KR102122482B1 - 신규한 α-글루코실 레바우디오사이드 A 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 α-글루코실 레바우디오사이드 A 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 레바우디오사이드 A의 19 위치의 글루코오스에 글루코오스가 α-1,6 글리코시드 결합에 의해 연결되어 부가된 α-글루코실 레바우디오사이드 A 및 이를 제조하는 방법에 대한 것이다. 보다 상세하게는, 당전이 효소를 이용하여 설탕의 글루코오스를 레바우디오사이드 A에 전이시켜 제조됨으로써, 안정성이 개선되면서도 쓴맛이 감소된 신규한 α-글루코실 레바우디오사이드 A에 대한 것이다. 본 발명의 α-글루코실 레바우디오사이드 A는 보존상 안정성을 요구하는 식품 조성물의 제조에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

신규한 α-글루코실 레바우디오사이드 A 및 이의 제조방법{Novel α-Glucosyl-Rebaudioside A and Method for Preparing The Same}

본 발명은 신규한 α-글루코실 레바우디오사이드 A 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 레바우디오사이드 A의 19 위치의 글루코오스에 새로운 글루코오스가 α-1,6 글리코시드 결합에 의해 연결되어 부가된 α-글루코실 레바우디오사이드 A 및 이를 제조하는 방법에 대한 것이다. 보다 상세하게는, 당전이 효소를 이용하여 설탕의 글루코오스를 레바우디오사이드 A에 전이시켜 제조됨으로써, 안정성이 개선되면서도 쓴맛이 감소된 신규한 α-글루코실 레바우디오사이드 A에 대한 것이다.

설탕(자당)은 가장 많이 알려지고 널리 사용되고 있는 감미료로서, 인스탄트 커피를 비롯한 커피 음료, 쥬스류나 탄산 음료 등의 청량 음료수에 다량으로 사용되고 있다. 그러나 웰빙을 추구하는 사회적 기류에 따라 비만, 당뇨 등 성인병과 충치의 원인이 되는 설탕을 줄이거나 설탕을 대신할 수 있는 고감미도의 감미료를 사용하는 경향이 증가하고 있다. 상기의 설탕을 대신할 수 있는 감미료로서 사카린, 아스파탐과 같은 인공감미료는 독성, 알러지 유발 등의 유해성과 안정성의 문제로 인하여 사용이 점차 규제되는 추세에 있어 새로운 감미 소재에 대한 필요성이 대두되고 있다.

스테비아 감미료는 남미 파라과이를 원산지로 하는 국화과의 다년생식물인 스테비아에서 추출한 고감미 물질이다. 스테비아 감미료의 세계적인 소비처는 한국이 약 30%, 일본이 약 27%, 중국이 약 30%이고, 나머지 13%가 기타의 나라인 것으로 조사되었다. 그리고, 한국에서 식품으로서의 소비 형태는 거의 효소를 이용하여 포도당을 부가해 감미질을 개량한 제품, 즉 효소처리 스테비아(식품첨가물 공전상의 공식명칭) 제품이 전체의 약 80% 이상을 차지하고 있다. 스테비아 감미료 중에서 효소처리 스테비아가 가지는 장점은 ① 감미질이 설탕에 가깝고, 쓴 맛이 없으며, 감미도가 설탕의 100~250 배로 높으나 실질적으로 무칼로리이다. ② 열과 산에 안정하여 가공, 보존중의 감미 변화가 적다. ③ 미생물의 영양원이 되기 어렵고, 구강에서는 실질적으로 비우식성이다. ④ 메일라드 반응을 일으키지 않고, 식품가공으로 갈변되기 어렵다. ⑤ 젓갈의 맛을 완화시킨다. ⑥ 산미를 완화시킨다. ⑦ 빙점 강하가 작다. ⑧ 침투압을 올리지 않는다. ⑨ 다른 감미료와의 상승효과가 있어서 감미 코스트의 저감에 유효하다. ⑩ 산뜻한 감미질이며 당질 감미료의 걸죽한 맛을 완화한다는 것이다. 그러나 상기와 같은 장점과 스테비아 잎 추출물에서의 정제공정 및 효소반응에 의한 감미질 보완에도 불구하고 효소처리 스테비아는 타 당질감미료(설탕, 과당 등)와 비교하여 감미의 상승이 느리고, 뒷맛의 감미가 비교적 오래 남아, 이른바 감미의 마무리가 나쁘다는 특징이 있다. 또 상기 스테비아 감미료에 다량 포함되는 스테비아사이드에는 감미와는 별도로 뒷맛에 독특한 떫은 맛이나 쓴맛을 수반하므로, 커피 음료, 청량 음료수, 알콜 음료에 이용하면 명확히 위화감을 주는 단점이 있다.

