KR20200132940A

KR20200132940A - 고-순도 스테비올 글리코사이드

Info

Publication number: KR20200132940A
Application number: KR1020207029496A
Authority: KR
Inventors: 아베틱 마르코스얀; 사라바난 에이/엘 라만다흐; 빈 하심 모하마드 아프잘; 빈 나위 카이룰 니잠; 시우 인 초우; 시다르타 푸르카야스타; 마르시아 페티트
Original assignee: 퓨어써클 유에스에이 잉크.
Priority date: 2018-03-16
Filing date: 2019-03-15
Publication date: 2020-11-25
Also published as: BR112020018972A2; CN112513059A; JP2021518163A; EP3765472A4; JP2024033006A; AU2024201079A1; WO2019178541A1; JP7432533B2; AU2019236279A1; EP3765472A1; AU2019236279B2; CA3094205A1; MX2020009635A

Abstract

고도로 정제된 레바우디오사이드 AM를 사용하는 방법이 기술된다. 상기 방법은 다양한 출발 조성물을 표적 스테비올 글리코사이드로 전환시키기 위한 효소 제제 및 재조합 미생물의 사용을 포함한다. 고도로 정제된 레바우디오사이드 AM는 식용 및 저작 조성물 가령 음료, 과자류, 베이커리 제품, 쿠키, 및 츄잉검에서 풍미 증가제, 감미 증가제, 및 거품 억제제로서 유용하다.

Description

고-순도 스테비올 글리코사이드

본발명은 고도로 정제된 스테비올 글리코사이드 조성물을 포함하는 스테비올 글리코사이드를 포함하는 조성물, 및 이를 제조하는 공정에 관한 것이다.

고강도 감미제는 수크로스의 감미 수준보다 훨씬 큰 감미 수준을 가진다. 고강도 감미제는 본질적으로 비-칼로리이고, 식품 및 음료를 포함하는 다이어트 및 감소-칼로리 제품에서 흔히 사용된다. 고강도 감미제는 혈당 반응을 유도하지 않고, 당뇨병 및 탄수화물 섭취에 대한 제한이 중요한 기타 병을 표적으로 하는 제품에서의 사용에 적합하도록 한다.

스테비올 글리코사이드는 남미의 특정 영역이 원산지인 Asteraceae (Compositae) 군의 스테비아 (Stevia rebaudiana Bertoni)의 잎에서 발견되는 화합물의 부류이다. 스테비올 글리코사이드는 위치 C13 및 C19에서 탄수화물 잔기의 존재가 다른, 단일 염기, 스테비올을 구조적으로 특징으로 한다. 스테비올 글리코사이드는 총 건조 중량의 대략 10% - 20%을 구성하는 스테비아 잎 내에 축적된다. 건조 중량 기준으로, 스테비아 잎 내에서 발견되는 4개의 주요 글리코사이드는 대표적으로 스테비오사이드 (9.1%), 레바우디오사이드 A (3.8%), 레바우디오사이드 C (0.6-1.0%) 및 둘코사이드 A (0.3%)을 포함한다. 다른 공지된 스테비올 글리코사이드는 레바우디오사이드 B, C, D, E, F 및 M, 스테비올바이오사이드 및 루부소사이드를 포함한다.

스테비아 (Stevia rebaudiana)로부터 스테비올 글리코사이드를 제조하는 방법이 공지되어 있지만, 많은 이들 방법은 상업적으로 사용에 부적합하다.

따라서, 고도로 정제된 스테비올 글리코사이드 조성물을 포함하는 스테비올 글리코사이드를 포함하는 조성물을 제조하는 단순하고, 효율적이고 경제적인 방법에 대한 필요가 남아 있다.

발명의 요약

본발명은 유기 기질을 포함하는 출발 조성물을 미생물 세포 및/또는 효소 제제와 접촉시켜, 표적 스테비올 글리코사이드를 포함하는 조성물을 제조하는 것에 의해 표적 스테비올 글리코사이드를 포함하는 조성물을 제조하는 공정을 제공한다.

출발 조성물은 적어도 하나의 탄소 원자를 포함하는 임의의 유기 화합물일 수 있다. 하나의 구체예에서, 출발 조성물은 스테비올 글리코사이드, 폴리올 또는 당 알콜, 다양한 탄수화물로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

표적 스테비올 글리코사이드는 임의의 스테비올 글리코사이드일 수 있다. 하나의 구체예에서, 표적 스테비올 글리코사이드는 스테비올모노사이드, 스테비올모노사이드 A, 스테비올바이오사이드, 스테비올바이오사이드 A, 스테비올바이오사이드 B, 루부소사이드, 스테비오사이드, 스테비오사이드 A (레바우디오사이드 KA), 스테비오사이드 B, 스테비오사이드 C, 레바우디오사이드 E, 레바우디오사이드 E2, 레바우디오사이드 E3, 레바우디오사이드 AM 또는 합성 스테비올 글리코사이드이다.

하나의 구체예에서, 표적 스테비올 글리코사이드는 레바우디오사이드 AM이다.

일부 바람직한 구체예에서, 출발 조성물을 표적 스테비올 글리코사이드로 전환가능한 하나 이상의 효소, 또는 하나 이상의 효소를 포함하는 미생물 세포를 포함하는 효소 제제가 사용된다. 효소는 세포 표면 및/또는 내에 위치할 수 있다. 효소 제제는 전체 세포 현탁액, 미정제 용해물의 형태 또는 정제된 효소(들)로서 제공될 수 있다. 효소 제제는 유리 형태 또는 무기 또는 유기 재료로부터 제조된 고체 지지체에 고정될 수 있다.

일부 구체예에서, 미생물 세포는 그의 출발 조성물을 표적 스테비올 글리코사이드로 전환시키기 위한 필요한 효소 및 이를 암호화하는 유전자를 포함한다. 따라서, 본발명은 유기 기질을 포함하는 출발 조성물을 출발 조성물을 표적 스테비올 글리코사이드로 전환가능한 적어도 하나의 효소를 포함하는 미생물 세포와 접촉시켜, 적어도 하나의 표적 스테비올 글리코사이드를 포함하는 배지를 제조하는 것에 의해 표적 스테비올 글리코사이드를 포함하는 조성물을 제조하는 공정을 또한 제공한다.

출발 조성물을 표적 스테비올 글리코사이드로 전환시키기 위해 필요한 효소는 스테비올 생합성 효소, UDP-글루코실트랜스퍼라제 (UGTs) 및/또는 UDP-재생 효소를 포함한다.

하나의 구체예에서, 스테비올 생합성 효소는 메발로네이트 (MVA) 경로 효소를 포함한다.

또다른 구체예에서 스테비올 생합성 효소는비-메발로네이트 2-C-메틸-D-에리쓰리톨-4-포스페이트 경로 (MEP/DOXP) 효소를 포함한다.

하나의 구체예에서 스테비올 생합성 효소는 게라닐게라닐 디포스페이트 신타제, 코팔릴 디포스페이트 신타제, 카우렌 신타제, 카우렌 옥시다제, 카우렌산 13??히드록실라제 (KAH), 스테비올 신테타제, 데옥시자일루로스 5-포스페이트 신타제 (DXS), D-1-데옥시자일루로스 5-포스페이트 리덕토이소머라제 (DXR), 4-디포스포시티딜-2-C-메틸-D-에리쓰리톨 신타제 (CMS), 4-디포스포시티딜-2-C-메틸-D-에리쓰리톨 키나제 (CMK), 4-디포스포시티딜-2-C-메틸-D-에리쓰리톨 2,4- 시클로디포스페이트 신타제 (MCS), l-히드록시-2-메틸-2(E)-부테닐 4-디포스페이트 신타제 (HDS), l-히드록시-2-메틸-2(E)-부테닐 4-디포스페이트 리덕타제 (HDR), 아세토아세틸-CoA 티올라제, 절단된 HMG-CoA 리덕타제, 메발로네이트 키나제, 포스포메발로네이트 키나제, 메발로네이트 피로포스페이트 데카복실라제, 시토크롬 P450 리덕타제 등을 포함하는 그룹으로부터 선택된다.

UDP-글루코실트랜스퍼라제는 적어도 하나의 글루코오스 유닛을 스테비올 및/또는 스테비올 글리코사이드 기질에 부가가능하여 표적 스테비올 글리코사이드를 제공하는 임의의 UDP-글루코실트랜스퍼라제일 수 있다.

이하에서 사용된, 용어 "SuSy_AT"는, 다르게 특정되지 않는다면, 실시예 1에서 기술된 바와 같은 아미노-산 서열 "SEQ ID 1"를 갖는 수크로스 신타제를 지칭한다.

이하에서 사용된, 용어 "UGTSl2"는, 다르게 특정되지 않는다면, 실시예 1에서 기술된 바와 같은 아미노-산 서열 "SEQ ID 2"를 갖는 UDP-글루코실트랜스퍼라제를 지칭한다.

이하에서 사용된, 용어 "UGT76G1"는, 다르게 특정되지 않는다면, 실시예 1에서 기술된 바와 같은 아미노-산 서열 "SEQ ID 2"를 갖는 UDP-글루코실트랜스퍼라제를 지칭한다.

하나의 구체예에서, 스테비올 생합성 효소 및 UDP-글루코실트랜스퍼라제가 미생물 세포에서 생성된다. 미생물 세포는 예를 들어, 대장균 (E. coli), 사카로미세스 (saccharomyces) 종, 아스퍼질러스 (Aspergillus) 종, 피키아 (Pichia) 종, 바실러스 (Bacillus) 종, 야로위아 (Yarrowia) 종 등일 수 있다. 또다른 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제가 합성된다.

하나의 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 이들 폴리펩티드에 상당한 (>85%, >86%, >87%, >88%, >89%, >90%, >91%, >92%, >93%, >94%, >95%, >96%,>97%, >98%, >99%) 아미노-산 서열 동일성을 갖는 UGT74G1, UGT85C2, UGT76G1, UGT91D2, UGTSl2, EUGT11 및 UGTs, 또한 이들 UGTs를 암호화하는 분리된 핵산 분자를 포함하는 그룹으로부터 선택된다.

하나의 구체예에서, 스테비올 생합성 효소, UGTs 및 UDP-글루코오스 재생 시스템은 하나의 미생물 (미생물 세포) 내에 존재한다. 미생물은 예를 들어, 대장균 (E. coli), 사카로미세스 (saccharomyces) 종, 아스퍼질러스 (Aspergillus) 종, 피키아 (Pichia) 종, 바실러스 (Bacillus) 종, 야로위아 (Yarrowia) 종일 수 있다.

하나의 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 적어도 하나의 글루코스 유닛을 C13에서, -OH 기능성 기를 보유하는 스테비올 또는 임의의 출발 스테비올 글리코사이드에 부가가능하여 C13에서, O-글루코오스 베타 글루코피라노사이드 글리코사이드 연결을 갖는 표적 스테비올 글리코사이드를 생성하는 임의의 UDP-글루코실트랜스퍼라제이다. 특정의 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 UGT85C2, 또는 UGT85C2와 >85% 아미노-산 서열 동일성을 갖는 UGT이다.

또다른 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 적어도 하나의 글루코스 유닛을 C19에서, -COOH 기능성 기를 보유하는 스테비올 또는 임의의 출발 스테비올 글리코사이드에 부가가능하여 C19에서, -COO-글루코오스 베타-글루코피라노사이드 글리코사이드 연결을 갖는 표적 스테비올 글리코사이드를 생성하는 임의의 UDP-글루코실트랜스퍼라제이다. 특정의 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 UGT74G1, 또는 UGT74G1와 >85% 아미노-산 서열 동일성을 갖는 UGT이다.

또다른 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 임의의 출발 스테비올 글리코사이드의 C19에서 적어도 하나의 글루코오스 유닛을 기존의 글루코오스에 부가가능하여 적어도 하나의 부가적 글루코오스를 갖는 새로 형성된 글리코사이드 결합(들)에서 적어도 하나의 베타 1→2 글루코피라노사이드 글리코사이드 연결(들)을 보유하는 표적 스테비올 글리코사이드를 생성하는 임의의 UDP-글루코실트랜스퍼라제이다. 특정의 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 UGTSl2, 또는 UGTSl2와 >85% 아미노-산 서열 동일성을 갖는 UGT이다. 또다른 특정의 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 EUGT11, 또는 EUGT11와 >85% 아미노-산 서열 동일성을 갖는 UGT이다. 역시 또다른 특정의 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 UGT91D2, 또는 UGT91D2와 >85% 아미노-산 서열 동일성을 갖는 UGT이다.

또다른 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 임의의 출발 스테비올 글리코사이드의 C19에서 적어도 하나의 글루코오스 유닛을 기존의 글루코오스에 부가가능하여 적어도 하나의 부가적 글루코오스를 갖는 새로 형성된 결합 글리코사이드 결합(들)에서 적어도 하나의 베타 1→3 글루코피라노사이드 글리코사이드 연결(들)을 보유하는 표적 스테비올 글리코사이드를 생성하는 임의의 UDP-글루코실트랜스퍼라제이다. 특정의 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 UGT76G1, 또는 UGT76G1와 >85% 아미노-산 서열 동일성을 갖는 UGT이다.

또다른 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 임의의 출발 스테비올 글리코사이드의 C13에서 적어도 하나의 글루코오스 유닛을 기존의 글루코오스에 부가가능하여 적어도 하나의 부가적 글루코오스를 갖는 새로 형성된 글리코사이드 결합(들)에서 적어도 하나의 베타 1→2 글루코피라노사이드 글리코사이드 연결(들)을 보유하는 표적 스테비올 글리코사이드를 생성하는 임의의 UDP-글루코실트랜스퍼라제이다. 특정의 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 UGTSl2, 또는 UGTSl2와 >85% 아미노-산 서열 동일성을 갖는 UGT이다. 또다른 특정의 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 EUGT11, 또는 EUGT11와 >85% 아미노-산 서열 동일성을 갖는 UGT이다. 역시 또다른 특정의 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 UGT91D2, 또는 UGT91D2와 >85% 아미노-산 서열 동일성을 갖는 UGT이다.

하나의 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 적어도 하나의 글루코오스 유닛을 스테비올에 부가가능하여 스테비올모노사이드를 형성하는 임의의 UDP-글루코실트랜스퍼라제이다. 특정의 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 UGT85C2 또는 UGT85C2와 >85% 아미노-산 서열 동일성을 갖는 UGT 또는 UGT85C2와 >85% 아미노-산 서열 동일성을 갖는 UGT이다.

또다른 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 적어도 하나의 글루코오스 유닛을 스테비올에 부가가능하여 스테비올모노사이드 A를 형성하는 임의의 UDP-글루코실트랜스퍼라제이다. 특정의 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 UGT74G1 또는 UGT74G1와 >85% 아미노-산 서열 동일성을 갖는 UGT이다.

또다른 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 적어도 하나의 글루코오스 유닛을 스테비올모노사이드 A에 부가가능하여 스테비올바이오사이드 B를 형성하는 임의의 UDP-글루코실트랜스퍼라제이다. 특정의 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 UGT76G1 또는 UGT76G1와 >85% 아미노-산 서열 동일성을 갖는 UGT이다.

또다른 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 적어도 하나의 글루코오스 유닛을 스테비올모노사이드 A에 부가가능하여 스테비올바이오사이드 A를 형성하는 임의의 UDP-글루코실트랜스퍼라제이다. 특정의 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 UGTSl2 또는 UGTSl2와 >85% 아미노-산 서열 동일성을 갖는 UGT이다. 또다른 특정의 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 EUGT11, 또는 EUGT11와 >85% 아미노-산 서열 동일성을 갖는 UGT이다. 역시 또다른 특정의 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 UGT91D2, 또는 UGT91D2와 >85% 아미노-산 서열 동일성을 갖는 UGT이다.

또다른 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 적어도 하나의 글루코오스 유닛을 스테비올모노사이드 A에 부가가능하여 루부소사이드를 형성하는 임의의 UDP-글루코실트랜스퍼라제이다. 특정의 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 UGT85C2, 또는 UGT85C2와 >85% 아미노-산 서열 동일성을 갖는 UGT이다.

또다른 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 적어도 하나의 글루코오스 유닛을 스테비올모노사이드에 부가가능하여 루부소사이드를 형성하는 임의의 UDP-글루코실트랜스퍼라제이다. 특정의 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 UGT74G1 또는 UGT74G1와 >85% 아미노-산 서열 동일성을 갖는 UGT이다.

또다른 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 적어도 하나의 글루코오스 유닛을 스테비올모노사이드에 부가가능하여 스테비올바이오사이드를 형성하는 임의의 UDP-글루코실트랜스퍼라제이다.

또다른 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 적어도 하나의 글루코오스 유닛을 스테비올바이오사이드 B에 부가가능하여 스테비오사이드 B를 형성하는 임의의 UDP-글루코실트랜스퍼라제이다. 특정의 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 UGT85C2 또는 UGT85C2와 >85% 아미노-산 서열 동일성을 갖는 UGT이다.

또다른 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 적어도 하나의 글루코오스 유닛을 스테비올바이오사이드 B에 부가가능하여 스테비오사이드 C를 형성하는 임의의 UDP-글루코실트랜스퍼라제이다. 특정의 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 UGTSl2 또는 UGTSl2와 >85% 아미노-산 서열 동일성을 갖는 UGT이다. 또다른 특정의 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 EUGT11, 또는 EUGT11와 >85% 아미노-산 서열 동일성을 갖는 UGT이다. 역시 또다른 특정의 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 UGT91D2, 또는 UGT91D2와 >85% 아미노-산 서열 동일성을 갖는 UGT이다.

또다른 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 적어도 하나의 글루코오스 유닛을 스테비올바이오사이드 A에 부가가능하여 스테비오사이드 A를 형성하는 임의의 UDP-글루코실트랜스퍼라제이다. 특정의 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 UGT85C2 또는 UGT85C2와 >85% 아미노-산 서열 동일성을 갖는 UGT이다.

또다른 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 적어도 하나의 글루코오스 유닛을 스테비올에 부가가능하여바이오사이드 A 스테비오사이드 C를 형성하는 임의의 UDP-글루코실트랜스퍼라제이다. 특정의 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 UGT76G1 또는 UGT76G1와 >85% 아미노-산 서열 동일성을 갖는 UGT이다.

또다른 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 적어도 하나의 글루코오스 유닛을 루부소사이드에 부가가능하여 스테비오사이드 B를 형성하는 임의의 UDP-글루코실트랜스퍼라제이다. 특정의 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 UGT76G1 또는 UGT76G1와 >85% 아미노-산 서열 동일성을 갖는 UGT이다.

또다른 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 적어도 하나의 글루코오스 유닛을 루부소사이드에 부가가능하여 스테비오사이드 A (레바우디오사이드 KA)를 형성하는 임의의 UDP-글루코실트랜스퍼라제이다. 특정의 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 UGTSl2 또는 UGTSl2와 >85% 아미노-산 서열 동일성을 갖는 UGT이다. 또다른 특정의 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 EUGT11, 또는 EUGT11와 >85% 아미노-산 서열 동일성을 갖는 UGT이다. 역시 또다른 특정의 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 UGT91D2, 또는 UGT91D2와 >85% 아미노-산 서열 동일성을 갖는 UGT이다.

