KR20190002364A

KR20190002364A - 레반수크라아제를 이용한 루부소사이드-프락토사이드의 합성 방법

Info

Publication number: KR20190002364A
Application number: KR1020180075351A
Authority: KR
Inventors: 김도만; 서창섭; 이태경; 탄한; 곽소형; 손규민; 김지수
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2017-06-29
Filing date: 2018-06-29
Publication date: 2019-01-08
Also published as: KR102050863B1

Abstract

본 발명은 레반수크라아제를 루부소사이드-프락토사이드의 합성 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 루부소사이드-프락토사이드는 천연 감미소재로서 기존의 루부소사이드의 항-신생혈관형성(antiangiogenic) 및 항-알러지 효능, 항균, 및 천연용제로 난수용성 소재의 수용화 기능을 유지시키거나 강화시킬 수 있으므로, 기능 화장품 및 식품 소재로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

레반수크라아제를 이용한 루부소사이드-프락토사이드의 합성 방법{SYNTHESIS METHOD OF RUBUSOSIDE-FRUCTOSIDE USING LEVANSUCRASE}

본 발명은 레반수크라아제를 이용한 루부소사이드-프락토사이드의 합성 방법 및 상기 방법에 따라 제조된 루부소사이드-프락토사이드에 관한 것이다. 본 발명에 따른 루부소사이드-프락토사이드는 천연 감미소재로서 기존의 루부소사이드의 항-신생혈관형성(antiangiogenic) 및 항-알러지 효능, 항균, 및 천연용제로 난수용성 소재의 수용화 기능을 유지시키거나 강화시킬 수 있으므로, 기능 화장품 및 식품 소재로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

최근 설탕의 과잉 섭취와 기존의 당류의 다량 섭취로 생기는 충치, 비만, 당뇨병, 성인병 등의 문제점을 보완하기 위해서 생물공학 기술을 통해 천연식품 소재의 새로운 종류의 대체 당질이 개발되고 있다. 천연 고감미료 소재의 주요 시장인 한국·미국(유럽)에서 모두 사용이 가능한 고감미료 소재는 총 8종 성분이 있으며, 이 중 천연 컨셉을 부여 가능한 제품은 단 2종(Stevioside 계열, Mogroside 계열)이 존재 한다. 각 소재의 원료(Stevia Leaf, Luo Han Guo Fruit)의 감미성분 함량, 경작 환경 등을 분석한 결과, 기존의 설탕 혹은 합성감미료와 유사한 단위원가(가공식품에 적용 시 감미료가 차지하는 가격 수준)가 가능한 천연 고감미료 소재는 Stevioside 계열이 유일하다고 알려져 있다.

스테비오사이드는 천연 감미료의 일종으로 설탕에 비하여 저칼로리이며 감미도는 설탕의 약 200-300배로 높아 그의 수요가 급속하게 높아지고 있다. 스테비오사이드는 남미 파라과이가 원산지인 국화과 다년생 초본인 스테비아 레바우디아나 베르토니 (Stevia rebaudiana BERTONI)로부터 추출한 감미성분으로 스테비아의 단맛 성분으로는 스테비오사이드(C38H60O18), 레바우디오사이드 A(C44H70O23), 레바우디오사이드 C, D, E, 둘코사이드 A 등이 알려져 있다. 천연 감미료로서 전세계적으로 사용되고 있는 스테비아는 미국의 식품음료산업에서 빠르게 성장하고 있으며, 미국식품의약국(FDA)에 의해 주요 식품원료 중 하나로 선정되었다. 각각의 성분은 모두 diterpene계 물질인 Steviol에 다양한 형태의 당(포도당, 만노스)이 결합된 형태에 따라서 분류되며, 각각의 물질은 조금씩 다른 감미도 및 미질을 가지는 것으로 알려져 있다. 상대적으로 Stevioside에 비하여 Rebaudioside 계열의 구조가 보다 미질이 우수한 것으로 알려져있다. 하지만, 스테비오사이드는 뒷맛이 오래 남으며 단맛 이외에 쓴맛, 불쾌감, 낮은 수용성 등이 있는 단점을 지니고 있으며, 그로 인해 사용량 및 용도의 한계가 발생하는 문제점이 있어 스테비오사이드의 미질을 개선할 필요가 있다. 현재의 스테비오사이드의 감미질 개선 방법은 (1) 설탕, 포도당, 과당 등과 같은 천연 당질 감미료를 1종 또는 그 이상을 첨가하는 방법, (2) 아미노산 또는 아미노산의 염과 배합하는 방법, (3) 싸이클로덱스트린과 같이 포접능을 갖는 환형 당질에 물리적으로 결합시키는 방법 등이 있다. 그러나 이상의 방법은 첨가물을 상당히 많은 양을 첨가하여야 하며 결국 스테비오사이드가 저칼로리 감미료라는 특징을 잃어버리는 단점이 있다.