스테비아의 감미 성분 중 미질이 설탕에 가깝고 감미도가 높은 성분은 레바우디오사이드 A(rebaudioside A)이다. 상기 레바우디오사이드 A는 최근 FDA에 의해서 식품으로의 사용이 허가됨에 따라 코카콜라와 펩시에서도 감미료로서 사용이 되고 있으며, 상기 감미가 우수한 레바우디오사이드 A를 함유하는 제품의 수요가 증가하고 있다.

그러나, 상기 레바우디오사이드 A는 수용액상에서 쉽게 침전이 되는 등 매우 불안정한 물성을 지니고 있어 식품 소재, 특히 음료의 소재로 널리 이용되기에는 한계가 있다.

또한, 이러한 한계를 극복하고자 상기 레바우디오사이드 A로부터 당전이 레바우디오사이드 M을 제조하는 방법(특허문헌 1)이 개발되었으나, 상기 방법은 매우 고가의 기질인 UDP(Sigma사 기준 1g 당 100 만원 이상)를 이용하고 있어 경제성이 현저히 떨어지는 문제점이 있었다.

KR 10-2016-0111998 A

본 발명이 해결하고자 하는 첫 번째 과제는 안정성이 개선되면서도 쓴맛이 감소된 신규한 α-글루코실 레바우디오사이드 A를 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 두 번째 과제는 상기 신규한 α-글루코실 레바우디오사이드 A를 경제적으로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 세 번째 과제는 상기 안정성이 개선되면서도 쓴맛이 감소된 신규한 α-글루코실 레바우디오사이드 A를 포함하는 식품 조성물을 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 레바우디오사이드 A의 19 위치의 글루코오스에 글루코오스가 α-1,6 글리코시드 결합에 의해 연결되어 부가된 α-글루코실 레바우디오사이드 A를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 α-글루코실 레바우디오사이드 A는 하기 화학식 1로 표시될 수 있다.

[화학식 1]

또한, 본 발명은 당전이 효소의 존재 하에 레바우디오사이드 A 및 설탕으로부터 α-글루코실 레바우디오사이드 A를 제조하는 단계;를 포함하는, α-글루코실 레바우디오사이드 A의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 당전이 효소는 글루칸수크라아제일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 글루칸수크라아제는 류코노스톡 락티스(Leuconostoc lactis) EG001 균주로부터 얻어질 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 당전이 효소는 당전이 효소 유전자를 함유하는 벡터로 형질전환된 재조합 대장균, 바실러스, 효모, 코리네박테리움 또는 아그로박테리움으로부터 생산된 것일 수 있다.

삭제

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 α-글루코실 레바우디오사이드 A의 수율은 85% 이상일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조되어 수용액상에서의 안정성이 개선된 것을 특징으로 하는 α-글루코실 레바우디오사이드 A를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기의 α-글루코실 레바우디오사이드 A를 포함하는 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 신규한 α-글루코실 레바우디오사이드 A는 안정성이 개선될 뿐만 아니라 쓴맛이 감소되어 감미질이 향상된 효과가 있다.

또한, 본 발명의 제조방법에 따르면 상기 신규한 α-글루코실 레바우디오사이드 A를 경제적으로 얻을 수 있게 된다. 따라서 상기한 α-글루코실 레바우디오사이드 A는 보존상 안정성을 요구하는 식품 조성물의 제조에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 류코노스톡 락티스 유래의 글루칸수크라아제의 존재 하에 설탕 및 레바우디오사이드 A를 반응시켜 α-글루코실 레바우디오사이드 A를 합성하는 과정을 나타내는 화학 반응식이다.
도 2는 실시예의 당전이 산물을 최초 반응 시간으로부터 2 시간 간격으로 HPLC 성분 분석을 실시하여 시간이 경과함에 따라 레바우디오사이드 A가 α-글루코실 레바우디오사이드 A로 효소 전환되는 정도를 나타내는 것이다.
도 3은 실시예에서 얻은 최종 반응 산물을 LC/MS/MS를 통해 분자량을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 α-글루코실 레바우디오사이드 A의 ¹H-NMR 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 α-글루코실 레바우디오사이드 A의 ¹³C-NMR 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 α-글루코실 레바우디오사이드 A의 1D-NOESY 스펙트럼 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명에 따른 α-글루코실 레바우디오사이드 A의 gCOSY 스펙트럼 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명에 따른 α-글루코실 레바우디오사이드 A의 gHSQCAD 스펙트럼 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명에 따른 α-글루코실 레바우디오사이드 A의 gHMBC 스펙트럼 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명에 따른 α-글루코실 레바우디오사이드 A의 2D-TOCSY 스펙트럼 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 11a는 상기 α-글루코실 레바우디오사이드 A 수용액의 농도별, 보존기간별 상온 안정성을 나타내는 그래프이고, 도 11b는 레바우디오사이드 A 수용액의 농도별, 보존기간별 상온 안정성을 나타내는 그래프이다.
도 12는 레바우디오사이드 A 수용액과 상기 α-글루코실 레바우디오사이드 A 수용액 각각의 pH에 따른 안정성을 나타내는 그래프이다.
도 13a는 레바우디오사이드 A의 온도에 따른 열 안정성을 나타내는 그래프이고, 도 13b는 상기 α-글루코실 레바우디오사이드 A의 온도에 따른 열 안정성을 나타내는 그래프이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 레바우디오사이드 A의 레바우디오사이드 A 19 위치의 글루코오스에 글루코오스가 α-1,6 글리코시드 결합에 의해 연결되어 부가된 α-글루코실 레바우디오사이드 A를 제공한다.