또다른 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 적어도 하나의 글루코오스 유닛을 루부소사이드에 부가가능하여 스테비오사이드를 형성하는 임의의 UDP-글루코실트랜스퍼라제이다.

또다른 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 적어도 하나의 글루코오스 유닛을 스테비올바이오사이드에 부가가능하여 스테비오사이드를 형성하는 임의의 UDP-글루코실트랜스퍼라제이다. 특정의 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 UGT74G1 또는 UGT74G1와 >85% 아미노-산 서열 동일성을 갖는 UGT이다.

또다른 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 적어도 하나의 글루코오스 유닛을 스테비오사이드 B에 부가가능하여 레바우디오사이드 E3를 형성하는 임의의 UDP-글루코실트랜스퍼라제이다. 특정의 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 UGTSl2 또는 UGTSl2와 >85% 아미노-산 서열 동일성을 갖는 UGT이다. 또다른 특정의 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 EUGT11, 또는 EUGT11와 >85% 아미노-산 서열 동일성을 갖는 UGT이다. 역시 또다른 특정의 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 UGT91D2, 또는 UGT91D2와 >85% 아미노-산 서열 동일성을 갖는 UGT이다.

또다른 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 적어도 하나의 글루코오스 유닛을 스테비오사이드 B에 부가가능하여 레바우디오사이드 E2를 형성하는 임의의 UDP-글루코실트랜스퍼라제이다.

또다른 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 적어도 하나의 글루코오스 유닛을 스테비오사이드 A (레바우디오사이드 KA)에 부가가능하여 레바우디오사이드 E3를 형성하는 임의의 UDP-글루코실트랜스퍼라제이다. 특정의 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 UGT76G1 또는 UGT76G1와 >85% 아미노-산 서열 동일성을 갖는 UGT이다.

또다른 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 적어도 하나의 글루코오스 유닛을 스테비오사이드 A (레바우디오사이드 KA)에 부가가능하여 레바우디오사이드 E를 형성하는 임의의 UDP-글루코실트랜스퍼라제이다.

또다른 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 적어도 하나의 글루코오스 유닛을 스테비오사이드 C에 부가가능하여 레바우디오사이드 E3를 형성하는 임의의 UDP-글루코실트랜스퍼라제이다. 특정의 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 UGT85C2, 또는 UGT85C2와 >85% 아미노-산 서열 동일성을 갖는 UGT이다.

또다른 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 적어도 하나의 글루코오스 유닛을 스테비오사이드에 부가가능하여 레바우디오사이드 E2를 형성하는 임의의 UDP-글루코실트랜스퍼라제이다. 특정의 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 UGT76G1 또는 UGT76G1와 >85% 아미노-산 서열 동일성을 갖는 UGT이다.

또다른 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 적어도 하나의 글루코오스 유닛을 스테비오사이드에 부가가능하여 레바우디오사이드 E를 형성하는 임의의 UDP-글루코실트랜스퍼라제이다. 특정의 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 UGTSl2 또는 UGTSl2와 >85% 아미노-산 서열 동일성을 갖는 UGT이다. 또다른 특정의 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 EUGT11, 또는 EUGT11와 >85% 아미노-산 서열 동일성을 갖는 UGT이다. 역시 또다른 특정의 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 UGT91D2, 또는 UGT91D2와 >85% 아미노-산 서열 동일성을 갖는 UGT이다.

또다른 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 적어도 하나의 글루코오스 유닛을 레바우디오사이드 E3에 부가가능하여 레바우디오사이드 AM를 형성하는 임의의 UDP-글루코실트랜스퍼라제이다.

또다른 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는을 레바우디오사이드 E2로 부가가능하여 레바우디오사이드 AM를 형성하는 임의의 UDP-글루코실트랜스퍼라제이다. 특정의 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 UGTSl2 또는 UGTSl2와 >85% 아미노-산 서열 동일성을 갖는 UGT이다. 또다른 특정의 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 EUGT11, 또는 EUGT11와 >85% 아미노-산 서열 동일성을 갖는 UGT이다. 역시 또다른 특정의 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 UGT91D2, 또는 UGT91D2와 >85% 아미노-산 서열 동일성을 갖는 UGT이다.

또다른 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 적어도 하나의 글루코오스 유닛을 레바우디오사이드 E에 부가가능하여 레바우디오사이드 AM를 형성하는 임의의 UDP-글루코실트랜스퍼라제이다. 특정의 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 UGT76G1 또는 UGT76G1와 >85% 아미노-산 서열 동일성을 갖는 UGT이다.

임의로, 본발명의 방법은 출발 조성물에 대해 하나 초과의 UGT를 사용하여, 출발 조성물보다 하나 초과의 글루코오스 유닛을 갖는 표적 스테비올 글리코사이드(들)를 생성하는 것을 추가로 포함한다. 특정의 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는, 하나 초과의 글루코오스 유닛을 출발 조성물에 부가가능하여 출발 조성물보다 하나 초과의 글루코오스 유닛을 갖는 스테비올 글리코사이드(들)를 생성하는 UGT74G1, UGT85C2, UGT76G1, UGTSl2, EUGT11 및/또는 UGT91D2 또는 UGT74G1, UGT85C2, UGT76G1, UGTSl2, EUGT11 및/또는 UGT91D2와 >85% 아미노-산 서열 동일성을 갖는 임의의 UGT 또는 임의의 그의 조합이다.

하나의 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 전체적으로 두 개의 글루코오스 유닛을 스테비오사이드에 부가가능하여 레바우디오사이드 AM를 형성하는 임의의 UDP-글루코실트랜스퍼라제이다. 특정의 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 UGTSl2, EUGT11, UGT91D2, UGT76G1 또는 UGTSl2, EUGT11, UGT91D2, UGT76G1 또는 임의의 그의 조합과 >85% 아미노-산 서열 동일성을 갖는 UGT로부터 선택된다. 또다른 특정의 구체예에서, UDP-글루코실트랜스퍼라제는 UGTSl2 및 UGT76G1이다.

임의로, 본발명의 방법은 UDP를 재생하여 UDP-글루코오스를 제공하는 것을 추가로 포함한다. 하나의 구체예에서, 상기 방법은 스테비올 및/또는 스테비올 글리코사이드 기질의 표적 스테비올 글리코사이드로의 생전환이 촉매적 양의 UDP-글루코실트랜스퍼라제 및 UDP-글루코오스를 사용하여 수행되도록 재생 촉매 및 재생 기질을 제공하여 UDP를 재생하는 것을 포함한다.

하나의 구체예에서, 재생 촉매는 수크로스 신타제 SuSy_At 또는 SuSy_At와 >85% 아미노-산 서열 동일성을 갖는 수크로스 신타제이다.

하나의 구체예에서, 재생 기질은 수크로스이다.

임의로, 본발명의 방법은 수여자 표적 스테비올 글리코사이드 분자를 개질시키는 당 공여자로서 올리고- 또는 폴리-사카라이드를 사용하는 트랜스글리코시다제의 사용을 추가로 포함한다. 비-제한적 예시는 시클로덱스트린 글리코실트랜스퍼라제 (CGTase), 프럭토푸라노시다제, 아밀라제, 사카라제, 글루코수크라제, 베타-h-프럭토시다제, 베타-프럭토시다제, 수크라제, 프럭토실버타제, 알칼리 인버타제, 산 인버타제, 프럭토푸라노시다제를 포함한다. 일부 구체예에서, 비제한적으로 프럭토스, 자일로스, 람노스, 아라비노스, 데옥시글루코오스, 갈락토스를 포함하는 글루코오스 및 글루코오스 외의 당(들)은 수여자 표적 스테비올 글리코사이드로 이동된다. 하나의 구체예에서, 수여자 스테비올 글리코사이드는 레바우디오사이드 AM이다.

임의로, 본발명의 방법은 배지로부터 표적 스테비올 글리코사이드를 분리하여 고도로 정제된 표적 스테비올 글리코사이드 조성물을 제공하는 것을 추가로 포함한다. 표적 스테비올 글리코사이드는 적어도 하나의 적합한 방법, 가령, 예를 들어, 결정화, 막에 의한 분리, 원심분리, 추출, 크로마토그래피 분리 또는 그러한 방법의 조합에 의해 분리될 수 있다.

하나의 구체예에서, 표적 스테비올 글리코사이드는 미생물 내에서, 생성될 수 있다. 또다른 구체예에서, 표적 스테비올 글리코사이드는 배지 내에 분비될 수 있다. 하나의 또다른 구체예에서, 방출 스테비올 글리코사이드는 배지로부터 계속 제거될 수 있다. 역시 또다른 구체예에서, 표적 스테비올 글리코사이드는 전환 반응 완료 후 분리된다.

하나의 구체예에서, 분리는 무수물 기준, 즉, 고도로 정제된 스테비올 글리코사이드 조성물 기준으로 약 80 중량 초과 % 표적 스테비올 글리코사이드를 포함하는 조성물을 생성한다. 또다른 구체예에서, 분리는 약 90 중량% 초과의 표적 스테비올 글리코사이드를 포함하는 조성물을 생성한다. 특정의 구체예에서, 조성물은 약 95 중량% 초과의 표적 스테비올 글리코사이드를 포함한다. 다른 구체예에서, 조성물은 약 99 중량% 초과의 표적 스테비올 글리코사이드를 포함한다.

표적 스테비올 글리코사이드는 수화물, 용매화물, 무수물 또는 그의 조합을 포함하는 임의의 다형체 또는 무정형 형태일 수 있다.

정제된 표적 스테비올 글리코사이드는 감미제, 풍미 개질제, 개질 특성을 갖는 향미료 및/또는 거품 억제제로서 소비가능 제품에서 사용될 수 있다. 적합한 소비가능 제품은, 비제한적으로 식품, 음료, 약제학적 조성물, 담배 제품, 기능성 조성물, 구강 위생 조성물, 및 화장품 조성물을 포함한다.

도 1은 레바우디오사이드 AM의 화학 구조를 나타낸다.
도 2은 스테비올로부터 레바우디오사이드 AM 및 다양한 스테비올 글리코사이드 제조하는 경로를 나타낸다.
도 3은 효소 UGTSl2 및 UGT76G1 및 수크로스 신타제 SuSy_At를 통한 UDP의 UDP-글루코오스로의 부수적 재생을 사용하여 스테비오사이드로부터 레바우디오사이드 AM의 생촉매적 생성을 나타낸다.
도 4은 효소 UGTSl2 및 UGT76G1 및 수크로스 신타제 SuSy_At를 통한 UDP의 UDP-글루코오스로의 부수적 재생을 사용하여 레바우디오사이드 E로부터 레바우디오사이드 AM의 생촉매적 생성을 나타낸다.
도 5은 스테비오사이드의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다. 25.992 분의 체류 시간을 갖는 피크는 스테비오사이드에 해당한다.
도 6은 스테비오사이드로부터 레바우디오사이드 AM의 생촉매적 생성의 생성물의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다. 10.636 분의 체류 시간을 갖는 피크는 레바우디오사이드 AM에 해당한다.
도 7은 레바우디오사이드 E의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다. 10.835 분의 체류 시간을 갖는 피크는 레바우디오사이드 E에 해당한다.
도 8은 레바우디오사이드 E로부터레바우디오사이드 AM의 생촉매적 생성의 생성물의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다. 10.936 및 11.442 분의 체류 시간을 갖는 피크는 각각 레바우디오사이드 E에 및 레바우디오사이드 AM에 해당한다.
도 9은 메탄올 결정화에 의한 정제 후 레바우디오사이드 AM의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다. 10.336 분의 체류 시간을 갖는 피크는 레바우디오사이드 AM에 해당한다.
도 10은 레바우디오사이드 AM의 ¹H NMR 스펙트럼을 나타낸다 (500 MHz, 피리딘-d5).
도 11은 레바우디오사이드 AM의 HSQC 스펙트럼을 나타낸다 (500 MHz, 피리딘-d5).
도 12은 레바우디오사이드 AM의 H,H COSY 스펙트럼을 나타낸다 (500 MHz, 피리딘-d5).
도 13은 레바우디오사이드 AM의 HMBC 스펙트럼을 나타낸다 (500 MHz, 피리딘-d5).
도 14은 레바우디오사이드 AM의 HSQC-TOCSY 스펙트럼을 나타낸다 (500 MHz, 피리딘-d5).
도 15a 및 도 15b은 레바우디오사이드 AM의 LC 크로마토그램 및 질량 스펙트럼을 각각 나타낸다.
도 16는 코코넛 물의 풍미 개질에 대한 Reb AM의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 17는 초콜렛 단백질 쉐이크의 풍미 개질에 대한 Reb AM의 효과를 나타내는 그래프이다.

본발명의 하나의 목적은 다양한 출발 조성물로부터 표적 스테비올 글리코사이드, 특히 스테비올모노사이드, 스테비올모노사이드 A, 스테비올바이오사이드, 스테비올바이오사이드 A, 스테비올바이오사이드 B, 루부소사이드, 스테비오사이드, 스테비오사이드 A (레바우디오사이드 KA), 스테비오사이드 B, 스테비오사이드 C, 레바우디오사이드 E, 레바우디오사이드 E2, 레바우디오사이드 E3, 레바우디오사이드 AM 또는 합성 스테비올 글리코사이드를 제조하는 효율적인 생촉매적 방법을 제공하는 것이다.

여기서 사용된, 약어 용어 "reb"는 "레바우디오사이드"를 지칭한다. 두 용어는 모두 동일한 의미를 가지고 상호교환가능하게 사용될 수 있다.

여기서 사용된, "생촉매화" 또는 "생촉매적"은 유기 화합물에 대해 단일 또는 다수의 단계 화학 형질전환이 가능한 천연 또는 유전적으로 조작된 생촉매, 가령 효소, 또는 하나 이상의 효소를 포함하는 미생물을 포함하는 세포의 사용을 지칭한다. 생촉매 공정은 발효, 생합성, 생전환 및 생전환 공정을 포함한다. 분리된 효소, 및 전-세포 생촉매 방법이 모두 업계에서 공지되어 있다. 생촉매 단백질 효소는 천연 발생 또는 재조합 단백질일 수 있다.

여기서 사용된, 용어 "스테비올 글리코사이드(들)"는, 비제한적으로, 천연 발생 스테비올 글리코사이드, 예를 들어 스테비올모노사이드, 스테비올모노사이드 A, 스테비올바이오사이드, 스테비올바이오사이드 A, 스테비올바이오사이드 B, 루부소사이드, 스테비오사이드, 스테비오사이드 A (레바우디오사이드 KA), 스테비오사이드 B, 스테비오사이드 C, 레바우디오사이드 E, 레바우디오사이드 E2, 레바우디오사이드 E3, 레바우디오사이드 AM, 합성 스테비올 글리코사이드, 예를 들어 효소적으로 글루코실화된 스테비올 글리코사이드 및 그의 조합을 포함하는 스테비올의 글리코사이드를 지칭한다.

출발 조성물

여기서 사용된, "출발 조성물"은 적어도 하나의 탄소 원자를 포함하는 하나 이상의 유기 화합물을 함유하는 임의의 조성물 (일반적으로 수성 용액)를 지칭한다.

하나의 구체예에서, 출발 조성물은 스테비올, 스테비올 글리코사이드, 폴리올 및 다양한 탄수화물로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

출발 조성물 스테비올 글리코사이드는 스테비올모노사이드, 스테비올모노사이드 A, 스테비올바이오사이드, 스테비올바이오사이드 A, 스테비올바이오사이드 B, 루부소사이드, 스테비오사이드, 스테비오사이드 A (레바우디오사이드 KA), 스테비오사이드 B, 스테비오사이드 C, 레바우디오사이드 E, 레바우디오사이드 E2, 레바우디오사이드 E3 또는 식물 내에서 발생하는 스테비올의 다른 글리코사이드, 합성 스테비올 글리코사이드, 예를 들어 효소적으로 글루코실화된 스테비올 글리코사이드 및 그의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

하나의 구체예에서, 출발 조성물은 스테비올이다.

또다른 구체예에서, 출발 조성물 스테비올 글리코사이드는 스테비올모노사이드이다.

역시 또다른 구체예에서, 출발 조성물 스테비올 글리코사이드는 스테비올모노사이드 A이다.

여전히 또다른 구체예에서, 출발 조성물 스테비올 글리코사이드는 루부소사이드이다.

역시 또다른 구체예에서, 출발 조성물 스테비올 글리코사이드는 스테비올바이오사이드이다.

역시 또다른 구체예에서, 출발 조성물 스테비올 글리코사이드는 스테비올바이오사이드 A이다.

역시 또다른 구체예에서, 출발 조성물 스테비올 글리코사이드는 스테비올바이오사이드 B이다.

여전히 또다른 구체예에서, 출발 조성물 스테비올 글리코사이드는 스테비오사이드이다.

역시 또다른 구체예에서, 출발 조성물 스테비올 글리코사이드는, 레바우디오사이드 KA로서 또한 공지된 스테비오사이드 A이다.

여전히 또다른 구체예에서, 출발 조성물 스테비올 글리코사이드는 스테비오사이드 B이다.

여전히 또다른 구체예에서, 출발 조성물 스테비올 글리코사이드는 스테비오사이드 C이다.

또다른 구체예에서, 출발 조성물 스테비올 글리코사이드는 레바우디오사이드 E이다.

또다른 구체예에서, 출발 조성물 스테비올 글리코사이드는 레바우디오사이드 E2이다.

또다른 구체예에서, 출발 조성물 스테비올 글리코사이드는 레바우디오사이드 E3이다.

용어 "폴리올"은 하나 초과의 히드록실 기를 함유하는 분자를 지칭한다. 폴리올은 2, 3 및 4 히드록실 기 각각을 함유하는 디올 트리올 또는 테트라올일 수 있다. 폴리올은 또한 4 초과 히드록실 기, 가령, 각각 5, 6, 또는 7 히드록실 기를 함유하는, 펜타올, 헥사올, 헵타올, 등을 함유할 수 있다. 부가적으로, 폴리올은 또한 당 알콜, 다가 알콜, 또는 탄수화물의 환원 형태인 폴리알콜일 수 있고, 여기서 카르보닐 기 (알데히드 또는 케톤, 환원 당)은 1차 또는 2차 히드록실 기로 환원되어 있다. 폴리올의 예시는, 비제한적으로 에리쓰리톨, 말티톨, 만니톨, 솔비톨, 락티톨, 자일리톨, 이노시톨, 이소말트, 프로필렌 글리콜, 글리세롤, 트레이톨, 갈락티톨, 수소화 이소말툴로스, 환원 이소말토-올리고사카라이드, 환원 자일로-올리고사카라이드, 환원 겐티오-올리고사카라이드, 환원 말토스 시럽, 환원 글루코오스 시럽, 수소화 전분 가수분해물, 폴리글리시톨 및 당 알콜 또는 환원가능한 임의의 다른 탄수화물을 포함한다.