선행문헌

1. 대한민국 등록특허 제10-0453576호

본 발명은 레반수크라아제를 이용한 루부소사이드-프락토사이드의 합성 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 또한 상기 방법에 따라 제조된 루부소사이드-프락토사이드를 제공하는 것을 목적으로 한다.

제1구현예에 따르면,

본 발명은 레반수크라아제를 이용한 루부소사이드-프락토사이드의 합성 방법을 제공하고자 하는 것으로, 상기 방법은:

(A) 레반수크라아제를 수크로오스의 존재 하에서 루부소사이드와 반응시키는 단계; 및

(B) 상기 수용체 반응에 의해 생성된 루부소사이드-프락토사이드를 회수하는 단계를 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "레반수크라아제(levansucrase)" 는 수크로오스로부터 레반을 합성하는 효소를 의미한다.

상기 레반수크라아제의 수크로오스에 대한 반응기작은 다음과 같다:

수크로오스→프락탄 + 글루코오스 + 케스토오스 + 니스토오스 + 프락토오스

본 발명은 레반수크라아제를 이용한 루부소사이드-프락토사이드의 합성 방법에 있어서, 상기 레반수크라아제는 류코노스톡속(Leuconostoc) 균주, 바실러스속(Bacillus) 균주 또는 아스퍼질러스속(Aspergillus) 균주로부터 유래할 수 있다. 상기 류코노스톡속 균주는 류코노스톡 김치아이(Leuconostoc kimchii), 류코노스톡 시트리움(Leuconostoc citreum), 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides), 류코노스톡 가시코미타툼(Leuconostoc gasicomitatum) 및 류코노스톡 락티스(Leuconostoc lactis)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상으로부터 유래한 것일 수도 있다. 상기 바실러스속 균주는 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 푸미루스(Bacillus pumilus), 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis) 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상으로부터 유래한 것일 수도 있다. 상기 아스퍼질러스속 균주는 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 아스퍼질러스 오리제(Aspergillus oryzae) 및 아스퍼질러스 테르레우스(Aspergillus terreus)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상으로부터 유래한 것일 수도 있다.

본 발명은 레반수크라아제를 이용한 루부소사이드-프락토사이드의 합성 방법에 있어서, 상기 루부소사이드의 농도는 150 nM 내지 300 nM, 바람직하기는 200 nM 내지 250 nM일 수 있다.

본 발명은 레반수크라아제를 이용한 루부소사이드-프락토사이드의 합성 방법에 있어서, 상기 수크로오스의 농도는 500 nM 내지 1000 nM, 바람직하기는 700 nM 내지 800 nM 일 수 있다.

본 발명은 레반수크라아제를 이용한 루부소사이드-프락토사이드의 합성 방법에 있어서, 상기 레반수크라아제의 농도는 10 U/mL 내지 30 U/mL, 바람직하기는 20 U/mL 내지 25 U/mL 일 수 있다.

제2구현예에 따르면,

본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 루부소사이드-프락토사이드를 제공하고자 하는 것으로, 상기 루부소사이드-프락토사이드는 하기의 화학식 1 또는 2를 가질 수 있다.