본 발명에서의 용어 "α-글루코실 레바우디오사이드 A"는 본 발명의 당전이 효소에 의해 레바우디오사이드 A의 19 위치의 글루코오스에, 선택적으로 하나의 글루코스가 α-1,6 글리코시드 결합을 통해 연결되어진 α-글루코실 레바우디오사이드 A를 의미한다.

바람직하게는, 본 발명의 α-글루코실 레바우디오사이드 A는 레바우디오사이드 A를 기질로 하여 상기 당전이 효소에 의해 레바우디오사이드 A 19 위치의 글루코오스에 α-1,6 글리코시드 결합을 통해 글루코오스 하나가 부가된 형태일 수 있고, 보다 바람직하게는 하기 화학식 1로 표시되는 α-글루코실 레바우디오사이드 A(O-α-D-glucosyl(1˝→6ㅄ)-rebaudioside A)이다.

[화학식 1]

본 발명에서, 상기 당전이 효소는 류코노스톡 락티스(Leuconostoc lactis)에서 생산되는 글루칸수크라아제인 것이 바람직하다.

기존의 당전이 효소는 레바우디오사이드 A의 13위치의 글루코오스 또는 19위치의 글루코오스 등에 무작위로 글루코오스를 1 내지 12개까지 부가하므로, 레바우디오사이드 A 19위치의 글루코오스에 알파 형태로, 선택적으로 한 개의 포도당만을 부가할 수가 없었다. 이에 본 발명자는 류코노스톡 락티스에서 생산되는 글루칸수크라아제가 레바우디오사이드 A와 설탕을 이용하여 레바우디오사이드 A의 레바우디오사이드 A 19 위치의 글루코오스에 선택적으로 하나의 글루코오스만을 α-1,6 글리코시드 결합으로 연결시킨다는 것을 최초로 규명하였으며, 이는 화학식 1로 나타내는 신규한 α-1,6 글루코실 레바우디오사이드 A가 기존의 레바우디오사이드 A에 비해 안정성이 개선되고, 쓴맛이 감소하여 감미질이 향상되는 것을 최초로 규명하였다.

본 발명에 따른 α-1,6 글루코실 레바우디오사이드 A는 종래의 베타 글루코실 레바우디오사이드 A에 비해 안정성 및 감미질이 크게 향상되는 것을 구체적으로 확인할 수 있었다.

본 발명의 다른 일 측면에 따르면, 본 발명은 당전이 효소의 존재 하에 레바우디오사이드 A 및 설탕으로부터 α-글루코실 레바우디오사이드 A를 제조하는 단계;를 포함하는, α-글루코실 레바우디오사이드 A의 제조방법을 제공한다.

상기의 당전이 효소는 당전이 효소 유전자를 함유하는 벡터로 형질전환된 재조합 대장균, 바실러스, 효모, 코리네박테리움 또는 아그로박테리움으로부터 대량으로 생산된 것일 수 있다. 상기 당전이 효소는 류코노스톡 락티스 EG001 균주 유래의 글루칸수크라아제일 수 있다. 또한, 상기 글루칸수크라아제의 유전자는 류코노스톡 락티스 EG001 균주로부터 분리한 DNA와 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 프라이머 쌍을 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행함으로써 얻은 염기서열일 수 있다.

상기 글루칸수크라아제는 당전이 반응을 통해 설탕으로부터 당을 분해시켜 글루칸(glucans)으로 불리는 D-glucose polymers의 합성을 촉매하는 효소이다. 설탕으로부터 합성된 글루칸은 주쇄에 글루코오스(glucose) 단위가 α-(1-2), α-(1-3), α-(1-4), α-(1-6) 등 다양한 결합으로 연결된 호모폴리머(homopolymer)로서 글루칸수크라제의 종류에 따라 가지(chains) 결합의 종류, 비율 및 길이가 각각 달라진다. 따라서 다양하게 존재하는 글루칸수크라아제는 서로 높은 유사성을 갖더라도 글루코시딕 결합의 형태에 따라서 다양한 글루칸을 합성할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서 본 발명자들은 상기 글루칸수크라아제를 대량 생산하기 위하여, 상기 글루칸수크라아제 유전자를 pET22b(+) 발현 벡터의 NcoⅠ과 NotⅠ 사이에 삽입하여 재조합 DNA를 제조하였다. 본 발명에 있어서, 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터는 pET22b(+), pET 계열의 벡터, pHCE, pGEX 계열, pTRP, pMAL 계열 등의 단백질 발현벡터를 예시할 수 있으나, 이에 한정된 것은 아니다.

