CN1330769C - 一种含异麦芽低聚糖和果糖的糖浆及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
含异麦芽低聚糖和果糖的糖浆的制备方法有三步：1、萄聚糖蔗糖酶制备与纯化：先将生长旺盛的产酶菌(明珠串球菌)加于特别的营养培养基中，在25-28℃温度下发酵，待酶活性达到高峰时终止发酵，用离心沉降法除去细菌，再经沉淀和离子交换等过程，将酶进一步纯化；2、麦芽糖制备：用市售超高麦芽糖经超过滤系统纯化而得；3、将上述纯化的麦芽糖和蔗糖以适当比例混合，并加入一定量上述制备的纯酶，在适当条件下反应，最后纯化得到的产品，其成分有：果糖、麦芽糖、潘糖、异麦芽四——九糖及其它分支糖。比现有技术生产的产品具有更多高级异麦芽低聚糖，同时还伴有20%左右的果糖，而不含或有很少葡萄糖。这种新型的产品具有更好的营养保健功能。
Description
技术领域：
本发明涉及一种多糖类及其制备方法，尤其涉及一种低聚糖(寡糖)及其制备方法。
异麦芽低聚糖(Iso-Maltose-Oligosacchride)是低聚糖中较重要的一种。它是由2～10个葡萄糖分子以α-1，6糖苷键结合而成的糖类。近年来发现异麦芽低聚糖能有效地促进人体肠道中有益细菌-双歧杆菌的繁殖，从而改善肌体各种代谢过程，增强免疫功能，由此而引起国内外食品营养界的广泛关注。各种产品相继问世，并推向市场。
这些产品的生产过程大致相同，都是以淀粉为原料，经液化和糖化分解成不同分子量的麦芽低聚糖和葡萄糖。其中部分分子量较低的麦芽低聚糖(多为四糖以下)在葡萄糖苷转移酶的作用下转化为相应的异麦芽低聚糖。因此，这些产品的共同特点是较为高级的异麦芽低聚糖(即四糖以上者)含量较低。另方面，葡萄糖的含量却比较高(占25～50％)。
发明内容：
本发明的目的在于：提供另一不同的合成过程-受体途径，以制备含有较为高级的异麦芽低聚糖伴适量的果糖，而不含葡萄糖的产品，为中、老年人和糖尿病患者的营养保健提供更多的选择。
本发明的依据是：在麦芽糖和蔗糖存在的情况下，萄聚糖蔗糖酶能将蔗糖分子分解成葡萄糖和果糖两部分，然后，再将葡萄糖转移到受体-麦芽糖分子上使之成为异麦芽三糖，后者又被作为受体，进一步转化为异麦芽四糖，依此规律不断延伸，这就使得我们有可能在可控制条件下合成具有上述特点的产品。
本发明的实现通过如几个过程：
1、萄聚糖蔗糖酶的制备与纯化培养基的配制：
首先是配制产酶培养基，其组成如下：
蔗糖2.5％，酵母膏1％，蛋白胨0.25％，磷酸氢二钾1.0％，无机盐液1.0％，加蒸馏水至100％，pH7.4-7.8。
上述无机盐液的配方为：每100毫升，硫酸镁2.0克，氯化钙0.5克，硫酸亚铁0.1克，硫酸锰0.1克和氯化钠0.1克。
上述培养基混匀后，高温消毒(121℃，30分钟)冷却至25℃±2℃备用。
酶的生产：
在无菌条件下，将产酶的菌液(常为明珠串球菌)按10％的体积接种于述培养基中，通以少量消毒空气，轻度搅拌(50转/分)于25～28℃发酵24小时左右，定时测定各项指标，包括pH、细菌生长状况、酶活力情况，直到pH下降至4.5，酶活力达到高峰时即停止发酵，将发酵液排放，并贮存于无菌罐中备用。
酶的分离与纯化：
将上述发酵液通过沉降型管式离心机离心沉淀或无机钠膜过滤系统过滤除去细菌，收集清液再将无细菌的酶液用沉淀，透析，吸附和洗涤等过程，进一步纯化，测定酶活性，置于4℃冰箱备用。纯化方法颇多，兹介绍两种：
其一是：通过加入适量聚乙二醇(分子量1500)于上述无细菌滤液中，充分混合后使其形成二相，除去下层聚乙二醇相，余下清液部分为初步纯化的酶液，经标定酶活力后，存放于4℃冰箱备用。