용어 "탄수화물"는 일반식 (CH₂O)_n의다수의 히드록실 기로 치환된 알데히드 또는 케톤 화합물, 여기서 n은 3-30, 또한 그의 올리고머 및 폴리머를 지칭한다. 본발명의 탄수화물은, 또한, 하나 이상의 위치에서, 치환 또는 탈산소화될 수 있다. 여기서 사용된 탄수화물은 비개질 탄수화물, 탄수화물 유도체, 치환 탄수화물, 및 개질 탄수화물을 포함한다. 여기서 사용된, 구절 "탄수화물 유도체", "치환 탄수화물", 및 "개질 탄수화물"은 동의어이다. 개질 탄수화물은 여기서 적어도 하나의 원자가 부가, 제거, 또는 치환, 또는 그의 조합이 된 임의의 탄수화물을 의미한다. 따라서, 탄수화물 유도체 또는 치환 탄수화물은 치환 및 비치환 모노사카라이드, 디사카라이드, 올리고사카라이드, 및 폴리사카라이드를 포함한다. 탄수화물 유도체 또는 치환 탄수화물은 임의로 임의의 상응하는 C-위치에서, 탈산소화, 및/또는 하나 이상의 모이어티 가령 수소, 할로겐, 할로알킬, 카르복실, 아실, 아실옥시, 아미노, 아미도, 카르복실 유도체, 알킬아미노, 디알킬아미노, 아릴아미노, 알콕시, 아릴옥시, 니트로, 시아노, 설포, 머캅토, 이미노, 설포닐, 설페닐, 설피닐, 설파모일, 카르보알콕시, 카르복사미도, 포스포닐, 포스피닐, 포스포릴, 포스피노, 티오에스테르, 티오에테르, 옥스이미노, 히드라지노, 카바밀, 포스포, 포스포네이토, 또는 감미제 조성물의 감미 맛을 향상시키는 탄수화물 유도체 또는 치환 탄수화물 기능이 제공된 임의의 다른 활성 기능성 기로 치환될 수 있다.

본발명에 따라서 사용될 수 있는 탄수화물의 예시는, 비제한적으로 타가토스, 트레할로스, 갈락토스, 람노스, 다양한 시클로덱스트린, 시클릭 올리고사카라이드, 다양한 타입의 말토덱스트린, 덱스트란, 수크로스, 글루코오스, 리불로스, 프럭토스, 트레오스, 아라비노스, 자일로스, 릭소스, 알로스, 알트로스, 만노스, 아이도스, 락토스, 말토스, 반전당, 이소트레할로스, 네오트레할로스, 이소말툴로스, 에리쓰로스, 데옥시리보스, 굴로스, 아이도스, 탈로스, 에리쓰룰로스, 자일루로스, 프시코스, 투란오스, 셀로비오스, 아밀로펙틴, 글루코자민, 만노자민, 푸코스, 글루쿠론산, 글루콘산, 글루코노-락톤, 아베쿠오스, 갈락토자민, 사탕무 올리고사카라이드, 이소말토-올리고사카라이드 (이소말토스, 이소말토트리오스, 파노스 등), 자일로-올리고사카라이드 (자일로트리오스, 자일로비오스 등), 자일로-말단 올리고사카라이드, 겐티오-올리고사카라이드 (겐티오비오스, 겐티오트리오스, 겐티오테트라오스 등), 소르보스, 니게로-올리고사카라이드, 팔라티노스 올리고사카라이드, 프럭토올리고사카라이드 (케스토스, 니스토스 등), 말토테트라올, 말토트리올, 말토-올리고사카라이드 (말토트리오스, 말토테트라오스, 말토펜타오스, 말토헥사오스, 말토헵타오스 등), 전분, 이눌린, 이눌로-올리고사카라이드, 락툴로스, 멜리비오스, 라핀오스, 리보스, 이성체화된 액체 당 가령 고 프럭토스 옥수수 시럽, 커플링 당, 및 대두 올리고사카라이드를 포함한다. 부가적으로, 여기서 사용된 탄수화물은 D- 또는 L-구성일 수 있다.

출발 조성물은 합성 또는 정제 (부분적으로 또는 전체적으로), 상업적으로 이용가능 또는 제조될 수 있다.

하나의 구체예에서, 출발 조성물은 글리세롤이다.

또다른 구체예에서, 출발 조성물은 글루코오스이다.

여전히 또다른 구체예에서, 출발 조성물은 수크로스이다.

역시 또다른 구체예에서, 출발 조성물은 전분이다.

또다른 구체예에서, 출발 조성물은 말토덱스트린이다.

역시 또다른 구체예에서, 출발 조성물은 셀룰로스이다.

여전히 또다른 구체예에서, 출발 조성물은 아밀로스이다.

출발 조성물의 유기 화합물(들)은 여기서 기술된 표적 스테비올 글리코사이드(들)의 생성을 위한 기질(들)로서 작용한다.

표적 스테비올 글리코사이드

본방법의 표적 스테비올 글리코사이드는 여기서 개시된 공정에 의해 제조될 수 있는 임의의 스테비올 글리코사이드일 수 있다. 하나의 구체예에서, 표적 스테비올 글리코사이드는 스테비올모노사이드, 스테비올모노사이드 A, 스테비올바이오사이드, 스테비올바이오사이드 A, 스테비올바이오사이드 B, 루부소사이드, 스테비오사이드, 스테비오사이드 A (레바우디오사이드 KA), 스테비오사이드 B, 스테비오사이드 C, 레바우디오사이드 E, 레바우디오사이드 E2, 레바우디오사이드 E3, 레바우디오사이드 AM 또는 식물 내에서 발생하는 스테비올의 다른 글리코사이드, 합성 스테비올 글리코사이드, 예를 들어 효소적으로 글루코실화된 스테비올 글리코사이드 및 그의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다

하나의 구체예에서, 표적 스테비올 글리코사이드는 스테비올모노사이드이다.

또다른 구체예에서, 표적 스테비올 글리코사이드는 스테비올모노사이드 A이다.

또다른 구체예에서, 표적 스테비올 글리코사이드는 스테비올바이오사이드이다.

또다른 구체예에서, 표적 스테비올 글리코사이드는 스테비올바이오사이드 A이다.

또다른 구체예에서, 표적 스테비올 글리코사이드는 스테비올바이오사이드 B이다.

또다른 구체예에서, 표적 스테비올 글리코사이드는 루부소사이드이다.

또다른 구체예에서, 표적 스테비올 글리코사이드는 스테비오사이드이다.

또다른 구체예에서, 표적 스테비올 글리코사이드는 스테비오사이드 A이다 (레바우디오사이드 KA).

또다른 구체예에서, 표적 스테비올 글리코사이드는 스테비오사이드 B이다.

또다른 구체예에서, 표적 스테비올 글리코사이드는 스테비오사이드 C이다.

또다른 구체예에서, 표적 스테비올 글리코사이드는 레바우디오사이드 E이다.

또다른 구체예에서, 표적 스테비올 글리코사이드는 레바우디오사이드 E2이다.

또다른 구체예에서, 표적 스테비올 글리코사이드는 레바우디오사이드 E3이다.

또다른 구체예에서, 표적 스테비올 글리코사이드는 레바우디오사이드 AM이다.

하나의 구체예에서, 본발명은 스테비올모노사이드의 생성을 위한 생촉매적 공정이다.

하나의 구체예에서, 본발명은 스테비올모노사이드 A의 생성을 위한 생촉매적 공정이다.

하나의 구체예에서, 본발명은 스테비올바이오사이드의 생성을 위한 생촉매적 공정이다.

하나의 구체예에서, 본발명은 스테비올바이오사이드 A의 생성을 위한 생촉매적 공정이다.

하나의 구체예에서, 본발명은 스테비올바이오사이드 B의 생성을 위한 생촉매적 공정이다.

하나의 구체예에서, 본발명은 루부소사이드의 생성을 위한 생촉매적 공정이다.

하나의 구체예에서, 본발명은 스테비오사이드의 생성을 위한 생촉매적 공정이다.

하나의 구체예에서, 본발명은 스테비오사이드 A (레바우디오사이드 KA)의 생성을 위한 생촉매적 공정이다.

하나의 구체예에서, 본발명은 스테비오사이드 B의 생성을 위한 생촉매적 공정이다.

하나의 구체예에서, 본발명은 스테비오사이드 C의 생성을 위한 생촉매적 공정이다.

하나의 구체예에서, 본발명은 레바우디오사이드 E의 생성을 위한 생촉매적 공정이다.

하나의 구체예에서, 본발명은 레바우디오사이드 E2의 생성을 위한 생촉매적 공정이다.

하나의 구체예에서, 본발명은 레바우디오사이드 E3의 생성을 위한 생촉매적 공정이다.

하나의 구체예에서, 본발명은 레바우디오사이드 AM의 생성을 위한 생촉매적 공정이다.

특정의 구체예에서, 본발명은 스테비오사이드 및 UDP-글루코오스를 포함하는 출발 조성물로부터 레바우디오사이드 AM의 생성을 위한 생촉매적 공정을 제공한다.

또다른 특정의 구체예에서, 본발명은 레바우디오사이드 E 및 UDP-글루코오스를 포함하는 출발 조성물로부터 레바우디오사이드 AM의 생성을 위한 생촉매적 공정을 제공한다.

임의로, 본발명의 방법은 배지로부터 표적 스테비올 글리코사이드를 분리하여 고도로 정제된 표적 스테비올 글리코사이드 조성물을 제공하는 것을 추가로 포함한다. 표적 스테비올 글리코사이드는 임의의 적합한 방법, 가령, 예를 들어, 결정화, 막에 의한 분리, 원심분리, 추출, 크로마토그래피 분리 또는 그러한 방법의 조합에 의해 분리될 수 있다.

특정의 구체예에서, 여기서 기술된 공정은 고도로 정제된 표적 스테비올 글리코사이드 조성물을 유발한다. 여기서 사용된 용어 "고도로 정제된"는 무수물 (건조) 기준으로 약 80 중량% 초과의 표적 스테비올 글리코사이드를 갖는 조성물을 지칭한다. 하나의 구체예에서, 고도로 정제된 표적 스테비올 글리코사이드 조성물은 무수물 (건조) 기준으로 약 90 중량% 초과의 표적 스테비올 글리코사이드, 가령, 예를 들어, 건조 기준으로 약 91% 초과, 약 92% 초과, 약 93% 초과, 약 94% 초과, 약 95% 초과, 약 96% 초과, 약 97% 초과, 약 98% 또는 초과 약 99% 초과 표적 스테비올 글리코사이드 함량을 함유한다.

하나의 구체예에서, 표적 스테비올 글리코사이드가 reb AM일 때, 여기서 기술된 공정은 건조 기준 중량으로 약 90% 초과 reb AM 함량을 갖는 조성물을 제공한다. 또다른 특정의 구체예에서, 표적 스테비올 글리코사이드가 reb AM일 때, 여기서 기술된 공정은 건조 기준 중량으로 약 95% 초과 reb AM 함량을 포함하는 조성물을 제공한다.

미생물 및 효소 제제

본발명의 하나의 구체예에서, 미생물 (미생물 세포) 및/또는 효소 제제를 출발 조성물을 함유하는 배지와 접촉시켜 표적 스테비올 글리코사이드를 제조한다.

효소는 전체 세포 현탁액, 미정제 용해물, 정제된 효소 또는 그의 조합의 형태로 제공될 수 있다. 하나의 구체예에서, 생촉매는 정제된 출발 조성물을 표적 스테비올 글리코사이드로 전환가능한 효소이다. 또다른 구체예에서, 생촉매는 적어도 하나의 출발 조성물을 표적 스테비올 글리코사이드로 전환가능한 효소를 포함하는 미정제 용해물이다. 여전히 또다른 구체예에서, 생촉매는 적어도 하나의 출발 조성물을 표적 스테비올 글리코사이드로 전환가능한 효소를 포함하는 전체 세포 현탁액이다.

또다른 구체예에서, 생촉매는 출발 조성물을 표적 스테비올 글리코사이드로 전환가능한 효소(들)를 포함하는 하나 이상의 미생물 세포이다. 효소는 세포표면 상 위치할 수 있거나, 세포 내에 또는 세포표면 및 세포 내 모두에 위치할 수 있다.

출발 조성물을 표적 스테비올 글리코사이드로 전환시키기 위한 적합한 효소는, 비제한적으로 스테비올 생합성 효소 및 UDP-글루코실트랜스퍼라제 (UGTs)을 포함한다. 임의로 효소는 UDP 재생 효소(들)을 포함할 수 있다.

또다른 구체예에서 스테비올 생합성 효소는 비-메발로네이트 2-C-메틸-D-에리쓰리톨-4-포스페이트 경로 (MEP/DOXP) 효소를 포함한다.

하나의 구체예에서 스테비올 생합성 효소는 게라닐게라닐 디포스페이트 신타제, 코팔릴 디포스페이트 신타제, 카우렌 신타제, 카우렌 옥시다제, 카우렌산 13-히드록실라제 (KAH), 스테비올 신테타제, 데옥시자일루로스 5-포스페이트 신타제 (DXS), D-1-데옥시자일루로스 5-포스페이트 리덕토이소머라제 (DXR), 4-디포스포시티딜-2-C-메틸-D-에리쓰리톨 신타제 (CMS), 4-디포스포시티딜-2-C-메틸-D-에리쓰리톨 키나제 (CMK), 4-디포스포시티딜-2-C-메틸-D-에리쓰리톨 2,4- 시클로디포스페이트 신타제 (MCS), l-히드록시-2-메틸-2(E)-부테닐 4-디포스페이트 신타제 (HDS), l-히드록시-2-메틸-2(E)-부테닐 4-디포스페이트 리덕타제 (HDR), 아세토아세틸-CoA 티올라제, 절단된 HMG-CoA 리덕타제, 메발로네이트 키나제, 포스포메발로네이트 키나제, 메발로네이트 피로포스페이트 데카복실라제, 시토크롬 P450 리덕타제 등을 포함하는 그룹으로부터 선택된다.

임의로, 본발명의 방법은 UDP를 재생하여 UDP-글루코오스를 제공하는 것을 추가로 포함한다. 하나의 구체예에서, 상기 방법은 스테비올 및/또는 스테비올 글리코사이드 기질의 표적 스테비올 글리코사이드로의 생전환이 촉매적 양의 UDP-글루코실트랜스퍼라제 및 UDP-글루코오스를 사용하여 수행되도록 재생 촉매 및 재생 기질을 제공하여 UDP를 재생하는 것을 포함한다. UDP 재생 효소는 SuSy_At와 >85% 아미노-산 서열 동일성을 갖는 수크로스 신타제 SuSy_At 또는 수크로스 신타제일 수 있고 재생 기질은 수크로스일 수 있다.

또다른 구체예에서, 적어도 하나의 글루코오스 유닛을 출발 조성물 스테비올 글리코사이드에 부가가능한 UDP-글루코실트랜스퍼라제는 바람직하게는 표 1, 및 표 2에 제시된 그룹으로부터의, GenInfo 식별자 번호의 다음 리스트로부터 선택된 UGTs 와 >85% 아미노-산 서열 동일성을 가진다.

본발명의 하나의 구체예는 미생물 세포를 포함하는 효소, 즉 출발 조성물을 표적 스테비올 글리코사이드로 전환가능한 효소이다. 따라서, 본방법의 일부 구체예는 미생물을 출발 조성물을 함유하는 배지와 접촉시켜 적어도 하나의 표적 스테비올 글리코사이드를 포함하는 배지를 제공하는 것을 포함한다.

미생물은 출발 조성물을 표적 스테비올 글리코사이드(들)로 전환시키기 위한 필요한 효소(들)를 소유하는 임의의 미생물일 수 있다. 이들 효소는 미생물의 게놈 내에 암호화된다.

적합한 미생물은, 비제한적으로 대장균 (E.coli), 사카로미세스 (saccharomyces) 종, 아스퍼질러스 (Aspergillus) 종, 피키아 (Pichia) 종, 바실러스 (Bacillus) 종, 야로위아 (Yarrowia) 종 등을 포함한다.

하나의 구체예에서, 출발 조성물과 접촉시 미생물이 없다.

또다른 구체예에서, 미생물은 출발 조성물과 접촉시 고정된다. 예를 들어, 미생물은 무기 또는 유기 재료로부터 제조된 고체 지지체에 고정될 수 있다. 미생물을 고정하기에 적합한 고체 지지체의 비-제한적 예시는 유도체화된 셀룰로스 또는 유리, 세라믹스, 금속 옥사이드 또는 막을 포함한다. 미생물은 예를 들어, 공유적 부착, 흡착, 가교결합, 포착 또는 캡슐화에 의해 고체 지지체에 고정될 수 있다.

여전히 또다른 구체예에서, 출발 조성물을 표적 스테비올 글리코사이드로 전환가능한 효소는 미생물로부터 및 반응 배지 내로 분비된다.

표적 스테비올 글리코사이드는 임의로 정제된다. 반응 배지로부터 표적 스테비올 글리코사이드의 정제는 고도로 정제된 표적 스테비올 글리코사이드 조성물을 제공하는 적어도 하나의 적합한 방법에 의해 달성될 수 있다. 적합한 방법은 결정화, 막에 의한 분리, 원심분리, 추출 (액체 또는 고체 상), 크로마토그래피 분리, HPLC (분취 또는 분석) 또는 그러한 방법의 조합을 포함한다.

용도

본발명에 따라서 수득된 고도로 정제된 표적 글리코사이드(들), 특히 스테비올모노사이드, 스테비올모노사이드 A, 스테비올바이오사이드, 스테비올바이오사이드 A, 스테비올바이오사이드 B, 루부소사이드, 스테비오사이드, 스테비오사이드 A (레바우디오사이드 KA), 스테비오사이드 B, 스테비오사이드 C, 레바우디오사이드 E, 레바우디오사이드 E2, 레바우디오사이드 E3 및/또는 레바우디오사이드 AM는 "그대로" 또는 다른 감미제, 향미료, 식품 성분 및 그의 조합과 조합하여 사용될 수 있다.

향미료의 비-제한적 예시는, 비제한적으로 라임, 레몬, 오렌지, 과일, 바나나, 포도, 배, 파인애플, 망고, 베리, 쓴 아몬드, 콜라, 계피, 당, 솜사탕, 바닐라 및 그의 조합을 포함한다.

다른 식품 성분의 비-제한적 예시는, 비제한적으로 산미료, 유기 및 아미노산, 착색제, 증량제, 변성 전분, 검, 텍스쳐라이저, 방부제, 카페인, 항산화제, 유화제, 안정제, 증점제, 겔화제 및 그의 조합을 포함한다.

본발명에 따라서 수득된 고도로 정제된 표적 글리코사이드(들), 특히 스테비올모노사이드, 스테비올모노사이드 A, 스테비올바이오사이드, 스테비올바이오사이드 A, 스테비올바이오사이드 B, 루부소사이드, 스테비오사이드, 스테비오사이드 A (레바우디오사이드 KA), 스테비오사이드 B, 스테비오사이드 C, 레바우디오사이드 E, 레바우디오사이드 E2, 레바우디오사이드 E3 및/또는 레바우디오사이드 AM는 비제한적으로 수화물, 용매화물, 무수물, 무정형 형태 및 그의 조합을 포함하는 다양한 다형체 형태로 제조될 수 있다.