본 발명에서, "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드" 및 "벡터"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 α-글루코실 레바우디오사이드 A 제조방법에서, 상기 글루칸수크라아제는 필요에 따라 유리 형태로 사용하거나 또는 고정화하여 사용할 수 있다. 글루칸수크라아제의 고정화는 당 업계에 공지된 방법인 기제결합, 교차결합, 봉입 또는 캡슐화 등에 의한 방법으로 수행될 수 있다. 상기 교차 결합은 예를 들면 글루타르알데히드를 사용하여 수행할 수 있으며 기제결합은 흡착 결합 또는 공유 결합에 의해 수행될 수 있고, 상기 봉입은 겔, 마이크로캡슐 또는 섬유 형태의 반투과성 막을 이용할 수 있다. 상기와 같은 방법으로 효소를 고정화하여 사용하면 효소의 재이용, 효소의 회수 및 정제 공정이 단축되는 장점이 있다.

상기 글루칸수크라아제의 반응 온도는 20 내지 50 ℃, 바람직하게는 25 내지 35 ℃, 더욱 바람직하게는 30 ℃이고, pH 범위는 4.5 내지 6.0, 바람직하게는 5이며, 반응시간은 3 내지 10 시간, 바람직하게는 5 내지 8 시간, 더욱 바람직하게는 6 시간이다.

본 발명의 α-글루코실 레바우디오사이드 A 제조방법에서, 상기 레바우디오사이드 A 및 설탕은 합성 또는 시판되고 있는 것을 제한 없이 사용할 수 있다.

도 1은 류코노스톡 락티스 유래의 글루칸수크라아제의 존재 하에서 설탕(기질) 및 레바우디오사이드 A(당 수용체)를 반응시켜 α-글루코실 레바우디오사이드 A를 합성하는 과정을 나타내는 화학 구조식이다. 상기 도 1을 참조하여 α-글루코실 레바우디오사이드 A의 합성 과정을 구체적으로 설명하면, ① 먼저 기질인 설탕(당 공여체)이 글루칸수크라아제에 의해 포도당과 과당으로 분해되고, ② 이 중 과당을 유리되고, 포도당은 글루칸 수크라아제에 결합하여 글루코실 효소 중간체를 형성하게 되며, ③ 상기 글루코실 효소 중간체가 -OH 결합을 갖는 화합물(수용체)인 레바우디오사이드 A에 결합하게 된다. ④ 그리고, 상기 포도당이 레바우디오사이드 A에 전이되어 α-글루코실 레바우디오사이드 A가 합성되는 것이다. 상기 합성 과정에서, 글루코실 효소 중간체와 레바우디오사이드 A의 높은 친화력으로 인해 85% 이상의 수율로 α-글루코실 레바우디오사이드 A가 합성될 수 있다.

본 발명의 제조방법은 반응산물로부터 α-글루코실 레바우디오사이드 A만을 분리 및 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 분리 및 정제하여 수득한 α-글루코실 레바우디오사이드 A는 액체 형태 그대로 사용하거나 상기 액체를 농축하여 사용하거나, 필요에 따라서는 건조시켜 분말화하여 사용할 수도 있다.

상기한 본 발명의 제조방법에 따르면, α-글루코실 레바우디오사이드 A를 85% 이상의 수율로 얻을 수 있게 된다.

본 발명의 방법에 따라 제조된 α-글루코실 레바우디오사이드 A는 특히 수용액 상에서의 안정성이 개선되므로, 수용액 상에서 30일 이상 보존하여도 98% 이상이 가용성 있는 형태로 존재한다.

본 발명은 또한, 상기의 방법에 따라 제조된 α-글루코실 레바우디오사이드 A를 포함하는 감미료 조성물을 제공한다.

본 발명의 안정성이 개량된 α-글루코실 레바우디오사이드 A를 유효성분으로 포함하는 감미료 조성물은, 레바우디오사이드 A가 가지는 불안정한 물성 등의 문제점을 개선하고, 맛의 질을 변화시키며, 설탕과 같이 신맛, 짠맛, 떫은맛, 단맛, 쓴맛 등 각종 물질의 다른 미감과 조화되므로, 보통의 일반 식품의 미감 개량 또는 품질 개량 등에 광범위하게 사용될 수 있다.