其二是：沉淀-透析-层析法，过程大致如下：
将硫酸铵逐步加于无细菌滤液中，使酶沉淀下来，再将沉淀物溶解于20mM，pH5.2的醋酸盐溶液中，装入透析袋，并浸在相同溶液中，在4℃条件下透析24小时，然后再经过羟磷灰石柱层析和萄聚糖凝胶过滤层析，获得纯酶，标定酶活力，置于4℃冰箱备用。
2、麦芽糖的制备
自行生产所需麦芽糖，或购买市售超高麦芽糖，然后经超过滤系统进一步纯化为95％以上的麦芽糖。
3、含异麦芽糖低聚糖和果糖的糖浆的制备与纯化
基质液的配制：
0.58M蔗糖溶液：称取蔗糖198.5克，用500毫升的蒸馏水，搅拌使溶，再加蒸馏水至总体积1000毫升。0.30M蔗糖溶液：称取蔗糖102.3克，用500毫升的蒸馏水，搅拌使溶，再加蒸馏水至总体1000毫升。
0.25M麦芽糖溶液：称取纯麦芽糖90.1克，加500毫升蒸馏水，搅拌使溶，再加蒸馏水至总体积1000毫升，(如麦芽糖为糖浆，则必须折算为干重，如溶解困难可适当加温)。
0.58M麦芽糖溶液：称取纯麦芽糖177.7克，加500毫升蒸馏水，搅拌使溶，再加蒸馏水至总体积1000毫升，(如麦芽糖为糖浆，则必须折算为干重，如溶解困难可适当加温)。
0.60M麦芽糖溶液：称取纯麦芽糖183.8克，加500毫升蒸馏水，搅拌使溶，再加蒸馏水至总体积1000毫升，(如麦芽糖为糖浆，则必须折算为干重，如溶解困难可适当加温)。
0.5％氯化钙溶液：称取0.5克氯化钙，溶解于100毫升蒸馏水中(使用当日新鲜配制)。
基质液：将上述0.58M蔗糖溶液与0.25M麦芽糖溶液以等体积混合，再根据混合液总体积加进1.0％的0.5％氯化钙溶液，充分搅拌，然后用30％醋酸缓冲液调节pH在5.2～5.4范围；或基质液：将上述0.58蔗糖溶液与0.58M麦芽糖溶液以等体积混合，再根据混合液的总体积加进1.0％的0.5％氯化钙溶液，充分搅拌，然后用30％醋酸缓冲液调节pH在5.2～5.4范围；或基质液：将上述0.30M蔗糖溶液与0.60M麦芽糖溶液以等体积混合，再根据混合液的总体积加进1.0％的0.5％氯化钙溶液，充分搅拌，然后用30％醋酸缓冲液调节pH在5.2～5.4范围。
含异麦芽低聚糖和果糖的糖浆的制备：
将上述基质液装于洁净无菌的生物反应器或玻璃容器中，根据基质液的总体积，按每毫升10单位，加入上述制备的纯酶液，并充分混匀，再调节pH在4.2～4.4范围之内。然后调节反应物温度在25℃～28℃之间，低速(50转/分)间隙搅拌24～48小时，并维持温度在上述范围内。定期测定pH，并加以调整。反应24小时后，开始取样作高压液相分析或薄板层析以决定反应终点。待反应完全时，即进行升温灭酶和纯化等过程。
产物的纯化方法：
经过升温灭酶以后的产物可通过板框压滤机过滤(工业上常用板框压滤机)除去大部分酶蛋白及其他不溶解的杂质。必要时加用活性炭，以除去色素及其他低分子杂质，同时使用阳离子和阴离子交换树脂柱，以除去盐类，有机酸及其他离子。最后经真空浓缩到所需浓度，或喷雾干燥，制得纯品。
当改变上述基质配方的比例时，则可使产物中异麦芽低聚糖的组分发生改变，由此制备多种类型的产品(详见实施例)。总之，由上知，含异麦芽低聚糖和果糖的糖浆制备方法括三个步骤：①萄聚糖蔗糖酶的制备与纯化，先将生长旺盛的产酶菌(明珠串球菌)加于特别的营养培养基中，在25℃～28℃温度下发酵，待酶活性达到高峰时终止发酵，用离心沉降法除去细菌，再经沉淀和离子交换等过程，将酶进一步纯化。②麦芽糖的制备：用市售超高麦芽糖经超过滤系统纯化而得。③将上述纯化的麦芽糖和蔗糖以适当比例混合，并加一定量上述纯酶，在适当条件下反应，最后纯化得到产品。