본발명에 따라서 수득된 고도로 정제된 표적 글리코사이드(들) 특히, 스테비올모노사이드, 스테비올모노사이드 A, 스테비올바이오사이드, 스테비올바이오사이드 A, 스테비올바이오사이드 B, 루부소사이드, 스테비오사이드, 스테비오사이드 A (레바우디오사이드 KA), 스테비오사이드 B, 스테비오사이드 C, 레바우디오사이드 E, 레바우디오사이드 E2, 레바우디오사이드 E3 및/또는 레바우디오사이드 AM는 식품, 음료, 약제학적 조성물, 화장품, 츄잉검, 테이블탑 제품, 시리얼, 유제품, 치약 및 다른 구강 조성물, 등 내 고강도 천연 감미제로서 함입될 수 있다.

본발명에 따라서 수득된 고도로 정제된 표적 글리코사이드(들) 특히, 스테비올모노사이드, 스테비올모노사이드 A, 스테비올바이오사이드, 스테비올바이오사이드 A, 스테비올바이오사이드 B, 루부소사이드, 스테비오사이드, 스테비오사이드 A (레바우디오사이드 KA), 스테비오사이드 B, 스테비오사이드 C, 레바우디오사이드 E, 레바우디오사이드 E2, 레바우디오사이드 E3 및/또는 레바우디오사이드 AM는 유일한 감미제로서의 감미 화합물로서 사용될 수 있고, 또는 적어도 하나의 천연 발생 고강도 감미제 가령 레바우디오사이드 A, 레바우디오사이드 A2, 레바우디오사이드 A3, 레바우디오사이드 B, 레바우디오사이드 C, 레바우디오사이드 C2, 레바우디오사이드 D, 레바우디오사이드 D2, 레바우디오사이드 F, 레바우디오사이드 F2, 레바우디오사이드 F3, 레바우디오사이드 G, 레바우디오사이드 H, 레바우디오사이드 I, 레바우디오사이드 I2, 레바우디오사이드 I3, 레바우디오사이드 J, 레바우디오사이드 K, 레바우디오사이드 K2, 레바우디오사이드 L, 레바우디오사이드 M, 레바우디오사이드 M2, 레바우디오사이드 N, 레바우디오사이드 O, 레바우디오사이드 O2, 레바우디오사이드 Q, 레바우디오사이드 Q2, 레바우디오사이드 Q3, 레바우디오사이드 R, 레바우디오사이드, 레바우디오사이드 T, 레바우디오사이드 T1, 레바우디오사이드 U, 레바우디오사이드 U2, 레바우디오사이드 V, 레바우디오사이드 W, 레바우디오사이드 W2, 레바우디오사이드 W3, 레바우디오사이드 Y, 레바우디오사이드 Z1, 레바우디오사이드 Z2, 둘코사이드 A, 둘코사이드 C, 스테비오사이드 D, 스테비오사이드 E, 스테비오사이드 E2, 스테비오사이드 F, 모그로사이드, 브라제인, 네오헤스페리딘 디하이드로찰콘, 글리시리진산 및 그의 염, 타우마틴, 페릴라틴, 퍼난둘신, 무쿠로지오사이드, 바이유노사이드, 플로미소사이드-I, 디메틸-헥사하이드로플루오렌-디카복실산, 아브루소사이드, 페라인드린, 카르노시플로사이드, 시클로카리오사이드, 프테로카르요사이드, 폴리포도사이드 A, 브라질린, 헤르난둘신, 필로둘신, 글리시필린, 플로리진, 트릴로바틴, 디하이드로플라보놀, 디하이드로퀘르세틴-3-아세테이트, 네오아스틸리빈, 트랜스-신남알데히드, 모나틴 및 그의 염, 셀리게인 A, 헤마톡실린, 모넬린, 오슬라딘, 프테로카르요사이드 A, 프테로카르요사이드 B, 마빈린, 펜타딘, 미라쿨린, 쿠르쿨린, 네오쿨린, 클로로겐산, 시나린, Luo Han Guo 감미제, 모그로사이드 V, 시아메노사이드 및 그의 조합.

특정의 구체예에서, 스테비올모노사이드, 스테비올모노사이드 A, 스테비올바이오사이드, 스테비올바이오사이드 A, 스테비올바이오사이드 B, 루부소사이드, 스테비오사이드, 스테비오사이드 A (레바우디오사이드 KA), 스테비오사이드 B, 스테비오사이드 C, 레바우디오사이드 E, 레바우디오사이드 E2, 레바우디오사이드 E3 및/또는 레바우디오사이드 AM는 사용될 수 있다에서 감미제를 포함하는 조성물 로 이루어진 그룹으로부터 선택된 화합물 레바우디오사이드 A, 레바우디오사이드 A2, 레바우디오사이드 A3, 레바우디오사이드 B, 레바우디오사이드 C, 레바우디오사이드 C2, 레바우디오사이드 D, 레바우디오사이드 D2, 레바우디오사이드 F, 레바우디오사이드 F2, 레바우디오사이드 F3, 레바우디오사이드 G, 레바우디오사이드 H, 레바우디오사이드 I, 레바우디오사이드 I2, 레바우디오사이드 I3, 레바우디오사이드 J, 레바우디오사이드 K, 레바우디오사이드 K2, 레바우디오사이드 L, 레바우디오사이드 M, 레바우디오사이드 M2, 레바우디오사이드 N, 레바우디오사이드 O, 레바우디오사이드 O2, 레바우디오사이드 Q, 레바우디오사이드 Q2, 레바우디오사이드 Q3, 레바우디오사이드 R, 레바우디오사이드, 레바우디오사이드 T, 레바우디오사이드 T1, 레바우디오사이드 U, 레바우디오사이드 U2, 레바우디오사이드 V, 레바우디오사이드 W, 레바우디오사이드 W2, 레바우디오사이드 W3, 레바우디오사이드 Y, 레바우디오사이드 Z1, 레바우디오사이드 Z2, 둘코사이드 A, 둘코사이드 C, 스테비오사이드 D, 스테비오사이드 E, 스테비오사이드 E2, 스테비오사이드 F, NSF-02, 모그로사이드 V, Luo Han Guo, 알룰로스, 알로스, D-타가토스, 에리쓰리톨 및 그의 조합과 함께 사용될 수 있다.

고도로 정제된 표적 글리코사이드(들), 특히 스테비올모노사이드, 스테비올모노사이드 A, 스테비올바이오사이드, 스테비올바이오사이드 A, 스테비올바이오사이드 B, 루부소사이드, 스테비오사이드, 스테비오사이드 A (레바우디오사이드 KA), 스테비오사이드 B, 스테비오사이드 C, 레바우디오사이드 E, 레바우디오사이드 E2, 레바우디오사이드 E3 및/또는 레바우디오사이드 AM는 또한 합성 고강도 감미제 가령 수크랄로스, 포타슘 아세술팜, 아스파탐, 알리탐, 사카린, 네오헤스페리딘 디하이드로찰콘, 시클라메이트, 네오탐, 둘신, 수오산 아드반탐, 염 그의, 및 그의 조합과 조합하여 사용될 수 있다.

또한, 고도로 정제된 표적 스테비올 글리코사이드(들), 특히 스테비올모노사이드, 스테비올모노사이드 A, 스테비올바이오사이드, 스테비올바이오사이드 A, 스테비올바이오사이드 B, 루부소사이드, 스테비오사이드, 스테비오사이드 A (레바우디오사이드 KA), 스테비오사이드 B, 스테비오사이드 C, 레바우디오사이드 E, 레바우디오사이드 E2, 레바우디오사이드 E3 및/또는 레바우디오사이드 AM는 천연 감미제 억제제 가령 짐넴산, 호둘신, 지지핀, 락티솔, 및 등과 조합하여 사용될 수 있다. 스테비올모노사이드, 스테비올모노사이드 A, 스테비올바이오사이드, 스테비올바이오사이드 A, 스테비올바이오사이드 B, 루부소사이드, 스테비오사이드, 스테비오사이드 A (레바우디오사이드 KA), 스테비오사이드 B, 스테비오사이드 C, 레바우디오사이드 E, 레바우디오사이드 E2, 레바우디오사이드 E3 및/또는 레바우디오사이드 AM는 또한 다양한 감칠맛 증가제와 조합될 수 있다. 스테비올모노사이드, 스테비올모노사이드 A, 스테비올바이오사이드, 스테비올바이오사이드 A, 스테비올바이오사이드 B, 루부소사이드, 스테비오사이드, 스테비오사이드 A (레바우디오사이드 KA), 스테비오사이드 B, 스테비오사이드 C, 레바우디오사이드 E, 레바우디오사이드 E2, 레바우디오사이드 E3 및/또는 레바우디오사이드 AM는 감칠맛 및 감미 아미노산 가령 글루타메이트, 아스파르트산, 글리신, 알라닌, 트레오닌, 프롤린, 세린, 글루타메이트, 라이신, 트립토판 및 그의 조합과 혼합될 수 있다.

고도로 정제된 표적 스테비올 글리코사이드(들) 특히, 스테비올모노사이드, 스테비올모노사이드 A, 스테비올바이오사이드, 스테비올바이오사이드 A, 스테비올바이오사이드 B, 루부소사이드, 스테비오사이드, 스테비오사이드 A (레바우디오사이드 KA), 스테비오사이드 B, 스테비오사이드 C, 레바우디오사이드 E, 레바우디오사이드 E2, 레바우디오사이드 E3 및/또는 레바우디오사이드 AM는 탄수화물, 폴리올, 아미노산 및 그의 상응하는 염, 폴리-아미노산 및 그의 상응하는 염, 당 산 및 그의 상응하는 염, 누클레오티드, 유기산, 무기산, 유기 염을 포함하는 유기 산 염 및 유기 염기 염, 무기 염, 쓴맛 화합물, 향미료 및 풍미 성분, 떫은 맛 화합물, 단백질 또는 단백질 가수분해물, 계면활성제, 유화제, 플라보노이드, 알콜, 폴리머 및 그의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 첨가제와 조합하여 사용될 수 있다.

고도로 정제된 표적 스테비올 글리코사이드(들) 특히, 스테비올모노사이드, 스테비올모노사이드 A, 스테비올바이오사이드, 스테비올바이오사이드 A, 스테비올바이오사이드 B, 루부소사이드, 스테비오사이드, 스테비오사이드 A (레바우디오사이드 KA), 스테비오사이드 B, 스테비오사이드 C, 레바우디오사이드 E, 레바우디오사이드 E2, 레바우디오사이드 E3 및/또는 레바우디오사이드 AM는 폴리올 또는 당 알콜과 조합될 수 있다. 용어 "폴리올"은 하나 초과의 히드록실 기를 함유하는 분자를 지칭한다. 폴리올은 2, 3 및 4 히드록실 기 각각을 함유하는 디올 트리올 또는 테트라올일 수 있다. 폴리올은 또한 4 초과 히드록실 기, 가령, 각각 5, 6, 또는 7 히드록실 기를 함유하는, 펜타올, 헥사올, 헵타올, 등을 함유할 수 있다. 부가적으로, 폴리올은 또한 당 알콜, 다가 알콜, 또는 탄수화물의 환원 형태인 폴리알콜일 수 있고, 여기서 카르보닐 기 (알데히드 또는 케톤, 환원 당)은 1차 또는 2차 히드록실 기로 환원되어 있다. 폴리올의 예시는, 비제한적으로 에리쓰리톨, 말티톨, 만니톨, 솔비톨, 락티톨, 자일리톨, 이노시톨, 이소말트, 프로필렌 글리콜, 글리세롤, 트레이톨, 갈락티톨, 수소화 이소말툴로스, 환원 이소말토-올리고사카라이드, 환원 자일로-올리고사카라이드, 환원 겐티오-올리고사카라이드, 환원 말토스 시럽, 환원 글루코오스 시럽, 수소화 전분 가수분해물, 폴리글리시톨 및 당 알콜 또는 감미제 조성물의 맛에 나쁘게 영향을 미치지 않는 환원 가능한 임의의 다른 탄수화물을 포함한다.

고도로 정제된 표적 스테비올 글리코사이드(들), 특히 스테비올모노사이드, 스테비올모노사이드 A, 스테비올바이오사이드, 스테비올바이오사이드 A, 스테비올바이오사이드 B, 루부소사이드, 스테비오사이드, 스테비오사이드 A (레바우디오사이드 KA), 스테비오사이드 B, 스테비오사이드 C, 레바우디오사이드 E, 레바우디오사이드 E2, 레바우디오사이드 E3 및/또는 레바우디오사이드 AM는 감소된 칼로리 감미제 가령, 예를 들어, D-타가토스, L-당, L-소르보스, L-아라비노스 및 그의 조합과 조합될 수 있다.

고도로 정제된 표적 스테비올 글리코사이드(들), 특히 스테비올모노사이드, 스테비올모노사이드 A, 스테비올바이오사이드, 스테비올바이오사이드 A, 스테비올바이오사이드 B, 루부소사이드, 스테비오사이드, 스테비오사이드 A (레바우디오사이드 KA), 스테비오사이드 B, 스테비오사이드 C, 레바우디오사이드 E, 레바우디오사이드 E2, 레바우디오사이드 E3 및/또는 레바우디오사이드 AM는 또한 다양한 탄수화물과 조합될 수 있다. 용어 "탄수화물"는 일반적으로 일반식 (CH₂O)_n의, 치환된 다수의 히드록실기를 갖는 알데히드 또는 케톤 화합물, 여기서 n는 3-30, 또한 그의 올리고머 및 폴리머를 지칭하고. 본발명의 탄수화물은, 또한, 하나 이상의 위치에서, 치환 또는 탈산소화될 수 있다. 여기서 사용된 탄수화물은 비개질 탄수화물, 탄수화물 유도체, 치환 탄수화물, 및 개질 탄수화물을 포함한다. 여기서 사용된, 구절 "탄수화물 유도체", "치환 탄수화물", 및 "개질 탄수화물"은 동의어이다. 개질 탄수화물은 여기서 적어도 하나의 원자가 부가, 제거, 또는 치환, 또는 그의 조합이 된 임의의 탄수화물을 의미한다. 따라서, 탄수화물 유도체 또는 치환 탄수화물은 치환 및 비치환 모노사카라이드, 디사카라이드, 올리고사카라이드, 및 폴리사카라이드를 포함한다. 탄수화물 유도체 또는 치환 탄수화물은 임의로 임의의 상응하는 C-위치에서 탈산소화, 및/또는 하나 이상의 모이어티 가령 수소, 할로겐, 할로알킬, 카르복실, 아실, 아실옥시, 아미노, 아미도, 카르복실 유도체, 알킬아미노, 디알킬아미노, 아릴아미노, 알콕시, 아릴옥시, 니트로, 시아노, 설포, 머캅토, 이미노, 설포닐, 설페닐, 설피닐, 설파모일, 카르보알콕시, 카르복사미도, 포스포닐, 포스피닐, 포스포릴, 포스피노, 티오에스테르, 티오에테르, 옥스이미노, 히드라지노, 카바밀, 포스포, 포스포네이토, 또는 감미제 조성물의 감미를 향상시키는 탄수화물 유도체 또는 치환 탄수화물 기능이 제공된 임의의 다른 활성 기능성 기로 치환될 수 있다.

본발명에 따라서 사용될 수 있는 탄수화물의 예시는, 비제한적으로 프시코스, 투란오스, 알로스, 타가토스, 트레할로스, 갈락토스, 람노스, 다양한 시클로덱스트린, 시클릭 올리고사카라이드, 다양한 타입의 말토덱스트린, 덱스트란, 수크로스, 글루코오스, 리불로스, 프럭토스, 트레오스, 아라비노스, 자일로스, 릭소스, 알로스, 알트로스, 만노스, 아이도스, 락토스, 말토스, 반전당, 이소트레할로스, 네오트레할로스, 이소말툴로스, 에리쓰로스, 데옥시리보스, 굴로스, 아이도스, 탈로스, 에리쓰룰로스, 자일루로스, 프시코스, 투란오스, 셀로비오스, 아밀로펙틴, 글루코자민, 만노자민, 푸코스, 글루쿠론산, 글루콘산, 글루코노-락톤, 아베쿠오스, 갈락토자민, 사탕무 올리고사카라이드, 이소말토-올리고사카라이드 (이소말토스, 이소말토트리오스, 파노스 등), 자일로-올리고사카라이드 (자일로트리오스, 자일로비오스 등), 자일로-말단 올리고사카라이드, 겐티오-올리고사카라이드 (겐티오비오스, 겐티오트리오스, 겐티오테트라오스 등), 소르보스, 니게로-올리고사카라이드, 팔라티노스 올리고사카라이드, 프럭토올리고사카라이드 (케스토스, 니스토스 등), 말토테트라올, 말토트리올, 말토-올리고사카라이드 (말토트리오스, 말토테트라오스, 말토펜타오스, 말토헥사오스, 말토헵타오스 등), 전분, 이눌린, 이눌로-올리고사카라이드, 락툴로스, 멜리비오스, 라핀오스, 리보스, 이성체화된 액체 당 가령 고 프럭토스 옥수수 시럽, 커플링 당, 및 대두 올리고사카라이드를 포함한다. 부가적으로, 여기서 사용된 탄수화물은 D- 또는 L-구성일 수 있다.

본발명에 따라서 수득된 고도로 정제된 표적 스테비올 글리코사이드(들), 특히 스테비올모노사이드, 스테비올모노사이드 A, 스테비올바이오사이드, 스테비올바이오사이드 A, 스테비올바이오사이드 B, 루부소사이드, 스테비오사이드, 스테비오사이드 A (레바우디오사이드 KA), 스테비오사이드 B, 스테비오사이드 C, 레바우디오사이드 E, 레바우디오사이드 E2, 레바우디오사이드 E3 및/또는 레바우디오사이드 AM는 다양한 생리학적으로 활성인 물질 또는 기능성 성분과 조합하여 사용될 수 있다. 기능성 성분은 일반적으로 카테고리 가령 카로테노이드, 식이 섬유, 지방산, 사포닌, 항산화제, 기능성식품, 플라보노이드, 이소티오시아네이트, 페놀, 식물 스테롤 및 스타놀 (피토스테롤 및 피토스타놀); 폴리올; 프리바이오틱스, 활생균; 피토에스트로겐; 콩 단백질; 설피드/티올; 아미노산; 단백질; 비타민; 및 미네랄로 분류된다. 기능성 성분은 또한 그의 건강 이득, 가령 심혈관, 콜레스테롤-감소, 및 항-염증성에 기초하여 분류될 수 있다. 예시적 기능성 성분은 WO2013/096420에 제공되고, 그 내용물은 참고로서 여기에 포함된다.

본발명에 따라서 수득된 고도로 정제된 표적 스테비올 글리코사이드(들), 특히 스테비올모노사이드, 스테비올모노사이드 A, 스테비올바이오사이드, 스테비올바이오사이드 A, 스테비올바이오사이드 B, 루부소사이드, 스테비오사이드, 스테비오사이드 A (레바우디오사이드 KA), 스테비오사이드 B, 스테비오사이드 C, 레바우디오사이드 E, 레바우디오사이드 E2, 레바우디오사이드 E3 및/또는 레바우디오사이드 AM는 향상된 맛 특징을 갖는 제로 칼로리, 감소된 칼로리 또는 당뇨병 음료 및 식품을 제조하기 위해 고강도 감미제로서 적용될 수 있다. 이는 또한 당이 사용될 수 없는 음료, 식품, 약제, 및 다른 제품에서 사용될 수 있다. 또한, 고도로 정제된 표적 스테비올 글리코사이드(들), 특히 스테비올모노사이드 A, 스테비올바이오사이드, 스테비올바이오사이드 A, 스테비올바이오사이드 B, 루부소사이드, 스테비오사이드, 스테비오사이드 A (레바우디오사이드 KA), 스테비오사이드 B, 스테비오사이드 C, 레바우디오사이드 E, 레바우디오사이드 E2, 레바우디오사이드 E3 및/또는 레바우디오사이드 AM는 음료, 식품, 및 인간 소비재 전용 다른 제품뿐만 아니라, 또한 향상된 특징을 갖는 동물 먹이 및 사료에도 감미제로서 사용될 수 있다.

