ES2929571T3

ES2929571T3 - Proceso para la producción de isomaltooligosacáridos

Info

Publication number: ES2929571T3
Application number: ES15833983T
Authority: ES
Inventors: Lee Madsen; Jack Oswald; Donal F Day; Young Hwan Moon
Original assignee: Isothrive Inc
Current assignee: Isothrive Inc
Priority date: 2014-08-22
Filing date: 2015-08-22
Publication date: 2022-11-30
Anticipated expiration: 2035-08-22
Also published as: FI3182981T3; EP3182981A4; US20170275661A1; EP3182981B1; US11155847B2; PT3182981T; PL3182981T3; EP3182981A1; US20220119854A1; CN107249598A

Abstract

La presente invención proporciona un método para la producción de oligosacáridos mediante la fermentación de microorganismos productores de dextransacarasa con sacarosa y maltosa. El proceso descrito permite el control de la composición final de los isomaltooligosacáridos mediante ajustes del pH y la proporción inicial de sacarosa a maltosa. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Proceso para la producción de isomaltooligosacáridos

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a la preparación de oligosacáridos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los suplementos dietéticos, a veces también llamados nutracéuticos, son alimentos o constituyentes de alimentos que supuestamente brindan beneficios médicos o para la salud que pueden incluir la prevención de enfermedades (Stephen, D.F.L., Trends in Food Sci. Tech, 1995, 6:59-61). El término típicamente incluye las siguientes clases representativas: probióticos, prebióticos, fibra dietética, ácidos grasos omega-3 y antioxidantes (Pandey, M. et al., Asian J. Pharm. Clin. Res., 2010, 3:11-15). Debido al creciente número de consumidores conscientes de la salud en Asia, Estados Unidos y Europa, el mercado de suplementos dietéticos, específicamente en las áreas de oligosacáridos y prebióticos, ha demostrado un crecimiento significativo en las últimas tres décadas (Goffin, D. et al., Crit. Rev. Food. Sci Nutr., 2011, 51:394-409; Roberfroid, MB, Br. J. Nutr., 2002, 88 Suplemento 2: S133-8) y se demandan métodos nuevos y económicos para su producción.

De interés aquí son las clases de suplementos dietéticos prebióticos y probióticos. En términos generales, los probióticos se componen de cultivos vivos de bacterias, tales como los que se encuentran en el yogur, que promueven el crecimiento de una flora intestinal saludable por medio del apoyo a la población (Gilliland, SE et al., "Propiedades nutricionales y de salud de los probióticos en los alimentos, incluida la leche en polvo con bacterias vivas del ácido láctico", 2001, p. 1-34, Organización Mundial de la Salud). Los prebióticos, sin embargo, son materiales, ya sean físicos (p. ej., fibra dietética) o químicos (p. ej., butirato) que pueden promover el crecimiento de una flora benéfica seleccionada (Chung, C.H., et al., Poult. Sci., 2004, 83:1302-6) y/o ejercer algún efecto beneficioso directamente sobre las células epiteliales intestinales (mejorando así la absorción de calorías nutritivas, vitaminas, minerales, etc.). Porque muchos prebióticos pueden vencer la resistencia de la barrera digestiva facilitando la proliferación y/o actividad de las poblaciones de bacterias deseadas en el lugar (Gibson G. R. et al., J. Nutr., 1995, 125:1401-12; Van Loo, J. et al., Br. J. Nutr., 1999, 81:121-32), la investigación y el desarrollo en esta área han experimentado un auge. Adicionalmente, los prebióticos a menudo se encuentran naturalmente en el suministro de alimentos, especialmente en los alimentos fermentados, y generalmente son compatibles con la mayoría de las formulaciones de alimentos (Macfarlane, S. et al., Aliment Pharmacol. Ther., 2006, 24:701-14; Manning, T. S. et al., Best Pract. Res. Clin. Gastroenterol., 2004, 18:287-98). Por definición, los glucooligosacáridos son agentes prebióticos y muchas formas están disponibles comercialmente.

Los glucooligosacáridos son una clase de oligómeros de carbohidratos que incluyen isomaltooligosacáridos (IMO). Los IMO son glucosil sacáridos con una estructura central basada en un esqueleto enlazado a -(1^6 ) que puede incluir ramas enlazadas a-(1^4), a -(1^3) (nigerooligosacáridos) y\o a -(1^2)) (kojioligosacáridos) (Yun, J. et al., Biotechnol. Lett., 1994, 16:1145-1150). Estos grupos de enlace glucosídicos se encuentran en jarabes de IMO comerciales (Goffin, D. et al., Crit. Rev. ciencia de los alimentos. Nutr., 2011, 51:394-409.)

Chung y Day han producido glucooligosacáridos, específicamente IMO, a través de la acción de la dextransacarasa generada en el lugar sobre sacarosa en presencia de un aceptor de maltosa (patente de EE. UU. n.° 7.291.607). El IMO era un producto extracelular de la fermentación de la sacarosa por Leuconostoc mesenteroides ATCC® 13146™. Chung y Day demostraron que estos glucooligosacáridos (OMI ramificados) son fácilmente utilizados por Bifidobacterium sp. y Lactobacillus sp., pero no por Escherichia coli o Salmonella sp. en estudios de cultivo puro (Chung, CH y Day, D. F., J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 2002, 29:196-9).

El documento US 2008/0064657 (Day et al.) divulga que los isomaltooligosacáridos (IMO) producidos por fermentación de Leuconostoc mesenteroides ATCC 13146 con una relación de sacarosa:maltosa de 2:1 son prebióticos efectivos en cultivos mixtos de poblaciones microbianas, incluidos cultivos de ciegos de pollo. Sorprendentemente, en cultivos microbianos mixtos, esta composición de IMO demostró ser tan eficaz como los fructooligosacáridos. Por tanto, estos IMO se pueden usar como prebióticos efectivos tanto para aves como para mamíferos y son inhibidores no competitivos efectivos de alfa-glucosidasa. También son útiles, como inhibidores de la alfa-glucosidasa, en una aplicación terapéutica para varias enfermedades, incluyendo obesidad, diabetes mellitus, prediabetes, gastritis, úlcera gástrica, úlcera duodenal, caries, cáncer, enfermedades víricas tales como la hepatitis B y C, VIH y SIDA. Se mostró que una dieta con 5-20 % de IMO reduce el tejido adiposo abdominal en los mamíferos.

El documento US 5580762 (Isao) divulga un método que comprende las etapas de: hidrolizar enzimáticamente almidón, pululano o dextrano en una solución acuosa de 30 % a 90 % en volumen de metanol, etanol o propanol en agua usando alfa-amilasa, pululanasa o dextranasa en una cantidad y durante un tiempo suficiente para degradar el polisacárido, desplazando la distribución de los valores del grado de polimerización de los oligosacáridos generados como resultado de la reacción a 5-20; y recuperar los oligosacáridos que tienen un grado de polimerización de 5-20 de la mezcla de reacción.

La publicación de patente de EE. UU. 2004/0149200 (Shimose et al.) divulga un proceso para producir cristales de un oligosacárido que comprende tres o más residuos de monosacárido que comprende añadir una solución acuosa que contiene el oligosacárido que comprende tres o más residuos de monosacárido a un disolvente orgánico miscible con agua.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

En un aspecto, esta invención proporciona un método para la preparación de oligosacáridos que comprende:

(a) poner en contacto una materia prima que comprende sacarosa y maltosa en una relación dentro de un intervalo superior a 2:1 con bacterias productoras de dextransacarasa en un medio de cultivo acuoso;

(b) fermentar la materia prima con las células bacterianas mientras el pH del medio de cultivo se controla dentro del intervalo de 5,5 a 6,0;

(c) retirar las células bacterianas; y

(d) refinar;

en el que la composición final de los oligosacáridos producidos comprende maltosil-isomaltooligosacáridos con grados de polimerización (GP) >2 y <10.

