CN107249598A - 用于生产异麦芽寡糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供通过用蔗糖和麦芽糖使产葡聚糖蔗糖酶的微生物发酵而生产寡糖的方法。所公开的方法允许通过调整pH和蔗糖与麦芽糖的初始比率而控制异麦芽寡糖的最终组成。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2014年8月22日提交的美国临时申请序列号62/0421,006和于2015年4月22日提交的美国临时申请序列号62/151,404的权益,所述临时申请的内容以其整体结合到本文中。
发明背景
膳食补充剂,有时也称作营养制品,为据称提供可包括疾病预防的医疗或健康益处的食品或食品成分(Stephen, D.F.L., Trends in Food Sci. Tech, 1995, 6:59-61)。该术语通常包括以下代表性的种类:益生菌、益生元、膳食纤维、ω-3脂肪酸和抗氧化剂(Pandey, M.等人, Asian J. Pharm. Clin. Res., 2010, 3:11-15)。由于在亚洲、美国和欧洲具有保健意识的消费者数量日益增加,膳食补充剂市场,特别是在寡糖和益生元领域,在过去的三十年里已显示出显著增长(Goffin, D.等人, Crit. Rev. Food. Sci. Nutr.,2011, 51:394-409; Roberfroid, M.B., Br. J. Nutr., 2002, 88 Suppl 2:S133-8),并且用于其生产的新的经济的方法是有需求的。
此处感兴趣的是膳食补充剂的益生元和益生菌种类。广义上,益生菌由活细菌培养物构成,例如酸奶中的那些,其通过种群支持促进健康肠道菌群的生长(Gilliland,S.E.等人, “Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food includingPowder Milk with Live Lactic Acid Bacteria (包含具有活乳酸菌的奶粉的食品中的益生菌的保健和营养性质)”, 2001, p. 1-34, World Health Organization)。然而,益生元为可促进所选的有益菌群生长(Chung, C.H.,等人, Poult. Sci., 2004, 83:1302-6)和/或对肠上皮细胞直接施加一些有益作用(因此改善营养卡路里、维生素、矿物质等的吸收)的自然界(例如膳食纤维素)或化学(例如丁酸盐)物质。由于许多益生元可克服消化屏障的阻力,原位促进期需细菌群的增殖和/或活性(Gibson G. R.等人, J. Nutr., 1995,125:1401-12; Van Loo, J.等人, Br. J. Nutr., 1999, 81:121-32),该领域的研究和开发迅速发展。此外,益生元常在食品供应尤其是发酵食品中天然存在,并且通常与大部分食品配方相容(Macfarlane, S.等人, Aliment Pharmacol. Ther., 2006, 24:701-14;Manning, T.S.等人, Best Pract. Res. Clin. Gastroenterol., 2004, 18:287-98)。根据定义,葡寡糖为益生元剂,并且许多形式市售可得。
葡寡糖为一类糖寡聚物,包括异麦芽寡糖(IMO)。IMO为具有基于α-(1→6)连接的骨架的核心结构的葡糖基糖,其可包含α-(1→4)、α-(1→3) (黑曲霉寡糖)和\或α-(1→2)(曲寡糖(kojioligosaccharides))连接的支链(Yun, J.等人, Biotechnol. Lett.,1994, 16:1145-1150)。这些糖苷键在市售IMO糖浆剂中存在(Goffin, D.等人, Crit. Rev. Food Sci. Nutr., 2011, 51:394-409.)。
Chung和Day已经通过原位产生的葡聚糖蔗糖酶对蔗糖的作用在麦芽糖受体存在下生产葡寡糖,特别是IMO (美国专利号7,291,607)。IMO为通过肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides) ATCC® 13146™蔗糖发酵的胞外产物。Chung和Day证明在纯培养研究中,这些葡寡糖(支链IMO)易被双歧杆菌属(bifidobacterium sp.)和乳酸菌属(lactobacillus sp.)利用,而不易被大肠杆菌(Escherichia coli)或沙门氏菌属(Salmonella sp.)利用(Chung, C.H.和Day, D. F., J. Ind. Microbiol. Biotechnol.,2002, 29:196-9)。
发明概述
在一个方面,本发明提供用于制备寡糖的方法,包括以下步骤:(a)使包含固定比率的蔗糖与麦芽糖的原料与产葡聚糖蔗糖酶的微生物在含水的培养基中接触;(b)在pH 4-8用细菌细胞使原料发酵;(c)去除细菌细胞;和(d)精制,其中产生的寡糖的最终组成根据所选的pH和使用的起始原料比率而不同。在一个实施方案中,连续进行步骤(a)到(c)。在另一个实施方案中,所述方法作为固定化酶或固定化细胞过程进行。在进一步的实施方案中,所述方法作为分批操作或补料分批操作进行。
在另一个实施方案中,所述蔗糖与麦芽糖的固定比率范围在比率1.5:1到7:1之间。在一个实施方案中,固定比率维持在2:1或2.33:1或2.75:1。在进一步的实施方案中,蔗糖与麦芽糖的固定比率在发酵过程期间通过添加更多蔗糖或更多麦芽糖调整。
在另一个实施方案中,所述产葡聚糖蔗糖酶的微生物为肠膜明串珠菌(特别地肠膜明串珠菌ATCC 13146或肠膜明串珠菌NRRL B-742或肠膜明串珠菌亚种mesenteroides(Tsenkovskii) van Tieghem (ATCC® 11449™),或NRRL B-1299)、柠檬明串珠菌(Leuconostoc citreum)、Leuconostoc gasicomitatum或泡菜明串珠菌(Leuconostoc kimchii)。在进一步的实施方案中,产葡聚糖蔗糖酶的微生物为融合魏斯氏菌(Weisella confusa)、食窦魏斯氏菌(Weissella cibaria)、乳球菌属(Lactococcus spp)、棘孢青霉(Penicillium aculeatum)、片球菌属(Pediococcus spp)(戊糖片球菌(pentosaceus))、变异链球菌(Streptococcus mutans)、口腔链球菌(Streptococcus oralis)、血链球菌(Streptococcus sanguinis)或乳杆菌属(Lactobacillis spp)(罗氏乳杆菌(reuteri))。
在另一个实施方案中,所述pH通过向培养基中添加酸或碱来控制。在进一步的实施方案中,所述碱包括碱土金属氢氧化物或碳酸盐。在一个实施方案中,所述碱土金属为钙。在另一个实施方案中,所述碱包括氢氧化钠。
在一个实施方案中,细菌细胞通过离心、过滤或澄清去除。在另一个实施方案中,精制去除不溶杂质。在进一步的实施方案中,精制包括脱色。在一个实施方案中,脱色使用活性木炭或活性炭。在进一步的实施方案中,脱色包括使用弱碱阴离子树脂。在又一个实施方案中,精制包括脱灰。在一个实施方案中,脱灰包括使用强酸阳离子树脂以去除金属离子。在另一个实施方案中,所述脱灰包括使用强酸随后弱碱的两步过程。在进一步的实施方案中,精制包括去除蛋白质。在另一个实施方案中,去除蛋白质包括加热,然后使含水培养基蒸发,随后离心或过滤。在一个实施方案中,去除蛋白质包括使用弱碱阴离子树脂。在另一个实施方案中,精制包括去除有机酸。在一个实施方案中,去除有机酸包括使用弱碱阴离子树脂。在另一个实施方案中,去除有机酸包括使用色谱级凝胶型钙形式的强酸阳离子交换树脂(SAC-Ca++)的液相色谱法。
在另一个实施方案中,精制包括去除甘露醇。在另一个实施方案中,去除甘露醇使用连续或脉冲液相色谱法。在进一步的实施方案中,去除甘露醇使用蒸发接着一个或两个冷却阶段以开始结晶和沉淀。
在另一个实施方案中,所产生的寡糖的最终组成包含在还原端具有一个或多个α-(1→4)以及具有聚合度3至9或3至10的α-(1→6)连接的异麦芽寡糖。在进一步的实施方案中,所述异麦芽寡糖进一步包含α-(1→4)、α-(1→3)和/或α-(1→2)分支。
另一个实施方案进一步包括作为浓缩溶液提供寡糖,任选在适合人类消耗的条件下制备。一个单独的实施方案进一步包括作为粉末提供寡糖,任选在适合人类消耗的条件下制备。在一个实施方案中,所述粉末通过干燥、喷雾干燥或冷冻干燥生产。
在本发明的另一个方面,通过上述方法生产组合物。任选地,所述组合物适合人类消耗。
本发明的另一个方面提供寡糖的制备,包括以下步骤:(a)使包含固定比率的蔗糖与麦芽糖的原料与产葡聚糖蔗糖酶的微生物在含水的培养基中接触;(b)在pH 4至8之间用细菌细胞使原料发酵;(c)去除细菌细胞;和(d)精制;其中最终产生的寡糖基本上没有灰、无机酸、残留蛋白、糖醇和有机酸。在一个实施方案中,连续进行步骤(a)到(c)。在另一个实施方案中,所述方法作为固定化酶或固定化细胞过程进行。在进一步的实施方案中,所述方法作为分批操作或补料分批操作进行。