본발명에 따라서 수득된 고도로 정제된 표적 스테비올 글리코사이드(들), 특히 스테비올모노사이드, 스테비올모노사이드 A, 스테비올바이오사이드, 스테비올바이오사이드 A, 스테비올바이오사이드 B, 루부소사이드, 스테비오사이드, 스테비오사이드 A (레바우디오사이드 KA), 스테비오사이드 B, 스테비오사이드 C, 레바우디오사이드 E, 레바우디오사이드 E2, 레바우디오사이드 E3 및/또는 레바우디오사이드 AM는 개질된 풍미를 갖는 제로 칼로리, 감소된 칼로리 또는 당뇨병 음료 및 식품 제조에서 풍미 개질제로서 적용될 수 있다. 풍미 개질제, 또는 개질 특성을 갖는 향미료 (FMP)로서 사용된 때, 고도로 정제된 표적 스테비올 글리코사이드는 풍미 개질제 또는 FMP의 검출 수준 이하의 소비가능 제품에서 사용된다. 따라서 풍미 개질제 또는 FMP는 그 자신의 검출가능 맛 또는 풍미를 소비가능 제품에 부여하지는 않고, 대신 소비가능 제품 내 다른 성분의 맛 및/또는 풍미의 소비자 검출을 개질시키는 역할을 한다. 맛 및 풍미 개질의 하나의 예시는 감미 증가이고, 여기서 풍미 개질제 또는 FMP 자체는 소비가능 제품 감미에 기여하지 않고, 소비자가 느끼는 감미의 품질을 향상시킨다.

고도로 정제된 표적 스테비올 글리코사이드(들), 특히 스테비올모노사이드 A, 스테비올바이오사이드, 스테비올바이오사이드 A, 스테비올바이오사이드 B, 루부소사이드, 스테비오사이드, 스테비오사이드 A (레바우디오사이드 KA), 스테비오사이드 B, 스테비오사이드 C, 레바우디오사이드 E, 레바우디오사이드 E2, 레바우디오사이드 E3 및/또는 레바우디오사이드 AM는 풍미 개질제 또는 개질 특성을 갖는 향미료로서 사용될 수 있는 소비가능 제품의 예시는, 비제한적으로 알콜 음료 가령 보드카, 와인, 맥주, 리큐어, 및 사케, 등; 천연 쥬스; 청량 음료; 탄산 음료; 다이어트 음료; 제로 칼로리 음료; 감소된 칼로리 음료 및 식품; 요구르트 음료; 인스턴트 쥬스; 인스턴트 커피; 분말 타입의 인스턴트 음료; 캔 제품; 시럽; 발효 대두 페이스트; 콩 소스; 식초; 드레싱; 마요네즈; 케찹; 커리; 수프; 인스턴트 부용; 분말 콩 소스; 분말 식초; 타입의 비스켓; 쌀 비스켓; 크래커; 빵; 초콜렛; 카라멜; 캔디; 츄잉검; 젤리; 푸딩; 보존된 과일 및 식물; 신선한 크림; 잼; 마멀레이드; 꽃 페이스트; 분말 우유; 아이스 크림; 샤베트; 식물 및 병에 충전된 과일; 캔 및 끓인 콩; 감미된 소스 내에서 끓인 육류 및 식품; 농업용 채소 식품; 씨푸드; 햄; 소세지; 생선 햄; 생선 소세지; 생선 페이스트; 딥 프라이드 생선 제품; 건조 씨푸드 제품; 냉동 식품; 보존된 해초; 보존된 육류; 담배; 의료 제품; 및 그외 다수를 포함한다. 원칙적으로 고도로 정제된 표적 스테비올 글리코사이드(들)는 비제한적 응용용도를 가질 수 있다.

본발명에 따라서 수득된 고도로 정제된 표적 스테비올 글리코사이드(들), 특히 스테비올모노사이드, 스테비올모노사이드 A, 스테비올바이오사이드, 스테비올바이오사이드 A, 스테비올바이오사이드 B, 루부소사이드, 스테비오사이드, 스테비오사이드 A (레바우디오사이드 KA), 스테비오사이드 B, 스테비오사이드 C, 레바우디오사이드 E, 레바우디오사이드 E2, 레바우디오사이드 E3 및/또는 레바우디오사이드 AM는 제로 칼로리, 감소된 칼로리 또는 당뇨병 음료 및 식품을 제조하기 위해 거품 억제제로서 적용될 수 있다.

고도로 정제된 표적 스테비올 글리코사이드(들), 특히 스테비올모노사이드 A, 스테비올바이오사이드, 스테비올바이오사이드 A, 스테비올바이오사이드 B, 루부소사이드, 스테비오사이드, 스테비오사이드 A (레바우디오사이드 KA), 스테비오사이드 B, 스테비오사이드 C, 레바우디오사이드 E, 레바우디오사이드 E2, 레바우디오사이드 E3 및/또는 레바우디오사이드 AM는 감미 화합물로서 사용될 수 있는 소비가능 제품의 예시는, 비제한적으로 알콜 음료 가령 보드카, 와인, 맥주, 리큐어, 및 사케, 등; 천연 쥬스; 청량 음료; 탄산 음료; 다이어트 음료; 제로 칼로리 음료; 감소된 칼로리 음료 및 식품; 요구르트 음료; 인스턴트 쥬스; 인스턴트 커피; 분말 타입의 인스턴트 음료; 캔 제품; 시럽; 발효 대두 페이스트; 콩 소스; 식초; 드레싱; 마요네즈; 케찹; 커리; 수프; 인스턴트 부용; 분말 콩 소스; 분말 식초; 타입의 비스켓; 쌀 비스켓; 크래커; 빵; 초콜렛; 카라멜; 캔디; 츄잉검; 젤리; 푸딩; 보존된 과일 및 식물; 신선한 크림; 잼; 마멀레이드; 꽃 페이스트; 분말 우유; 아이스 크림; 샤베트; 식물 및 병에 충전된 과일; 캔 및 끓인 콩; 감미된 소스 내에서 끓인 육류 및 식품; 농업용 채소 식품; 씨푸드; 햄; 소세지; 생선 햄; 생선 소세지; 생선 페이스트; 딥 프라이드 생선 제품; 건조 씨푸드 제품; 냉동 식품; 보존된 해초; 보존된 육류; 담배; 의료 제품; 및 그외 다수를 포함한다. 원칙적으로 고도로 정제된 표적 스테비올 글리코사이드(들)는 비제한적 응용용도를 가질 수 있다.

제품 가령 식품, 음료, 약제, 화장품, 테이블탑 제품, 및 츄잉검 제조 동안, 종래의 방법 가령 혼합, 반죽, 용해, 피클링, 침투, 여과, 뿌리기, 분무, 주입 및 다른 방법은 사용될 수 있다.

또한, 본발명에서 수득된 고도로 정제된 표적 스테비올 글리코사이드(들), 스테비올모노사이드 A, 스테비올바이오사이드, 스테비올바이오사이드 A, 스테비올바이오사이드 B, 루부소사이드, 스테비오사이드, 스테비오사이드 A (레바우디오사이드 KA), 스테비오사이드 B, 스테비오사이드 C, 레바우디오사이드 E, 레바우디오사이드 E2, 레바우디오사이드 E3 및/또는 레바우디오사이드 AM는 건조 또는 액체 형태로 사용될 수 있다.

고도로 정제된 표적 스테비올 글리코사이드는 식품의 열 처리 전후에 부가될 수 있다. 고도로 정제된 표적 스테비올 글리코사이드(들), 특히 스테비올모노사이드 A, 스테비올바이오사이드, 스테비올바이오사이드 A, 스테비올바이오사이드 B, 루부소사이드, 스테비오사이드, 스테비오사이드 A (레바우디오사이드 KA), 스테비오사이드 B, 스테비오사이드 C, 레바우디오사이드 E, 레바우디오사이드 E2, 레바우디오사이드 E3 및/또는 레바우디오사이드 AM의 양은 사용목적에 의존한다. 위에서 논의된 바와 같이, 고도로 정제된 표적 스테비올 글리코사이드(들)는 단독 또는 다른 화합물과 조합하여 부가될 수 있다.

본발명은 또한 스테비올모노사이드 A, 스테비올바이오사이드, 스테비올바이오사이드 A, 스테비올바이오사이드 B, 루부소사이드, 스테비오사이드, 스테비오사이드 A (레바우디오사이드 KA), 스테비오사이드 B, 스테비오사이드 C, 레바우디오사이드 E, 레바우디오사이드 E2, 레바우디오사이드 E3 및/또는 레바우디오사이드 AM를 사용하는 음료 감미 증가에 관한 것이다. 따라서, 본발명은 감미제 및 그의 각각의 감미 인식 역치 이하의 농도에서 존재하는 스테비올모노사이드 A, 스테비올바이오사이드, 스테비올바이오사이드 A, 스테비올바이오사이드 B, 루부소사이드, 스테비오사이드, 스테비오사이드 A (레바우디오사이드 KA), 스테비오사이드 B, 스테비오사이드 C, 레바우디오사이드 E, 레바우디오사이드 E2, 레바우디오사이드 E3 및/또는 레바우디오사이드 AM 감미 증가제로서, 여기서 스테비올모노사이드 A, 스테비올바이오사이드, 스테비올바이오사이드 A, 스테비올바이오사이드 B, 루부소사이드, 스테비오사이드, 스테비오사이드 A (레바우디오사이드 KA), 스테비오사이드 B, 스테비오사이드 C, 레바우디오사이드 E, 레바우디오사이드 E2, 레바우디오사이드 E3 및/또는 레바우디오사이드 AM를 포함하는 음료를 제공한다.

여기서 사용된, 용어 "감미 증가제"는 조성물, 가령 음료 내 감미 인지를 증가 또는 강화가능한 화합물을 지칭한다. 용어 "감미 증가제"는 용어 "감미 증강제," "감미 증강제," "감미 증폭제," 및 "감미 강화제"와 동의어이다.

여기서 일반적으로 사용된 용어 "감미 인식 역치 농도"는 인간 맛감각에 의해 인지가능한 감미 화합물의 최저 공지된 농도, 대표적으로 약 1.0% 수크로스 당량 (1.0% SE)이다. 일반적으로, 감미 증가제는 주어진 감미 증가제의 감미 인식 역치 농도 이하에서 존재시 단독으로 인식가능한 감미 제공 없이 감미제의 감미를 증가 또는 강화할 수 있고; 그러나, 감미 증가제 자신은 그의 감미 인식 역치 농도 위의 농도에서 감미를 제공할 수 있고. 감미 인식 역치 농도는 특정의 증가제에 대해 특이적이고 음료 매트릭스에 기초하여 변할 수 있다. 감미 인식 역치 농도는 주어진 음료 매트릭스에서 1.0% 초과 수크로스 당량이 검출될 때까지 주어진 증가제의 농도를 증가시키는 맛 시험에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 약 1.0% 수크로스 당량을 제공하는 농도는 감미 인식 역치로 고려된다.

일부 구체예에서, 감미제는 약 0.5% 내지 약 12 중량%, 가령, 예를 들어, 약 1.0 중량%, 약 1.5 중량%, 약 2.0 중량%, 약 2.5 중량%, 약 3.0 중량%, 약 3.5 중량%, 약 4.0 중량%, 약 4.5 중량%, 약 5.0 중량%, 약 5.5 중량%, 약 6.0 중량%, 약 6.5 중량%, 약 7.0 중량%, 약 7.5 중량%, 약 8.0 중량%, 약 8.5 중량%, 약 9.0 중량%, 약 9.5 중량%, 약 10.0 중량%, 약 10.5 중량%, 약 11.0 중량%, 약 11.5 중량% 또는 약 12.0 중량% 양으로 음료 내에 존재한다.

특정의 구체예에서, 감미제는 약 0.5% 내지 약 10%, 가령 예를 들어, 약 2% 내지 약 8%, 약 3% 내지 약 7% 또는 약 4% 내지 약 6 중량% 양으로 음료 내에 존재한다. 특정의 구체예에서, 감미제는 약 0.5% 내지 약 8 중량% 양으로 음료 내에 존재한다. 또다른 특정의 구체예에서, 감미제는 약 2% 내지 약 8 중량% 양으로 음료 내에 존재한다.

하나의 구체예에서, 감미제는 전통적 칼로리 감미제이다. 적합한 감미제는, 비제한적으로 수크로스, 프럭토스, 글루코오스, 고 프럭토스 옥수수 시럽 및 고 프럭토스 전분 시럽을 포함한다.

또다른 구체예에서, 감미제는 에리쓰리톨이다.

여전히 또다른 구체예에서, 감미제는 희소당이다. 적합한 희소당은, 비제한적으로 D-알로스, D-프시코스, D-리보스, D-타가토스, L-글루코오스, L-푸코스, L-아라비노스, D-투란오스, D-류크로스 및 그의 조합을 포함한다.

감미제는 단독, 또는 다른 감미제와 조합하여 사용될 수 있다고 생각된다.

하나의 구체예에서, 희소당은 D-알로스이다. 더욱 특정의 구체예에서, D-알로스는 약 0.5% 내지 약 10 중량%, 가령, 예를 들어, 약 2% 내지 약 8%의 양으로 음료 내에 존재한다.

또다른 구체예에서, 희소당은 D-사이코스이다. 더욱 특정의 구체예에서, D-프시코스는 약 0.5% 내지 약 10 중량%, 가령, 예를 들어, 약 2% 내지 약 8%의 양으로 음료 내에 존재한다.

여전히 또다른 구체예에서, 희소당은 D-리보스이다. 더욱 특정의 구체예에서, D-리보스는 약 0.5% 내지 약 10 중량%, 가령, 예를 들어, 약 2% 내지 약 8%의 양으로 음료 내에 존재한다.

역시 또다른 구체예에서, 희소당은 D-타가토스이다. 더욱 특정의 구체예에서, D-타가토스는 약 0.5% 내지 약 10 중량%, 가령, 예를 들어, 약 2% 내지 약 8%의 양으로 음료 내에 존재한다.

추가 구체예에서, 희소당은 L-글루코오스이다. 더욱 특정의 구체예에서, L-글루코오스는 약 0.5% 내지 약 10 중량%, 가령, 예를 들어, 약 2% 내지 약 8%의 양으로 음료 내에 존재한다.

하나의 구체예에서, 희소당은 L-푸코스이다. 더욱 특정의 구체예에서, L-푸코스는 약 0.5% 내지 약 10 중량%, 가령, 예를 들어, 약 2% 내지 약 8%의 양으로 음료 내에 존재한다.

또다른 구체예에서, 희소당은 L-아라비노스이다. 더욱 특정의 구체예에서, L-아라비노스는 약 0.5% 내지 약 10 중량%, 가령, 예를 들어, 약 2% 내지 약 8%의 양으로 음료 내에 존재한다.

역시 또다른 구체예에서, 희소당은 D-투라노스이다. 더욱 특정의 구체예에서, D-투란오스는 약 0.5% 내지 약 10 중량%, 가령, 예를 들어, 약 2% 내지 약 8%의 양으로 음료 내에 존재한다.

역시 또다른 구체예에서, 희소당은 D-루크로스이다. 더욱 특정의 구체예에서, D-류크로스는 약 0.5% 내지 약 10 중량%, 가령, 예를 들어, 약 2% 내지 약 8%의 양으로 음료 내에 존재한다.

그의 감미 인식 역치 이하의 농도에서 감미 증가제의 부가는 감미 증가제의 부재 하의 상응하는 음료와 비교하여 감미제 및 감미 증가제를 포함하는 음료의 검출 수크로스 당량을 증가시킨다. 또한, 감미는 임의의 감미제의 부재 하의 적어도 하나의 감미 증가제동일 농도를 함유하는 용액의 검출가능 감미보다 많은 양으로 증가될 수 있다.

따라서, 본발명은 감미제를 포함하는 음료를 제공하는 단계 및 그의 감미 인식 역치 이하의 농도로 존재하는, 스테비올모노사이드 A, 스테비올바이오사이드, 스테비올바이오사이드 A, 스테비올바이오사이드 B, 루부소사이드, 스테비오사이드, 스테비오사이드 A (레바우디오사이드 KA), 스테비오사이드 B, 스테비오사이드 C, 레바우디오사이드 E, 레바우디오사이드 E2, 레바우디오사이드 E3 및/또는 레바우디오사이드 AM 또는 그의 조합, 여기서 스테비올모노사이드 A, 스테비올바이오사이드, 스테비올바이오사이드 A, 스테비올바이오사이드 B, 루부소사이드, 스테비오사이드, 스테비오사이드 A (레바우디오사이드 KA), 스테비오사이드 B, 스테비오사이드 C, 레바우디오사이드 E, 레바우디오사이드 E2, 레바우디오사이드 E3 및/또는 레바우디오사이드 AM 로부터 선택된 감미 증가제를 부가하는 단계를 포함하는, 감미제를 포함하는 음료의 감미를 증가시키는 방법을 또한 제공한다.

감미제를 함유하는 음료에, 감미 인식 역치 이하의 농도에서 스테비올모노사이드 A, 스테비올바이오사이드, 스테비올바이오사이드 A, 스테비올바이오사이드 B, 루부소사이드, 스테비오사이드, 스테비오사이드 A (레바우디오사이드 KA), 스테비오사이드 B, 스테비오사이드 C, 레바우디오사이드 E, 레바우디오사이드 E2, 레바우디오사이드 E3 및/또는 레바우디오사이드 AM의 부가는 약 1.0% 내지 약 5.0%, 가령, 예를 들어, 약 1.0%, 약 1.5%, 약 2.0%, 약 2.5%, 약 3.0%, 약 3.5%, 약 4.0%, 약 4.5% 또는 약 5.0% 검출 수크로스 당량을 증가시킬 수 있다.

다음 예시는 고도로 정제된 표적 스테비올 글리코사이드(들), 특히 스테비올모노사이드 A, 스테비올바이오사이드, 스테비올바이오사이드 A, 스테비올바이오사이드 B, 루부소사이드, 스테비오사이드, 스테비오사이드 A (레바우디오사이드 KA), 스테비오사이드 B, 스테비오사이드 C, 레바우디오사이드 E, 레바우디오사이드 E2, 레바우디오사이드 E3 및/또는 레바우디오사이드 AM의 제조를 위한 본발명의 바람직한 구체예를 예시한다. 본발명은 단지 예시적인 실시예에서 규정된 재료, 비율, 조건 및 절차에 제한되지 않음이 이해될 것이다.