[화학식 1]

[화학식 2]

본 발명에 따른 루부소사이드-프락토사이드는 천연 감미소재로서 기존의 루부소사이드의 항-신생혈관형성(antiangiogenic) 및 항-알러지 효능, 항균, 및 천연용제로 난수용성 소재의 수용화 기능을 유지시키거나 강화시킬 수 있으므로, 기능 화장품 및 식품 소재로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 실시예 1에 따른 루부소사이드-프락토사이드 반응액의 당 제거 전의 TLC 결과를 나타낸다. (래인 A - 루부소사이드 및 설탕 혼합물, 래인 B - 효소와 설탕간의 반응, 래인 C - 효소와 루부소사이드의 반응, 레인 D - 효소와 설탕, 루부소사이드의 반응)
도 2는 본 발명의 실시예 1에 따른 루부소사이드-프락토사이드 반응액의 당 제거 후의 TLC 결과를 나타낸다. (래인 Glc - 포도당, 래인 Ru - 루부소사이드, 래인 Ru-Fs - 효소 반응 직후 루부소사이드-프락토사이드, 래인 Ru-Fs 당제거 - 단당, 올리고당, 다당 제거 후의 루부소사이드-프락토사이드)
도 3은 루부소사이드-프락토사이드의 MPLC-ELSD 결과 및 상기 MPLC-ELSD 결과로부터 확인된 단일 peak에 대한 TLC 결과를 나타낸다. (래인 Glc - 포도당, 래인 Ru - 루보소사이드, 래인 Ste Mix - 스테비올 배당체 혼합물, 래인 Ru-Fs - 효소 반응 직후 루부소사이드-프락토사이드, 래인 Ru-Fs 수용체 반응 후 단당, 올리고당, 다당 제거 후의 루부소사이드-프락토사이드, 래인 2 ~ 6 - 분리 된 루부소사이드, 래인 7 ~ 9 - 분리 된 루부소사이드-프락토사이드 1, 래인 40 ~ 42 - 정제된 루부소사이드-프락토사이드 2, 래인 45 - 정제 된 루부소사이드 과당 배당체 3)
도 4는 본 발명의 실시예 1에 따른 정제된 루부소사이드-프락토사이드 1 및 루부소사이드-프락토사이드 2의 MALDI-TOF 분석에 따른 분자량 결정 결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 실시예 2에 따른 루부소사이드-프락토사이드 및 Diaion HP-20 resin을 이용한 단당류 제거 후 TLC 분석 결과를 나타낸다.((A) Ru-Frc 1~4 합성된 루부소사이드-프락토사이드와 MALDI-TOF를 이용한 루부소사이드-프락토사이드 혼합물의 분자량 확인 (B) Ru : 루부소사이드, Glc : 포도당, 1 : 수용체 반응 직후, 2 : 수용체 반응 직후 90% 에탄올로 고분자 제거한 직후의 시료, 3 : 수용체 반응을 시킨 뒤 고분자와 단당 및 이당류를 제거한 후)
도 6은 본 발명의 실시예 2에 따른 루부소사이드-프락토사이드의 MALDI-TOF를 이용한 분자량 확인 결과를 나타낸다. (A, Ru-Frc1; B, Ru-Frc2; C, Ru-Frc3; D, Ru-Frc4)
도 7은 본 발명의 실시예 2에 따른 루부소사이드-프락토사이드의 RSM 프로그램(Design Expert 10 program (Stat-Ease, Inc. USA)을 이용한 수용체 반응의 최적화 조건을 나타낸다.
도 8은 본 발명의 실시예 3에 따른 루부소사이드-프락토사이드의 정제 결과를 나타낸다.
도 9는 본 발명의 실시예 3에 따른 루부소사이드-프락토사이드의 NMR (850MHz) 분석 도표를 나타낸다.

이하, 발명의 이해를 돕기 위해 다양한 실시예를 제시한다. 하기 실시예는발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 발명의 보호범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 >