在另一个实施方案中,所述蔗糖与麦芽糖的固定比率范围在比率1.5:1到7:1之间。在一个实施方案中,所述固定比率维持在2:1或2.33:1或2.75:1。在进一步的实施方案中,蔗糖与麦芽糖的固定比率在发酵过程期间通过添加更多的蔗糖或更多的麦芽糖予以调整。
在另一个实施方案中,所述产葡聚糖蔗糖酶的微生物为肠膜明串珠菌[特别地肠膜明串珠菌ATCC 13146或肠膜明串珠菌NRRL B-742或肠膜明串珠菌亚种mesenteroides(Tsenkovskii) van Tieghem (ATCC® 11449™),或NRRL B-1299]、柠檬明串珠菌、Leuconostoc gasicomitatum或泡菜明串珠菌。在进一步的实施方案中,所述生产葡聚糖蔗糖酶的微生物为融合魏斯氏菌、食窦魏斯氏菌、乳球菌属、棘孢青霉、片球菌属(戊糖片球菌)、变异链球菌、口腔链球菌、血链球菌或乳杆菌属(罗氏乳杆菌)。
在另一个实施方案中,所述pH通过向培养基中添加酸或碱来控制。在进一步的实施方案中,所述碱包括碱土金属氢氧化物或碳酸盐。在一个实施方案中,所述碱土金属为钙。在另一个实施方案中,所述碱包括氢氧化钠。
在一个实施方案中,细菌细胞通过离心、过滤或澄清去除。在另一个实施方案中,精制去除不溶杂质。在进一步的实施方案中,精制包括脱色。在一个实施方案中,脱色使用活性木炭或活性炭。在进一步的实施方案中,脱色包括使用弱碱阴离子树脂。在又一个实施方案中,精制包括脱灰。在一个实施方案中,脱灰包括使用强酸阳离子树脂以去除金属离子。在另一个实施方案中,脱灰包括使用强酸随后弱碱的两步过程。在进一步的实施方案中,精制包括去除蛋白质。在另一个实施方案中,去除蛋白质包括加热,然后使含水培养基蒸发,随后离心或过滤。在一个实施方案中,去除蛋白质包括使用弱碱阴离子树脂。在另一个实施方案中,精制包括去除有机酸。在一个实施方案中,去除有机酸包括使用弱碱阴离子树脂。在另一个实施方案中,去除有机酸包括使用色谱级凝胶型钙形式的强酸阳离子交换树脂(SAC-Ca++)的液相色谱法。
在另一个实施方案中,精制包括去除甘露醇。在另一个实施方案中,去除甘露醇使用连续或脉冲液相色谱法。在进一步的实施方案中,去除甘露醇使用蒸发接着一个或两个冷却阶段以开始结晶和沉淀。
在另一个实施方案中,所产生的寡糖的最终组成包含在还原端具有一个或多个α-(1→4)以及具有聚合度3至9或3至10的α-(1→6)连接的异麦芽寡糖。在进一步的实施方案中,所述异麦芽寡糖进一步包含α-(1→4)、α-(1→3)和/或α-(1→2)分支。
另一个实施方案进一步包括作为浓缩溶液提供寡糖,任选在适合人类消耗的条件下制备。一个单独的实施方案进一步包括作为粉末提供寡糖,任选在适合人类消耗的条件下制备。在一个实施方案中,所述粉末通过干燥、喷雾干燥或冷冻干燥生产。
在本发明的另一个方面,通过上述方法生产组合物。任选地,所述组合物在适合人类消耗的条件下制备。
当阅读下述说明书和权利要求书时,本发明的其它目标可对本领域技术人员显而易见。
附图简述
本发明的新特征在所附的权利要求书中具体阐述。通过参考阐述说明性实施方案(其中利用本发明的原理)的下列详述和附图,将会获得对本发明的特征和优点的更好理解,在附图中:
图1显示寡糖的分类法。
图2A描绘使用三种pH控制方法,肠膜明串珠菌ATCC 13146发酵的葡寡糖的薄层色谱(TLC),其中泳道1显示5% NaOH发酵批次;泳道2,5%石灰发酵批次;和泳道3,5%石灰蔗糖合物(lime sucrate)发酵批次。下述缩写在图中显示:Gluc.,葡萄糖;Fruc.,果糖;Suc.,蔗糖;IM2,异麦芽糖;IM3,异麦芽三糖;IM4,异麦芽四糖;M2,麦芽糖;M3,麦芽三糖;M4,麦芽四糖;M5,麦芽五糖。图2B描绘典型的HPAEC色谱图,以便比较。蓝线代表典型产物,红线代表标准品(1,4-DPx = 麦芽糖基寡糖或DPx)。
图3说明了作为时间函数的肠膜明串珠菌ATCC 13146从蔗糖和麦芽糖的葡寡糖生产模式。肠膜明串珠菌ATCC 13146的发酵用(A) 5% NaOH pH控制;(B) 5%石灰pH控制;和(C) 5%石灰蔗糖合物pH控制。通过高效液相色谱(Agilent 1200 HPLC,具有45℃的示差折光率检测器,85℃的BioRad Aminex® HPX-87K,使用0.01 M K2SO4以0.8 mL/min洗脱)分析根据所示的时间收集的发酵样品(糖类)。
图4显示HPLC分析,其中以10 mL/min流速在50℃进行阳离子树脂色谱(装载60 mL57 Brix样品),其中收集级分(各15 mL)。对于糖类(GlcOS (标记为GOS)、潘糖、麦芽糖和甘露醇,使用Agilent 1200 HPLC,45℃的示差折光率检测器,85℃的BioRad Aminex® HPX-87K,用0.01 M K2SO4以0.8 mL/min洗脱。对于有机酸(乙酸和乳酸),使用Agilent 1100HPLC,具有65℃的Aminex HPX-87H柱,用0.005 N H2SO4以1.0 mL/min洗脱,经由210 nm处的吸光度检测。
图5显示条形图,说明如通过HPLC测定的在不同pH产生的麦芽糖基-异麦芽寡糖的产物模式。条形图给出相对百分比。样品通过高效液相色谱(Agilent 1200 HPLC,45℃的示差折光率检测器,85℃的BioRad Aminex® HPX-87K,用0.01 M K2SO4以0.6 mL/min洗脱)分析。
图6显示在固定的pH 5.5时蔗糖:麦芽糖(S/M)比率对分子量分布的作用。随着S/M增加,分子量分布也增加。
图7显示在固定的蔗糖:麦芽糖(S/M)比率时pH对分子量分布的作用。随着pH向5.5降低,分子量分布增加。
图8显示每一寡聚物的产率最佳化所需要的pH值。麦芽糖和潘糖应最小化,并且更高级的寡聚物应最大化。
图9显示使用明串珠菌属NRRL B742, 1299和泡菜作为产葡聚糖蔗糖酶微生物的发酵的比较;迹线A来自使用酵母野生起子中存在的物种的样品MIMO 070814,其产生呈现线性和支链二者的低产物浓度;迹线B来自使用从泡菜衍生的明串珠菌属的混合物种的样品MIMO 070314,其产生高线性产物浓度;迹线C来自使用PWSA-柠檬明串珠菌B742的样品ISOT 071714,其产生呈现线性(DP3-8)的高产物浓度,在更大的DP分支;迹线D来自使用肠膜明串珠菌B1299的样品ISOT 070914,其产生中等产物浓度,在DP>4时分支;迹线E来自使用柠檬明串珠菌B742的样品ISOT Classic 2012,其产生呈现线性(DP 3-8)并在更大DP时分支的高产物浓度。
发明详述
本申请不限于所描述的具体方法学或特定组成,因为这些可改变。还应理解的是本文所使用的术语仅为了描述具体实施方案的目的,并且不意在限制,因为本申请的范围将仅受所附权利要求书及其等同物的限制。
除非另有定义,本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员所通常理解的相同含义。尽管在本申请的实践或检验中可使用与本文描述的那些相似的任何方法和材料或等同物,但现在描述了优选的方法和材料。本文提及的所有出版物通过引用结合到本文中,以公开和描述与引用出版物有关的方法和/或材料。
定义
如根据本公开内容所使用的,下列术语,除非另外指明,应理解为具有下列含义:
“白利糖度(Brix)”,又名Brix度(符号°Bx),指水溶液中的糖含量。一白利糖度为100克溶液中1克蔗糖,并代表作为重量百分数(% w/w)的溶液浓度。白利糖度也解释溶解的盐类、有机酸和其它增加溶液折光率的溶质。正因如此,在复杂的发酵液(发酵混合物)中其作为糖含量的定量测量不太有用,但是对于精制产品相当准确。因此,1白利糖度=每100 g物质中1 g折射的干燥固体。如果溶液包含溶解的固体而不是纯蔗糖,那么°Bx仅近似于溶解的固体含量。
“聚合度”或“DP”指给定寡糖中糖单元的数目。
“寡糖”指DP>2且<10的所有种类的聚糖。
“葡寡糖”或“GlcOS”指由以任何结构排列的葡萄糖构成的寡糖。GlcOS的一个实例为麦芽寡糖[-O-α-(1,4)-],麦芽五糖,其具有下列化学结构:
“异麦芽寡糖”或“IMO”指具有基于α-(1→6)连接的骨架的核心结构的葡糖基糖,其可包含α-(1→4)、α-(1→3) (黑曲霉寡糖)和\或α-(1→2) (曲寡糖)连接的支链。IMO的一个实例为以[-O-α-(1,6)-]连接组装的GlcOS,异麦芽五糖,其具有下列化学结构:
“麦芽糖基-异麦芽寡糖”或MIMO,指由以α-(1→4)连接终止的α-(1→6)连接构成的聚合度小于10的寡糖,特别地葡聚糖。α-(1→4)端基为麦芽糖,因此麦芽糖基-异麦芽寡糖或MIMO通过麦芽糖或其它麦芽寡糖的受体反应生产。在还原端具有单一麦芽糖基连接[-O-α-(1,4)-]连接的MIMO的一个实例为麦芽糖基-异麦芽三糖,其具有下列化学结构:
“支链MIMO”指由以α-(1→4)连接终止的α-(1→6)连接和α-(1→2)、α-(1→3)和/或α-(1→4)支链构成的聚合度小于10的寡糖,特别地葡聚糖。在1,2和1,3和/或1,4位具有葡萄糖支链连接的支链MIMO的实例具有下列结构:
“膳食补充剂”指产生健康益处的食品、食品成分或食品添加剂,包括糖类例如寡糖。
“SAC”意指强酸阳离子交换树脂,通常为具有磺酸基团,即硫酸等同物的树脂。
“SBA”意指强碱阴离子交换树脂,通常为具有游离胺基的树脂,游离胺基可相当于羟基。
“WAC”意指弱酸阳离子交换树脂,通常为具有游离羧基(pKa ~4.2)的树脂。