En una realización, la práctica de las etapas (a) a (c) es continua. En otra realización, el método se realiza como una enzima inmovilizada o un proceso celular inmovilizado. En otra realización, el método se realiza como una operación por lotes o como una operación por lotes alimentados.

En otra realización, la relación fija de sacarosa a maltosa varía entre relaciones mayores de 2:1 a 7:1. En una realización, la relación fija se mantiene en 2,33:1 o en 2,75:1. En una realización adicional, la relación fija de sacarosa a maltosa se ajusta durante el proceso de fermentación mediante la adición de más sacarosa o más maltosa.

En otra realización, el microorganismo productor de dextransacarasa es Leuconostoc mesenteroides [En particular Leuconostoc mesenteroides ATCC 13146 o Leuconostoc mesenteroides NRRL B-742 o Leuconostoc mesenteroides subesp. mesenteroides (Tsenkovskii) van Tieghem (ATCC)® 11449™), o NRRL B-1299], Leuconostoc citreum, Leuconostoc gasicomitatum, o Leuconostoc kimchii. En una realización adicional, el microorganismo productor de dextransacarasa es Weisella confusa, Weissella cibaria, Lactococcus spp Penicillium aculeatum, Pediococcus spp (pentosaceus), Streptococcus mutans, Streptococcus oralis, Streptococcus sanguinis, o Lactobacillis spp (reuteri).

En otra realización, el pH se controla añadiendo un ácido o una base al medio de cultivo. En una realización adicional, la base comprende un hidróxido o carbonato de metal alcalinotérreo. En una realización, el metal alcalinotérreo es calcio. En otra realización, la base comprende hidróxido de sodio.

En una realización, las células bacterianas se retiran por centrifugación, filtración o clarificación. En otra realización, el refinado retira las impurezas insolubles. En otra realización, el refinado comprende la decoloración. En una realización, la decoloración utiliza carbón activado o carbono activado. En una realización adicional, la decoloración comprende el uso de una resina aniónica de base débil. En otra realización más, el refinado comprende la retirada de cenizas. En una realización, la retirada de cenizas comprende el uso de una resina catiónica de ácido fuerte para retirar los iones metálicos. En otra realización, la retirada de cenizas comprende un proceso de dos etapas que usa un ácido fuerte seguido de una base débil. En una realización adicional, el refinado comprende la retirada de proteína. En otra realización, la retirada de proteína comprende calentar, luego evaporar el medio de cultivo acuoso seguido de centrifugación o filtración. En una realización, la retirada de la proteína comprende el uso de una resina aniónica de base débil. En otra realización, el refinado comprende la retirada de ácidos orgánicos. En una realización, la retirada de ácidos orgánicos comprende utilizar una resina aniónica de base débil. En otra realización, la retirada de ácidos orgánicos comprende cromatografía líquida usando una resina de intercambio catiónico de ácido fuerte de tipo gel de grado cromatográfico en forma de calcio (SAC-Ca++).

En otra realización, el refinado comprende retirar el manitol. En otra realización, la retirada del manitol utiliza cromatografía líquida continua o pulsada. En una realización adicional, la retirada del manitol utiliza la evaporación seguida de una o dos etapas de enfriamiento para iniciar la cristalización y la precipitación.

En otra realización, la composición final de los oligosacáridos producidos comprende isomaltooligosacáridos con uno o más grupos de enlace a -(1^4) en el extremo reductor y a -(1^6 ) con un grado de polimerización entre 3 y 9 o entre 3 y 10. En una realización adicional, los isomaltooligosacáridos comprenden además ramificación a-(1^4), a -(1^3) y/o a-(1^2).

Otra realización comprende además proporcionar los oligosacáridos como una solución concentrada, opcionalmente preparada en condiciones adecuadas para el consumo humano. Una realización separada comprende además proporcionar los oligosacáridos en forma de polvo, opcionalmente preparados en condiciones adecuadas para el consumo humano. En una realización, el polvo se produce mediante secado, secado por pulverización o secado por congelación.

En otro aspecto de la invención, se produce una composición mediante el método descrito anteriormente. Opcionalmente, la composición es apta para el consumo humano.

En otra realización, los oligosacáridos finales producidos están esencialmente libres de cenizas, ácidos minerales, proteínas residuales, alcoholes de azúcar y ácidos orgánicos. En una realización, la práctica de las etapa (a) a (c) es continua. En otra realización, el método se realiza como una enzima inmovilizada o un proceso celular inmovilizado. En una realización adicional, el método se realiza como una operación por lotes o como una operación por lotes alimentados.

Otra realización comprende además proporcionar los oligosacáridos como una solución concentrada, opcionalmente preparada en condiciones adecuadas para el consumo humano. Una realización separada comprende además proporcionar los oligosacáridos en forma de polvo, opcionalmente preparados en condiciones adecuadas para el consumo humano. En una realización, el polvo se produce mediante secado, secado por pulverización o secado por congelación. En otro aspecto de la invención, se produce una composición mediante el método descrito anteriormente. Opcionalmente, la composición se prepara en condiciones adecuadas para el consumo humano.

Otros objetos de la invención pueden resultar evidentes para un experto en la materia al leer la memoria descriptiva y las reivindicaciones siguientes.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

En los siguientes dibujos:

La FIG. 1 muestra la taxonomía de los oligosacáridos.

La FIG. 2A representa una cromatografía de capa fina (TLC) de glucooligosacáridos de fermentaciones de L. mesenteroides ATCC 13146 con tres métodos de control de pH en los que el carril 1 muestra un lote de fermentación con NaOH al 5 %; el carril 2, un lote de fermentación de cal al 5 % y el carril 3, un lote de fermentación de sucrato de calcio al 5 %. En la figura se muestran las siguientes abreviaturas: Gluc., glucosa; Fruc., fructosa; Suc., sacarosa; IM2, isomaltosa; IM3, isomaltriosa; IM4, isomaltotetraosa; M2, maltosa; M3, maltotriosa; M4, maltotetraosa; M5, maltopentaosa. La FIG. 2B representa un cromatograma de HPAEC típico, a modo de comparación. La línea azul representa un producto típico y la línea roja representa un patrón (1,4-DPx = maltosiloligosacárido o DPx).

La FIG. 3 ilustra los patrones de producción de glucooligosacáridos y manitol por L. mesenteroides ATCC 13146 a partir de sacarosa y maltosa en función del tiempo. Fermentación de L. mesenteroides ATCC 13146 con (A) control de pH de NaOH al 5 %; (B) control de pH de cal al 5 %; y (C) control de pH de sucrato de calcio al 5 %. Las muestras de fermentación (carbohidratos) recogidas según los tiempos mostrados se analizaron mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC Agilent 1200 con detector de índice de refracción diferencial a 45 °C, BioRad Aminex® HPX-87K a 85 °C eluido con K2SO40,01 M a 0,8 ml/min).