制出的含异麦芽低聚糖和果糖的糖浆其成分按重量为：果糖10-30％，葡萄糖0-5％，麦芽糖10-22％，潘糖5-20％，异麦芽四糖10-30％，异麦芽五糖0-3％，异麦芽六糖10-30％，异麦芽七糖0-15％，异麦芽八糖5-15％，异麦芽九糖0-10％，其它分支糖0-5％。
本发明与现有技术对比，具有的优点：
从技术本身来看，本发明采用萄聚糖蔗糖酶，而现有技术采用葡萄糖转苷酶。两者有许多不同的地方。
(1)前者我们能自行生产，后者目前尚需依赖进口，主要由于产酶菌较难得到。
(2)前者通过受体机制，在控制条件下，有可能合成不同组分异麦芽低聚糖，尤其是五糖以上者；而后者系通过糖苷键的转化来实现，因而局限性较大，尤其是四糖以上的麦芽低聚糖基本上无法转化为相应的异麦芽低聚糖。
(3)前者的反应副产品是果糖，而不是葡萄糖，加上原料是葡萄糖含量很低的麦芽糖而不是含有大量葡萄糖的淀粉水解物。这就使得本技术生产的产品应比现有技术生产的产品具有更好的营养保健功能，因它具有较高级的异麦芽低聚糖和果糖，而不含或很少含葡萄糖。
具体实施方法：
实施例1
先配制500毫升0.25M麦芽糖溶液和500毫升0.58M蔗糖溶液，倒入2000毫升三角烧瓶中，再加入10毫升0.5％氯化钙溶液，充分搅拌并用30％醋酸缓冲液调节pH至5.2～5.4，必要时煮沸和过滤，待温度降至25℃左右时加入10000单位的酶液。充分混合后，置于25℃恒温水浴，间隙搅拌24～48小时。随时测定pH，并维持在上述范围内，待反应完成后，取出三角烧瓶，加热至80～90℃，15～30分钟。然后采用厚滤纸板正压过滤，再将滤液通过一根15×100mm的阳离子和阴离子混合离子交换柱，除去盐类和其他小分子杂质，最后将纯化的糖液倒入2000毫升单口的圆底烧瓶中，真空浓缩，或于小型离心喷雾机干燥成粉。取样作高压液相或薄板层析，取得如下结果：果糖23％，麦芽糖15.7％，潘糖8.5％，异麦芽四糖16.5％，异麦芽五糖2.1％，异麦芽六糖16.7％，异麦芽七糖2.1％，异麦芽八糖8.0％，异麦芽九糖3.4％，其他分支糖4.0％。
实施例2
配制500毫升0.58M麦芽糖溶液和500毫升0.58M蔗糖溶液，倒入2000毫升三角烧瓶中，加入10毫升0.5％氯化钙溶液，充分混合后，用醋酸缓冲液调节pH至5.2～5.4，加入10,000单位萄聚糖蔗糖酶，然后按实施例1相同操作进行，得产品组分如下：
果糖20.0％，麦芽糖17.5％，潘糖10.1％，异麦芽四糖15.3％，异麦芽五糖2.0％，异麦芽六糖21.0％，异麦芽七糖10％，异麦芽八糖4.1％。
实施例3
配制500毫升0.60M麦芽糖溶液和500毫升0.3M蔗糖溶液，倒入2000毫升三角烧瓶中，加10毫升0.5％氯化钙溶液，充分混合后，用醋酸缓冲液调节pH至5.2～5.4，加入10,000单位萄聚糖蔗糖酶，然后按实施例1相同操作进行，最终产品组分如下：
果糖10.0％，麦芽糖20.2％，潘糖15.5％，异麦芽四糖2.5％，异麦芽六糖18.6％，异麦芽八糖8.0％，其他分支糖2.7％。
Claims (5)
1、一种含异麦芽低聚糖和果糖的糖浆的制备方法，其特征包括：
A、萄聚糖蔗糖酶的制备与纯化：
(1)培养基的配制：先配制产酶的培养基，其组分按重量比：蔗糖2.5％，酵母膏1％，蛋白胨0.25％，磷酸氢二钾1.0％，无机盐液1.0％，加蒸馏水至100％，pH为7.4-7.8；上述培养基混匀后，高温121℃/30分钟消毒，冷却至25℃±2℃备用；
(2)酶的生产：在无菌条件下将产酶的菌液按10％体积接种在上述培养基中，通进少量消毒空气，轻度搅拌50转/分，在25-28℃发酵24小时左右，定时洲定各项指标，包括：pH、细菌生长情况，酶活力情况，直至pH下降至4.5，酶活力达到高峰时即停止发酵，将发酵液排放，并贮存在无菌罐中备用；