“WBA”意指弱碱阴离子交换树脂,通常为具有不强于相应的游离碱(pKa ~9.8)的叔胺基的树脂。
现在将详细参考某些优选的处理方法、化合物和给予这些化合物的方法。本发明不限于那些优选的化合物和方法,而是通过由此得出的权利要求定义。
发明综述
本公开内容的葡寡糖通过在麦芽糖或其它受体存在下在蔗糖上生长肠膜明串珠菌(ATCC 13146)或产生酶葡聚糖蔗糖酶的任何其它产葡聚糖蔗糖酶的微生物生产。pH在接种前根据最佳pH调整至6.5-6.8以在发酵开始时达到最大细胞生长。调整初始pH至4-8范围内的任何水平也是可能的。随着在适当原料存在下培养物中的微生物生长,发酵pH自其初始pH自然下降。细胞生长的最佳pH为6.5-6.8。最佳的酶生产和活性在5.5-6.0的范围。当达到pH 5.5时,pH控制通过添加碱性物质例如氢氧化钠维持。微生物ATCC 13146在pH 5.5表现最佳。在本发明方法的一个优选实施方案中,发酵液的pH用50%氢氧化钠水溶液调节至pH6.5,并在发酵步骤的期需时间长度期间维持在约pH 5.5。
对于最佳表现,其它产葡聚糖蔗糖酶的酶可优选不同pH。因此,在本发明的方法中,初始pH设定为所用生物细胞生长的优选pH。然后由于本发明的方法期间产生有机酸,允许pH自然降低至所使用的特定产葡聚糖蔗糖酶的酶的优选pH。如果不通过外部手段控制,发酵液的pH将继续降低直到细菌生长停止,并且期需麦芽糖基-异麦芽寡糖(IMO)的产生结束。
最期需的IMO混合物由在最佳pH 5.5进行发酵过程的细菌酶发酵期间产生。pH向高于或低于5.5的值转变可改变产率和产物IMO中存在的多种寡糖大小的混合物二者。或者,该混合物也可通过改变初始蔗糖与麦芽糖的比率以及改变钙含量而改变。
通过以期需的蔗糖与麦芽糖的比率连续加入蔗糖/麦芽糖原料可增加给定发酵中IMO的总体产生。如果pH控制通过添加碱性物质例如氢氧化钠或氢氧化钾实现,这种在产品输出和组成上的增加可不依赖于pH控制进行,或者如果使用包含蔗糖的物质例如石灰蔗糖合物并补充麦芽糖,这种在产品输出和组成上的增加可结合pH控制进行。石灰蔗糖合物,也称为石灰的糖酸盐,为其中钙与蔗糖络合的氢氧化钙形式。
所公开的方法也包括通过降低生产成本对已知商业规模的用于使用肠膜明串珠菌(ATCC 13146)发酵生产GlcOS的方法的改良。与碱相关的成本可通过使用Ca(OH)2而不是NaOH降低至约1/2.4。用一个Ca2+离子替换两个Na+离子也不需要对色谱离子交换柱脱灰,其消除两个潜在昂贵的色谱步骤。石灰蔗糖合物的使用解决了钙在水中溶解性的问题,并且蔗糖-碱用作发酵的补充原料。
已知生产方法的缺点
异麦芽寡糖的混合物一般通过固定化酶对单糖或二糖原料的作用生产,并且也可通过淀粉水解产物的转糖基作用,随后色谱分离生产。在早期的方法中,Chludzinski等人使用细菌培养物例如明串珠菌属和链球菌属表达的葡聚糖蔗糖酶(EC 2.4.1.5)产生支链异麦芽寡糖(Chludzinski, A. M.,等人, J. Bacteriol., 1974, B:1-7)。随后Roper和Koch公开了通过来自曲霉属(Aspergillus sp.)的α-转葡糖苷酶(EC 2.4.1.24)的作用从淀粉水解产物(麦芽糖和麦芽糊精)生产异麦芽寡糖混合物(Starch, 1988, 40:453-459)。
最近,报道了使用从肠膜明串珠菌分离的葡糖基转移酶。Remaud等人公开了使用初始比率为7:1的蔗糖:麦芽糖原料从胞外肠膜明串珠菌ATCC 13146葡糖基转移酶催化的反应(产生具有1-3连接的支链葡聚糖)生产具有α-(1→6)连接并在还原端具有麦芽糖的线性短支链寡糖(Remaud, M.,等人, J. Carbohydrate Chem., 1992, 11(3):359-378)。同一小组报道了用葡聚糖蔗糖酶催化的受体反应从蔗糖生产支链α-(1→2)异麦芽寡糖混合物(Remaud-Simeon, M.等人, Appl. Biochem. Biotechnol., 1994, 44:101-17)。Paul等人公开了通过分离自肠膜明串珠菌B-1299的可溶性和不溶性葡糖基转移酶对蔗糖和葡糖基受体,例如麦芽糖(或富含麦芽糖的物质,例如淀粉水解产物)、异麦芽糖、甲基α-葡萄糖苷、异麦芽三糖或葡萄糖(或富含葡萄糖的物质,例如淀粉水解产物)的作用,合成和纯化包含α-(1→2)键的支链异麦芽寡糖混合物(Paul, F.等人, 美国专利号 5,141,858)。
Chung和Day通过活发酵(live fermentation)期间原位生成的葡聚糖蔗糖酶对蔗糖的作用,在麦芽糖受体存在下,生产了在发酵期间原位生成的葡寡糖(MIMO) (美国专利号 7,291,607)。所产生的异麦芽寡糖为通过肠膜明串珠菌ATCC 13146将蔗糖发酵的胞外产物。Chung和Day证明在纯培养研究中这些葡寡糖(MIMO)易被双歧杆菌属和乳酸菌属利用,而不易被大肠杆菌或沙门氏菌属利用(Chung, C.H.和Day, D. F., J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 2002, 29:196-9)。
异麦芽寡糖的固定化酶合成已经用于生产这些化合物,但是其为需要酶分离、固定化和分离的昂贵的复杂方法,而且在终产物的纯化中可能需要更加昂贵的步骤。本发明的方法为在终产物的生产效率和纯度方面如何制备异麦芽寡糖的阶跃变化的改良。与自然原位发酵方法相比,固定化酶生产方法也产生不同的分子混合物。因此,原位方法优选用于生产天然产物,其作为膳食补充剂可比通过其它方法生产的产物更合乎需要。
用于生产异麦芽寡糖的改良方法
传统发酵是比使用固定化酶更加实用的用于工业制造葡寡糖特别是异麦芽寡糖的方法。原位产生葡聚糖蔗糖酶的活培养物也经代谢将D-果糖转化为可经济性分离的D-甘露醇。D-果糖是一种难以与异麦芽寡糖分离的化合物,并且考虑到当前关于高果糖糖浆剂的负面作用的信息,在人类营养品中使用该产物可为有害的(参见:Ouyang, X.,等人, J. Hepatol., 2008, 48(6):993-9. doi: 10.1016/j.jhep.2008.02.011. Epub 2008 Mar10; Dhingra, R.等人, Circulation, 2007, 116:480-488; Swanson, J. E.,等人, Am. J. Clin. Nutr., 1992, 55(4):851-856; and Vartanian, L. R.,等人,Am. J. Public Health, 2007, 97(4):667-75. Epub 2007 Feb 28.)
通过使用本发明的方法,产物MIMO的大小和组成可严格控制。蔗糖:麦芽糖(S/M)比率提供产物组成的主要控制,因为其决定大体DP分布。发酵混合物pH的严格控制允许产物组成的精制。特别地,在pH 6.5-5.5的范围内,产物组成的钟形曲线随着pH降低向更高DP移动,反之亦然。通过促进一个或更多葡聚糖蔗糖酶的同种型,引入特定量Ca++也决定产物MIMO的分支程度(Chae,等人, J. Microbiol. Biotechnol., 2009, 19(12):1644-1649)。
产生的MIMO的组成主要由发酵步骤中使用的细菌决定。在本发明的条件下,细菌属物种肠膜明串珠菌ATCC 13146对蔗糖/麦芽糖混合物的作用产生具有α-(1→4)和α-(1→6)连接的,具有或不具有α-(1→4)、α-(1→3)和α-(1→2)支链的IMO。肠膜明串珠菌用来催化连接反应的酶,葡聚糖蔗糖酶,先前已从各种细菌菌株分离,并用于生产类似的IMO。当麦芽糖用作受体时,通过从肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides) ATCC 13146分离的葡聚糖蔗糖酶合成的IMO具有带有α-(1→2)、α-(1→3)和/或α-(1→4)侧链的α-(1→6)骨架(Remaud, M.等人, J. Carbohyd. Chem., 1992, 11:359-378)。可以合理地假设包含α-(1→2)、α-(1→3)和α-(1→4)侧链的MIMO将会是有效的益生元。
任何产葡聚糖蔗糖酶的生物均适用于本文所描述的方法。例如,如图1所示,通过本发明方法生产的GlcOS为一个异麦芽寡糖家族,包含但不限于支链异麦芽寡糖。最终的混合物包含具有DP2-DP10的IMO,其被认为是期需的益生元(Van Loo, J.等人, Br. J. Nutr., 1999, 81:121-32)。当麦芽糖用作受体时,来自肠膜明串珠菌菌株ATCC 13146的葡聚糖蔗糖酶可靠地优选合成具有α-(1→6)连接的GlcOS。较大的GlcOS寡聚物(DP4-DP8)可具有连续的至麦芽糖的α-(1→6)连接,即MIMO。许多明串珠菌属物种也产生支链MIMO。