예를 들면, 간장, 분말간장, 된장, 분말된장, 젓갈, 마요네즈, 드레싱, 식초, 초간장, 중화요리 재료, 튀김요리용 간장, 국수용 간장, 소스, 케첩, 불고기 소스, 카레, 스튜 재료, 복합 조미료, 미림, 테이블 슈거, 커피 슈거 등 각종 조미료의 감미료로서, 또는 미감 개량제, 품질 개량제 등으로 유리하게 이용될 수 있다.

또한, 예를 들면 생과자, 밥풀 과자, 떡류, 만두, 팥소류, 양갱, 젤리, 카스테라, 알사탕, 빵, 비스킷, 크래커, 쿠키, 파이, 푸딩, 버터크림, 카스타드 크림, 슈크림, 와플, 스펀지 케이크, 도넛, 초콜렛, 츄잉검, 카라멜, 캔디 등의 각종 과자, 아이스크림, 샤베트 등의 빙과류, 과실의 시럽절임 등의 시럽류, 플라워 페이스트, 땅콩 페이스트, 과일 페이스트 등의 페이스트류, 잼, 마멀레이드, 시럽절임, 당과 등의 과실, 야채의 가공 식품류, 빵류, 국수류, 쌀밥류, 인조 고기 등 곡류 가공식품류, 햄, 소시지 등의 축산제품류, 어육 햄, 어육 소시지, 어묵, 튀김 등의 어육제품, 성게, 오징어젓, 초 다시마, 찢은 오징어, 복어의 미림 말림 등의 각종 진미류, 김, 산채, 말린 오징어, 작은 물고기, 조개 등으로 제조되는 해산물 조림류, 콩자반, 포테이토 샐러드, 다시마 말이 등의 반찬식품, 유제품, 어육, 축육, 과실, 야채의 병조림, 통조림류, 합성 술, 과실 술, 양주, 리큐어 등의 주류, 커피, 코코아, 쥬스, 탄산음료, 락트산 음료, 유산균 음료 등의 청량음료수, 푸딩 믹스, 핫케이크 믹스 등의 프리믹스분류, 즉석 쥬스, 즉석 커피, 즉석 팥죽, 즉석 수프 등의 즉석식품 등의 각종 식품에의 감미료로서, 또는 미감개량제, 품질개량제 등으로서 유리하게 이용할 수 있다.

본 발명에 따른 α-글루코실 레바우디오사이드 A는 우수한 물리화학적 특성으로 인해, 단독으로 또는 필요에 따라 하나 이상의 기타 감미제, 예를 들면 글루코오스, 수크로오스, 스테비오사이드, 효소처리 스테비오사이드, 기존의 레바우디오사이드 A, 레바우디오사이드 D 또는 E, 에리스리톨, 말티톨, 솔비톨 및 글루시톨 등과 같은 감미제와 혼합하여 다양한 식품의 감미료 조성물로서 사용할 수 있는데, 이때 감미료 조성물의 형태는 분말, 미분, 과립, 결정, 정제 등의 고형물, 수용액, 용액 등의 어떤 형태라도 좋다. 이의 제조방법에 대해서도 특별히 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 감미료 조성물은 그 형태에 따라서 약학적으로 허용되는 담체, 또는 식품에 배합 가능한 담체를 적절히 배합할 수도 있다. 이러한 담체로서는 유당, 포도당, 과당, 설탕 등의 당류; 소르비톨, 에리스리톨, 락티톨, 말티톨, 만니톨, 크실리톨, 환원 파라티노스 등의 당 알코올류; 이소말토올리고당, 갈락토올리고당, 프럭토올리고당 등의 올리고당류; 덱스트린, 셀룰로오스, 아라비아검 및 콘스타치 등의 다당류; 및 물 등을 들 수 있다.

또한, 음식품이나 의약품에 통상 사용되는 향료, 색소, 산미료, 방부제 등을 첨가해도 좋고, 나아가 본 발명의 목적을 저해하지 않는 범위에서 추가로 별개의 감미 성분이나 정미 성분이 아닌 증량제나, 담체 등으로 사용되는 것을 함유할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기의 방법에 따라 제조된 α-글루코실 레바우디오사이드 A를 포함하는 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 α-글루코실 레바우디오사이드 A를 감미료로서 다양한 식품에 첨가하는 경우 식품의 감미질을 개선할 수 있을 뿐 아니라 안정성을 개선할 수 있다.

본 발명에서 식품은, 음료, 캔디, 빙과, 요구르트, 초콜렛 등 감미를 필요로 하는 식품 전반을 의미한다.

이하, 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.