실시예 1. 루부소사이드 - 프락토사이드의 제조

1-1. 레반수크라아제 M1FT 효소액의 제조

레반수크라아제 유전자를 함유하는 플라스미드를 가지는 대장균[E. coli]을 암피실린이 함유된 LB 액체 배지 1L에 A600 [0090] 값이 0.5에 도달할 때까지 37℃에서 교반하면서 배양하였다. 여기에 400 μM 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드를 첨가하여 16℃에서 18시간 동안 진탕 배양하였다. 배양이 끝난 후 세포는 원심분리(8,000xg, 4℃ 에서 10분)를 통해 회수하고, 50 μl의 β-머캅토에탄올(BME)을 첨가한 용해(lysis) 완충 용액(50 ml, 조성: 50 mM Tris-HCl, 25 mM NaCl, pH 8.0)에서 재현탁하였다. 현탁된 세포는 초음파 파쇄기(Ultrasonic processor 250, Sonics and Materials, Inc., CT, USA; output 4, duty cycle 50%, 얼음 속에서 30 초, 25번 반복)를 이용하여 파쇄하였다. 파쇄 후 원심분리를 실시한 후, 봉입체(inclusion body)를 함유한 펠렛을 50 μl의 BME가 첨가된 0.1M Tris(pH 10) 완충 용액에 다시 세척하였다. 상기 펠렛을 8M의 요소 용액(100 mM Tris-HCl pH 10, 1 mM EDTA, 1mM 글리신 용액에 녹임)에 재현탁시키고, 초음파 파쇄기로 세포를 파쇄한 후, 35 μl의 BME를 첨가하였다. 이 현탁액을 4℃에서 18 시간 보관 후, 4℃에서 23,000xg 속도로 30 분간 원심분리하였다. 원심분리 후 상등액을 얻고, 단백질은 분석에 이용될 때까지 영하 20℃에서 보관하였다.

1-2. 수용체 반응

효소로서 상기에서 제조된 레반수크라아제를 사용하고 루보소사이드를 직접 정제하여 사용하였다. 스테비오사이드를 효소적 처리 하여, MPLC로 정제하였다.

(1) 효소적 배당체 합성

효소 반응은 기질로 루보소사이드 50 mM, 설탕 500 mM, phosphate buffer 50mM(pH 6.5), 효소농도 6 U/mL로 수행하였다. pH는 K2HPO4와 KH2PO4 를 적정비 혼합하여 사용하였으며, 37 ℃의 온도 조건에서 반응시켰다.

(2) TLC(Thin layer chromatogram)를 이용한 배당체 합성 확인

nitromethan:n-propyl:water = 2:5:1.5 (v/v) 및 acetonitrile:water = 85:15 (v/v)로 1회 올린 후, 0.3% (w/v) N-(1-naphthyl)-ethylenediamine and 5% (v/v) H2SO4 in methanol 용액으로 코팅 후 125 ℃에서 5분 동안 황산 발색 시켰다.

(3) 루부소사이드 배당체 이외, 단당, 올리고당 및 다당의 제거

루보소사이드-과당 배당체 반응액:에탄올=1:9 (v/v)의 비율로 혼합하여, 다당 및 올리고당을 제거하였다. 다당 및 올리고당이 제거된 산물은 evaporator를 이용하여 에탄올을 증발시켜 농축시켰다. 농축한 루보소사이드-과당 배당체 산물의 단당 제거 및 루보소사이드-과당 배당체 회수를 위해 Diaion HP-2O 레진에 로딩하였다. 단당을 제거하기 위해 물을 이용하여 elution 후 단당이 제거된 레진에 80%의 에탄올 농도로 다시 elution을 하여 루부소사이드-프락토사이드 배당체를 획득하였다.

(4) 루부소사이드 배당체의 분리 및 정제

루부소사이드-프락토사이드 배당체 산물은 Reveleris 아미노 플래시 카트리지 컬럼 (40 g)을 사용하여 MPLC-ELSD 장치로 분리 및 정제하였다. 분당 40 mL의 유속으로 99% Acetonitrile을 1 시간에 걸쳐 10%까지 서서히 낮추고, ELSD 장치에 검출되는 시료를 순차적으로 회수하였다.

1-3. 결과

(1) 루부소사이드-프락토사이드 배당체 반응액의 당 제거 전 및 당 제거 후의 TLC 결과를 각각 도 1 및 도 2에 나타내었으며, 이로부터 레반수크라아제를 이용하여 루부소사이드의 배당체가 합성되며, 중합도도 다양하게 형성됨을 확인하였다.

(2) 루부소사이드-프락토사이드 배당체의 MPLC-ELSD 결과 및 상기 MPLC-ELSD 결과 로부터 확인된 단일 peak에 대한 TLC 결과를 도 3에 나타내었으며, 이로부터 루부소사이드-프락토사이드 배당체는 여러 중합도를 갖는 단일 산물임이 확인되었다.