本发明方法可使用任何能够产生葡聚糖蔗糖酶的微生物物种,包括肠膜明串珠菌。例如,可使用肠膜明串珠菌ATCC 13146。该细菌通过其它名称为本领域技术人员所知,包括名称柠檬明串珠菌ATCC 13146、名称NRRL B-742和名称PWSA-柠檬明串珠菌B742,名称柠檬明串珠菌Farrow和名称L. amelibiosum。也可使用细菌肠膜明串珠菌亚种mesenteroides (Tsenkovskii) van Tieghem (ATCC® 11449™)、NRRL B-1299。其它有用的产葡聚糖蔗糖酶的微生物包括,但不限于,明串珠菌属(特别地肠膜明串珠菌、柠檬明串珠菌、gasicomitatum和泡菜明串珠菌)、魏斯氏菌属(特别地融合魏斯氏菌,例如NRRL # B1064)、乳球菌属(Lactococcus spp.)、链球菌属(Streptococcus spp.)(特别地变异链球菌、乳杆菌属(Lactobacillis spp.)(罗氏乳杆菌)、戊糖片球菌,特别地戊糖片球菌(ATCC#33316)和某些突变的大肠杆菌。有用的微生物也可从自然源分离,包括但不限于酵母野生起子(用于生产酵母面包的生物有机体混合物)和泡菜(蔬菜和调味品制成的传统发酵韩国食物)。
本发明方法中利用的蔗糖与麦芽糖的原料比率(S:M)为产物寡聚物化学组成的决定因素。在一个实施方案中,在分批条件下,细菌在适合支持细菌生长和固定蔗糖:麦芽糖比率的营养混合物(培养基)中生长,并让发酵持续直到在反应期间生成的所有果糖转化为甘露醇。当蔗糖耗尽时,寡糖生产完成。额外的发酵时间可通过改变DP分布的化学重组而引起MIMO的重新组织。在一些情况下,较长的链可能由延续的残留酶活形成。延续直到果糖转化为甘露醇也简化终产物的纯化。然后进行所述方法的进一步的步骤,去除失效的细菌细胞,使产品脱色和从产物寡糖中分离甘露醇和有机酸。
在商业规模上,本发明的方法在本领域技术人员所已知的设备中进行。启动发酵过程时,冲洗、清洁并灭菌整个设备系统。发酵罐充满必需的培养基组分(典型的维生素、硫酸盐、磷酸盐、盐和其它用于细菌生长的物质,例如ATCC推荐的用于生长培养的微生物的那些培养基,包括DIFCO®脱水培养基和成分)以及确定比率的蔗糖和麦芽糖。分别地,使接种物(在优选的方法中,ATCC 13146)生长直至达到OD-1 (通过UV-VIS分光光度计在660 nm处光密度或吸光度),以约1%-约10%范围的发酵中包含的量的体积加入发酵中。发酵在温度约28℃进行。发酵继续直到无果糖存在,持续时间为约25-60小时。通过微量过滤、离心或澄清从发酵液中分离细胞,然后丢弃。发酵液在约70-约80℃下通过使用颗粒状活性木炭脱色。或者,可使用粉末状活性木炭,并通过过滤去除。在约60-约65℃下,使用脉冲或模拟移动床色谱从脱色的发酵液中分离产物。然后按照需要浓缩提取物,并精制以去除不溶杂质,其可通过离心或微量过滤进行。如果目的是生产粉末产物,然后可将其喷雾干燥或冷冻干燥。
在另一个实施方案中,在补料分批条件下,本发明方法可在连续或半连续的基础上运行。可引入额外的原料以保持发酵进行并控制蔗糖:麦芽糖比率。在延续发酵期间同时可通过加入氢氧化钠、石灰、石灰蔗糖合物或另一种下述合适的碱控制pH。随着初始原料的消耗,可向培养基中加入额外的原料,蔗糖或麦芽糖。这种原料添加可用以(a)维持初始固定的蔗糖:麦芽糖比率或(b)随着发酵进行改变蔗糖:麦芽糖比率。在一个实施方案中,蔗糖与麦芽糖分开添加以达到特定的蔗糖:麦芽糖比率。在另一个实施方案中,麦芽糖与蔗糖分开添加,作为调节蔗糖:麦芽糖比率的手段。这种仅添加麦芽糖也可预防其在加入培养物之前由于与强碱连续接触而降解。可使用任一方法产生具有期需化学组成的一级MIMO终产物。
在延续发酵期间的任何时间,pH控制可利用氢氧化钠、石灰、石灰蔗糖合物或其它碱进行。当使用石灰蔗糖合物时,原料添加、蔗糖:麦芽糖比率和pH控制的调节可同时进行。这种补料分批方法可涉及用于每一原料组分和每一pH控制组分的输入泵,其允许严格控制蔗糖:麦芽糖比率和pH控制。用虹吸管吸出包含产物的发酵液,并进行本方法的其它步骤。在另一个实施方案中,向培养物中加入石灰蔗糖合物以控制pH,特别地,以维持5.5-6.8范围中的特定pH。还可同时添加额外的麦芽糖以便伴随每一pH控制剂量引入特定蔗糖:麦芽糖比率。在另一个实施方案中,蔗糖(或石灰蔗糖合物)和麦芽糖可在临用前混合、保持冷却并立即使用。以这些方式,无论使用氢氧化钠、石灰、石灰蔗糖合物或另一种碱,可同时控制蔗糖:麦芽糖比率和pH以达到期需MIMO化学组成。
在本文所公开的任何实施方案下,蔗糖:麦芽糖比率范围可从1.5:1到7:1。蔗糖:麦芽糖比率范围可从2:1到3.5:1。优选地,蔗糖:麦芽糖比率范围从2:1到3.2:1。此外,下列蔗糖:麦芽糖比率具有实用性:2:1、2.33:1、3.17:1和3.2:1。本发明方法可使用所有这些蔗糖:麦芽糖比率以提供商业上期需的用于哺乳类或鸟类消耗的,优选地用于人类消耗的产物MIMO。例如,使用本发明方法,2:1的蔗糖:麦芽糖比率产生DP范围4-7。
改变S:M比率改变所产生异麦芽寡糖分布的聚合度和平均分子量,随着麦芽糖的量相对于蔗糖增加,使其向更小的平均值移动。这显示出是对任何产葡聚糖蔗糖酶的生物的普遍效应,不依赖于菌株(Day, D.F.和Yoo, S. K., “Natural Glucans:Productionand Prospects (天然葡聚糖:生产和前景),” in R. A. Gross和C. Scholz (编辑),Biopolymers from Polysaccharides and Agroproteins (来自多糖和Agroprotein的生 物聚合物), ACS Symposium Series, American Chemical Society, Washington D.C.,2001, 786:292-300)。MIMO的分支程度可通过培养基中适当量的二价金属阳离子的存在确定。不希望受任何具体理论束缚,二价金属阳离子可通过与原料糖、活性酶或二者形成络合物影响最终的IMO组成。适当的二价金属阳离子包括,但不限于,钙(Ca++)、镁(Mg++)、锶(Sr++)、锌(Zn++)、锰(Mn++)和铁(Fe++)。
pH控制
氢氧化钠(NaOH)在发酵中常规用作pH控制试剂。例如,由于发酵期间产生有机酸,乳酸细菌,包括明串珠菌,需要大量NaOH维持用于其活跃生长的最佳pH。没有pH控制,在10小时内发酵中肠膜明串珠菌ATCC 13146的pH迅速降至pH 3.5 (学位论文, Yoo, Sun Kyun,“The Production of Glucooligosaccharides by Leuconostoc mesenteroides ATCC13146 and Lipomyces Starkeyi ATCC 74054 (通过肠膜明串珠菌ATCC 13146和斯达氏油脂酵母ATCC 74054生产葡寡糖),” 1997, Louisiana State University).
在本发明的方法中,所使用的碱可为选自碱金属或碱土金属的任何氢氧化物,包括但不限于MgO、MgOH2、CaO、CaOH2、SrO、Sr(OH)2、NaOH、LiOH和KOH。在一个实施方案中,优选氢氧化钙糖酸盐(糖二酸盐)。氢氧化钙糖二酸盐的使用允许同时加入蔗糖原料和调节pH在期需水平所需的碱。例如,大约5% CaOH2/25%蔗糖的溶液为一种期需的组合。CaOH2可作为熟石灰、石灰或氧化钙提供。在另一个实施方案中,所使用的碱可为碱土金属的碳酸盐。
本发明中获自石灰的CaOH2的使用具有经济上的优势。如下述实施例5中所示,两升发酵需要16.2 g NaOH来维持pH 5.5。使用2013年的价格信息(参见下述实施例5,表2),在大批基础上,对于10,000 L发酵,NaOH的成本为$44.55,而等量石灰的成本将会为$18.15。在工业规模上,石灰($0.14每10 kg产物)可为NaOH的低成本替代,即使维持适当的pH需要将石灰的量增加两倍或更多。石灰蔗糖合物方法($0.07每1 kg产物)更加具有吸引力,因为在22.5%蔗糖溶液中石灰的溶解度增加至5% (学位论文, Madsen, L. R. “IronMediated Precipitation of Phenol:Protein Aggregates from Sugar Cane Juice (铁介导的苯酚沉淀:来自甘蔗汁的蛋白聚集)”, Louisiana State University, BatonRouge, 2009),并且同时进料麦芽糖使观察到的产物产率随时间增加。
作为碱性反荷离子,钙离子的使用具有处理优势。在该实施方案中,使用阳离子(钙,Ca++形式)色谱交换树脂分离MIMO与有机酸和甘露醇。由于发酵液中存在高浓度的钠离子(Na+),分离期间使用的树脂中用钠离子代替钙离子(Ca++)。在处理期间,钙离子的存在减缓使分离树脂再生的需要。因此,在本方法中,基于钙离子的碱的使用降低生产MIMO的总体成本。
产物纯化
在本发明方法下,如通过果糖至甘露醇的转化测定的,发酵完成后,从发酵混合物分离MIMO。或者,如果终产物需要,发酵继续一定量的时间以允许产生的MIMO自发地将其自身重排为更长的链。该重排所需的时间量可通过如本文所述进行实验确定,以优化期需的MIMO链长度。
然后从发酵混合物去除细菌细胞,然后经受两步(强酸/弱碱)脱灰过程,然后脱色。然后通过结晶过程去除甘露醇,然后产物MIMO任选可通过色谱法与副产物分离。
或者,如通过果糖至甘露醇的转化测定的,发酵完成后,从发酵混合物分离MIMO。在进一步的实施方案中,发酵继续一定量的时间以允许产生的MIMO自发地将其自身重排为更长的链。重排所需的时间量可通过如本文所述进行实验确定,以优化期需的MIMO链长度。
从发酵混合物去除细菌细胞,然后脱色,并经受两步脱灰过程:强酸随后弱碱。然后通过使用单一或复合结晶过程去除甘露醇。产物MIMO可任选通过色谱法与剩余的副产物分离。