실시예

실시예 1

생촉매적 공정에서 사용된 조작된 효소의 단백질 서열

SEQ ID 1:

>SuSy_At, 변이체 PM1-54-2-E05 (조작된 수크로스 신타제; WT 유전자의 공급원: 애기장대 (Arabidopsis thaliana))

MANAERMITRVHSQRERLNETLVSERNEVLALLSRVEAKGKGILQQNQII

AEFEALPEQTRKKLEGGPFFDLLKSTQEAIVLPPWVALAVRPRPGVWEYL

RVNLHALVVEELQPAEFLHFKEELVDGVKNGNFTLELDFEPFNASIPRPT

LHKYIGNGVDFLNRHLSAKLFHDKESLLPLLDFLRLHSHQGKNLMLSEKI

QNLNTLQHTLRKAEEYLAELKSETLYEEFEAKFEEIGLERGWGDNAERVL

DMIRLLLDLLEAPDPSTLETFLGRVPMVFNVVILSPHGYFAQDNVLGYPD

TGGQVVYILDQVRALEIEMLQRIKQQGLNIKPRILILTRLLPDAVGTTCG

ERLERVYDSEYCDILRVPFRTEKGIVRKWISRFEVWPYLETYTEDAAVEL

SKELNGKPDLIIGNYSDGNLVASLLAHKLGVTQCTIAHALEKTKYPDSDI

YWKKLDDKYHFSCQFTADIFAMNHTDFIITSTFQEIAGSKETVGQYESHT

AFTLPGLYRVVHGIDVFDPKFNIVSPGADMSIYFPYTEEKRRLTKFHSEI

EELLYSDVENDEHLCVLKDKKKPILFTMARLDRVKNLSGLVEWYGKNTRL

RELVNLVVVGGDRRKESKDNEEKAEMKKMYDLIEEYKLNGQFRWISSQMD

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EKYTWQIYSQRLLTLTGVYGFWKHVSNLDRLEHRRYLEMFYALKYRPLAQ AVPLAQDD

SEQ ID 2:

>UGTSl2 변이체 0234 (조작된 글루코실트랜스퍼라제; WT 유전자의 공급원: 토마토 (Solanum lycopersicum))

MATNLRVLMFPWLAYGHISPFLNIAKQLADRGFLIYLCSTRINLESIIKK

IPEKYADSIHLIELQLPELPELPPHYHTTNGLPPHLNPTLHKALKMSKPN

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SEQ ID 3:

>UGT76G1 변이체 0042 (조작된 글루코실트랜스퍼라제; WT 유전자의 공급원: 스테비아 (Stevia rebaudiana))

MENKTETTVRRRRRIILFPVPFQGHINPILQLANVLYSKGFAITILHTNFNKPKTSNYPHFTFRFILDNDPQDERISNLPTHGPLAGMRIPIINEHGADELRRELELLMLASEEDEEVSCLITDALWYFAQDVADSLNLRRLVLMTSSLFNFHAHVSLPQFDELGYLDPDDKTRLEEQASGFPMLKVKDIKSAYSNWQIGKEILGKMIKQTKASSGVIWNSFKELEESELETVIREIPAPSFLIPLPKHLTASSSSLLDHDRTVFEWLDQQAPSSVLYVSFGSTSEVDEKDFLEIARGLVDSGQSFLWVVRPGFVKGSTWVEPLPDGFLGERGKIVKWVPQQEVLAHPAIGAFWTHSGWNSTLESVCEGVPMIFSSFGGDQPLNARYMSDVLRVGVYLENGWERGEVVNAIRRVMVDEEGEYIRQNARVLKQKADVSLMKGGSSYESLESLVSYISSL

실시예 2

SEQ ID 1의 SuSy_At 변이체의 발현 및 제제화

SEQ ID 1의 SuSy_At 변이체 (실시예 1)에 대한 유전자 코딩을 발현 벡터 pLE1A17 (pRSF-1b의 유도체, Novagen) 내로 클로닝했다. 결과로서 얻어진 플라스미드를 대장균 (E.coli) BL21(DE3) 세포의 형질전환을 위해 사용했다.

세포를 카나마이신 (50 mg/l) 로 보충된 ZYM505 배지 (F. William Studier, Protein Expression and Purification (2005) 207-234) 내에서 37℃에서 배양했다. 유전자의 발현을 IPTG (0.2 mM)에 의해 로그 상에서 유도하고 30℃ 및 200 rpm에서 16-18 시간 동안 수행했다.

세포를 원심분리 (3220 x g, 20 min, 4℃)에 의해 수확하고 세포 용해 완충액 (100 mM Tris-HCl pH 7.0; 2 mM MgCl₂, DNA 누클레아제 20 U/mL, 리소자임 0.5 mg/mL)과 함께 200의 광학 밀도 (600nm (OD₆₀₀)에서 측정)까지 재-현탁시켰다. 세포를 이후 초음파처리에 의해 파괴하고 미정제 추출물을 원심분리 (18000 x g 40 min, 4℃)에 의해 세포 조각으로부터 분리했다. 상청액을 0.2 m 필터를 통한 여과에 의해 살균하고 증류수로 50:50 희석하여, 효소 활성 제제를 얻었다.

SuSy_At의 효소 활성 제제에 대해, 유닛인 활성은 다음과 같이 정의된다: 1 mU의 SuSy_At은 1 nmol의 수크로스를 프럭토스로 1 분 내 전환시킨다. 어세이에 대한 반응 조건은 30℃, 50 mM 포타슘 포스페이트 완충액 pH 7.0, t₀에서 400 mM 수크로스, 3 mM MgCl₂, 및 15 mM 유리딘 디포스페이트 (UDP)이다.

실시예 3

SEQ ID 2의 UGTSl2 변이체의 발현 및 제제화

SEQ ID 2의 UGTSl2 변이체에 대한 유전자 코딩 (실시예 1)을 발현 벡터 pLE1A17 (pRSF-1b의 유도체, Novagen) 내로 클로닝했다. 결과로서 얻어진 플라스미드를 대장균 (E.coli) BL21(DE3) 세포의 형질전환을 위해 사용했다.

세포를 카나마이신 (50 mg/l) 로 보충된 ZYM505 배지 (F. William Studier, Protein Expression and Purification (2005) 207-234) 내에서37℃에서 배양했다. 유전자의 발현을 IPTG (0.1 mM)에 의해 로그 상에서 유도하고 30℃ 및 200 rpm에서 16-18 시간 동안 수행했다.

세포를 원심분리 (3220 x g, 20 min, 4℃)에 의해 수확하고 세포 용해 완충액 (100 mM Tris-HCl pH 7.0; 2 mM MgCl₂, DNA 누클레아제 20 U/mL, 리소자임 0.5 mg/mL)과 함께 200의 광학 밀도 (600nm (OD₆₀₀)에서 측정)까지 재-현탁시켰다. 세포를 이후 초음파처리에 의해 파괴하고 미정제 추출물을 원심분리 (18000 x g 40 min, 4℃)에 의해 세포 조각으로부터 분리했다. 상청액을 0.2 μm 필터를 통한 여과에 의해 살균하고 1 M 수크로스 용액으로 50:50 희석하여, 효소 활성 제제를 얻었다.

UGTSl2의 효소 활성 제제에 대해, 유닛인 활성은 다음과 같이 정의된다: 1 mU의 UGTSl2은 1 분 내 1 nmol의 레바우디오사이드 A (RebA)를 레바우디오사이드 D (Reb D)로 전환시킨다. 어세이에 대한 반응 조건은 30℃, 50 mM 포타슘 포스페이트 완충액 pH 7.0, t0에서 10 mM RebA at t₀, 500 mM 수크로스, 3 mM MgCl₂, 0.25 mM 유리딘 디포스페이트 (UDP) 및 3 U/mL의 SuSy_At 이다.

실시예 4

SEQ ID 3의 UGT76G1 변이체의 발현 및 제제화

SEQ ID 3의 UGT76G1 변이체에 대한 유전자 코딩 (실시예 1)을 발현 벡터 pLE1A17 (pRSF-1b의 유도체, Novagen) 내로 클로닝했다. 결과로서 얻어진 플라스미드를 대장균 (E.coli) BL21(DE3) 세포의 형질전환을 위해 사용했다.

UGT76G1의 효소 활성 제제에 대해, 유닛인 활성은 다음과 같이 정의된다: 1 mU의 UGT76G1는 1 분 내 1 nmol의 레바우디오사이드 D (Reb D)를 레바우디오사이드 M (Reb M) 로 전환시킨다. 어세이에 대한 반응 조건은 30℃, 50 mM 포타슘 포스페이트 완충액 pH 7.0, t0에서 10 mM RebA at t₀, 500 mM 수크로스, 3 mM MgCl₂, 0.25 mM 유리딘 디포스페이트 (UDP) 및 3 U/mL의 SuSy_At 이다.

실시예 5

동시에 UGTSl2, SuSy_At 및 UGT76G1를 부가하여 원-포트 반응으로 스테비오사이드로부터 레바우디오사이드 AM 의 합성

레바우디오사이드 AM (reb AM)을 다음 세 가지 효소 (실시예 1, 2, 3 및 4 참조)를 사용하여 스테비오사이드로부터 원-포트 반응으로 직접 합성했다(도 3): UGTSl2 (SEQ ID 2의 변이체), SuSy_At-(SEQ ID 1의 변이체) 및 UGT76G1 (SEQ ID 3의 변이체). 최종 반응 용액은 105 U/L UGTSl2, 405 U/L SuSy_At, 3 U/L UGT76G1, 5 mM 스테비오사이드, 0.25 mM 유리딘 디포스페이트 (UDP), 1 M 수크로스, 4 mM MgCl₂ 및 포타슘 포스페이트 완충액 (pH 6.6)을 함유했다. 우선, 207 mL의 증류수를 0.24 g MgCl₂·6H₂O, 103g 수크로스, 9.9 mL의 1.5 M 포타슘 포스페이트 완충액 (pH 6.6) 및 15g 스테비오사이드와 혼합했다. 성분용해 후, 온도를 45℃로 조정하고 UGTSl2, SuSy_At, UGT76G1 및 39 mg UDP를 부가했다. 반응 혼합물을 45℃ 쉐이커에서 24 hrs 동안 배양했다. 부가적 39 mg UDP을 8시간 및 18시간에서 부가했다. 몇몇 시점에서 reb AM, reb E, 스테비오사이드, reb M, reb B, 스테비올바이오사이드 및 reb I의 함량을 HPLC에 의해 분석했다.

분석을 위해, 생전환 샘플을 17% H₃PO₄를 사용하여 반응 혼합물을 pH5.5로 조정하여 불활성화시키고 이후 10 분 동안 끓였다. 얻어진 샘플을 여과하고, 여액을 10 회 희석하고 HPLC 분석을 위한 샘플로서 사용했다. HPLC 어세이를, 펌프, 칼럼 온도 조절 장치, 오토 샘플러, 배경 보정이 가능한 UV 검출기 및 데이터 획득 시스템으로 구성된 Agilent HP 1200 HPLC 시스템 상에서 수행했다. 피분석물을 40℃에서 Agilent Poroshell 120 SB- C18, 4.6 mm x 150 mm, 2.7 μm를 사용하여 분리했다. 이동 상은 다음 두 개의 프리믹스로 이루어졌다:

- 75% 10 mM 포스페이트 완충액 (pH2.6) 및 25% 아세토니트릴을 함유하는 프리믹스 1, 및

- 68% 10 mM 포스페이트 완충액 (pH2.6) 및 32% 아세토니트릴을 함유하는 프리믹스 2.

용리 구배를 프리믹스 1로 시작하고, 50%까지 12.5 분에서 프리믹스 2로 개질하고, 13 분에서 100%까지 프리믹스 2로 개질했다. 총 실행 시간은 45 분이었다. 칼럼 온도를 40 ℃에서 유지했다. 주입 부피는 5 μL였다. 레바우디오사이드 종을 UV에 의해 210 nm에서 검출했다.

표 3은 각각의 시점에 대해 스테비오사이드의 확인된 레바우디오사이드 종으로의 전환 (면적 퍼센트)을 나타낸다. 24 시간에서 스테비오사이드 및 반응 혼합물의 크로마토그램을 각각 도 5 및 도 6에 나타낸다. 업계에서의 숙련가는 용매 및/또는 장비에서의 변화로 체류 시간이 종종 변할 수 있음을 이해할 것이다.

실시예 6

동시에 SuSy_At 및 UGT76G1 원-포트 반응으로 레바우디오사이드 E로부터 레바우디오사이드 AM 의 합성

두 개의 효소 (실시예 1, 2 및 4 참조)를 사용하여 직접 원-포트 반응으로레바우디오사이드 E (reb E)로부터 레바우디오사이드 AM (reb AM)을 합성했다 (도 4): SuSy_At-(SEQ ID 1의 변이체) 및 UGT76G1 (SEQ ID 3의 변이체). 최종 반응 용액은 405 U/L SuSy_At, 3 U/L UGT76G1, 5 mM reb E, 0.25 mM 유리딘 디포스페이트 (UDP), 1 M 수크로스, 4 mM MgCl₂·6H₂O 및 포타슘 포스페이트 완충액 (pH 6.6)를 함유했다. 우선, 37 mL의 증류수를 40.3 mg MgCl₂, 17.12g 수크로스, 1.65 mL의 1.5 M 포타슘 포스페이트 완충액 (pH 6.6) 및 5.04 g reb E와 혼합했다. 성분용해 후, 온도를 45℃로 조정하고 SuSy_At, UGT76G1 및 6.5 mg UDP를 부가했다. 반응 혼합물을 45℃ 쉐이커에서 24 hrs 동안 배양했다. 부가적 6.5 mg UDP을 8시간 및 18시간에서 부가했다. 몇몇 시점에서 reb AM, reb E, 스테비오사이드, reb A, reb M, reb B, 및 스테비올바이오사이드의 함량을 HPLC에 의해 분석했다.

75% 10 mM 포스페이트 완충액 (pH2.6) 및 25% 아세토니트릴을 함유하는 프리믹스 1, 및

68% 10 mM 포스페이트 완충액 (pH2.6) 및 32% 아세토니트릴을 함유하는 프리믹스 2.

표 4은 각각의 시점에 대해 reb E의 확인된 레바우디오사이드 종으로의 전환 (면적 퍼센트)을 나타낸다. 24 시간에서 스테비오사이드 및 반응 혼합물의 크로마토그램을 각각 도 7 및 도 8에 나타낸다. 업계에서의 숙련가는 용매 및/또는 장비에서의 변화로 체류 시간이 종종 변할 수 있음을 이해할 것이다.

실시예 7

레바우디오사이드 AM 의 정제

24 hrs 후, 실시예 5의 반응 혼합물을 pH를 H₃PO₄로 pH 5.5로 조정하여 불활성화시키고 이후 10 분 동안 끓였다. 끓인 후 반응 혼합물을 여과하고 RO 물로 5% 고체 함량으로 희석했다. 희석 용액을 YWD03 거대공극 흡착 수지 (Cangzhou Yuanwei, China)로 충전시킨 1 L 칼럼을 통해 통과시켰다. 흡착된 스테비올 글리코사이드를 5L 70% 에탄올로 용리시켰다. 수득된 용리물을 건조시까지 증발시켜 16 g의 건조 분말을 얻었고 이를 80 mL의 70% 메탄올 내에 용해시켰다. 용액을 20℃에서 3 일간 결정화시켰다. 결정을 여과로 분리하고 진공 오븐 내에서 80℃에서 18 시간 동안 건조하여 HPLC 어세이에 의해 결정된 95.92% 순도를 갖는 10.4 g의 순수한 reb AM 결정을 얻었다. reb AM의 크로마토그램을 도 9에 나타낸다. 업계에서의 숙련가는 용매 및/또는 장비에서의 변화로 체류 시간이 종종 변할 수 있음을 이해할 것이다.

실시예 8

레바우디오사이드 AM 의 구조 규명

피리딘-d5 내에 용해시킨 샘플을 사용하여, NMR 실험을 Bruker 500 MHz 분광계 상에서 수행했다. 샘플로부터의 신호와 함께, _C 123.5, 135.5, 149.9 ppm 및 δ_H 7.19, 7.55, 8.71 ppm에서의 피리딘-d5 로부터의 신호를 관찰했다.

피리딘-d ₅ 내 레바우디오사이드 AM의 ¹H-NMR-스펙트럼은 샘플의 우수한 품질을 나타낸다 (도 10 참조). HSQC (도 11 참조)은 H,H-COSY에서 관찰가능한 C-15에 긴-범위 커플링을 갖는 당 영역 내 엑소-메틸렌 기의 존재를 나타낸다(도 12). 4차 탄소 (C-13, C-16 및 C-19)의 다른 딥-필드 신호가 HMBC에 의해 검출된다 (도 13). HSQC, HMBC 및 H,H-COSY에서의 신호의 상호관계는 다음 아글리콘 구조를 갖는 스테비올 글리코사이드의 존재를 나타낸다:

HSQC 및 HMBC 신호의 상호관계는 5 아노머 신호를 나타낸다. 약 8 Hz의 아노머 프로톤의 커플링 상수 및 그의 당 연결의 넓은 신호는 β-D-글루코피라노사이드로서 이들 5 당의 확인을 가능하게 한다.

HSQC 및 HMBC와 조합하여 아노머 프로톤의 관찰은 당 연결 및 아글리콘에 대한 상호관계를 나타낸다. HSQC-TOCSY (도 14) 및 HSQC의 조합을 사용하여 당 배열의 할당을 확인했다.

위의 NMR 실험을 적용하여 프로톤 및 탄소의 화학 시프트, 주요 커플링 상수 및 주요 HMBC 상호관계를 할당했다 (표 5 참조).

표 5 (계속)

모든 NMR 데이터의 상호관계는 다음 화학 구조에 도시된 바와 같이 스테비올 아글리콘에 부착된 5 β-D-글루코피라노스를 갖는 레바우디오사이드 AM를 나타낸다:

레바우디오사이드 AM의 화학 식은 C₅₀H₈₀O₂₈이고, 이는 1128.5의 계산된 단일 동위원소 분자 질량에 해당한다. LCMS 분석을 위해, 레바우디오사이드 AM을 메탄올 내에 용해시키고 Cortecs UPLC C18 1.6μm, 50 x 2.1 mm 칼럼 상 Shimadzu Nexera 2020 UFLC LCMS 장비를 사용하여 분석했다. 1127.3의 관찰된 LCMS (음성 ESI 모드) 결과 (도 15a 및 도 15b 각각 참조)는 레바우디오사이드 AM와 일치하고 이온 (M-H)^-에 해당한다.

Reb AM의 용해도, 감미 및 풍미 개질 특성

실시예 9

용해도 및 용액 안정성 특성에 대해 Reb AM을 평가했다. 이하의 표 6a 및 6b은 표 6b의 최종 칼럼에 나타낸 총 스테비올 글리코사이드 (TSG) 퍼센트와 함께, 시험 샘플의 조성을 나타낸다.

표 6a: 시험 샘플의 조성:

표 6b

용액 안정성:

용해도 특징을 다음과 같이 측정했다. 물 내 다음 용액을 제조하고 각각 700 rpm에서 교반. 필요시 교반 2 분 및 30 초에서 열 부가. 스톱워치를 사용하여, 모든 분말이 완전히 녹기까지 걸린 시간을 측정하고 녹는 온도를 기록. 다음 표는 레바우디오사이드 D, M, 및 AM의 용해도 특징을 요약한다. 놀랍게도, Reb AM은 다른 부수적 및 주요 스테비올 글리코사이드보다 상당히 더 높은 용해도를 나타낸다.