La FIG. 4 muestra un análisis de HPLC donde se llevó a cabo una cromatografía de resina catiónica (carga de 60 ml con una muestra de 57 Brix) con un caudal de 10 ml/min a 50 °C, donde se recogieron las fracciones (cada una de 15 ml). Para los carbohidratos (GlcOS (marcado como GOS), panosa, maltosa y manitol), se usó HPLC Agilent 1200 con un detector de índice de refracción diferencial a 45 °C, BioRad Aminex HPX-87K a 85 °C eluido con K2SO40,01 M a 0,8 ml/min. Para los ácidos orgánicos (ácido acético y ácido láctico), se usó HPLC Agilent 1100 con una columna Aminex HPX-87H a 65 °C eluida con 1,0 ml/min de H2SO40,005 N con detección por absorbancia a 210 nm.

La FIG. 5 muestra un gráfico de barras que ilustra patrones de productos de maltosil-isomaltooligosacáridos producidos a diferentes pH determinados por HPLC. El gráfico de barras da los porcentajes relativos. Las muestras se analizaron mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC Agilent 1200 con un detector de índice de refracción diferencial a 45 °C, BioRad Aminex HPX-87K a 85 °C eluido con K2SO40,01 M a 0,6 ml/min).

La FIG. 6 muestra el efecto que tiene la relación de sacarosa:maltosa (S/M) sobre la distribución del peso molecular a un pH fijo de 5,5. A medida que aumenta la S/M, también lo hace la distribución del peso molecular.

La FIG. 7 muestra el efecto que tiene el pH sobre la distribución del peso molecular a una relación fija de sacarosa:maltosa (S/M). A medida que el pH disminuye hacia 5,5, aumenta la distribución del peso molecular.

La FIG. 8 muestra los valores de pH necesarios para la optimización de los rendimientos de cada oligómero. La maltosa y la panosa deben minimizarse y los oligómeros superiores deben maximizarse.

La FIG. 9 muestra una comparación de fermentaciones usando Leuconostoc spp. NRRL B742, 1299 y kimchi como el microorganismo productor de dextransacarasa; la traza A es de la muestra MIMO 070814 que usa una especie que se encuentra en el iniciador silvestre de masa madre, que producía una baja concentración de producto que parece ser tanto lineal como ramificado; la traza B es de la muestra MIMO 070314 que usa una mezcla de especies de Leuconostoc derivado de kimchi, que producía una alta concentración de producto lineal; la traza C es de la muestra ISOT 071714 que usa PWSA-L. citreum B742, que producía una alta concentración de producto que parece ser lineal (GP3-8), con ramificación a mayor GP; la traza D es de la muestra ISOT 070914 que usa L. mesenteroides B1299, que producía una concentración de producto media con ramificación a GP>4; y la traza E de la muestra ISOT Classic 2012 que usa L. citreum B742, que producía una alta concentración de producto que parece ser lineal (GP3-8) con ramificación a mayor GP.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Definiciones

Tal como se utilizan de acuerdo con la presente divulgación, los siguientes términos, a menos que se indique lo contrario, se entenderá que tienen los siguientes significados:

"Brix", también conocido como grados Brix (símbolo °Bx), se refiere al contenido de azúcar de una solución acuosa. Un grado Brix es 1 gramo de sacarosa en 100 gramos de solución y representa la concentración de la solución como porcentaje en peso (% p/p). Brix también da cuenta de sales disueltas, ácidos orgánicos y otros solutos que aumentan el índice de refracción de la solución. Como tal, es menos útil como medida cuantitativa del contenido de sacáridos en caldos complejos (mezclas de fermentación), pero es bastante preciso con respecto al producto refinado. Por tanto, 1 grado brix = 1 g de sólidos secos refractivos por 100 g de material. Si la solución contiene sólidos disueltos que no sean sacarosa pura, entonces el °Bx solo se aproxima al contenido de sólidos disueltos.

"Grado de polimerización", o "GP", se refiere al número de unidades de azúcar en un oligosacárido dado.

"Oligosacáridos" se refiere a glicanos de todo tipo con GP>2 y <10.

"Glucooligosacárido" o "GlcOS", se refiere a un oligosacárido compuesto de glucosa en cualquier disposición estructural. Un ejemplo de un GlcOS es el maltooligosacárido [-O-a-(1,4)-], maltopentaosa, que tiene la siguiente estructura química:

" Isomaltooligosacárido". o "IMO", se refiere a glucosil sacáridos con una estructura central basada en un esqueleto enlazado a -(1^6) que puede incluir ramas de grupos de enlace a-(1^4), a-(1^-3) (nigerooligosacáridos) y/o (kojioligosacáridos). Un ejemplo de un IMO es un GlcOS ensamblado con grupos de enlace [-O-a-(1,6)-], isomaltopentaosa, que tiene la siguiente estructura química:

"Maltosil-isomaltooligosacáridos”, o MIMO, se refiere a un oligosacárido, específicamente glucano, de menos de 10 grados de polimerización compuesto por grupos de enlace a -(1^6 ) terminados por un grupo de enlace a-(1^4). El grupo terminal a -(1^4) es la maltosa, por lo tanto, el maltosil-isomaltooligosacárido o MIMO se produce mediante una reacción aceptora de la maltosa u otro maltooligosacárido. Un ejemplo de un MIMO con un solo grupo de enlace maltosilo [-O-a-(1,4)-] en el extremo reductor es la maltosil-isomaltotriosa, que tiene la siguiente estructura química:

"MIMO ramificado" se refiere a un oligosacarido, específicamente glucano, de menos de 10 grados de polimerización compuesto por grupos de enlace a -(1^6) terminados por un grupo de enlace a -(1^4) y ramas a-(1^2), a -(1^3) y/o a-(1 mificado con grupos de enlace de ramificación de glucosa en las posiciones 1,2 y 1,3 y/o 1,4 tienen las siguientes estructuras:

"Suplemento dietético" se refiere a un alimento, ingrediente alimentario o aditivo alimentario que produce un beneficio para la salud, incluidos los carbohidratos tales como los oligosacáridos.

"SAC" significa una resina de intercambio catiónico de ácido fuerte, típicamente una con grupos ácido sulfónico, es decir, un equivalente de ácido sulfúrico.

"SBA" significa una resina de intercambio aniónico de base fuerte, típicamente una con grupos amina libres, que puede hacerse equivalente a grupos hidroxilo.

"WAC" significa una resina de intercambio catiónico de ácido débil, típicamente una con grupos ácido carboxílico libres (pKa ~4,2).

"WBA" significa una resina de intercambio aniónico de base débil, típicamente una con grupos amina terciaria que no son más fuertes que la base libre correspondiente (pKa ~9,8).

Ahora se hará referencia en detalle a ciertos métodos preferidos de tratamiento, compuestos y métodos de administración de estos compuestos. La invención no se limita a esos compuestos y métodos preferidos, sino que se define por la reivindicación o reivindicaciones que emanan de los mismos.

Descripción general de la invención

Los glucooligosacáridos de la presente divulgación son producidos por el crecimiento de L. mesenteroides (ATCC 13146) o cualquier otro microorganismo productor de dextransacarasa que produzca la enzima dextransacarasa en sacarosa en presencia de maltosa u otro receptor. El pH se ajusta antes de la inoculación a 6,5-6,8 dependiendo del pH óptimo para lograr el máximo crecimiento celular al comienzo de la fermentación. También es posible ajustar el pH inicial a cualquier nivel en el intervalo de 4 a 8. El pH de la fermentación cae naturalmente desde su pH inicial a medida que el organismo crece en cultivo en presencia de una materia prima apropiada. El pH óptimo para el crecimiento celular es de 6,5 a 6,8. La producción y actividad óptima de la enzima está en el intervalo de 5,5 a 6,0. Cuando se alcanza un pH de 5,5, el control del pH se mantiene mediante la adición de un material alcalino tal como el hidróxido de sodio. El organismo ATCC 13146 funciona a un pH óptimo de 5,5. En una realización preferida del proceso de la invención, el pH del caldo de fermentación se ajusta a pH 6,5 con hidróxido de sodio acuoso al 50 % y se mantiene aproximadamente pH 5,5 durante la duración deseada de la etapa de fermentación.