用于去除细菌细胞的合适方法包括离心、过滤或化学澄清。在一个实施方案中,使用离心。分离的类型包括使用水平倾析器、乳油分离器/盘式离心机连续液体或分批离心,和/或化学澄清随后倾析和/或过滤。过滤的类型包括,但不限于,超滤、微量过滤或凝胶过滤。
用于脱色的合适方法包括,但不限于,pH缓冲或不缓冲下使用粉末或颗粒状形式的活性木炭(例如菱镁矿),并且可以以分批或连续(例如柱子)模式进行。也可使用活性木炭。合适的粉末状炭为Carbochem CA-50 (Carbochem Inc., Wynnewood, PA)或等同的活性炭。在分批模式下,脱色炭在约60-约70℃加入,让大批混合物冷却至温度约40℃,并且搅拌后加入助滤剂。过滤大批混合物以产生脱色的液体。
在连续模式下,将大批液体在约65-约70℃通过装满颗粒活性炭的柱子。一旦饱和,炭可通过用碱性乙醇或等同物(Bento)处理而干燥或再生。合适的助滤剂的实例包括,但不限于,二氧化硅、硅藻土(diatomaceous earth、diatomite和kieselguhr)。合适的商标名包括Celite® 545 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)和Celatom® (Sigma-Aldrich)。过滤器的级别根据使过滤以最佳速率发生的期需时间而选择,因为越精细的级别将会显著减慢过滤。
在一个优选的实施方案中,大批副产物甘露醇可通过浓缩混合物并冷却直至结晶发生而去除。然后晶体可通过倾析、过滤或使用篮式离心机而分离。或者,可使用有机溶剂例如乙醇进行产物的分级沉淀。
在另一个实施方案中,甘露醇和有机酸可通过连续或脉冲色谱法进一步去除。(参见图5)。例如,可利用保持在45-70℃的钙形式的色谱级凝胶型强酸交换(SAC)树脂(SAC-Ca)。由色谱法产生两个主要级分:1) MIMO加乙酸;和2)甘露醇加乳酸。在完成色谱后MIMO级分中可残留一些乳酸和一些乙酸是可能的,而不干扰进一步处理。
如果期需脱灰,可如Saska和Chen (美国专利号 6,451,123)所描述的使用部分游离碱形式的阴离子交换树脂。或者,包含寡糖产物的级分可通过利用酸/碱组合的离子交换树脂去除存在的任何重金属离子而进一步纯化。实例组合包括,但不限于,SAC/SBA、SAC/WBA、WAC/SBA和WAC/WBA,串联或作为混合树脂床使用。
在一个优选的实施方案中,脱色发生在脱灰之前,以保护脱灰树脂免受发色体的污染。WBA vs SBA的使用也提供三个关键改良:(1) WBA去除所有有机酸,否则该有机酸通过液相色谱法将仅部分去除,(2) 去除发酵液中的任何残留蛋白,和(3) 去除通过活性炭步骤未被去除的任何残留颜色。去除残留颜色是重要的,因为无该步骤树脂可被不可逆地污染。通过使用这种特定的脱灰装置,用于终产物精制的额外下游选择除液相色谱法之外例如甘露醇结晶变得可用或可用二者组合。
在进一步的实施方案中,包含MIMO的液体通过蒸发浓缩以产生具有白利糖度范围约20-约70的溶液(克折光干燥固体/100g)。其它可能的白利糖度范围为约30-约65、约50-约60、约55-约65和约55-约59。对于特定终产物用途可优选其它白利糖度范围。
在另一个实施方案中,甘露醇可通过连续或脉冲色谱法进一步去除。参见图5。例如,可使用保持在45-70℃的钙形式的色谱级凝胶型强酸交换(SAC)树脂(SAC-Ca)。从色谱法产生两种主要级分,MIMO和甘露醇,MIMO级分中保留一些残留甘露醇。
在进一步的实施方案中,包含MIMO的液体通过蒸发浓缩以产生具有白利糖度范围20-70的溶液(克折光干燥固体/100g)。其它可能的白利糖度范围为约30-约65、约50-约60、约55-约65和约55-约59。对于特定终产物用途可优选其它白利糖度范围。
在又一个实施方案中,MIMO通过喷雾干燥或通过冷冻干燥或其它形式的真空蒸发制成粉末。或者,纯化的液体可用乙醇或相似的溶剂沉淀以产生易干燥的固体产物。
下列实施例通过说明的方式而非通过限制的方式提供。
实施例
实施例1
细菌菌株和培养基的制备
柠檬明串珠菌购自美国典型培养物保藏中心(ATCC 13146, Manassas, VA)。再分离后,菌株在20%甘油中保存于-74℃冰箱。该两升培养物在由蔗糖(100 g/L)、麦芽糖(50 g/L)、酵母提取物(5 g/L)、MgSO4·7H2O (0.2 g/L)、FeSO4·7H2O (0.01 g/L)、NaCl (0.01g/L)、MnSO4·7H2O (0.01 g/L)、CaCl2 (0.05 g/L)、KH2PO4 (3 g/L,pH 6.5)构成的培养基中在28℃生长。对于两升发酵,将酵母提取物(10 g)、MgSO4·7H2O (400 mg)、FeSO4·7H2O(20 mg)、NaCl (20 mg)、MnSO4·7H2O (20 mg)、CaCl2 (100 mg)和KH2PO4 (6 g)溶解在蒸馏水(1250 mL)中,并在接种前使用6 M NaOH调节至pH 6.5。混合物在120℃高压灭菌15 min。麦芽糖(100 g/250 mL)和蔗糖(200 g/500 mL)溶液在转移至发酵罐之前灭菌。
实施例2
pH控制物质和制备
比较石灰与氢氧化钠(NaOH)的pH控制能力。氢氧化钠颗粒购自Fisher Scientific(Hanover Park, IL),氢氧化钙粉末购自Batesville Marble Hydrated Lime (ArkansasLime Company, Batesville, AR)。NaOH (5% w/v, 1.25M, 1.25M eq. [OH-]),和石灰(5%w/v, 0.68M, 1.35M eq. [OH-])溶液通过溶解各自50 g在1 L蒸馏水中制备。为了制备5%石灰蔗糖合物溶液,将石灰粉末(50 g在1 L瓶中)和蔗糖(250 g在805 mL蒸馏水中)分别高压灭菌。高压灭菌后,将蔗糖溶液转移至50 g石灰中,以产生在25%蔗糖中5%石灰的终溶液浓度,并且给出标识“5%石灰蔗糖合物”。还单独制备麦芽糖溶液(1L,12.5%)。
实施例3
发酵和pH控制
分批发酵使用2L BioFlo II发酵罐(New Brunswick Scientific, New Brunswick,NJ)进行。以工作体积的1.0% (20 mL)从对数晚期摇瓶种子培养物接种发酵罐。发酵在28℃以200 rpm搅拌进行。
随着细胞产生有机酸,培养物的pH从初始pH 6.5降低,并且继续下降直至pH达到5.5 (对使用的葡聚糖蔗糖酶最佳)时自动控制开始。这耗费约5.5小时。使用5% NaOH (w/v)、5%石灰(w/v)或5%石灰蔗糖合物(连同12.5% w/v麦芽糖溶液)维持pH在5.5直到发酵完成(约30小时)。使用5%石灰蔗糖合物和12.5%的麦芽糖进料调节pH并维持蔗糖与麦芽糖比率在2:1。对于石灰蔗糖合物方法,在最初18小时内石灰蔗糖合物和麦芽糖以同样的流速分开进料以控制pH,然后替换为石灰溶液持续12小时直至终点(30小时)以避免最终发酵液中的残留果糖。
实施例4
MIMO、甘露醇和有机酸的纯化
收获后,通过10,400g离心20 min去除细胞。向无细胞培养液中加入活性木炭(5g/L,Sigma, St. Louis, MO; 100~400目)和Celite 545 (1 g/L, Fisher Scientific,Hanover Park, IL),并在50℃混合20 min。培养液过滤通过3号滤纸(Whatman,Maidstone, England)以去除炭。过滤的培养液使用Yamato旋转蒸发仪RE71 (Yamato,Santa Clara, CA)在65℃-85℃浓缩至57 g/100g (白利糖度)。
使用具有预溶胀的Dowex Monosphere 99 320树脂(磺化苯乙烯-DVB, 300-330 μm, 凝胶, 1.5 eq/L [H+], Ca++形式; Dow, Midland, MI)的阳离子交换色谱(6.0 x 70cm柱)分离MIMO。(参见图5)。通过定期测量折光计白利糖度(Atago Pallet)实时监测洗脱。在洗脱期间,丢弃空隙体积,然后收集级分并通过HPLC分析糖类和酸类二者。
基于HPLC分析(或白利糖度)的结果,合并包含MIMO:乙酸或甘露醇:乳酸的MIMO级分。浓缩至30白利糖度后,通过乙醇沉淀(70%乙醇)将甘露醇与乳酸分离。沉淀的固体级分(甘露醇)用100%乙醇再次洗涤,并在55℃空气干燥。冷冻干燥MIMO级分和乳酸级分。乙酸为挥发性的,并且在冻干期间将大部分乙酸去除。(参见图3)
实施例5
MIMO、甘露醇和有机酸的纯化
收获后,通过9-14k*g离心20-30 min去除细胞。向无细胞培养液中加入活性木炭(0.5-3.0 % w/w, Carbochem DC-50,或等同物),并在40-70℃混合20-60 min。培养液过滤通过上部覆盖硅藻土助滤剂(快速流动,Celite 545或等同物,1.0-6.0 % w/w)的3号滤纸(Whatman, Maidstone, England)以去除炭。过滤的培养液使用Buchi R-220旋转蒸发仪在65℃-85℃浓缩至57 g/100g (白利糖度)。
实施例6
比较用石灰、石灰蔗糖合物或氢氧化钠的MIMO生产
