até que o carboidrato tivesse sido consumido. Uma vez que a fonte de carbono estava exaurida, as células foram removidas a-través de centrifugação a 12.200 x g a 4eC durante 30 minutos. O sobrena-dante clarificado da cultura foi concentrado por ultrafiltragem através de uma membrana cortada de pelo molecular de 50.000 (50 kD MWCO) para ser obtido um concentrado de dez vezes em volume da enzima. Ambas as cepas NRRL B 30821 e NRRL B 30894 foram derivadas a partir de Leuconostoc Mesenteroides NRRL B 21297 através de mutagênese química e expressam "aiternansucrase" de forma constitutiva quando cultivadas em meio de glicose.

Exemplo 2. Análise para determinar a diaestibilidade. A digestibilidade do xarope resultante foi determinada através de uma analise de digestão in vitro. 2 ml de 8% de xarope em teste foram misturados com 10 μΙ de glicoamilase (Optidex L-400 da Genencor International, Paio Alto, CA), e 2 ml de 0,019 M tampão de acetato, pH = 4,5, e incubado a 60°C durante de 16 a 20 horas. Depois da digestão, 2 ml do xarope foram retirados e misturados com 2 ml de 0,05 M de tampão de fosfato, pH = 6.5, 0,1 ml de 1% NaN3, e0,1 g pó intestinal de rato (Catalog* 1-1630, Sigma-Aldrich Fine Chemicals, St, Louis, MO, USA) e incubados a 37gC durante até 24 horas. A cada ponto de tempo, 0,5 ml da mistura foram misturados com 1 ml de 1,2 H HCI para parar a reação adicional. A quantidade de glicose libe- rada através da glicoamilase e da hidrolise da enzima intestinal de rato foi determinada através de HPLC com a utilização de uma coluna Aminex HPX-87H, disponível de Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA), com 0,01 N (normal) ácido sulfúrico como a fase móvel a 0,6 ml/minuto e 60°C. A digestibilt-dade foi expressa como a percentagem de glicose liberada dos glicossacarí-deos totais e calculada através da seguinte equação: Liberação teórica de glicose = [glicose]/[frutose]*0,45/0,55*100 Alternativamente, a etapa inicial de tratamento da glicoamilase pode ser omitida.

Exemplo 3, Análise de enzima e definição da unidade. A 2,5 ml de 40% (p/v) de sacarose para maltose em uma proporção de 9:1 e 0,1 ml de 1,5 M tampão de citrato, pH 5,5, 0,1 até 2,4 ml de enzima concentrada foram adicionados. O volume foi levado para até 5,0 ml com água nanopura e as reações foram incubadas até 37SC. Depois de uma hora, 0,5 ml de cada reação foram colocadas em um banho de água a 90 -100°C durante 5 minutos. Depois de um curto período de resfriamento, 1,0 ml de água nano pura foram adicionados às amostras de 0,5 ml e 0,05 - 0,1 g de uma mistura de troca de íon consistindo em Dowex 66 e Dowex 88 (Dow Chemical Co, Midland, Ml) foram adicionados. As amostras foram invertidas durante de 2 a 3 minutos e foram filtradas através de um filtro de náilon de 0,45 pm (Whatman, Clifton, NJ) para dentro de frascos HPLC. As amostras foram passadas por um HPLC através de uma coluna de carboi-drato HPX-87C (300mm X 7.8 mm) (Bio-Rad, Hercules, CA) a 85°C com água como a fase móvel a 0,9 ml/minuto. Os cálculos foram baseados no percentual de frutose com relação à área do açucares totais. O cálculo é como se segue: Percentual de frutose * 1 g açúcar total em 5 ml de reação/1 h/ volume de calda de enzima usado = g frutose/h/ml de atividade.

Os valores são convertidos para μ rnols frutose/min/ml com a utilização da fórmula do peso da frutose e conversão métrica. Uma unidade é definida como a liberação de 1 μιτιοΙ de frutose por minuto a 37eC e os valores são registrados como U/ml.