실시예

가. 당전이 효소(글루칸수크라아제)의 준비

류코노스톡 락티스(Leuconostoc lactis) EG001 균주 유래의 글루칸수크라아제를 대장균(DH5α)에서 대량생산하기 위하여, 글루칸수크라아제 유전자를 발현 벡터인 pET-22b(+)의 NcoI-NotI 부위에 삽입하여 재조합 DNA를 제조하였다. 상기 글루칸수크라아제 유전자는 류코노스톡 락티스 EG001 균주의 염색체 DNA를 분리하고, NcoI 사이트에 삽입시킨 서열번호 1의 정방향 프라이머, NotI 사이트에 삽입시킨 서열번호 2의 역방향 프라이머를 제작한 후, 상기 DNA 및 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 증폭함으로써 얻을 수 있었다.

[서열번호 1] : 5'-ATCCATGGATAGTAACCAAAACACAACTGGTT-3'

[서열번호 2] : 5'-ATGCGGCCGCCATATTGACGAGATCACCGTTG-3'

PCR 증폭은 2U Taq polymerase(Solgent사), 10배 polymerase buffer(MgCl₂ 포함) 5㎕, 10 mM dNTP 1㎕, 각 프라이머(2 ㅅM) 5㎕, 주형 DNA(염색체 DNA) 100 ng을 함유하는 PCR 반응용액(50 ㎕)을 준비한 후, 유전자 증폭기를 이용하여 수행하였다.

PCR 반응은 95 ℃에서 5분간 변성(denaturation)을 수행한 후, 95 ℃에서 30초 변성, 55 ℃에서 30초 어닐링(annealing), 72 ℃에서 연장(extension)을 30회 반복하였다. 마지막으로 72 ℃에서 10분 연장을 수행하고, 4 ℃에서 유지시켰다. 상기 방법으로 획득한 PCR 생산물은 pGEM T-easy vector(Promega사)에 cloning 후 NcoI-NotI으로 처리하여 pET-22b(+) expression vector의 NcoI-NotI 부위에 subcloning하여 재조합 벡터를 제조하였다.

글루칸수크라아제의 과잉생산을 위하여, 상기 제조된 재조합 벡터를 대장균[BL21(DE3)](Novagen사)에 도입하였고, 얻어진 형질전환체를 100 ㎕/ml 앰피실린(ampicillin)이 첨가된 LB 액체배지에서 37 ℃에서 16 시간 동안 200 rpm으로 진탕배양하였다. 그 후 0.1 mM IPTG를 첨가하여 20 ℃에서 12 시간 동안 200 rpm으로 진탕배양하여 효소의 과잉생산을 유도하였다. 배양체를 원심분리하여 침전된 균체를 회수하고, 0.85% NaCl로 두 번 세척하였다. 회수된 균체에 1 mM PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride), protease inhibitor cocktail(Roche사) 및 10 mM imidazole이 첨가된 100 mM Tris-Cl(pH 7.4)을 가하여 초음파로 파쇄한 후, 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 상기 상등액은 Ni-NTA agarose를 이용한 크로마토그래피로 정제하였다.

나. α-글루코실 레바우디오사이드 A의 제조

총 부피 20 mL에 상기 가.에서 제조된 글루칸수크라아제 5 mL, 레바우디오사이드 A 80 mM, 설탕 400 mM 및 30 mM의 소듐 아세테이트 완충용액(pH 5.2)를 첨가하여 30 ℃에서 6 시간 동안 반응시켰다.

그 후, 상기 반응물을 90 ℃에서 10 분 동안 가열하여 효소를 실활시킨 후 분리 및 정제를 위해 Diaion HP-20 및 C₁₈ 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 아세토나이트릴 농도구배(0-50%)를 통해 α-글루코실 레바우디오사이드 A를 얻을 수 있었다.

실험예

실험예 1. 당전이 효소(글루칸수크라아제)의 효소 활성 측정

실험예 1-1. 시간 경과에 따른 HPLC 분석

상기 가.에서 제조된 당전이 효소의 활성(당전이 반응)을 측정하기 위한 HPLC 분석 조건은 다음과 같다.

<HPLC 분석조건>

- HPLC: Prominence, Shimadzu, Kyoto, Japan

- 검출기: UV-VIS 검출기 (210 nm)

- 펌프 A, B: LC-20AD

- 유속: 1.0 ml/min

- 칼럼: ZORBAX 300SB-C18 column (5 μm, 4.6 ㅧ 150 mm, USA)

- 시료 주입량: 10 μl

- 칼럼 온도: 30℃

- 이동상 용매 A: H2O

- 이동상 용매 B: Acetonitrile

당전이 효소의 활성은 레바우디오사이드 A에 포도당 1 분자를 결합시켜 α-글루코실 레바우디오사이드 A로 전환되는지를 효소전환반응으로 확인하였다.