使用石灰而不是NaOH控制pH,根据Chung和Day (2004, Poult. Sci., 83:1302-6)的方法从肠膜明串珠菌ATCC 13146生产GlcOS。进程通过TLC监测。GlcOS产物(在图2中通过箭头指示)主要为DP3 (聚合度,潘糖)到DP6多糖,Rf值既不与麦芽寡糖(M2-M5)对应,也不与异麦芽寡糖(IM2-IM4)对应。
如通过TLC评估的,一旦发酵完成,关于总GlcOS,比较使用5% NaOH或5%石灰或5%石灰蔗糖合物控制pH以及用12.5%麦芽糖产生的GlcOS (DP≥3)、甘露醇和麦芽糖的产率,如通过HPLC测定的。表1显示以糖进料的重量百分比计的GlcOS产生。
表1
产物 | NaOH | 石灰 | 石灰蔗糖合物 |
GlcOS (DG>3) | 42.40 + 1.50 | 41.40 + 0.51 | 40.00 + 1.35 |
甘露醇 | 32.45 + 1.49 | 32.42 + 0.82 | 31.15 + 1.26 |
麦芽糖 | 12.85 + 1.61 | 12.45 + 0.31 | 12.96 + 0.80 |
使用石灰,产率(% GlcOS (DP≥3)/总糖量输入) (42.4±0.51 %)与NaOH (41.1±1.50 %)对照相似(表1)。在所有的发酵中,GOS (DP≥3)和甘露醇的产生在接种后大约15 h和21 h完成,取决于所使用的pH控制类型(图4)。使用5%石灰蔗糖合物,最终GlcOS产生(387.7 g)大于用NaOH (表2)的最终GlcOS产生,并且40.0±1.35 %的产率(GlcOS (DP≥3)/总糖量输入)略微低于使用5% NaOH观察到的42.4±1.50 % (表1)。
表2
a用于2L发酵的NaOH和石灰的量。
b终产物为GlcOS (DP≥3)、甘露醇和麦芽糖。
cNaOH的价格($550每公吨),按照2013年5月全球化工市场情报服务ICIS价格(在世界万维网URL icis.com/Articles/2013/05/02/9664807/three-us-producers-announce-price-initiatives-for-caustic.html)。在美国的氢氧化钙价格($138每公吨)(个人通信,M. Michael Miller, Lime Specialist, U.S. Geological Survey, 2013年12月3日)。
两升发酵需要16.2 g NaOH、26.3 g石灰和21.5 g石灰蔗糖合物以维持最佳pH。计算NaOH或石灰相对于各自的产物产率的成本并在表2中给出。
实施例7
麦芽糖基-异麦芽寡糖产物模式的pH控制
麦芽糖基-异麦芽寡糖通过生物肠膜明串珠菌ATCC 13146在麦芽糖存在下使蔗糖发酵而生产。通常,随着生物生长,发酵培养基的pH从其优选的初始pH 6.5-6.8下降至5.5-4.5。在该实施例中,麦芽糖基-异麦芽寡糖在三种不同pH (pH 6.5、pH 6.0和pH 5.5)下发酵生产。
分批发酵在10L BioFlo发酵罐(New Brunswick Scientific, New Brunswick,NJ)中进行。以工作体积的1.0% (100 mL)从对数晚期摇瓶种子培养物接种发酵罐。发酵在28℃以200 rpm搅拌进行。为了维持发酵,培养基初始设置在pH 6.5,并且在发酵期间允许下降至pH 5.5,之后通过自动pH控制使用10 N NaOH进料维持pH 5.5。如果需要不同的过程pH值,使用相同的方法,除了将自动控制设置在期需的发酵pH开始。
使用高效液相色谱(Agilent 1200 HPLC,45℃的示差折光率检测器,85℃的BioRad Aminex HPX-87K,用100%水以0.6 mL/min洗脱)定量分析糖类。使用由麦芽糖、潘糖、甘露醇、葡萄糖和果糖构成的三点曲线使仪器标准化。所产生的麦芽糖基-异麦芽寡糖的最终模式根据发酵过程期间维持的pH而不同。如图6中所示,表3数据的条形图,较低的pH产生较长的麦芽糖基-异麦芽寡糖的寡聚物(DP 4-7),而较高的pH产生较短的麦芽糖或潘糖寡聚物(DP 2-3)。
表3
pH | 麦芽糖(DP2) | 潘糖(DP3) | DP4 | DP5 | DP 6-7 |
5.5 | 5.58 | 21.37 | 37.75 | 25.45 | 9.86 |
6.0 | 9.41 | 27.02 | 36.44 | 19.88 | 7.25 |
6.5 | 9.07 | 31.98 | 35.39 | 17.33 | 6.24 |
图7显示在固定pH 5.5时蔗糖:麦芽糖(S/M)比率对分子量分布的作用。随着S/M增加,分子量分布也增加。额外的实验在三个不同的发酵pH下进行。在三个不同pH下的这些发酵期间,汇集各糖组分的概况,并包括监测细胞生长密度、蔗糖、麦芽糖、甘露醇、单体(葡萄糖、果糖)和麦芽糖基-异麦芽寡糖聚合物(DP 3-7)。
实施例8
蔗糖:麦芽糖比率对产物组成的作用
根据前述方法生产寡糖。然而,改变蔗糖与麦芽糖的比率(S/M)以测定用于生产在各种聚合度(DP)范围内的麦芽糖基-异麦芽寡糖的最佳比率。通过HPAEC-PAD (使用配有Carbopac PA-100柱和脉冲安培检测器Thermo Dionex ICS-5000的高压离子交换色谱)分析发酵样品。
图8显示当S/M固定在2:1时,pH的作用。很显然pH越接近酶的最佳条件,高分子量寡糖的比例越大。也很明显pH<6.8时麦芽糖的转换变得更有效,并且潘糖以更高的速率糖化。
实施例9
不同的产葡聚糖蔗糖酶的微生物的使用
通过如对于本发明阐述的相同方法评估明串珠菌属ATCC 13146和泡菜。泡菜汁通过PCR测序以检查16SrRNA以测定泡菜汁中的细菌物种和证实能制造葡聚糖蔗糖酶的明串珠菌属(占汁液中存在的细菌的72.5%)的存在。参见下表4。在NRRL 1299的情况下,该物种从ATCC提供的复苏冻干的分离物培养。对于泡菜,使用有活性的发酵汁液作为接种物。在每一情况下,制备糖和营养培养基后,在发酵罐中原位灭菌,然后接种。通过生长细菌至OD-1(通过UV-VIS分光光度计在660 nm处的光密度或吸光度)制备接种物。初始发酵时,发酵罐中的pH使用氢氧化钠调节至6.5。如本发明所描述的,培养基的发酵进行25-65小时直至完成。发酵期间,允许pH下降至5.5,然后通过控制加入氢氧化钠维持在5.5。然后使用离心去除细胞,并用粉末状炭将所得的澄清液体脱色。所得培养液然后通过色谱法纯化。将所得纯化液体浓缩至55-65白利糖度,并离心所得的糖浆以去除蛋白质和其它固体。
表4
样品ID | 物种 | 泡菜汁 |
NR 102781 | 肉色明串珠菌(Leuconostoc carnosum) JB16 | 6.8% |
NR 074997 | Leuconostoc gasicomitatum LMG | 42.1% |
NR 102984 | 硬明串珠菌(Leuconostoc gelidum) JB7 | 12.2% |
NR 025204 | Leuconostoc inhae strain IH003 | 2.6% |
如上所述通过PCR (16ssRNA)对泡菜的评估证明用混合的明串珠菌属物种发酵能够产生葡聚糖蔗糖酶和期需的MIMO产物。另外,片球菌属物种,例如戊糖片球菌,也可产生期需的MIMO产物。图9中显示的数据证明,本发明方法也可使用单独和混合培养的除肠膜明串珠菌之外的产葡聚糖蔗糖酶的微生物。
实施例10
商业规模生产
柠檬明串珠菌购自美国典型培养物保藏中心(ATCC 13146, Manassas, VA)。再分离后,菌株在20%甘油中保存于-74℃冰箱。该两升培养物在由蔗糖(100 g/L)、麦芽糖(50 g/L)、酵母提取物(5 g/L)、MgSO4·7H2O (0.2 g/L)、FeSO4·7H2O (0.01 g/L)、NaCl (0.01g/L)、MnSO4·7H2O (1.5 g)、CaCl2 (0.05 g/L)、KH2PO4 (3 g/L,pH 6.5)构成的培养基中在27℃生长。将酵母提取物(0.075 kg)、MgSO4 (1.46 g,无水)、FeSO4·7H2O (1.5 g)、NaCl(0.15 g)、MnSO4·H2O (20 mg)、CaCl2 (0.8 g)和KH2PO4 (40.00 g)溶解在蒸馏水(12.6kg)中,并在接种前使用NaOH (3.2 g, 50%)调节至pH 7。混合物在120℃高压灭菌15 min。麦芽糖·H2O (0.864 kg)和蔗糖(1.910 kg)溶液在转移至发酵罐之前灭菌。
启动时,冲洗、清洁并灭菌整个系统。然后将上述量的麦芽糖、蔗糖和营养物加入发酵罐。将各物质彻底混合。接种物生长至OD-1 (通过UV-VIS分光光度计在660 nm处的光密度或吸光度)。
发酵继续直至完成。接种细胞从发酵罐的内含物中去除并丢弃。培养液如上所述脱色。
实施例11
使用任选脱灰和结晶步骤的商业规模生产
收获后,通过9-14k*g离心20-30 min去除细胞。去除细胞后,将液体浓缩至约35-40白利糖度,然后用活性木炭(0.5-3.0 % w/w, Carbochem DC-50,或等同物)处理以将液体脱色。过滤并洗涤后,脱色的液体为约35白利糖度。该液体如上所述通过SAC和WBA色谱进一步纯化。
或者,脱色后,培养液通过脱灰或浓缩至56-59白利糖度用于结晶。结晶在室温下过夜发生。将结晶的甘露醇离心(~400g/15L批),液体在5℃冷藏过夜。然后可离心第二批甘露醇,产生例如每批约100g/15L。液体然后浓缩至63-65白利糖度以产生最终的IMMO产物。