(3)酶的分离与纯化：将上述发酵液通过离心沉淀或膜过滤技术除去细菌，收集清液，再将无细菌的酶液通过聚乙二醇萃取方法或沉淀—透析一层析法，将酶进行纯化，然后测定酶活性，置于4℃冰箱中备用；
B、麦芽糖的制备：
自行生产所需麦芽糖或用市售超高麦芽糖，然后经超过滤系统进一步纯化为95％以上麦芽糖；
C、含异麦芽低聚糖和果糖的糖浆的制备与纯化：
(1)基质液的配制：
将0.58M蔗糖液与0.25M麦芽糖液等体积混合，或将0.58M蔗糖液与0.58M麦芽糖液等体积混合，或将0.30M蔗糖液与0.60M麦芽糖液等体积混合；
按上述配比混合液最后容积的1％加入0.5％氯化钙，即每100毫升加入1毫升，然后用30％醋酸缓冲液调节pH值为5.2-5.4；
(2)含异麦芽低聚糖和果糖的糖浆的制备：
将上述配制基质液装于洁净、无菌的生物反应器或玻璃容器中，根据基质液总体积按每毫升10单位计算，加入A(3)步骤中得到的纯酶液，调节pH至4.2～4.4，控制温度在25～28℃之间，间隙搅拌24-48小时，反应完成后即升温灭酶，以备进一步纯化；
(3)产物的纯化：
将灭酶后的糖液通过过滤，除去蛋白质及其他不溶解的杂质，再将滤液通过阳离子和阴离子交换树脂柱除盐纯化。
2、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的无机盐液，其成分按重量比为：每100毫升中，硫酸镁2.0克，氯化钙0.5克，硫酸亚铁0.1克，硫酸锰0.1克和氯化钠0.1克。
3、根据权利求1所述的制备方法，其特征在于：所述萄聚糖蔗糖酶的纯化方法有两种：一种是：通过加入适量分子量1500的聚乙二醇，在上述无细菌滤液中充分混合后使其形成二相，除去下层聚乙二醇相，余下清液部分为初步纯化的酶液，经标定酶活力后，存放在4℃冰箱中备用；
第二个方法是：沉淀—透析一层析法，其过程：将硫酸铵逐步加在无细菌滤液中，使酶沉淀下来，再将沉淀物溶解在20mM，pH5.2的醋酸盐溶液中，装入透析袋，并浸在相同溶液中，在4℃的温度条件下透析24小时，然后再经过羟磷灰石柱层析和萄聚糖凝胶过滤层析，获得纯酶，标定酶活力，置于4℃冰箱中备用。
4、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述基质液配制，0.58M蔗糖溶液，称取蔗糖198.5克，用500毫升的蒸馏水搅拌使溶，再加蒸馏水至总体积1000毫升；0.30M蔗糖溶液，称取蔗糖102.3克用500毫升的蒸馏水搅拌使溶再加蒸馏水至总体积1000毫升。
0.25M麦芽糖溶液，称取纯麦芽糖90.1克加500毫升蒸馏水，搅拌使溶再加蒸馏水至总体积1000毫升；0.58M麦芽糖溶液，称取纯麦芽糖177.7克加500毫升蒸馏水，搅拌使溶再加蒸馏水至总体积1000毫升；0.60M麦芽糖溶液，称取纯麦芽糖183.8克加500毫升蒸馏水，搅拌使溶再加蒸馏水至总体1000毫升，0.5％氯化钙溶液，称取0.5克氯化钙溶解在100毫升蒸馏水中。
5、根据权利求1所述制备方法制备的含异麦芽低聚糖和果糖的糖浆，其特征在于：它的成分按重量比为：果糖10-30％，葡萄糖0-5％，麦芽糖10-22％，潘糖5-20％，异麦芽四糖10-30％，异麦芽五糖0-3％，异麦芽六糖10-30％，异麦芽七糖0-15％，异麦芽八糖5-15％，异麦芽九糖0-10％，其它分支糖0-5％。
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