Exemplo 4. Análise do perfil e acúcar do xarope baixo-qlicêmico. O perfil de oligossacarídeo do xarope baixo-glicêmico é analisado através de um método de HPLC como descrito abaixo. Uma amostra de xarope baixo-glicêmico é diluída com água deionizada para 5 a 10% de sólidos secos, as cinzas são retiradas com resinas de troca de íon (Dowex 66/Dowex 88, Dow Chemical Co., Midland, Ml), e filtrada através de um filtro de 0,45 micra antes da injeção dentro do HPLC para a análise do açúcar. A separação do oligossacarídeo é conseguida através da utilização de duas colunas BioRad Aminex HPX-42A, 300 - 7,8 mm, (Hercules, CA) em série a 65°C e com um detector de índice de retração. Água é usada como o eluen-te em uma velocidade de fluxo de 0,2 ml por minuto. O cromatograma de uma amostra de xarope baixo-glicêmico típico (PDF8) está mostrado na Figura 1. Os picos seqüenciais mostrados no cromatograma são determinados como oligômeros de grau de polimerização crescente (DP). Por exemplo, o DP3 é um trissacarídeo e o DP4 é um tetrassacarídeo. O pico que elui no tempo mais curto no final do lado esquerdo é determinado como um pico de polímero com um peso molecular de pelo menos 250.000.

Exemplo 5. Conversão enzimática de substrato de sacarose/maltose (proporção de sacarose:maltose = 9:1) com relação a xarope especialmente transparente em temperaturas elevadas. O LGS substancialmente transparente com digestibilidade lenta e baixa viscosidade pode ser feito em temperaturas mais altas do que 45°C. Nas temperaturas elevadas, a taxa de conversão dos substratos de açúcar para o xarope transparente é bastante aumentada. Devido às velocidades de reação aumentadas em altas temperaturas, o uso da enzima, duração do tempo de conversão e o risco de contaminação microbiana durante o processamento são bastante reduzidos. Isso é de importância especifica na produção comercial, oferecendo vantagens econômicas para a produção do LGS substancialmente transparente.

Foi obtida uma preparação de enzima a partir de Leuconostoc Mesenteroides NRRL B 30821 como descrita no Exemplo 1. A preparação de enzima tinha uma atividade de 92,5 Unidades/ml como definido no Exemplo 3. A gravidade especifica da preparação de enzima e a água foi presumida a 1 g/ml. Sacarose e maltose cristalina, ambas adquiridas da Sigma-Aldrich Fine Chemicals (St. Louis, MO, USA), foram misturadas a seco em um a proporção de sacarose:maltose de 9:1 em uma base de peso seco e trituradas em um triturador de café para ser obtida uma mistura homogênea de substratos em pó, referida, a partir daqui, neste pedido de patente, como o substrato. O substrato de açúcar foi dissolvido em água deío-nizada até uma concentração final de 20, 30, 40 e 50% em peso por peso incluindo a adição da preparação de enzima em tubos de ensaio de polipro-pileno de 50 ml fechados. Uma alíquota de 0,17 ml da preparação de enzima foi adicionada a cada um dos tubos de ensaio, para produzir dosagens variadas de enzima (Tabela 1). O peso total do substrato, água e da enzima foi de 8,50 g em cada um dos tubos de ensaio. Os tubos de ensaio foram colocados em banhos de água ajustados a 37°C, 45°C, 50°C e 55°C durante 30 minutos para a solução de substrato ficar equilibrada as respectivas temperaturas antes da adição da enzima.

Tabela 1. Concentração de substrato, dosagem de enzima e quantidades de substrato e água contidas em cada tubo de ensaio. 0,17 ml de enzima foi adicionado a cada tubo de ensaio (equiva ente a 15,7 unidades totais).