Otras enzimas productoras de dextransacarasas pueden preferir un pH diferente para un rendimiento óptimo. Por tanto, en el proceso de la presente invención, el pH inicial se fija en el pH preferido para el crecimiento celular del organismo utilizado. Luego se deja que el pH caiga naturalmente debido a la producción de ácidos orgánicos durante el proceso de la presente invención al pH que es el preferido para la enzima productora de dextransacarasa específica que se está utilizando. Si el pH no se controla por medios externos, el pH del caldo de fermentación continuará cayendo hasta que se detenga el crecimiento bacteriano y cese la producción de los maltosil-isomaltooligosacáridos (IMO) deseados.

La mezcla más deseable de IMO se produce durante la fermentación mediante enzimas bacterianas que llevan a cabo el proceso de fermentación a un pH óptimo de 5,5. Los desplazamientos en el pH a valores por encima o por debajo de 5,5 pueden alterar tanto el rendimiento como la mezcla de tamaños de oligosacáridos presentes en los IMO del producto. Como alternativa, esta mezcla también se puede cambiar variando la relación inicial de sacarosa a maltosa, así como variando el contenido de calcio.

Es posible aumentar la producción total de IMO en una fermentación dada mediante la adición continua de una alimentación de sacarosa/maltosa en la relación deseada de sacarosa a maltosa. Este aumento en la producción y composición del producto se puede hacer independientemente del control del pH si el control del pH se logra mediante la adición de un material alcalino tal como el hidróxido de sodio o potasio, o se puede hacer junto con el control del pH si se usa un material que contiene sacarosa tal como sucrato de calcio, suplementado con maltosa. El sucrato de calcio, también conocido como sacarato de calcio, es una forma de hidróxido de calcio en la que el calcio forma un complejo con sacarosa.

El proceso divulgado también comprende una mejora en los métodos a escala comercial conocidos para la producción fermentativa de GlcOS usando L. mesenteroides (ATCC 13146) al reducir el coste de producción. Los costes asociados con el álcali se pueden reducir en un factor de ~2,4 usando Ca(OH)2 en lugar de NaOH. LA sustitución de dos iones Na+ por un ion Ca2+ también anula la necesidad de retirar las cenizas de la columna cromatográfica de intercambio iónico, lo que elimina dos etapas cromatográficas potencialmente costosas. El uso de sucrato de calcio resuelve el problema de la solubilidad del calcio en agua, y la base de sacarosa se usa como materia prima suplementaria para la fermentación.

Desventajas de los métodos de producción conocidos

Las mezclas de isomaltooligosacáridos generalmente se producen por la acción de enzimas inmovilizadas en materias primas de monosacáridos o disacáridos y también se pueden producir por transglicosilación de hidrolizados de almidón seguida de separación cromatográfica. En un proceso temprano, Chludzinski et al. produjeron isomaltooligosacáridos ramificados usando dextransacarasa (EC 2.4.1.5) expresados a partir de cultivos bacterianos tales como Leuconostoc spp. y Streptococcus sp. (Chludzinski, A. M., et al., J. Bacteriol., 1974, B: 1-7). Roper y Koch divulgaron más tarde la producción de mezclas de isomaltooligosacáridos a partir de hidrolizados de almidón (maltosa y maltodextrinas) mediante la acción de la a-transglucosidasa (EC 2.4.1.24) de Aspergillus sp. (Starch, 1988, 40:453-459).

Más recientemente, el uso de la enzima glucosiltransferasa aislada de Leuconostoc mesenteroides ha sido reseñado. Remaud et al. divulgaron la producción de oligosacáridos lineales y de ramificación corta con grupos de enlace a-(1 ^6 ) y una maltosa en el extremo reductor usando una relación inicial de materia prima de sacarosa:maltosa de 7:1 a partir de una reacción catalizada por glucosiltransferasa de Leuconostoc mesenteroides ATCC 13146 extracelular (Remaud, M., et al., J. Carbohydrate Chem., 1992, 11(3):359-378), produciendo dextranos ramificados con 1-3 grupos de enlace. El mismo grupo ha reseñado la producción de mezclas de isomaltooligosacáridos ramificados a -(1^2) a partir de sacarosa con una reacción aceptora catalizada por dextransacarasa (Remaud-Simeon, M. et al., Appl. Biochem. Biotechnol., 1994, 44:101-17). Pablo et al. divulgaron la síntesis y purificación de mezclas de isomaltooligosacáridos ramificados que contienen un enlace a -(1^2 ) por la acción de glucosiltransferasa soluble e insoluble aislada de Leuconostoc mesenteroides B-1299 en sacarosa y un aceptor de glucosilo tal como maltosa (o un material rico en maltosa, tal como un producto de hidrólisis de almidón), isomaltosa, a-glucósido de metilo, isomaltotriosa o glucosa (o un material rico en glucosa, tal como un almidón producto de hidrólisis) (Paul, F. et al., patente de EE. UU. n.° 5.141.858).

Chung y Day produjeron glucooligosacáridos (MIMO) generados en el lugar durante la fermentación a través de la acción de dextransacarasa generada en el lugar durante la fermentación viva sobre sacarosa en presencia de un aceptor de maltosa (patente de EE. UU. n.° 7.291.607). Los isomaltooligosacáridos producidos eran un producto extracelular de la fermentación de sacarosa por Leuconostoc mesenteroides ATCC 13146. Chung y Day demostraron que estos glucooligosacáridos (MIMO) son fácilmente utilizados por Bifidobacterium sp. y Lactobacillus sp., pero no por Escherichia coli o Salmonella sp. en estudios de cultivo puros (Chung, CH y Day, D. F., J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 2002, 29:196-9).

La síntesis enzimática inmovilizada de isomaltooligosacáridos se ha usado para producir estos compuestos, pero es un proceso costoso y complejo que requiere aislamiento, inmovilización y separación de enzimas y probablemente requiere más etapas costosas en la purificación del producto final. El método de la presente invención es una mejora de cambio gradual en la forma de producir isomaltooligosacáridos en términos de eficiencia de producción y pureza del producto final. El enfoque de producción de enzimas inmovilizadas también procura una mezcla diferente de moléculas en comparación con proceso de fermentación en el lugar natural. Por ello, se prefiere el enfoque en el lugar para producir un producto natural que puede ser más deseable como suplemento dietético que los productos producidos por otros métodos.