실시예 10

Reb AM을 그의 감각 특성에 대해 평가했다.

감각 특성

스테비올 글리코사이드 분자는 그의 구조 내에 존재하는 당 모이어티의 함수인 그의 다양한 감미 프로파일에 대해 공지되어 있다. 스테비올 글리코사이드는 소수성 (스테비올) 및 친수성 (당 모이어티)를 함유하기 때문에, 임의의 상당한 검출가능 감미 인지 없이 특정 용량 수준에서 풍미 개질을 나타낼 수 있다.

Reb AM 및 다른 스테비올 글리코사이드의 이소감미(isosweet) 결정:

· 산성 물 (pH 3.2) 내 2.5%, 5%, 7.5% 및 10% 수크로스-당량과 일치하는 시험 감미제의 5 농도 수준을 확인하고, 이에 대해, 각각의 농도 수준에서 두 개의 양자택일 (2-AFC) 시험을 수행하는 40 참가자 패널을 모집했다.

· 샘플을 평가하고, 50%의 패널이 감미제로서 수크로스 샘플을 선택하고 및 50%가 선택된 감미제로서 스테비아 샘플을 선택한 점에서 이소감미 포인트를 결정했다

· 4 이소감미 농도 및 그의 상응하는 표적 감미 값을 데이터로서 사용하여 농도-반응 관계를 피팅하기 위해 Beidler 모델을 사용했다.

· 감미 강도는 당 농도 대 감미 당량의 비로서 계산된다. 예시로서, Reb AM을 평가했다.

식품 및 음료 응용용도의 맛 & 풍미 프로파일에 대한 Reb AM의 효과

맛 및 풍미프로파일에 대한 Reb AM의 효과를 평가하기 위해 일련의 실험을 수행했다. 감미 및 맛/풍미 개질은 식품 및 음료 응용용도에서 서로 영향을 미칠 수 있다. 상이한 응용용도에서의 맛 및 풍미 개질의 효과를 결정하기 위해 FEMA (Flavor and Extract Manufacturing Association)는 이하에서 논의된, 실험 1에 제시된 감미 인지 역치 결정값을 결정하는 감각 방법을 기술한다.

실험 1은 감미 인지에 거의 기여하지 않는 물 내 Reb AM 농도의 예상치를 제공한다. 감미 인지 역치 농도는 1.5% 당 수성 용액보다 상당히 적은 감미를 제공한다. 선택된 스테비올 글리코사이드에 대한 감미 인지 역치의 요약이 아래 표 11에 있다.

이하에서 추가로 논의되는 실험 2는, 비-알콜 음료의 풍미 프로파일에 대한 Reb AM의 효과를 탐구한다. 음료의 상이한 맛 특성에 대한 Reb AM의 효과를 결정하기 위해 Reb AM (시험)을 갖는 또는 없는 (대조구) 시판 라즈베리 수박 코코넛 물 샘플을 사용했다. 결과는 Reb AM을 갖는 시험 샘플이 대조구 샘플와 비교하여 실질적으로 더 높은 망고 복숭아 풍미, 코코넛 물 풍미, 및 전체적 호감을 가졌음을 나타냈다 (95% 신뢰에서).

이하에서 추가로 논의되는 실험 3는, 감미된 유제품의 맛 및 풍미 프로파일에 대한 Reb AM의 효과를 탐구한다. 감각 패널은 Reb AM을 갖는 및 없는 (대조구) 스테비아 (Reb A) 감미된, 무-당-부가 초콜렛 풍미 유단백질 쉐이크의 샘플을 시험했다. 패널은 50 ppm의 Reb AM을 함유하는 시험 샘플이 실질적으로 더 낮은 쓴맛, 금속맛, 유청 단백질 및 더 낮은 쓴 뒷맛 대조구 (95% 신뢰에서)보다 및 더 높은 코코아 풍미, 우유맛, 바닐라 풍미, 및 전체적 호감도 (95% 신뢰에서)을 가짐을 발견했다.

훈련받았고 경력이 있는 맛 패널 멤버의 그룹은 500 ppm의 Reb AM, Reb D, 또는 Reb M 샘플로 감미된 무-칼로리 레몬-라임 탄산 드링크 (CSD)를 평가했다. 패널 멤버는 Reb AM을 갖는 CSD가 다른 샘플, 특히 Reb M로 감미된 CSD와 비교하여 더 작은 감미와 실질적으로 더 작은 쓴맛 및 감미 여운을 가짐을 발견했다.

실시예 10의 실험 1:

Reb AM을 갖는 감미 인지 역치

응용용도: 중성 물

Reb AM의 1.5% 당 용액 및 상이한 용액의 감미 인지를 감각 패널이 시험하고 물 내 50 ppm의 Reb AM 용액이 1.5% 당 용액보다 실질적으로 더 낮은 감미 인지를 제공함을 발견했다. 따라서 50 ppm의 Reb AM을 인식 역치 농도로서 선택했다.

방법

다음 표 (표 13)은 FEMA (Flavor and Extract Manufacturers Association https://www.femaflavor.org/)가 발행한 "Guidance for the Sensory Testing of Flavorings with Modifying Properties within the FEMA GRAS™ Program"의 섹션 1.4.2에 요약된 방법에 따라서 인식 역치 농도의 평가를 나타낸다.

실시예 10의 실험 2:

Reb AM을 갖는 라즈베리 수박 코코넛 물

응용용도: 비-알콜 음료

요약

30명 패널 멤버는 두 세션으로 전체 수락율 및 특성 강도 (감미, 라즈베리 풍미, 수박 풍미, 코코넛 물 풍미, 염도, 쓴맛, 및 감미 뒷맛, 쓴 뒷맛)에 대해 라즈베리 수박 가향 코코넛 물의 두 샘플을 평가했다. 세션 1에서, 두 샘플은 다음을 포함했다: 1) 가게에서 구입한 라즈베리 수박 코코넛 물 대조구 샘플 및 2) Reb AM을 함유하는, 가게에서 구입한 라즈베리 수박 코코넛 물 시험 샘플. 시험의 목적은 Reb AM의 부가가 비-알콜 음료의 풍미 프로파일에 영향을 미치는지를 결정하는 것이다. 결과는 시험 샘플 Reb AM가 대조구 샘플와 비교하여 실질적으로 더 높은 망고 복숭아 풍미, 코코넛 물 풍미, 및 전체적 호감도를 가졌음을 나타냈다 (95% 신뢰에서).

목적

프로젝트 목적은 스테비아 추출물 고체의 부가가 다양한 음료 응용용도에서 중요 풍미 특성에 효과를 가지는지를 결정하는 것이다.

시험 목적

시험 목적은 가향 코코넛 물의 대조구 샘플의 풍미 프로파일 및 전체 수락율이 Reb AM를 함유하는 동일 음료의 시험 샘플과 상이한지를 결정하는 것이다.

방법

샘플

결과

표 16 (이하의)은 각각의 샘플에 대한 전체 수락율 및 평균 특성 강도 결과를 요약한다.

결과는 시험 샘플 Reb AM가 대조구 샘플와 비교하여 실질적으로 더 높은 수박 풍미, 및 전체적으로 호감을 가졌음을 나타냈다 (95% 신뢰에서). 시험 샘플 Reb AM은 대조구 샘플과 비교하여 실질적으로 더 낮은 감미 뒷맛 강도를 가졌다 (90% 신뢰에서).

결론

30명 패널 멤버는 두 세션으로 전체 수락율 및 특성 강도 (감미, 수박 풍미, 라즈베리 풍미, 코코넛 물 풍미, 떫은 맛, 인공/화학적 맛, 쓴맛, 및 감미 뒷맛, 쓴 뒷맛)에 대해 라즈베리 수박 가향 코코넛 물의 두 샘플을 평가했다. 세션 1에서, 두 개의 샘플은 다음을 포함한다: 1) 가게에서 구입한 라즈베리 수박 코코넛 물 대조구 샘플 및 2) Reb AM을 함유하는, 가게에서 구입한 라즈베리 수박 코코넛 물 시험 샘플. 시험의 목적은 Reb AM의 부가가 비-알콜 음료의 풍미 프로파일에 영향을 미치는지를 결정하는 것이다. 결과는 시험 샘플 Reb AM가 대조구 샘플와 비교하여 실질적으로 더 높은 수박 풍미, 및 전체적으로 호감을 가졌음을 나타냈다 (95% 신뢰에서). 결과의 그래프를 도 16에 나타낸다.

시험 샘플 Reb AM은 대조구 샘플과 비교하여 실질적으로 더 낮은 감미 뒷맛 강도를 가졌다 (90% 신뢰에서).

실시예 10의 실험 3:

Reb AM을 갖는 초콜렛 단백질 쉐이크

응용용도: 우유/유제품

요약

30명의 훈련받은 패널리스트는 전체 수락율 및 특성 강도 (코코아 풍미, 우유맛, 유청 단백질, 바닐라, 금속맛, 감미, 쓴맛 및 뒷맛)에 대해 초콜렛 풍미 유단백질 쉐이크의 두 개의 샘플을 평가했다. 두 개의 샘플은 다음을 포함했다: 1) 300 ppm PureCircle Reb A을 함유하는 무가당 "대조구" 샘플 및 2) 300 ppm PureCircle Reb A 및 50 ppm Reb AM을 함유하는 무가당 "시험" 샘플. 시험의 목적은 Reb AM의 부가가 우유 제품의 풍미 프로파일에 영향을 미치는지를 결정하는 것이다. 패널은 50 ppm의 Reb AM을 함유하는 시험 샘플이 실질적으로 더 낮은 쓴맛, 금속맛, 유청 단백질 및 더 낮은 쓴 뒷맛 대조구 (95% 신뢰에서)보다 및 더 높은 코코아 풍미, 우유맛, 바닐라 풍미, 및 전체적 호감도 (95% 신뢰에서)을 가짐을 발견했다. 또한, 감미 강도에 대한 상당한 영향이 없었다.

목적

시험 목적

시험 목적은 유음료 응용용도의 대조구 샘플의 미 프로파일 및 전체 수락율이 Reb AM를 함유하는 동일 음료의 시험 샘플과 상이한지를 결정하는 것이다.

방법

샘플

*= 80% CI, ** = 90% CI, ***= 95%CI

패널은 50 ppm의 Reb AM을 함유하는 시험 샘플이 대조구보다 실질적으로 더 낮은 쓴맛, 금속맛, 유청 단백질 및 더 낮은 쓴 뒷맛 (95% 신뢰에서)을 가짐을 발견했다.

패널은 50 ppm의 Reb AM을 함유하는 시험 샘플이 더 높은 코코아 풍미, 우유맛, 바닐라 풍미, 및 전체적 호감도 (95% 신뢰에서)을 가짐을 발견했다.

결론

30명의 패널리스트는 전체 수락율 및 특성 강도 (코코아 풍미, 우유맛, 유청 단백질, 바닐라, 금속맛, 감미, 쓴맛 및 뒷맛)에 대해 초콜렛 풍미 유단백질 쉐이크의 두 개의 샘플을 평가했다. 두 개의 샘플은 다음을 포함했다: 1) 300 ppm PureCircle Reb A을 함유하는 무가당 "대조구" 샘플 및 2) 300 ppm PureCircle Reb A 및 50 ppm Reb AM을 함유하는 무가당 "시험" 샘플. 시험의 목적은 Reb AM의 부가가 우유 제품의 풍미 프로파일에 영향을 미치는지를 결정하는 것이다. 패널은 50 ppm의 Reb AM을 함유하는 시험 샘플이 실질적으로 더 낮은 쓴맛, 금속맛, 유청 단백질 및 더 낮은 쓴 뒷맛 대조구 (95% 신뢰에서)보다 및 더 높은 코코아 풍미, 우유맛, 바닐라 풍미, 및 전체적 호감도 (95% 신뢰에서)을 가짐을 발견했다. 또한, 감미 강도에 대한 상당한 영향이 없었다. 결과의 그래프를 도 17에 나타낸다.