Depois da adição da preparação de enzima, os tubos de ensaio foram colocados de volta em seus respectivos banhos de água a 37°C, 45°C, 50°C e 55°C. Depois de 20 horas de incubação, uma pequena amostra foi retirada de cada tubo de ensaio. O substrato restante nas amostras foi analisado através de HPLC como descrito no Exemplo 3, exceto em que a área percentual do substrato foi calculada contra as áreas totais de açúcar. A taxa média de reação durante as 20 horas de reação foi calculada como pmols de substrato exauridas por hora por unidade de enzima (pmols de substrato/hora/unidade). A Tabela 2 abaixo provê os resultados das reações e mostra que as reações em temperatura mais elevada e concentração de substrato mais elevada exibiram uma conversão mais alta de substrato e uma taxa de reação mais elevada. Como resultado, uma pessoa de habilidade comum na técnica irá observar que é necessária menos enzima para completar a reação em menos tempo em temperaturas elevadas e altas concentrações de substrato do que em baixas concentrações de substrato e temperaturas mais baixas. Por exemplo, foi alcançada uma utilização de 97% do substrato em uma concentração de 50% de substrato e a 50°C com 3,7 U/g de enzima, completação de 98% de substrato a uma concentração de 40% de substrato e 45°C com 4,63 U/g de enzima quando comparados com a exaustão de 98% do substrato em uma concentração a 30%, a 37°C com 6,17 U/g de enzima dentro de 20 horas, foram necessárias 9,25 U/g de enzima para completar um a reação de concentração a 20% a 37°C. A partir de um ponto de vista de operação industrial as reação em alta concentração de substrato também oferecem as vantagens de um uso reduzido de água e de energia. A partir deste experimento, uma pessoa de habilidade comum na técnica irá observar que será necessário um tempo muito mais longo para completar a reação em alta concentração de substrato e em temperatura baixa (37°C), devido a uma taxa de reação vagarosa.

Tabela 2. Efeitos da concentracão do substrato e da temoeratura sobre a conversão e a taxa de reação do substrato.

Exemplo 5, Propriedades químicas e físicas dos xaropes transparentes feitos em temperaturas elevadas.

Foi obtida uma preparação de enzima a partir de Leuconostoc Mesenteroides NRRL B 30821 como descrita no Exemplo 1. A preparação de enzima tinha uma atividade de 92,5 Unidades/ml como definido no Exemplo 3. A gravidade específica da preparação de enzima e a água foi presumida a 1 g/ml. Sacarose e maltose cristalinas, ambas adquiridas da Sigma-Aldrich Fine Chemicals (St. Louis, MO, USA), foram misturadas a seco em um a proporção de sacarose:maltose de 9:1 em uma base de peso seco e trituradas em um triturador de café para ser obtida uma mistura homogênea de substratos em pó, referida, a partir daqui, neste pedido de patente, como o substrato. O substrato de açúcar foi dissolvido em água deio-nizada até uma concentração final de 50 e 60% em peso por peso incluindo a adição da preparação de enzima em tubos de ensaio de polipropileno de 50 ml fechados. Alíquotas da preparação de enzima foram adicionadas a cada um dos tubos de ensaio para serem obtidas dosagens finais de enzima de 2 U/g, 5 U/g e 8 U/g. O peso total do substrato, água e enzima foi de 20 g em cada tubo de ensaio. Os tubos de ensaio foram colocados em banhos de água à 50°C durante 30 minutos, para as soluções de substrato se equilibrarem as respectivas temperaturas antes da adição da enzima. Depois de 48 horas a 50°C, as amostras foram analisadas com relação as suas composições de açúcar, com a utilização de coluna dupla Aminex HPX-42A HPLC descrita no Exemplo 3. A diaestibilidade das amostras foi determinada através do método descrito no Exemplo 2.

Em geral, os xaropes feitos em alta temperatura e alta concentração de substrato continham menos polímero e mais leucrose, porém quantidades similares de glico-oligossacarídeos (Tabela 3). Devido a que taxa de digestão in vitro foi largamente atribuível ao conteúdo de oligossaca-rídeos, os xaropes feitos em alta temperatura e alta concentração de substrato exibiram uma digestibilidade in vitro similar como aqueles feitos em baixa temperatura e baixas concentrações de substrato. Os resultados da taxa de digestão in vitro exibiram taxas de digestão similares entre as amostras testadas. Sob a mesma condição de digestão, a maltose ou os malto-oligossacarídeos são 100% digeridos dentro de 8 horas (dados não mostrados) Tabela 3- Perfil de açúcar e da digestibilidade in vitro de xarope transparente feito em altas temperaturas em comparação com aquele feito em uma baixa temperatura.