Método mejorado para la producción de isomaltooligosacáridos

La fermentación convencional es un enfoque más práctico para la fabricación industrial de glucooligosacáridos, y en particular de isomaltooligosacáridos, que el uso de enzimas inmovilizadas. Los cultivos vivos que producen dextransacarasa en el lugar también convierten metabólicamente la D-fructosa en D-manitol que se puede separar económicamente. La D-fructosa es un compuesto difícil de separar de los isomaltooligosacáridos y puede ser perjudicial para el uso de este producto en la nutrición humana, dada la información actual sobre los efectos negativos de los jarabes ricos en fructosa. (Véanse: Ouyang, X., et al., J. Hepatol., 2008, 48(6):993-9. doi: 10.1016/j.jhep.2008.02.011. Epub 10 de marzo de 2008; Dhingra, R. et al., Circulation, 2007, 116:480-488; Swanson, J. E., et al., Am. J. Clin. Nutr., 1992, 55(4):851-856; y Vartanian, L. R. et al., Am. J. Public Health, 2007, 97(4):667-75. Epub 28 de febrero de 2007.)

Al utilizar el método de la presente invención, el tamaño y la composición de los MIMO del producto pueden controlarse estrechamente. La relación de sacarosa:maltosa (S/M) proporciona el control principal de la composición del producto, ya que determina la distribución general de GP. El control estrecho del pH de la mezcla de fermentación deja el refinado de la composición del producto. Específicamente, dentro del intervalo de pH de 6,5 a 5,5, la curva de campana de la composición del producto se desplaza a un GP más alto a medida que el pH disminuye y viceversa. La introducción de cantidades específicas de Ca++ también determina el grado de ramificación del MIMO del producto al promover una o más isoformas de dextransacarasa (Chae et al., J. Microbiol. Biotechnol., 2009, 19(12): 1644-1649).

La composición del MIMO producido está determinada principalmente por las bacterias utilizadas en la etapa de fermentación. La acción de la especie del género de bacterias Leuconostoc mesenteroides ATCC 13146 sobre una mezcla de sacarosa/maltosa bajo las condiciones de la presente invención produce IMO con grupos de enlace a-(1 ^4 ) y a-(1^-6) con o sin ramificación a-(1^4), a-(1^-3) y a-(1^-2). La enzima utilizada por Leuconostoc mesenteroides para catalizar la reacción de enlazamiento, la dextransacarasa se ha aislado previamente de diversas cepas de la bacteria y se ha usado para producir IMO similares. El IMO sintetizado por dextransacarasa aislado de Leuconostoc mesenteroides ATCC 13146 tenía esqueletos a -(1^6 ) con cadenas laterales a-(1^2), a -(1^3 ) y/o a -(1^4 ) cuando se usaba maltosa como aceptor (Remaud, M. et al., J. Carbohyd. Chem., 1992, 11:359-378). Es razonable suponer que los MIMO que contienen cadenas laterales a-(1^2), a -(1^3 ) y a -(1^4 ) serán prebióticos efectivos.

Cualquier organismo que produzca dextransacarasa es aplicable para su uso en el proceso descrito en el presente documento. Por ejemplo, como se muestra en la Figura 1, el GlcOS producido por el método de la presente invención es una familia de isomaltooligosacáridos que incluyen, pero sin limitación, isomaltooligosacáridos ramificados. La mezcla final contiene IMO con GP2 a GP10, que se consideran prebióticos deseables (Van Loo, J. et al., Br. J. Nutr., 1999, 81:121-32). La dextransacarasa de Leuconostoc mesenteroides cepa ATCC 13146 prefiere de forma fiable sintetizar GlcOS con grupos de enlace a-(1^6) cuando se usa maltosa como aceptor. Los oligómeros de GlcOS más grandes (GP4 a GP8) pueden tener grupos de enlace a -(1^6 ) continuos con la maltosa, es decir, MIMO. Muchas especies de Leuconostocacea también producían MIMO ramificados.

Cualquier especie de microorganismo capaz de producir dextransacarasa, incluidos Leuconostoc mesenteroides, puede utilizarse en el proceso de la presente invención. Por ejemplo, se puede usar L. mesenteroides ATCC 13146. Esta bacteria es conocida por otras denominaciones por los expertos en la materia, incluida la denominación Leuconostoc citreum ATCC 13146, la denominación NRRL B-742 y la denominación PWSA-L. citreum B742, la denominación Leuconostoc citreum Farrow, y la denominación L. amelibiosum. la bacteria Leuconostoc mesenteroides subesp. mesenteroides (Tsenkovskii) van Tieghem (ATCC® 11449™), NRRL B-1299, también puede emplearse. Otros microorganismos productores de dextransacarasa útiles incluyen, pero sin limitación, Leuconostoc spp (específicamente mesenteroides, citreum, gasicomitatum y kimchii), Weisella spp. (específicamente confusa, tal como NRRL n.° B 1064), Lactococcus spp., Streptococcus spp. (específicamente mutans), Lactobacillis spp. (reuteri), Pediococcus pentosaceus spp., especialmente Pediococcus pentosaceus (ATCC n.° 33316), y ciertos mutantes de E. coli. Los microorganismos útiles también se pueden aislar de fuentes naturales que incluyen, pero sin limitación, masa madre silvestre (la mezcla de bioorganismos usada en la producción de pan de masa madre) y kimchi (un plato tradicional coreano fermentado hecho de verduras y condimentos).

La relación de materia prima de sacarosa a maltosa (S:M) utilizada en el proceso de la presente invención es un determinante de la composición química del oligómero producto. En una realización, en condiciones por lotes, las bacterias se cultivan en una mezcla de nutrientes (medio de cultivo) adecuada para soportar el crecimiento de las bacterias y una relación fija de sacarosa:maltosa y se deja que continúe la fermentación hasta que toda la fructosa generada durante la reacción se convierte en manitol. La producción de oligosacáridos se completa cuando se agota la sacarosa. El tiempo de fermentación adicional puede dar como resultado la reorganización de los MIMO por recombinación química que cambia la distribución de GP. En algunos casos, se forman cadenas más largas, posiblemente a partir de la actividad enzimática residual continua. La continuación hasta que la fructosa se convierte en manitol también simplifica la purificación del producto final. A continuación, se llevan a cabo las etapas posteriores del proceso, la retirada de las células bacterianas gastadas, la decoloración del producto y la separación del manitol y los ácidos orgánicos de los oligosacáridos producto.

A escala comercial, el método de la presente invención se lleva a cabo en equipos conocidos por los expertos en la materia. Al iniciar el proceso de fermentación, todo el sistema del equipo se enjuaga, limpia y esteriliza. Un tanque de fermentación se carga con los componentes de medios necesarios (vitaminas típicas, sulfatos, fosfatos, sales y otros materiales usados para el crecimiento bacteriano, tales como los medios recomendados por la ATCC para su uso en el crecimiento del microorganismo que se está cultivando, incluidos medios de cultivo e ingredientes deshidratados DIFCO®) y sacarosa y maltosa en una relación definida. Por separado, el inóculo (en el enfoque preferido, ATCC 13146) se cultiva hasta alcanzar la DO-1 (densidad óptica o absorbancia a 660 nm mediante espectrofotómetro UV-VIS) y se añade a la fermentación en un volumen en el intervalo de aproximadamente el 1 % a aproximadamentel 10 % de la cantidad contenida en la fermentación. La fermentación tiene lugar a una temperatura de unos 28 °C. La fermentación continúa hasta que no hay fructosa presente, durante un período de aproximadamente 25 a 60 horas. Las células se separan del caldo mediante microfiltración, centrifugación o clarificación y luego se desechan. El caldo se decolora mediante el uso de carbón activado granular a aproximadamente 70 a aproximadamente 80 °C. Como alternativa, se puede usar carbón activado en polvo y retirarlo por filtración. El producto se separa del caldo decolorado usando cromatografía de lecho móvil simulada o pulsada a una temperatura de aproximadamente 60 a aproximadamente 65 °C. Luego, el extracto se concentra según se desee y se refina para retirar las impurezas insolubles, lo que se puede efectuar mediante centrifugación o microfiltración. Luego se puede secar por pulverización o secar por congelación si la intención es procurar un producto en polvo.