본발명 및 그의 장점을 상세히 기술하였지만, 첨부된 청구범위에서 정의된 바와 같은 본발명의 사상과 범위를 벗어남 없이 다양한 변경, 치환 및 개질이 행해질 수 있음을 이해해야 한다. 또한 본출원의 범위는 본명세서에서 기술된 본발명의 특정 구체예에 제한되는 의도가 아니다. 업계에서의 숙련가가 본개시물로부터 쉽게 이해하는 바와 같이, 여기서 기술된 상응하는 구체예와 실질적으로 동일 기능을 수행하거나 또는 실질적으로 동일 결과를 달성하는 현재 존재하는 또는 향후 개발된 조성물, 공정, 방법 및 단계가 본발명에 따라서 사용될수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> PureCircle USA Inc. <120> HIGH-PURITY STEVIOL GLYCOSIDES <130> 39227-77WO <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 808 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 Met Ala Asn Ala Glu Arg Met Ile Thr Arg Val His Ser Gln Arg Glu 1 5 10 15 Arg Leu Asn Glu Thr Leu Val Ser Glu Arg Asn Glu Val Leu Ala Leu 20 25 30 Leu Ser Arg Val Glu Ala Lys Gly Lys Gly Ile Leu Gln Gln Asn Gln 35 40 45 Ile Ile Ala Glu Phe Glu Ala Leu Pro Glu Gln Thr Arg Lys Lys Leu 50 55 60 Glu Gly Gly Pro Phe Phe Asp Leu Leu Lys Ser Thr Gln Glu Ala Ile 65 70 75 80 Val Leu Pro Pro Trp Val Ala Leu Ala Val Arg Pro Arg Pro Gly Val 85 90 95 Trp Glu Tyr Leu Arg Val Asn Leu His Ala Leu Val Val Glu Glu Leu 100 105 110 Gln Pro Ala Glu Phe Leu His Phe Lys Glu Glu Leu Val Asp Gly Val 115 120 125 Lys Asn Gly Asn Phe Thr Leu Glu Leu Asp Phe Glu Pro Phe Asn Ala 130 135 140 Ser Ile Pro Arg Pro Thr Leu His Lys Tyr Ile Gly Asn Gly Val Asp 145 150 155 160 Phe Leu Asn Arg His Leu Ser Ala Lys Leu Phe His Asp Lys Glu Ser 165 170 175 Leu Leu Pro Leu Leu Asp Phe Leu Arg Leu His Ser His Gln Gly Lys 180 185 190 Asn Leu Met Leu Ser Glu Lys Ile Gln Asn Leu Asn Thr Leu Gln His 195 200 205 Thr Leu Arg Lys Ala Glu Glu Tyr Leu Ala Glu Leu Lys Ser Glu Thr 210 215 220 Leu Tyr Glu Glu Phe Glu Ala Lys Phe Glu Glu Ile Gly Leu Glu Arg 225 230 235 240 Gly Trp Gly Asp Asn Ala Glu Arg Val Leu Asp Met Ile Arg Leu Leu 245 250 255 Leu Asp Leu Leu Glu Ala Pro Asp Pro Ser Thr Leu Glu Thr Phe Leu 260 265 270 Gly Arg Val Pro Met Val Phe Asn Val Val Ile Leu Ser Pro His Gly 275 280 285 Tyr Phe Ala Gln Asp Asn Val Leu Gly Tyr Pro Asp Thr Gly Gly Gln 290 295 300 Val Val Tyr Ile Leu Asp Gln Val Arg Ala Leu Glu Ile Glu Met Leu 305 310 315 320 Gln Arg Ile Lys Gln Gln Gly Leu Asn Ile Lys Pro Arg Ile Leu Ile 325 330 335 Leu Thr Arg Leu Leu Pro Asp Ala Val Gly Thr Thr Cys Gly Glu Arg 340 345 350 Leu Glu Arg Val Tyr Asp Ser Glu Tyr Cys Asp Ile Leu Arg Val Pro 355 360 365 Phe Arg Thr Glu Lys Gly Ile Val Arg Lys Trp Ile Ser Arg Phe Glu 370 375 380 Val Trp Pro Tyr Leu Glu Thr Tyr Thr Glu Asp Ala Ala Val Glu Leu 385 390 395 400 Ser Lys Glu Leu Asn Gly Lys Pro Asp Leu Ile Ile Gly Asn Tyr Ser 405 410 415 Asp Gly Asn Leu Val Ala Ser Leu Leu Ala His Lys Leu Gly Val Thr 420 425 430 Gln Cys Thr Ile Ala His Ala Leu Glu Lys Thr Lys Tyr Pro Asp Ser 435 440 445 Asp Ile Tyr Trp Lys Lys Leu Asp Asp Lys Tyr His Phe Ser Cys Gln 450 455 460 Phe Thr Ala Asp Ile Phe Ala Met Asn His Thr Asp Phe Ile Ile Thr 465 470 475 480 Ser Thr Phe Gln Glu Ile Ala Gly Ser Lys Glu Thr Val Gly Gln Tyr 485 490 495 Glu Ser His Thr Ala Phe Thr Leu Pro Gly Leu Tyr Arg Val Val His 500 505 510 Gly Ile Asp Val Phe Asp Pro Lys Phe Asn Ile Val Ser Pro Gly Ala 515 520 525 Asp Met Ser Ile Tyr Phe Pro Tyr Thr Glu Glu Lys Arg Arg Leu Thr 530 535 540 Lys Phe His Ser Glu Ile Glu Glu Leu Leu Tyr Ser Asp Val Glu Asn 545 550 555 560 Asp Glu His Leu Cys Val Leu Lys Asp Lys Lys Lys Pro Ile Leu Phe 565 570 575 Thr Met Ala Arg Leu Asp Arg Val Lys Asn Leu Ser Gly Leu Val Glu 580 585 590 Trp Tyr Gly Lys Asn Thr Arg Leu Arg Glu Leu Val Asn Leu Val Val 595 600 605 Val Gly Gly Asp Arg Arg Lys Glu Ser Lys Asp Asn Glu Glu Lys Ala 610 615 620 Glu Met Lys Lys Met Tyr Asp Leu Ile Glu Glu Tyr Lys Leu Asn Gly 625 630 635 640 Gln Phe Arg Trp Ile Ser Ser Gln Met Asp Arg Val Arg Asn Gly Glu 645 650 655 Leu Tyr Arg Tyr Ile Cys Asp Thr Lys Gly Ala Phe Val Gln Pro Ala 660 665 670 Leu Tyr Glu Ala Phe Gly Leu Thr Val Val Glu Ala Met Thr Cys Gly 675 680 685 Leu Pro Thr Phe Ala Thr Cys Lys Gly Gly Pro Ala Glu Ile Ile Val 690 695 700 His Gly Lys Ser Gly Phe His Ile Asp Pro Tyr His Gly Asp Gln Ala 705 710 715 720 Ala Asp Leu Leu Ala Asp Phe Phe Thr Lys Cys Lys Glu Asp Pro Ser 725 730 735 His Trp Asp Glu Ile Ser Lys Gly Gly Leu Gln Arg Ile Glu Glu Lys 740 745 750 Tyr Thr Trp Gln Ile Tyr Ser Gln Arg Leu Leu Thr Leu Thr Gly Val 755 760 765 Tyr Gly Phe Trp Lys His Val Ser Asn Leu Asp Arg Leu Glu His Arg 770 775 780 Arg Tyr Leu Glu Met Phe Tyr Ala Leu Lys Tyr Arg Pro Leu Ala Gln 785 790 795 800 Ala Val Pro Leu Ala Gln Asp Asp 805 <210> 2 <211> 442 <212> PRT <213> Solanum lycopersicum <400> 2 Met Ala Thr Asn Leu Arg Val Leu Met Phe Pro Trp Leu Ala Tyr Gly 1 5 10 15 His Ile Ser Pro Phe Leu Asn Ile Ala Lys Gln Leu Ala Asp Arg Gly 20 25 30 Phe Leu Ile Tyr Leu Cys Ser Thr Arg Ile Asn Leu Glu Ser Ile Ile 35 40 45 Lys Lys Ile Pro Glu Lys Tyr Ala Asp Ser Ile His Leu Ile Glu Leu 50 55 60 Gln Leu Pro Glu Leu Pro Glu Leu Pro Pro His Tyr His Thr Thr Asn 65 70 75 80 Gly Leu Pro Pro His Leu Asn Pro Thr Leu His Lys Ala Leu Lys Met 85 90 95 Ser Lys Pro Asn Phe Ser Arg Ile Leu Gln Asn Leu Lys Pro Asp Leu 100 105 110 Leu Ile Tyr Asp Val Leu Gln Pro Trp Ala Glu His Val Ala Asn Glu 115 120 125 Gln Gly Ile Pro Ala Gly Lys Leu Leu Val Ser Cys Ala Ala Val Phe 130 135 140 Ser Tyr Phe Phe Ser Phe Arg Lys Asn Pro Gly Val Glu Phe Pro Phe 145 150 155 160 Pro Ala Ile His Leu Pro Glu Val Glu Lys Val Lys Ile Arg Glu Ile 165 170 175 Leu Ala Lys Glu Pro Glu Glu Gly Gly Arg Leu Asp Glu Gly Asn Lys 180 185 190 Gln Met Met Leu Met Cys Thr Ser Arg Thr Ile Glu Ala Lys Tyr Ile 195 200 205 Asp Tyr Cys Thr Glu Leu Cys Asn Trp Lys Val Val Pro Val Gly Pro 210 215 220 Pro Phe Gln Asp Leu Ile Thr Asn Asp Ala Asp Asn Lys Glu Leu Ile 225 230 235 240 Asp Trp Leu Gly Thr Lys Pro Glu Asn Ser Thr Val Phe Val Ser Phe 245 250 255 Gly Ser Glu Tyr Phe Leu Ser Lys Glu Asp Met Glu Glu Ile Ala Phe 260 265 270 Ala Leu Glu Ala Ser Asn Val Asn Phe Ile Trp Val Val Arg Phe Pro 275 280 285 Lys Gly Glu Glu Arg Asn Leu Glu Asp Ala Leu Pro Glu Gly Phe Leu 290 295 300 Glu Arg Ile Gly Glu Arg Gly Arg Val Leu Asp Lys Phe Ala Pro Gln 305 310 315 320 Pro Arg Ile Leu Asn His Pro Ser Thr Gly Gly Phe Ile Ser His Cys 325 330 335 Gly Trp Asn Ser Val Met Glu Ser Ile Asp Phe Gly Val Pro Ile Ile 340 345 350 Ala Met Pro Ile His Asn Asp Gln Pro Ile Asn Ala Lys Leu Met Val 355 360 365 Glu Leu Gly Val Ala Val Glu Ile Val Arg Asp Asp Asp Gly Lys Ile 370 375 380 His Arg Gly Glu Ile Ala Glu Ala Leu Lys Ser Val Val Thr Gly Glu 385 390 395 400 Thr Gly Glu Ile Leu Arg Ala Lys Val Arg Glu Ile Ser Lys Asn Leu 405 410 415 Lys Ser Ile Arg Asp Glu Glu Met Asp Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile 420 425 430 Gln Leu Cys Arg Asn Ser Asn Lys Ser Lys 435 440 <210> 3 <211> 458 <212> PRT <213> Stevia rebaudiana <400> 3 Met Glu Asn Lys Thr Glu Thr Thr Val Arg Arg Arg Arg Arg Ile Ile 1 5 10 15 Leu Phe Pro Val Pro Phe Gln Gly His Ile Asn Pro Ile Leu Gln Leu 20 25 30 Ala Asn Val Leu Tyr Ser Lys Gly Phe Ala Ile Thr Ile Leu His Thr 35 40 45 Asn Phe Asn Lys Pro Lys Thr Ser Asn Tyr Pro His Phe Thr Phe Arg 50 55 60 Phe Ile Leu Asp Asn Asp Pro Gln Asp Glu Arg Ile Ser Asn Leu Pro 65 70 75 80 Thr His Gly Pro Leu Ala Gly Met Arg Ile Pro Ile Ile Asn Glu His 85 90 95 Gly Ala Asp Glu Leu Arg Arg Glu Leu Glu Leu Leu Met Leu Ala Ser 100 105 110 Glu Glu Asp Glu Glu Val Ser Cys Leu Ile Thr Asp Ala Leu Trp Tyr 115 120 125 Phe Ala Gln Asp Val Ala Asp Ser Leu Asn Leu Arg Arg Leu Val Leu 130 135 140 Met Thr Ser Ser Leu Phe Asn Phe His Ala His Val Ser Leu Pro Gln 145 150 155 160 Phe Asp Glu Leu Gly Tyr Leu Asp Pro Asp Asp Lys Thr Arg Leu Glu 165 170 175 Glu Gln Ala Ser Gly Phe Pro Met Leu Lys Val Lys Asp Ile Lys Ser 180 185 190 Ala Tyr Ser Asn Trp Gln Ile Gly Lys Glu Ile Leu Gly Lys Met Ile 195 200 205 Lys Gln Thr Lys Ala Ser Ser Gly Val Ile Trp Asn Ser Phe Lys Glu 210 215 220 Leu Glu Glu Ser Glu Leu Glu Thr Val Ile Arg Glu Ile Pro Ala Pro 225 230 235 240 Ser Phe Leu Ile Pro Leu Pro Lys His Leu Thr Ala Ser Ser Ser Ser 245 250 255 Leu Leu Asp His Asp Arg Thr Val Phe Glu Trp Leu Asp Gln Gln Ala 260 265 270 Pro Ser Ser Val Leu Tyr Val Ser Phe Gly Ser Thr Ser Glu Val Asp 275 280 285 Glu Lys Asp Phe Leu Glu Ile Ala Arg Gly Leu Val Asp Ser Gly Gln 290 295 300 Ser Phe Leu Trp Val Val Arg Pro Gly Phe Val Lys Gly Ser Thr Trp 305 310 315 320 Val Glu Pro Leu Pro Asp Gly Phe Leu Gly Glu Arg Gly Lys Ile Val 325 330 335 Lys Trp Val Pro Gln Gln Glu Val Leu Ala His Pro Ala Ile Gly Ala 340 345 350 Phe Trp Thr His Ser Gly Trp Asn Ser Thr Leu Glu Ser Val Cys Glu 355 360 365 Gly Val Pro Met Ile Phe Ser Ser Phe Gly Gly Asp Gln Pro Leu Asn 370 375 380 Ala Arg Tyr Met Ser Asp Val Leu Arg Val Gly Val Tyr Leu Glu Asn 385 390 395 400 Gly Trp Glu Arg Gly Glu Val Val Asn Ala Ile Arg Arg Val Met Val 405 410 415 Asp Glu Glu Gly Glu Tyr Ile Arg Gln Asn Ala Arg Val Leu Lys Gln 420 425 430 Lys Ala Asp Val Ser Leu Met Lys Gly Gly Ser Ser Tyr Glu Ser Leu 435 440 445 Glu Ser Leu Val Ser Tyr Ile Ser Ser Leu 450 455

Claims

고도로 정제된 레바우디오사이드 AM을 레바우디오사이드 AM의 감미 검출 수준 이하의 수준에서 소비가능 제품에 부가하는 것을 포함하는, 소비가능 제품에서 풍미를 증가시키는 방법, 여기서 레바우디오사이드 AM은 다음 식을 가짐:
다음 단계를 포함하는, 제 1항의 고도로 정제된 레바우디오사이드 AM을 제조하는 방법:
a. 적어도 하나의 탄소 원자를 갖는 유기 화합물을 포함하는 출발 조성물을 제공하는 단계;
b. 효소 제제, 세포 또는 미생물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 생촉매를 제공하는 단계; 상기 생촉매는 출발 조성물을 레바우디오사이드 AM로 전환가능한 적어도 하나의 효소를 포함함;
c. 상기 생촉매를 상기 출발 조성물을 함유하는 배지와 접촉시켜 레바우디오사이드 AM를 포함하는 배지를 제조하는 단계.
제 2 항에 있어서 다음 단계를 추가로 포함하는 방법:
d. 레바우디오사이드 AM를 고도로 정제된 레바우디오사이드 AM 조성물을 제공하는 배지로부터 분리하는 단계.
제 2항에 있어서, 출발 조성물은 스테비올, 스테비올모노사이드, 스테비올모노사이드 A, 스테비올바이오사이드, 스테비올바이오사이드 A, 스테비올바이오사이드 B, 루부소사이드, 스테비오사이드, 스테비오사이드 A (레바우디오사이드 KA), 스테비오사이드 B, 스테비오사이드 C, 레바우디오사이드 E, 레바우디오사이드 E2, 레바우디오사이드 E3, 다른 스테비올 글리코사이드, 폴리올, 탄수화물, 및 그의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
제 2항에 있어서, 미생물은 대장균 (E.coli), 사카로미세스 (saccharomyces) 종, 아스퍼질러스 (Aspergillus) 종, 피키아 (Pichia) 종, 바실러스 (Bacillus) 종, 및 야로위아 (Yarrowia) 종으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
제 2항에 있어서, 효소는 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법: 스테비올 생합성 효소, UDP 글루코실트랜스퍼라제, UDP 글루코오스 재생 효소, 메발로네이트 (MVA) 경로 효소, 2-C-메틸-D-에리쓰리톨-4-포스페이트 경로 (MEP/DOXP) 효소, 게라닐게라닐 디포스페이트 신타제, 코팔릴 디포스페이트 신타제, 카우렌 신타제, 카우렌 옥시다제, 카우렌산 13-히드록실라제 (KAH), 스테비올 신테타제, 데옥시자일루로스 5-포스페이트 신타제 (DXS), D-1-데옥시자일루로스 5-포스페이트 리덕토이소머라제 (DXR), 4-디포스포시티딜-2-C-메틸-D-에리쓰리톨 신타제 (CMS), 4-디포스포시티딜-2-C-메틸-D-에리쓰리톨 키나제 (CMK), 4-디포스포시티딜-2-C-메틸-D-에리쓰리톨 2,4- 시클로디포스페이트 신타제 (MCS), l-히드록시-2-메틸-2(E)-부테닐 4-디포스페이트 신타제 (HDS), l-히드록시-2-메틸-2(E)-부테닐 4-디포스페이트 리덕타제 (HDR), 아세토아세틸-CoA 티올라제, 절단된 HMG-CoA 리덕타제, 메발로네이트 키나제, 포스포메발로네이트 키나제, 메발로네이트 피로포스페이트 데카복실라제, 시토크롬 P450 리덕타제, UGT74G1, UGT85C2, UGT91D2, EUGT11, UGTSl2, UGT76G1, 또는 >85% 아미노-산 서열 동일성, >86% 아미노-산 서열 동일성, >87% 아미노-산 서열 동일성, >88% 아미노-산 서열 동일성, >89% 아미노-산 서열 동일성, >90% 아미노-산 서열 동일성, >91% 아미노-산 서열 동일성, >92% 아미노-산 서열 동일성, >93% 아미노-산 서열 동일성, >94% 아미노-산 서열 동일성, >95% 아미노-산 서열 동일성, >96% 아미노-산 서열 동일성, >97% 아미노-산 서열 동일성, >98% 아미노-산 서열 동일성, >99% 아미노-산 서열 동일성을 갖는 그의 돌연변이 변이체; 및 그의 조합.
제 3항에 있어서, 여기서 고도로 정제된 레바우디오사이드 AM 조성물 내 레바우디오사이드 AM 함량은 건조 기준 중량으로 약 95% 초과인 방법.
제 1항의 방법에 의해 제조된 소비가능 제품, 여기서 제품은 식품, 음료, 약제학적 조성물, 담배 제품, 기능성 조성물, 구강 위생 조성물, 및 화장품 조성물로 이루어진 그룹으로부터 선택됨.
제 8항에 있어서, 탄수화물, 폴리올, 아미노산 및 그의 상응하는 염, 폴리-아미노산 및 그의 상응하는 염, 당 산 및 그의 상응하는 염, 누클레오티드, 유기산, 무기산, 유기 염을 포함하는 유기 산 염 및 유기 염기 염, 무기 염, 쓴맛 화합물, 카페인, 향미료 및 풍미 성분, 떫은 맛 화합물, 단백질 또는 단백질 가수분해물, 계면활성제, 유화제, 플라보노이드, 알콜, 폴리머 및 그의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 첨가제를 추가로 포함하는 소비가능 제품.
제 8항에 있어서, 사포닌, 항산화제, 식이 섬유 공급원, 지방산, 비타민, 글루코자민, 미네랄, 보존제, 수화제, 활생균, 프리바이오틱스, 중량 관리제, 골다공증 관리제, 피토에스트로겐, 장쇄 1차 지방족 포화 알콜, 피토스테롤 및 그의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 기능성 성분을 추가로 포함하는 소비가능 제품.
제 8항에 있어서, 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 화합물을 추가로 포함하는 소비가능 제품: 레바우디오사이드 A, 레바우디오사이드 A2, 레바우디오사이드 A3, 레바우디오사이드 B, 레바우디오사이드 C, 레바우디오사이드 C2, 레바우디오사이드 D, 레바우디오사이드 D2, 레바우디오사이드 E, 레바우디오사이드 E2, 레바우디오사이드 E3, 레바우디오사이드 F, 레바우디오사이드 F2, 레바우디오사이드 F3, 레바우디오사이드 G, 레바우디오사이드 H, 레바우디오사이드 I, 레바우디오사이드 I2, 레바우디오사이드 I3, 레바우디오사이드 J, 레바우디오사이드 K, 레바우디오사이드 K2, 레바우디오사이드 KA, 레바우디오사이드 L, 레바우디오사이드 M, 레바우디오사이드 M2, 레바우디오사이드 N, 레바우디오사이드 O, 레바우디오사이드 O2, 레바우디오사이드 Q, 레바우디오사이드 Q2, 레바우디오사이드 Q3, 레바우디오사이드 R, 레바우디오사이드, 레바우디오사이드 T, 레바우디오사이드 T1, 레바우디오사이드 U, 레바우디오사이드 U2, 레바우디오사이드 V, 레바우디오사이드 W, 레바우디오사이드 W2, 레바우디오사이드 W3, 레바우디오사이드 Y, 레바우디오사이드 Z1, 레바우디오사이드 Z2, 둘코사이드 A, 둘코사이드 C, 루부소사이드, 스테비올바이오사이드, 스테비올바이오사이드 A, 스테비올바이오사이드 B, 스테비올모노사이드, 스테비올모노사이드 A, 스테비오사이드, 스테비오사이드 A, 스테비오사이드 B, 스테비오사이드 C, 스테비오사이드 D, 스테비오사이드 E, 스테비오사이드 E2, 스테비오사이드 F, NSF-02, 모그로사이드 V, Luo Han Guo, 알룰로스, D-알로스, D-타가토스, 에리쓰리톨, 브라제인, 네오헤스페리딘 디하이드로찰콘, 글리시리진산 및 그의 염, 타우마틴, 페릴라틴, 퍼난둘신, 무쿠로지오사이드, 바이유노사이드, 플로미소사이드-I, 디메틸-헥사하이드로플루오렌-디카복실산, 아브루소사이드, 페라인드린, 카르노시플로사이드, 시클로카리오사이드, 프테로카르요사이드, 폴리포도사이드 A, 브라질린, 헤르난둘신, 필로둘신, 글리시필린, 플로리진, 트릴로바틴, 디하이드로플라보놀, 디하이드로퀘르세틴-3-아세테이트, 네오아스틸리빈, 트랜스-신남알데히드, 모나틴 및 그의 염, 셀리게인 A, 헤마톡실린, 모넬린, 오슬라딘, 프테로카르요사이드 A, 프테로카르요사이드 B, 마빈린, 펜타딘, 미라쿨린, 쿠르쿨린, 네오쿨린, 클로로겐산, 시나린, 시아메노사이드, 수크랄로스, 포타슘 아세술팜, 아스파탐, 알리탐, 사카린, 시클라메이트, 네오탐, 둘신, 수오산 아드반탐, 짐네민산, 호둘신, 지지핀, 락티솔, 글루타메이트, 아스파르트산, 글리신, 알라닌, 트레오닌, 프롤린, 세린, 라이신, 트립토판, 말티톨, 만니톨, 소르비톨, 락티톨, 자일리톨, 이노시톨, 이소말트, 프로필렌 글리콜, 글리세롤, 트레이톨, 갈락티톨, 수소화 이소말툴로스, 환원된 이소말토-올리고당, 환원된 자일로-올리고당, 환원된 젠티오-올리고당, 환원된 말 토스 시럽, 환원된 포도당 시럽, 수소화 전분 가수 분해물, 폴리글리시톨, 당 알코올, L-당, L- 소르보스, L- 아라비노스, 트레할로스, 갈락토스, 람노즈, 각종 시클로덱스트린, 고리형 올리고당, 각종 말토덱스트린, 덱스트란, 수크로스, 포도당, 리불로스, 과당, 트레오스, 자일로스, 릭소스, 알트로스, 만노스, 아이도스, 락토스, 말토스, 반전당, 이소트레할로스, 네오트레할로스, 이소말툴로스, 에리쓰로스, 데옥시리보스, 굴로스, 탈로스, 에리쓰룰로스, 자일루로스, 셀로비오스, 아밀로펙틴, 글루코자민, 만노자민, 글루쿠론산, 글루콘산, 글루코노-락톤, 아베쿠오스, 갈락토자민, 사탕무 올리고사카라이드, 이소말토-올리고사카라이드 (이소말토스, 이소말토트리오스, 파노스 등), 자일로-올리고사카라이드 (자일로트리오스, 자일로비오스 등), 자일로-말단 올리고사카라이드, 겐티오-올리고사카라이드 (겐티오비오스, 겐티오트리오스, 겐티오테트라오스 등), 니게로-올리고사카라이드, 팔라티노스 올리고사카라이드, 프럭토올리고사카라이드 (케스토스, 니스토스 등), 말토테트라올, 말토트리올, 말토-올리고사카라이드 (말토트리오스, 말토테트라오스, 말토펜타오스, 말토헥사오스, 말토헵타오스 등), 전분, 이눌린, 이눌로-올리고사카라이드, 락툴로스, 멜리비오스, 라핀오스, 이성체화된 액체 당 가령 고 프럭토스 옥수수 시럽, 커플링 당, 대두 올리고사카라이드, D-프시코스, D-리보스, L-글루코오스, L-푸코스, D-투란오스, D-루크로스.