Exemplo 6, Transparência de xaropes feitos em altas temperaturas.

Devido às concentrações reduzidas de polímeros, os xaropes fritos em altas temperaturas exibiram outra característica importante, em que eles são transparentes.

As amostras de xaropes produzidas a 20% (peso/peso) de concentração de substrato e a 37°C na Cargill Process Development Facility in Savage (MN, USA), PDF03, PDF04, PDF06, PDF08, e PDFIO, foram comparados com aqueles produzidos á 50% (peso/peso) de concentrações de substrato e 50°C. Uma amostra produzida a partir de PDF07 por ultra filtragem (50 kD MWCO) para remover polímero "alteman" também foi incluída na comparação. Todas as amostras foram diluídas com água deionizada a partir de - 80% de sólido seco até 50, 40, 30, 20,10 e 5 % de sólido seco e transmitância de luz medida com um espectrofotômetro (Hewlett Packard, Modei 8453) a 650 nm com a utilização de uma célula de 1 cm. Antes da medição da transmitância das amostras em teste o espectrofotômetro foi calibrado com água deionizada. Como mostrado na Tabela 4, todas as a-mostras feitas a uma concentração de substrato a 20% e a 37°C, exceto aPDF07 com o polímero removido através de ultra filtragem tiveram uma transmitância de luz de menos do que 98,1% e tinham a aparência de opacas em concentrações de 40% de sólido seco ou abaixo. De forma inversa, a amostra feita em alta temperatura era transparente com o polímero removido através de uttrafiltragem através de toda a faixa de concentrações (a partir de 0,5% de sólido seco até 85% de sólido seco).

Tabela 4. Transmitância de luz de um xarope feito em alta temperatura quando comparada com aquelas feitas em baixa temperatura com ou sem o polímero removido através de ultrafiltragem. ___________________ Exemplo 7, Xarope feito com NRRL B 30894 em alta temperatura.

Foi feita uma preparação de enzima a partir de Leuconostoc Me-senteroides NRRL B 30821 e da cepa NRRL B 30894, de acordo com o E-xemplo 1. O lote de xarope PDF12 foi feito com 3 U/g de enzima a partir de Leuconostoc Mesenteroides NRRL B 30894 a 50°C e 50% do total de açúcar em uma proporção de maltose para sacarose de 9. Os lotes de xarope PDF6 e PDF7 foram feitos com a enzima NRRL B 30821 em uma dosagem de 6 U/g de substrato a 37°C e 20% do total de açúcar com uma proporção de sacarose para maltose de 9. O ensaio de digestão foi feito como descrito no Exemplo 2 sem a etapa de pré-tratamento da glicoamilase. A medição da viscosidade foi executada em diversas temperaturas com dois lotes de xarope diferentes a 77% de sólido seco com a utilização de um Brookfield DV-E Viscometer (Brookfield Engineering Labs, Inc., Middleboro, MA).

Os lotes de xarope PDF6 e PDF7 foram opacos e o lote de xarope PDF12 era de xarope transparente. O perfil de açúcar dos dois tipos de xarope em temperatura baixa (PDF7) e alta (PDF12) estão mostrados na Tabela 6 e exibiram que não havia polímero presente no xarope PDF12. O xarope transparente tinha uma viscosidade significativamente mais baixa quando comparada com o xarope opaco nos mesmos níveis de sólido seco (Tabela 7) e é digerido por pó intestinal de rato em uma taxa similar como a do xarope opaco (Tabela 8).

Tabela 6: Perfil de açúcar de xarope transparente e opaco (em % de açúcar ' total) Tabela 7: Comparação de viscosidade de xarope transparente vs opaco (em centipoises por segundo) a 77% de sólido seco.