En otra realización, en condiciones de alimentación por lotes, el proceso de la invención puede ejecutarse de forma continua o semicontinua. Se puede introducir materia prima adicional para mantener la fermentación y gestionar la relación de sacarosa:maltosa. El pH puede controlarse durante la fermentación extendida al mismo tiempo mediante la adición de hidróxido de sodio, cal, sucrato de calcio u otra base adecuada como se describe a continuación. A medida que se consume la materia prima inicial, se puede añadir al medio de cultivo materia prima adicional, ya sea sacarosa o maltosa. Tales adiciones de materias primas se pueden usar (a) para mantener la relación de sacarosa:maltosa fija inicial o (b) para cambiar la relación de sacarosa:maltosa a medida que avanza la fermentación. En una realización, la sacarosa se añade por separado de la maltosa para lograr una relación específica de sacarosa:maltosa. En otra realización, la maltosa se añade por separado de la sacarosa como un medio para ajustar la relación de sacarosa:maltosa. Tal adición de maltosa sola también puede evitar su degradación por el contacto continuo con la base fuerte antes de la adición al cultivo. Se puede usar cualquier enfoque para producir el producto final MIMO de primer orden con la composición química deseada.

En cualquier momento durante la fermentación extendida, el control del pH puede tener lugar utilizando hidróxido de sodio, cal, sucrato de calcio u otra base. Cuando se usa sucrato de calcio, los ajustes en la adición de materia prima, la relación de sacarosa:maltosa y el control del pH pueden tener lugar simultáneamente. Tal proceso de alimentación por lotes puede implicar una bomba de entrada para cada componente de materia prima y cada componente de control del pH, lo que deja un control estrecho de la relación de sacarosa:maltosa y del control del pH. El caldo que contiene el producto se absorbe y se llevan a cabo las demás etapas del proceso. En otra realización, se añade sucrato de calcio al cultivo para controlar el pH, en particular, para mantener un pH específico en el intervalo de 5,5 a 6,8. También es posible añadir al mismo tiempo maltosa adicional para introducir una relación de sacarosa:maltosa específica con cada dosis de control de pH. En otra realización, la sacarosa (o sucrato de calcio) y la maltosa pueden mezclarse justo antes de su uso, mantenerse en frío y usarse inmediatamente. De esta forma, es posible controlar la relación de sacarosa:maltosa y el pH al mismo tiempo, ya sea usando hidróxido de sodio, cal, sucrato de calcio u otra base para lograr la composición química de MIMO deseada.

En cualquiera de las realizaciones divulgadas en el presente documento, la relación de sacarosa:maltosa puede oscilar entre más de 2:1 y 7:1. La relación de sacarosa:maltosa puede oscilar entre más de 2:1 y 3,5:1. Preferiblemente, la relación de sacarosa:maltosa oscila entre más de 2:1 y 3,2:1. Adicionalmente, las siguientes relaciones de sacarosa:maltosa tienen utilidad: 2,33:1; 3,17:1 y 3,2:1. Todas estas relaciones de sacarosa:maltosa se pueden utilizar en el proceso de la invención para proporcionar productos MIMO comercialmente deseables para consumo de mamíferos o aves, preferiblemente para consumo humano. A modo de antecedente, una relación de sacarosa:maltosa de 2:1 produce un intervalo de GP de 4 a 7 usando el proceso de la invención.

La variación de la relación de S:M cambia el grado de polimerización y el peso molecular promedio de las distribuciones de isomaltooligosacáridos que se producen, desplazándolos a valores promedio más pequeños a medida que aumenta la cantidad de maltosa en relación con la sacarosa. Este parece ser un efecto común para cualquier organismo productor de dextransacarasa, independientemente de la cepa (Day, D.F. y Yoo, S. K., "Natural Glucans: Production and Prospects", en R. A. Gross y C. Scholz (eds.), Biopolymers from Polysaccharides and Agroproteins, ACS Symposium Series, American Chemical Society, Washington D.C., 2001, 786:292-300). El grado de ramificación de los MIMO puede determinarse por la presencia de una cantidad apropiada de un catión de metal divalente en el medio de cultivo. Si bien no se desea ceñirse a ninguna teoría en particular, el catión de metal divalente puede influir en la composición final del IMO formando un complejo con los azúcares de la materia prima, la enzima activa o ambos. Los cationes de metales divalentes apropiados incluyen, pero sin limitación, calcio (Ca++), magnesio (Mg++), estroncio (Sr+++), cinc (Zn++), manganeso (Mn++) y hierro (Fe++).

Control de pH

El hidróxido de sodio (NaOH) se usa habitualmente como reactivo de control de pH en la fermentación. Por ejemplo, las bacterias acidolácticas, incluidas Leuconostoc spp., necesitan una cantidad significativa de NaOH para mantener el pH óptimo para su crecimiento activo debido a la producción de ácidos orgánicos durante la fermentación. Sin control de pH, el pH de Leuconostoc mesenteroides ATCC 13146 en fermentación desciende rápidamente a pH 3,5 en 10 horas (tesis doctoral, Yoo, Sun Kyun, "The Production of Glucooligosaccharides by Leuconostoc mesenteroides ATCC 13146 and Lipomyces Starkeyi ATCC 74054", 1997, Louisiana State University).

En el método de la presente invención, la base utilizada puede ser cualquier hidróxido seleccionado de metales alcalinos o alcalinotérreos, incluidos, pero sin limitación, MgO, MgOH2, CaO, CaOH2, SrO, Sr(OH)2, NaOH, LiOH y KOH. En una realización, se prefieren sacaratos de hidróxido de calcio (sucratos). El uso de sucrato de hidróxido de calcio deja la adición de sacarosa como materia prima simultáneamente con la base requerida para regular el pH al nivel deseado. Por ejemplo, es una combinación deseable una solución de CaOH2 aproximadamente al 5 % en sacarosa al 25 %. El CaOH2 puede proporcionarse como cal apagada, cal u óxido de calcio. En otra realización, la base utilizada puede ser un carbonato de metal alcalinotérreo.

El uso de CaOH2 obtenido a partir de la cal tiene ventajas económicas en la presente invención. Como se muestra en el Ejemplo 5 a continuación, una fermentación de dos litros requería 16,2 g de NaOH para mantener un pH de 5,5. Usando la información de precios de 2013 (véase el Ejemplo 5, Tabla 2, a continuación), el coste de NaOH a granel sería de 44,55 $ para una fermentación de 10.000 l, mientras que el costo de la cal equivalente sería de 18,15 $. A escala industrial, la cal (0,14 $ por 10 kg de producto) puede ser una alternativa de bajo costo al NaOH, incluso si es necesario aumentar la cantidad de cal al doble o más para mantener un pH apropiado. El método de sucrato de calcio (0,07 $ por 1 kg de producto) es más atractivo porque la solubilidad de la cal aumenta hasta un 5 % en una solución de sacarosa al 22,5 % (tesis doctoral, Madsen, L. R. "Iron Mediated Precipitation of Phenol: Protein Aggregates from Sugar Cane Juice ", Louisiana State University, Baton Rouge, 2009) y la alimentación con maltosa al mismo tiempo aumentaba el rendimiento observado del producto a lo largo del tiempo.