或者,MIMO可浓缩至30-40白利糖度,然后喷雾干燥以产生粉末状产物。
实施例12
麦芽糖基-异麦芽寡糖(MIMO)的生产
3,000升发酵罐规模
该实施例中制备的MIMO产物在cGMP和符合犹太教饮食(kosher parve)的条件下制备。本文中没有具体提及的过程细节与实施例10和11相同。除非特别指出,在过程步骤中,所有设备在使用或再使用前原位清洗。根据生物发酵工业中对人类消耗产品的cGMP标准小心消毒所有设备、转移线和软管。
在整个发酵和纯化过程中取样,用于连续的QC监测,如表5中所概述的。
表5
进行的分析 | 摇瓶 | 种子发酵罐 | 配方分批期(Formulation Batch Phase); T=0-24小时 | 配方维持期(Formulation Hold Phase); T=24-55小时 |
OD600 | 最终 | 每4小时 | 每4小时 | 每4小时 |
pH | 最终 | 每2小时 | 每2小时 | 每2小时 |
微生物检查 | 最终 | 最终 | 每8小时 | 每8小时 |
白利糖度测量** | X | 最终 | 每8小时 | 每8小时+最终 |
保留的QA样品 | 最终 | 最终 | 每2小时 | 每2小时+最终 |
**白利糖度测量通过手持装置获取。
将下列试剂和原材料溶解在3.7升RO水中(3.7升):磷酸二氢钾(0.0118 Kg)、无水硫酸镁(0.000431 Kg)、硫酸亚铁七水合物(0.000045 Kg)、硫酸锰一水合物(0.000045Kg)、氯化钠(0.000045 Kg)和氯化钙二水合物USP (0.00024 Kg)、酵母提取物(细菌级;0.0221 Kg)、蔗糖(Pure Cane Extra Fine Granulated Sugar;0.53021 Kg)、麦芽糖(Sunmalt-S[N]麦芽糖一水合物;0.2935 Kg)。初始pH使用50%氢氧化钠FCC (0.005 Kg)调节至7.0。将该培养基分入六个冯巴赫瓶中,加塞,121℃高压灭菌15分钟,然后冷却至室温。
柠檬明串珠菌(B-742; ATCC 13146),先前作为1:1 w/w培养液/甘油混合物的1.0ml等分试样保藏,在室温下解冻。五个烧瓶用1.0 ml制备的柠檬明串珠菌无菌接种。第六个烧瓶用作未接种对照。所有烧瓶在27℃、150 rpm摇振过夜(16小时)直到光密度(OD) > 1。来自每一烧瓶的样品的OD600 在Shimadzu分光光度计上测量。还进行来自每一烧瓶的样品的显微镜检查以观测柠檬明串珠菌的生长并排除污染。将来自五个烧瓶的健康培养物无菌转移至无菌的2加仑压力容器中。
为了产生糖和盐的母液,向1200加仑发酵罐中加入1440 Kg RO水、蔗糖(PureCane Extra Fine Granulated Sugar;498.96 Kg)、麦芽糖(Sunmalt-S[N]麦芽糖一水合物;200.0 Kg)、氯化钠(0.037 Kg)和氯化钙水合物USP (0.204 Kg)。混合物在通过无菌过滤转移至种子和母液生产罐之前彻底搅拌。
准备装配有两个pH探针和空气分布器的300加仑种子发酵罐用于通过混合238 KgRO水、2.76 Kg酵母提取物(细菌级)、1.48 Kg磷酸二氢钾、54.2克无水硫酸镁、5.7克硫酸亚铁七水合物和5.7克硫酸锰一水合物发酵。
糖和盐的母液(309.2 Kg)通过过滤灭菌无菌转移至种子发酵罐。转移之后,立即向15加仑压力容器中加入10 Kg RO水,使容器加压并将水无菌过滤消毒至种子罐中。加入额外的20 Kg RO水以调节发酵混合物的白利糖度。
种子罐通过无菌线接种健康的组合培养物。记录罐的pH。让发酵在27.0℃ + 1.0和通风下发生而不调节pH,持续16小时。每2小时监测pH并且每4小时测量OD600。
然后向1200-加仑发酵罐加入1332 Kg RO水、15.01 Kg酵母提取物(细菌级)、8.01Kg磷酸二氢钾、292.2克无水硫酸镁、30.0克硫酸亚铁七水合物和30.0克硫酸锰一水合物。混合物在50 rmp下搅拌以溶解干燥成分。pH记录为5.70,但不调节。当确认空气分布器继续适当运行时,将罐维持在37℃,持续额外的两小时。
然后121℃灭菌培养基60分钟。罐经由通过分布器线的微量通风冷却至27℃。通过过滤灭菌无菌转移先前准备的糖和盐母液(1676.1 Kg)。初始pH为5.71。将先前准备的种子液(31.0 Kg)无菌转移至生产发酵罐。开启顶部空间的空气供给。再次测量pH并使用50%氢氧化钠溶液调节至约7.0。
让发酵在罐中在27℃ + 1.0下伴随顶部空间通风和搅拌继续。pH使用50%氢氧化钠溶液维持在5.5 + 0.05。如表5中所给出的监测OD600、白利糖度和微生物学检查。让发酵继续直至完成且果糖不可检测。然后冷却发酵罐至10℃。
失效的柠檬明串珠菌细菌细胞通过微量过滤,随后以入口压力高达20 psi的六个渗滤阶段而从发酵液去除。简单而言,将发酵液加压过滤通过微滤膜以确保去除尽可能多的细胞碎片。微型过滤器保留的细胞物质用750 Kg RO水洗涤六次以提高产物的回收和产率。合并含水渗透物用于浓缩和脱色。
使用加热的刮膜蒸发器浓缩产物混合物。定期取样浓缩的产物混合物并通过手持计测定白利糖度水平。当白利糖度水平达到40时停止浓缩。
浓缩的发酵液使用粉末状活性炭脱色(26.25 Kg, CA-50S)。将产物混合物加热至65℃并且加入炭连同Celite© 545 (21.0 Kg)。温度降低至50℃之前,搅拌所得的悬浮液大约30分钟。活性炭通过使产物在压力下通过预包覆有更多悬浮在300 Kg RO水中的Celite 545 (21.0 kg)的Sperry压滤机去除。产物混合物然后再循环通过预包覆的压滤机直至滤液清澈。最后,将其泵送通过1微米增泽过滤器。额外的MIMO产物通过加入250 Kg RO水洗涤Sperry压滤机、搅拌罐内含物,然后再循环通过压滤机直至滤液澄清而回收。再次,将该滤液泵送通过1微米增泽过滤器。
在适当大小的批次(总计40白利糖度,1350 L,对于总计6个进料/再生周期,6个阶段,各进料225 L)中,利用离子交换色谱(IEX)去除灰分(由发酵过程中不被消耗的矿物质构成)、残留的有色有机化合物、有机酸、蛋白质和氨基酸。将所得的组合产物蒸发至浓度为56白利糖度。然后冷却产物至室温,同时搅拌以促进任何剩余的甘露醇结晶。甘露醇晶体通过篮式离心或通过过滤出结晶的甘露醇晶体去除。用冷水洗涤晶体以移除产物,将其保留用于将来使用。产物蒸发至浓度为65白利糖度。
将产物混合物再次冷却至室温,同时搅拌以促进任何剩余的甘露醇结晶。产物混合物进一步冷却至4℃并搅拌以促进任何剩余的甘露醇结晶。通过篮式离心机或通过过滤终产物去除任何产生的结晶甘露醇,并且再次用冷RO水洗涤晶体以回收任何残留的MIMO产物。将洗涤水保留用于将来使用。终产物为澄清、无色、轻微粘稠的液体。
实施例13
通过在较高总糖下发酵改善产率
通常,用于MIMO的发酵生产过程不在高总固体下运行以避免工作生物的渗透压休克相关的问题。先前的工作(12个15.5 kg的完全批次)表明在约17.6%总糖下发酵产生合适的产物分布、产率,并且可复现。因此,增加总糖(TS)含量应该增加产物产率。此处,44%作为中试规模回收的总产物给出,而不是生产规模的发酵罐中的产率,其通常为56-58%。因此可增加TS直至生物失去生产能力或为了保护其自身,例如通过产生甘油或乙醇(其为终产物中的不期需污染物)开始在代谢方面对抗其环境。渗透强度的第二个限制为酶对由于不充分的水合作用和/或协同底物(例如,在水解酶类的情况下,水)引起的从其优选的活性构象变形的抗性。
为了试图估量工作浓度的合理范围,在蔗糖:麦芽糖比率2.75:1和30% TS下运行两千克发酵。30% TS时发酵与已建立的发酵17.6%的方法表现相同。一旦相对于总折光干燥固体(RDS)归一化,产率、纯度和产物分布同一。对于产率计算,% w/w和衍生值在下表6和表7中给出。
表6
表7
这些数据显示在17.7%时TS 3000-Kg批次的产率与在29.4% TS发酵的2-Kg批次无显著不同,分别58.48 vs. 57.71%。对于在17.7%和29.4%发酵的TS,质量平均分子量分布(MWD)同样相似,分别763.77 vs. 759.06 Da (靶760 Da)。此外,TS的增加确实使产率从318.85kg增加到计算的542.5 Kg/批,使可回收产率改善,最坏情况下为49.28 %和最佳情况下为70.14%。
实施例14
通过结晶从MIMO去除甘露醇
如实施例12中所述,可在所述过程结束时进一步处理MIMO产物,以去除任何剩余的甘露醇,进一步改善终产物的纯度。本实施例描述对通过结晶去除甘露醇的过程的改良。
在一种方法中,将IEX产物(在表8中“IEX出”)蒸发至56°白利糖度,并让其室温结晶(“XL #1”)。甘露醇晶体通过配有10 μm孔聚丙烯过滤袋的篮式离心机或具有10 μm等效板/滤网的吸滤压滤机去除(滤饼#1)。滤饼用500 mL冷水洗涤(大约125%滤饼w/w)并收集洗涤液用于再循环(“洗涤#1”)。将所得液体(“液体#1”)冷却至2-5℃并让其结晶(“XL #2”)。甘露醇晶体通过配有10 μm孔聚丙烯过滤袋的篮式离心机或具有10 μm等效板/滤网的吸滤压滤机去除(“滤饼#2”)。滤饼用500 mL冷水洗涤(大约125%滤饼w/w)并收集洗涤液液用于再循环(“洗涤#2”)。如前去除晶体,并将所得液体进行终浓缩,至产物白利糖度63-64°。表8显示典型的物料平衡,作为11批次的平均给出。