Primeiro Amostra 7530 3722 2166 1363 864 Tambor 1 1744 1053 686 455 312 Tambor 2 3478 1973 1195 756 503 Tambor 3 1313 801 506 347 240 Tambor 4b 1856 1134 713 474 309 Tambor 5 3366 1898 1175 759 509 Tambor 6 1263 766 499 344 237 Baldei 3225 1856 1150 857 586 Tabela 8. As taxas de digestão de xarope transparente vs. xarope opaco (em % de glicose liberada depois de 0 a 24 horas)_______________________ Exemplo 8. Xaropes transparentes feitos em temperaturas elevadas com preparações de enzima a partir de várias cepas de Leuconostoc.

Foram obtidas preparações de enzima a partir de três cepas diferentes de Leuconostoc usando os métodos descritos no Exemplo 1. Um total de 3 kg de substrato de açúcar (sacarose:maltose = 9:1) foi dissolvido em água corrente até concentrações finais de 50% de sólido seco peso em peso ou 52% de sólido seco, peso em peso incluindo a adição da enzima. As reações foram executadas a 50°C ou 52°C (Tabela 9 abaixo). Alíquotas foram retiradas no final de cada reação e os perfis de açúcar e a digestibilida-de in vitro das mesmas foram determinados como descrito. Como mostrado na Tabela 9 todas as preparações de enzima completaram a reação. Os xaropes resultantes exibiram composição química e taxas de digestão in vitro similares.

Tabela 9. Condições de reação, perfil de açúcar e digestibilidade in vitro de xaropes feitos em temperatura elevada.____________ REIVINDICAÇÕES

Claims (17)

1. Processo para fabricação de um xarope, caracterizado pelo fato de que compreende a reação de mais de um substrato em uma concentração de pelo menos 40% p/p com pelo menos uma enzima alternansucra-se, em que a pelo menos uma enzima alternansucrase é obtida a partir de uma cepa selecionada dentre o grupo consistindo nas cepas NRRL B 1355, 23185, 23186, 23188, 23311 e 21297 de Leuconostoc mesenteroides em uma temperatura variando de 45Ό-55°0 para a formação de um xarope, em que os substratos compreendem sacarose e um aceitante, e em que o acei-tante é selecionado a partir de um açúcar ou álcool de açúcar tendo grupos hidroxila livres em uma ou mais das posições no carbono números 2, 3 e 6 que possam aceitar uma unidade de glicose a partir da sacarose.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o xarope tem uma transmitância de luz maior do que 96,86%.

3. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma alternansucrase e substratos são mantidos a uma temperatura variando de 45Ό-55°0 durante mais do que 0 horas e menos de 12 horas.

4. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a enzima tem uma concentração maior que 2 unidades por grama de substrato e menor que 8 unidades por grama de substrato.

5. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o xarope em uma concentração de 20% p/p tem uma transmitância a 650 nm maior que 93%.

6. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o xarope compreende mais do que 0 e menos do que 0,5% de alternan que é maior do que o DP12.

7. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o xarope tem uma viscosidade menor que 14000 cps a 26,7 °C (80 °F) e 77% de concentração de sólido seco.

8. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma enzima alternansucrase é obtida a partir de bactérias do ácido láctico.

9. Xarope, caracterizado pelo fato de que é feito por um processo como definido na reivindicação 1 ou 2.

10. Composição de alimento ou de bebida, caracterizada pelo fato de que compreende o xarope como definido na reivindicação 9.

11. Processo para a fabricação de um alimento ou bebida, caracterizado pelo fato de que compreende misturar um ou mais ingredientes com um xarope feito através do processo como definido na reivindicação 1.

12. Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a bebida é uma bebida esportiva.

13. Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma enzima alternansucrase é obtida a partir de bactérias do ácido láctico.

14. Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que pelo menos um ingrediente é uma vitamina.

15. Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que pelo menos um ingrediente é um adoçante de alta intensidade.

16. Alimento, caracterizado pelo fato de que é feito a partir do processo como definido na reivindicação 11.

17. Bebida, caracterizada pelo fato de que é feita a partir do processo como definido na reivindicação 11.