El uso de calcio como contraión básico tiene ventajas en el proceso. Se usa una resina catiónica de intercambio cromatográfico (calcio, forma de Ca++) en esta realización para separar los MIMO de los ácidos orgánicos y el manitol. Debido a la alta concentración de iones de sodio (Na+) presentes en el caldo de fermentación, los iones de sodio reemplazan a los iones de calcio (Ca++) en la resina usada durante las separaciones. La presencia de los iones de calcio mitiga la necesidad de regenerar las resinas de separación durante el procesamiento. Por tanto, en el presente método, el uso de un álcali basado en iones de calcio reduce el coste total de producción de MIMO.

Purificación de productos

Según el método de la presente invención, los MIMO se separan de la mezcla de fermentación después de que se completa la fermentación según lo determinado por la conversión de la fructosa en manitol. Como alternativa, la fermentación continúa durante una cierta cantidad de tiempo para dejar que los MIMO producidos se reorganicen espontáneamente en cadenas más largas, si se desea en el producto final. La cantidad de tiempo necesaria para esta reorganización puede determinarse realizando experimentos como se describe en este documento para optimizar las longitudes de cadena de MIMO deseadas.

Luego, las células bacterianas se retiran de la mezcla de fermentación, que luego se somete a un proceso de retirada de cenizas en dos etapas (ácido fuerte/base débil) y luego se decolora. Luego, el manitol se retira a través de un proceso de cristalización y, opcionalmente, los MIMO producto se pueden separar de los subproductos mediante cromatografía.

Como alternativa, los MIMO se separan de la mezcla de fermentación después de que se completa la fermentación según lo determinado por la conversión de la fructosa en manitol. En una realización adicional, la fermentación continúa durante una cierta cantidad de tiempo para dejar que los MIMO producidos se reorganicen espontáneamente en cadenas más largas. La cantidad de tiempo necesaria para la reorganización puede determinarse realizando experimentos como se describe en el presente documento para optimizar las longitudes de cadena de MIMO deseadas.

Las células bacterianas se retiran de la mezcla de fermentación, que luego se decolora y se somete a un proceso de retirada de cenizas en dos etapas: un ácido fuerte seguido de una base débil. Luego se retira el manitol usando un proceso de cristalización simple o compuesto. Los MIMO producto pueden separarse opcionalmente de los subproductos restantes mediante cromatografía.

Los métodos adecuados para retirar las células bacterianas incluyen centrifugación, filtración o clarificación química. En una realización, se emplea la centrifugación. Los tipos de separación incluyen centrifugación líquida continua o por lotes, usando un decantador horizontal, separador de crema/centrífuga de disco y/o clarificación química seguida de decantación y/o filtración. Los tipos de filtración incluyen, pero sin limitación, ultrafiltración, microfiltración o filtración en gel.

Los métodos adecuados para la decoloración incluyen, pero sin limitación, el uso de carbono activado en forma de polvo o gránulos, con o sin tampón de pH (p. ej., magnesita), y pueden efectuarse en modo discontinuo o continuo (p. ej., columna). También se puede utilizar carbón activado. Un carbono activado adecuado es Carbochem CA-50 (Carbochem Inc., Wynnewood, PA) o un carbono activado equivalente. En el modo discontinuo, se añade carbono decolorante de aproximadamente 60 a aproximadamente 70 °C, se deja enfriar la mezcla en bruto a una temperatura de aproximadamente 40 °C y, después de la agitación, se añade un auxiliar de filtración. La mezcla en bruto se filtra para procurar licor decolorado.

En modo continuo, el licor en bruto se hace pasar a través de una columna cargada con carbono activado granulado de aproximadamente 65 a aproximadamente 70 °C. Una vez saturado, el carbono se puede hornear o regenerar en el lugar mediante tratamiento con etanol alcalino o equivalente (Bento). Los ejemplos de auxiliares de filtración adecuados incluyen, pero sin limitación, dióxido de silicio, tierra de diatomeas, diatomita y tierra de infusorios. Las marcas adecuadas incluyen Celite® 545 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) y Celatom® (Sigma-Aldrich). El grado del filtro se selecciona según el tiempo deseado para que la filtración ocurra a una tasa óptima, ya que los grados más finos ralentizarán la filtración de manera significativa.

En una realización preferida, la mayor parte del producto secundario manitol se puede retirar concentrando la mezcla y enfriándola hasta que aparece la cristalización. A continuación, los cristales pueden separarse mediante decantación, filtración o uso de una centrífuga de cesta. Como alternativa, se puede realizar la precipitación fraccionada de productos utilizando disolventes orgánicos tales como el etanol.

En otra realización, el manitol y los ácidos orgánicos pueden retirarse adicionalmente mediante cromatografía continua o pulsada. (Véase la Figura 5). Por ejemplo, se puede utilizar una resina de intercambio de ácido fuerte (SAC) de tipo gel de calidad cromatográfica en forma de calcio (SAC-Ca) mantenida a 45-70 °C. Dos fracciones principales son resultado de la cromatografía: 1) MIMO más ácido acético; y 2) manitol más ácido láctico. Es posible que quede algo de ácido láctico y algo de ácido acético en la fracción de MIMO después de completar la cromatografía sin interferir con el procesamiento posterior.

Si se desean retirar las cenizas, se puede usar una resina de intercambio aniónico en forma de base libre parcial como se describe por Saska y Chen (patente de EE. UU. n.° 6.451.123). Como alternativa, la fracción que contiene el producto oligosacárido se puede purificar adicionalmente mediante la retirada de cualquier ion de metal pesado presente utilizando una combinación de ácido/base de resinas de intercambio iónico. Las combinaciones de ejemplo incluyen, pero sin limitación, SAC/SBA, SAC/WBA, WAC/SBA y WAC/WBA en serie, o se usan como lechos de resina mixta.

En una realización preferida, la decoloración ocurre antes de la retirada de cenizas para proteger las resinas de retirada de cenizas de la contaminación de los cuerpos de color. Además, el uso de WBA frente a SBA ofrece tres mejoras clave: (1) la WBA retira todos los ácidos orgánicos que, de otro modo, solo se retirarían parcialmente mediante cromatografía líquida, (2) retira las proteínas residuales en el caldo de fermentación y (3) retira cualquier color residual que no se retiró mediante la etapa de carbono activado. La retirada del color residual es importante porque la resina puede ensuciarse irreversiblemente sin esta etapa. Mediante el uso de este conjunto de retirada de cenizas específico, se encuentran disponibles opciones posteriores adicionales para el refinado del producto final, tales como la cristalización de manitol, además de la cromatografía líquida o ambas en combinación.

En una realización adicional, el licor que contiene MIMO se concentra por evaporación para dar una solución con un intervalo Brix entre aproximadamente 20 y aproximadamente 70 (gramos de sólidos refractivos secos/100 g). Otros intervalos de Brix posibles están entre aproximadamente 30 y aproximadamente 65, entre aproximadamente 50 y aproximadamente 60, entre aproximadamente 55 y aproximadamente 65 y entre aproximadamente 55 y aproximadamente 59. Se pueden preferir otros intervalos de Brix para usos específicos del producto final.

En otra realización, el manitol se puede retirar adicionalmente mediante cromatografía continua o pulsada. Véase la Figura 5. Por ejemplo, se puede utilizar una resina de intercambio de ácido fuerte (SAC) de tipo gel de calidad cromatográfica en forma de calcio (SAC-Ca) mantenida a 45-70 °C. Dos fracciones principales son el resultado de la cromatografía, MIMO y manitol, quedando algo de manitol residual en la fracción de MIMO.