表8
在改良的方法中,将IEX产物(“IEX出”)蒸发至56°白利糖度,并让其室温结晶(XL #1)。甘露醇晶体通过配有10 μm孔聚丙烯过滤袋的篮式离心机或具有10 μm等效板/滤网的吸滤压滤机去除(“滤饼#1”)。滤饼使用500 mL冷水洗涤(大约125%滤饼w/w)并收集洗涤液用于再循环(“洗涤#1”)。让所得液体(“液体#1”)室温结晶(“XL #2”)。一旦冷却并观察到结晶,将整个混合物冷却至2-5℃并让其结晶直至完成。甘露醇晶体通过配有10 μm孔聚丙烯过滤袋的篮式离心机或具有10 μm等效板/滤网的吸滤压滤机去除(“滤饼#2”)。滤饼用500 mL冷水洗涤(大约125%滤饼w/w)并收集洗涤液用于再循环(“洗涤#2”)。来自该实验的数据在下表8中示出。产物具有63-64°的白利糖度,并已准备好用于巴斯德氏杀菌和包装,作为商业物质。
表8
或者,如上所述使用IEX纯化产物混合物后,将产物混合物蒸发至56白利糖度,然后冷却至室温,同时搅拌以促使存在的甘露醇形成晶体。约12-约16小时后,晶体通过篮式离心,或通过利用振动筛过滤器,或通过使用吸滤器,或通过使用本领域技术人员所熟知的这些技术的组合去除。将剩余的液体蒸发至65‐66白利糖度,然后冷却至室温,同时搅拌以促使晶体形成,持续12到16小时。将混合物冷却至4℃以促使任何剩余的甘露醇结晶。需要两阶段结晶过程,即,使用两个不同温度的过程,以让晶体适当形成。约12-约16小时后,晶体通过篮式离心,或通过利用振动筛过滤器,或通过使用吸滤器,或通过使用这些技术的组合去除。现在产物已准备好用于巴斯德氏杀菌和包装,作为商业物质。
本说明中提及的所有出版物和专利申请通过引用结合到本文中,其程度与如同各单独出版物或专利申请明确和逐一指明通过引用结合相同。
从前文可以理解,尽管本文已经描述了本发明的具体实施方案用于说明目的,但可做出各种修饰而不违背本发明的精神和范围。因此,本发明不受除所附权利要求书之外的限制。
Claims (52)
1.用于制备寡糖的方法,包括:
(a) 使包含固定比率的蔗糖与麦芽糖的原料与产葡聚糖蔗糖酶的微生物在含水的培养基中接触;
(b) 在pH 4至8之间用细菌细胞使原料发酵;
(c) 去除细菌细胞;和
(d) 精制;
其中产生的寡糖的最终组成根据所选的pH和使用的起始原料比率而不同。
2.权利要求1的方法,其中连续进行步骤(a)到(c)。
3.权利要求1的方法,其中所述方法作为固定化酶或固定化细胞过程进行。
4.权利要求1的方法,其中所述方法作为分批或补料分批操作进行。
5.权利要求1的方法,其中所述蔗糖与麦芽糖的固定比率的范围在比率1.5:1到7:1之间。
6.权利要求5的方法,其中所述固定比率维持在2:1或2.33:1或2.75:1。
7.权利要求1的方法,其中蔗糖与麦芽糖的固定比率在发酵过程期间通过添加更多的蔗糖或更多的麦芽糖调整。
8. 权利要求1的方法,其中所述产葡聚糖蔗糖酶的微生物为肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、柠檬明串珠菌(Leuconostoc citreum)、Leuconostoc gasicomitatum或泡菜明串珠菌(Leuconostoc kimchii)。
9. 权利要求8的方法,其中所述产葡聚糖蔗糖酶的微生物为肠膜明串珠菌ATCC 13146或肠膜明串珠菌NRRL B-742或肠膜明串珠菌亚种mesenteroides (Tsenkovskii) vanTieghem (ATCC® 11449™),NRRL B-1299。
10. 权利要求1的方法,其中所述产葡聚糖蔗糖酶的微生物为融合魏斯氏菌(Weisella confusa)、食窦魏斯氏菌(Weissella cibaria)、乳球菌属(Lactococcus spp)、棘孢青霉(Penicillium aculeatum)、片球菌属(Pediococcus spp)(戊糖片球菌(pentosaceus))、变异链球菌(Streptococcus mutans)、口腔链球菌(Streptococcus oralis)、血链球菌(Streptococcus sanguinis)或乳杆菌属(Lactobacillis spp)(罗氏乳杆菌(reuteri))。
11.权利要求1的方法,其中pH通过向培养基中添加酸或碱控制。
12.权利要求11的方法,其中所述碱包括碱土金属氢氧化物或碳酸盐。
13.权利要求1的方法,其中细菌细胞通过离心、过滤或澄清去除。
14.权利要求1的方法,其中所述精制去除不溶杂质或包括脱色或包括脱灰或包括去除蛋白质或包括去除有机酸或包括这些步骤的组合。
15.权利要求14的方法,其中所述脱色利用活性木炭或活性炭或包括使用弱碱阴离子树脂或包括这些步骤的组合。
16.权利要求14的方法,其中所述脱灰包括使用强酸阳离子树脂以去除金属离子。
17.权利要求14的方法,其中所述脱灰包括使用强酸随后弱碱的两步过程。
18.权利要求14的方法,其中所述去除蛋白质包括加热,然后使含水培养基蒸发,随后离心或过滤或包括使用弱碱阴离子树脂。
19.权利要求14的方法,其中所述去除有机酸使用钙形式的色谱级凝胶型强酸阳离子交换树脂(SAC-Ca++)。
20.权利要求14的方法,其中所述去除有机酸包括使用弱碱阴离子树脂。
21.权利要求1的方法,其中所述精制包括去除甘露醇。
22.权利要求21的方法,其中所述去除甘露醇使用连续或脉冲液相色谱法,或使用蒸发接着一个或两个冷却阶段以开始结晶和沉淀。
23.权利要求1的方法,其中产生的寡糖的最终组成包含在还原端具有一个或多个α-(1→4)以及具有聚合度3至10或3至9的α-(1→6)连接的异麦芽寡糖。
24.权利要求23的方法,其中所述异麦芽寡糖进一步包含α-(1→4)、α-(1→3)和/或α-(1→2)分支。
25.权利要求1的方法,进一步包括作为浓缩溶液提供寡糖。
26.权利要求1的方法,进一步包括作为通过干燥或通过喷雾干燥或通过冷冻干燥产生的粉末提供寡糖。
27.通过权利要求1-26中任一项的方法生产的组合物。
28.用于制备寡糖的方法,包括:
(a)使包含固定比率的蔗糖与麦芽糖的原料与产葡聚糖蔗糖酶的微生物在含水的培养基中接触;
(b)在pH 4至8之间用细菌细胞使原料发酵;
(c)去除细菌细胞;和
(d)精制;
其中最终产生的寡糖基本上没有灰、无机酸、残留蛋白质、糖醇和有机酸。
29.权利要求28的方法,其中连续进行步骤(a)到(c)。
30.权利要求28的方法,其中所述方法作为固定化酶或固定化细胞过程进行。
31.权利要求28的方法,其中所述方法作为分批或补料分批操作进行。
32.权利要求28的方法,其中所述蔗糖与麦芽糖的固定比率范围在1.5:1到7:1之间。
33.权利要求28的方法,其中所述固定比率维持在2:1或2.33:1或2.75:1。
34.权利要求28的方法,其中所述蔗糖与麦芽糖的固定比率在发酵过程期间通过添加更多的蔗糖或更多的麦芽糖调整。
35. 权利要求28的方法,其中所述产葡聚糖蔗糖酶的微生物为肠膜明串珠菌、柠檬明串珠菌、Leuconostoc gasicomitatum或泡菜明串珠菌。
36. 权利要求35的方法,其中所述产葡聚糖蔗糖酶的微生物为肠膜明串珠菌ATCC13146或肠膜明串珠菌NRRL B-742或肠膜明串珠菌亚种mesenteroides (Tsenkovskii)van Tieghem (ATCC® 11449™)、NRRL B-1299。
37.权利要求28的方法,其中所述产葡聚糖蔗糖酶的微生物为融合魏斯氏菌、食窦魏斯氏菌、乳球菌属、棘孢青霉、片球菌属(戊糖片球菌)、变异链球菌、口腔链球菌、血链球菌或乳杆菌属(罗氏乳杆菌)。
38.权利要求28的方法,其中pH通过向培养基中添加酸或碱控制。
39.权利要求38的方法,其中所述碱包括碱土金属氢氧化物或碳酸盐。
40.权利要求28的方法,其中细菌细胞通过离心、过滤或澄清去除。
41.权利要求28的方法,其中所述精制去除不溶杂质或包括脱色或脱灰。
42.权利要求41的方法,其中脱色使用活性木炭或活性炭或包括使用弱碱阴离子树脂。
43.权利要求41的方法,其中脱灰包括使用强酸阳离子树脂以去除金属离子或使用强酸随后弱碱。
44.权利要求28的方法,其中所述精制包括去除蛋白质或包括去除有机酸或包括去除甘露醇或去除不溶杂质或包括脱色或包括脱灰或包括这些步骤的组合。
45.权利要求44的方法,其中去除蛋白质包括加热,然后使含水培养基蒸发,随后离心或过滤,或去除蛋白质包括使用弱碱阴离子树脂。
46.权利要求45的方法,其中去除有机酸包括使用弱碱阴离子树脂。
47.权利要求44的方法,其中去除甘露醇使用连续或脉冲液相色谱法或使用蒸发接着一个或两个冷却阶段以开始结晶和沉淀。
48.权利要求28的方法,其中产生的寡糖的最终组成包含在还原端具有一个或多个α-(1→4)以及具有聚合度3至9或3至10的α-(1→6)连接的异麦芽寡糖。
49.权利要求48的方法,其中所述异麦芽寡糖进一步包含α-(1→4)、α-(1→3)和/或α-(1→2)分支。
50.权利要求28的方法,进一步包括作为浓缩溶液或作为粉末提供寡糖。
51.权利要求50的方法,其中所述粉末通过干燥或通过喷雾干燥或通过冷冻干燥制备。
52.通过权利要求27-51中任一项的方法生产的组合物。
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