특히, 실시예 나.에서의 당전이 산물을 최초 반응 시간으로부터 2 시간 간격으로 HPLC 성분 분석을 실시하였다. 상기 2 시간 간격으로 당전이 산물을 측정한 결과를 도 2에 나타내었다. 상기 도 2에 나타낸 바와 같이, 시간이 경과함에 따라 레바우디오사이드 A(Retention time: 23.931 min)가 α-글루코실 레바우디오사이드(Retention time: 20.996 min)로 전환된 것을 확인할 수 있었다.

실험예 1-2. 당전이 수율

상기 실험 1-1에서의 HPLC 성분 분석을 통해 하기 수학식 1에 따라 당전이 수율을 계산한 결과 본 발명의 실시예에 의한 당전이 수율은 86.35%임을 확인할 수 있었다.

[수학식 1]

당전이 수율(%) = (C - C(Re A))/C × 100

(C: 최초 레바우디오사이드 A의 농도, C(Re A): 최종 레바우디오사이드 A의 농도)

실험예 2. α-글루코실 레바우디오사이드 A의 구조분석

도 3은 실시예에서 얻은 최종 반응 산물을 LC/MS/MS를 통해 분자량을 확인한 결과를 나타낸 것이다. 최종산물의 분자량을 확인하기 위해 Agilent 6410B(Agilent Technology, wilmington, DE, USA)의 ESI source가 장착 된 LC/MS/MS 질량 분석기와 함께 라인에 설치된 Surveyor HPLC를 사용했다. 분리는 역상 컬럼(Agilent XDB_C18, 5 um, 2.0 mm×15 cm)에서 수행 하였다. 주입 부피는 5 μL, 이동상 성분은 A = water, 0.1% formic acid; B = acetonitrile, 0.1% formic acid; Glucosyl stevioside는 20분 동안 0.23 mL/min 유속으로 B buffer 선형 구배(10-100%)에 따라 용출되었다. 이온은 electrospray ionization interface을 사용하여 positive ionization mode에서 생성되었다. Fragmenter 전위는 130 V, interface heater는 300℃, 스캔 범위는 m/z 100에서 1000까지 수행되었다. 상기 도 3을 살펴보면, 레바우디오사이드 A 분자량(M.W. 967.01)에 포도당이 결합하여 α-글루코실 레바우디오사이드 A(M.W. 1129.01)이 합성된 것을 확인할 수 있었다.

실험예 3. α-글루코실 레바우디오사이드 A의 구조분석

핵자기공명(NMR) 스펙트럼 측정법을 통해 상기 실시예에서 얻은 당전이 반응산물의 구조를 분석하여 확인하였다.

상기 반응산물을 20 mg씩 pyridine-d5에 용해시켜 사용하였으며, 이를 핵자기 공명(NMR) 분석을 통하여 ¹H-NMR(도 4 참조), ¹³C-NMR(도 5 참조), 1D-NOESY(도 6 참조), gCOSY(도 7 참조), gHSQCAD(도 8 참조), gHMBC(도 9 참조), 2D-TOCSY(도 10 참조) 스펙트럼을 얻어, 분자구조를 결정하였다.

상기 측정 결과(도 4 내지 도 10)를 분석한 결과, 류코노스톡 락티스 유래의 글루칸수크라아제에 의해 레바우디오사이드 A에 글루코오스가 전이되어, 구체적으로, α-1,6 글루코실 레바우디오사이드 A가 생성되었음을 확인하였다.

실험예 4. α-글루코실 레바우디오사이드 A 수용액의 보존 안정성

농도별로 0.04%(w/v), 0.1%(w/v), 0.5%(w/v), 1%(w/v) 및 2%(w/v)의 레바우디오사이드 A 수용액과 실시예의 α-글루코실 레바우디오사이드 A 수용액 각각을 25 ℃에서 30일 동안 보존하여 안정성 테스트를 진행하였다.

시간 경과별로 각 수용액의 상층액만 취한 뒤 실험예 1-1.의 HPLC 분석 조건으로 상온 안정성을 확인하였다. 도 11a는 상기 α-글루코실 레바우디오사이드 A 수용액의 농도별, 보존기간별 상온 안정성을 나타내는 그래프이고, 도 11b는 레바우디오사이드 A 수용액의 농도별, 보존기간별 상온 안정성을 나타내는 그래프이다. 상기 도 11을 살펴보면, 수용액 상에서 상기 α-글루코실 레바우디오사이드 A가 레바우디오사이드 A보다 더욱 안정하다는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 5. α-글루코실 레바우디오사이드 A 수용액의 pH 및 열 안정성