(3) 정제된 루부소사이드-프락토사이드 배당체 1 및 루부소사이드-프락토사이드 배당체 2의 의 MALDI-TOF 분석에 따른 분자량 결정 결과를 도 4에 나타내었으며, 827.6023, 989.6858의 분자량 확인하여 루부소사이드(666.5190)에 과당이 각 1개 및 2개 결합한 수용체 임을 확인하였다.

실시예 2. 루부소사이드 - 프락토사이드의 수용체 반응 결과

(1) 루부소사이드-프락토사이드의 수용체 반응 결과 및 분자량 측정

상기 실시예에서 합성된 루부소사이드-프락토사이드 및 Diaion HP-20 resin을 이용한 단당류 제거 후의 푸부소사이드-프락토사이드의 TLC 분석를 수행하고 이를 도 5에 나타내었다. 또한, MALDI-TOF 분석에 따른 분자량 측정 결과를 도 6에 나타내었다. 그 결과, 과당 전이 효소와 반응 이후, 루부소사이드-프락토사이드가 형성됨이 확인되었으며단당, 올리고당, 다당의 제거 이후 고 순도의 루부소사이드-배당체 형성될 수 있음이 확인되었다.

(2) 수용체 반응의 최적화

루부소사이드 농도, 수크로오즈 농도 및 효소 (레반수크라아제) 농도에 다른 수용체 반응의 최적 조건을 확인하고 이를 도 7에 나타내었다. 그 결과, 219 mM 루부소사이드, 723 mM 수크로오즈 및 23 U/mL 레반수크라제 조건에서 최고 33%의 전환율을 나타내는 것으로 확인되었다.

실시예 3. 루부소사이드 - 프락토사이드의 구조 확인

(1) 루부소사이드-프락토사이드의 정제

하기의 표 1에 따른 조건을 이용하여 루부소사이드-프락토사이드 배당체를 정제하고, 이를 도 8에 나타내었다.

[표 1]

(2) 루부소사이드-프락토사이드의 구조 분석

상기 정제된 루부소사이드-프락토사이드의 NMR (850MHz) 분석 도표를 도 9에 나타내었으며, 이에 따라 정제된 루부소사이드-프락토사이드의 구조는 하기와 같다:

[화학식 1] Ru-Frc 1 (Fructosyl-rubusoside 1); 13-O-[β-fructofuranosyl-(2→6)-β-D-glucosyl]-19-O-β-D-glucosyl-steviol

[화학식 2] Ru-Frc 2 (Fructosyl-rubusoside 2); 13-O-β-D-glucosyl-19-O-[β-fructofuranosyl-(2→6)-β-D-glucosyl-steviol

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

(A) 레반수크라아제를 수크로오스의 존재 하에서 루부소사이드와 반응시키는 단계; 및
(B) 상기 수용체 반응에 의해 생성된 루부소사이드-프락토사이드를 회수하는 단계를 포함하는, 루부소사이드-프락토사이드의 합성 방법.
제1항에 있어서,
상기 레반수크라아제는 류코노스톡속(Leuconostoc) 균주, 바실러스속(Bacillus) 균주 또는 아스퍼질러스속(Aspergillus) 균주로부터 유래하는 것을 특징으로 하는 것인, 방법.
제1항에 있어서,
상기 루부소사이드의 농도는 200 nM 내지 2500 nM인 것을 특징으로 하는 것인, 방법.
제1항에 있어서,
상기 수크로오스의 농도는 700 nM 내지 800 nM인 것을 특징으로 하는 것인, 방법.
제1항에 있어서,
상기 레반수크라아제의 농도는 20 U/mL 내지 25 U/mL인 것을 특징으로 하는 것인, 방법.
제1항에 있어서,
상기 루부소사이드, 수크로오즈 및 레반수크라제의 농도는 각각 219 mM, 723 mM 및 23 U/mL인 것을 특징으로 하는 것인, 방법.
제1항 내지 제6항에 따른 방법에 의해 제조된 기의 화학식 1 또는 2를 갖는 루부소사이드-프락토사이드.
[화학식 1]

[화학식 2]