실험예 5-1. α-글루코실 레바우디오사이드 A 수용액의 pH 안정성

0.04%(w/v)의 레바우디오사이드 A 수용액과 실시예의 α-글루코실 레바우디오사이드 A 수용액 각각을 브리튼-로빈슨 완충액(pH 1.4-10)으로 80 ℃에서 2 시간 동안 건열 반응시킨 후 각 반응산물을 HPLC 분석하였다. 도 12는 레바우디오사이드 A 수용액과 상기 α-글루코실 레바우디오사이드 A 수용액 각각의 pH에 따른 안정성을 나타내는 그래프이다. 상기 도 12를 살펴보면, 수용액 상에서 상기 α-글루코실 레바우디오사이드 A 및 레바우디오사이드 A 모두 pH 1.4에서 pH 10까지 80% 이상의 안정성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 상기 α-글루코실 레바우디오사이드 A가 레바우디오사이드 A보다 더욱 안정하다는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 5-2. α-글루코실 레바우디오사이드 A 수용액의 열 안정성

0.04%(w/v)의 레바우디오사이드 A 수용액과 실시예의 α-글루코실 레바우디오사이드 A 수용액을 각각 40 ℃, 80℃ 및 120 ℃에서 2 시간 동안 건열 반응시킨 후 각 반응산물을 HPLC 분석하였다. 도 13a는 레바우디오사이드 A의 온도에 따른 열 안정성을 나타내는 그래프이고, 도 13b는 상기 α-글루코실 레바우디오사이드 A의 온도에 따른 열 안정성을 나타내는 그래프이다. 상기 도 13을 살펴보면, 레바우디오사이드 A 및 상기 α-글루코실 레바우디오사이드 A 모두 고온에서도 분해되는 물질 없이 열에 안정함을 확인할 수 있었다.

실험예 6. α-글루코실 레바우디오사이드 A의 음료(콜라) 안정성

기포가 제거된 콜라에 레바우디오사이드 A와 실시예의 α-글루코실 레바우디오사이드 A를 각각 0.04%(w/v)의 농도로 첨가하고, 각각의 콜라 시료를 4 ℃, 24 ℃, 40 ℃, 80 ℃에서 48시간 동안 건열 반응시켰다. 그 후, 0 시간, 24 시간, 48 시간마다 상기 시료를 HPLC를 통해 분해 정도를 확인하여 하기 표 1에 나타내었다.

구분	콜라(pH 2.49)에 용해된 상태에서의 안정성
	4 ℃		24 ℃		40 ℃		60 ℃		80 ℃
	24h	48h	24h	48h	24h	48h	24h	48h	24h	48h
레바우디오사이드 A	100	100	100	100	99.77	99.07	88.25	78.54	25.45	7.22
α-글루코실 레바우디오사이드 A	100	100	100	100	99.88	99.21	91.03	82.22	32.55	11.59

상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 콜라에 용해된 상태에서는 레바우디오사이드 A 및 상기 α-글루코실 레바우디오사이드 A 모두 40 ℃ 이상의 온도에서 분해되기 시작하였고, 레바우디오사이드 A에 비해 상기 α-글루코실 레바우디오사이드 A가 더욱 안정함을 확인할 수 있었다.

비록 본 발명이 상기에 언급된 바람직한 실시예로서 설명되었으나, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 또한, 첨부된 특허청구범위는 본 발명의 요지에 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함한다.

<110> Industry Foundation of Chonnam National University <120> Novel alpha-Glucosyl-Rebaudioside A and Method for Preparing The Same <130> HPC-7787 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of forward primer for glucan sucrase <400> 1 atccatggat agtaaccaaa acacaactgg tt 32 <210> 2 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of reverse primer for glucan sucrase <400> 2 atgcggccgc catattgacg agatcaccgt tg 32

Claims (11)

1. 당전이 효소의 존재 하에, 레바우디오사이드 A 및 설탕으로부터 하기 화학식 1로 표시되는 α-글루코실 레바우디오사이드 A를 제조하는 단계;를 포함하되,
   상기 당전이 효소는 글루칸수크라아제이고,
   상기 글루칸수크라아제는 류코노스톡 락티스(Leuconostoc lactis) EG001 균주로부터 얻어지는 것이며,
   상기 α-글루코실 레바우디오사이드 A의 수율이 85% 이상인 것을 특징으로 하는, 수용액 상에서의 안정성이 개선된 α-글루코실 레바우디오사이드 A의 제조방법.
   [화학식 1]
   

   
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 제1항에 있어서,
   상기 당전이 효소는 당전이 효소 유전자를 함유하는 벡터로 형질전환된 재조합 대장균, 바실러스, 효모, 코리네박테리움 또는 아그로박테리움으로부터 생산된 것을 특징으로 하는 α-글루코실 레바우디오사이드 A의 제조방법.
7. 삭제
8. 제1항에 있어서,
   상기 당전이 효소가 설탕의 글루코오스를 상기 레바우디오사이드 A에 전이하는 것을 특징으로 하는 α-글루코실 레바우디오사이드 A의 제조방법.
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제

Images