En una realización adicional, el licor que contiene MIMO se concentra por evaporación para dar una solución con un intervalo Brix entre 20 y 70 (gramos de sólidos refractivos secos/100 g). Otros intervalos de Brix posibles están entre aproximadamente 30 y aproximadamente 65, entre aproximadamente 50 y aproximadamente 60, entre aproximadamente 55 y aproximadamente 65 y entre aproximadamente 55 y aproximadamente 59. Se pueden preferir otros intervalos de Brix para usos específicos del producto final.

En otra realización más, el MIMO se convierte en polvo mediante secado por pulverización o mediante secado por congelación u otras formas de evaporación al vacío. Como alternativa, el licor purificado se puede precipitar con etanol o un disolvente similar para procurar un producto sólido que se seca fácilmente.

Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no a modo de limitación.

EJEMPLOS

Ejemplo 1

Preparación de cepa bacteriana y medio de cultivo (referencia)

L. citreum se adquirió de la American Type Culture Collection (ATCC 13146, Manassas, VA). Después del reaislamiento, la cepa se almacenó en un congelador a -74 °C en glicerol al 20 %. Este cultivo de dos litros se cultivó a 28 °C en un medio compuesto por sacarosa (100 g/l), maltosa (50 g/l), extracto de levadura (5 g/l), MgSO⁴-7H²O (0,2 g/l), FeSO⁴-7H²O (0,01 g/l), NaCl (0,01 g/l), MnSO⁴-7H²O (0,01 g/l), CaCh (0,05 g/l), KH2PO4 (3 g/l a pH 6,5). Para fermentaciones de dos litros, se disolvieron extracto de levadura (10 g), MgSO⁴-7H²O (400 mg), FeSO⁴-7H²O (20 mg), NaCl (20 mg), MnSÜ⁴-7H²O (20 mg), CaCl2 (100 mg) y KH2PO4 (6 g) en agua destilada (1250 ml) y se ajustaron a pH 6,5 utilizando NaOH 6 M antes de la inoculación. La mezcla se sometió a autoclave durante 15 min a 120 °C. Las soluciones de maltosa (100 g/250 ml) y sacarosa (200 g/500 ml) se esterilizaron antes de transferirlas al fermentador.

Ejemplo 2

Control de pH-materiales y preparaciones

La capacidad de control del pH de la cal se comparó con el hidróxido de sodio (NaOH). Los gránulos de hidróxido de sodio se adquirieron de Fisher Scientific (Hanover Park, IL) y el polvo de cal hidratada se adquirió de Batesville Marble Hydrated Lime (Arkansas Lime Company, Batesville, AR). Se prepararon soluciones de NaOH (5 % p/v, 1,25 M, 1,25 M eq. [OH-]) y cal (5 % p/v, 0,68 M, 1,35 M eq. [OH-]) disolviendo 50 g de cada una en 1 l de agua destilada. Para preparar una solución de sucrato de calcio al 5 %, se sometieron a autoclave por separado polvo de cal (50 g en una botella de 1 l) y sacarosa (250 g en 805 ml de agua destilada). Después de someter a autoclave, la solución de sacarosa se transfirió a los 50 g de cal para dar una concentración de la solución final de 5 % de cal en 25 % de sacarosa, y se le dio la identificación "sucrato de calcio al 5 %". También se preparó por separado una solución de maltosa (1 l al 12,5 %).

Ejemplo 3

Fermentación y control de pH (Referencia)

Las fermentaciones por lotes se realizaron usando fermentadores BioFlo II de 2 l (New Brunswick Scientific, New Brunswick, NJ). Los fermentadores se inocularon a partir de cultivos de siembra en matraces de fase logarítmica tardía al 1,0 % (20 ml) del volumen de trabajo. Las fermentaciones se realizaron a 28 °C con agitación a 200 rpm.

El pH de los cultivos disminuyó desde un pH inicial de 6,5 a medida que las células producían ácido orgánico y continuó cayendo hasta que comenzó el control automático, cuando el pH alcanzó 5,5 (óptimo para la dextransacarasa usada). Esto tomó aproximadamente 5,5 horas. El pH se mantuvo en 5,5 hasta la finalización de la fermentación (~30 h) usando NaOH al 5 % (p/v), cal al 5 % (p/v) o sucrato de calcio al 5 % (junto con solución de maltosa al 12,5 % p/v)). Se usó una alimentación de 5 % de sucrato de calcio y 12,5% de maltosa para ajustar el pH y mantener una relación de sacarosa a maltosa de 2:1. Para el método de sucrato de calcio, el sucrato de calcio y la maltosa se alimentaron por separado con el mismo caudal durante las 18 horas iniciales para controlar el pH y luego se reemplazó por una solución de cal durante 12 horas hasta el final (30 horas) para evitar la fructosa residual en los caldos finales de fermentación.

Ejemplo 4

Purificación de MIMO, manitol y ácidos orgánicos

Después de la recolección, las células se retiraron por centrifugación a 10400 g durante 20 min. Se añadió carbón activado (5 g/l, Sigma, St. Louis, MO; malla 100~400) y Celite 545 (1 g/l, Fisher Scientific, Hanover Park, IL) al caldo de cultivo libre de células y se mezcló a 50 °C durante 20 min. El caldo se filtró a través de papel de filtro n.° 3 (Whatman, Maidstone, Inglaterra) para retirar el carbono. El caldo filtrado se concentró usando un rotavapor Yamato RE71 (Yamato, Santa Clara, CA) de 65 °C a 85 °C hasta 57 g/100 g (°brix).

Se usó cromatografía de intercambio catiónico (columna de 6,0 x 70 cm) con resina Dowex Monosphere 99 320 prehinchada (estireno sulfonado-DVB, 300-330 pm, gel, 1,5 eq/l [H+], forma de Ca++; Dow, Midland, MI) para separar los MIMO. (Véase la Figura 5). La elución se controló en tiempo real midiendo periódicamente el refractómetro brix (Atago Pallet). Durante la elución, se descartó el volumen vacío y luego se recogieron las fracciones y se analizaron tanto los carbohidratos como los ácidos por HPLC.

En base a los resultados del análisis de HPLC (o brix), se combinaron las fracciones de MIMO que contenían MIMO:ácido acético o manitol:ácido láctico. Después de concentrar a 30 °Brix, el manitol se separó del ácido láctico mediante precipitación etanólica (etanol al 70 %). La fracción sólida precipitada (manitol) se lavó nuevamente con etanol al 100 % y se secó al aire a 55 °C. La fracción de MIMO y las fracciones de ácido láctico se secaron por congelación. El ácido acético es volátil y la mayor parte se retiró durante la liofilización. (Véase la Figura 3.)

Ejemplo 5

Purificación de MIMO, manitol y ácidos orgánicos

Después de la recolección, las células se retiraron por centrifugación a 9-14 k*g durante 20-30 min. Se añadió carbón activado (0,5-3,0 % p/p, Carbochem DC-50 o equivalente) al caldo de cultivo libre de células y se mezcló a 40-70 °C durante 20-60 min. El caldo se filtró a través de papel de filtro n.° 3 (Whatman, Maidstone, Inglaterra) cubierto con auxiliar de filtrado de diatomeas (flujo rápido, Celite 545 o equivalente, 1,0-6,0 % p/p) para retirar el carbono. El caldo filtrado se concentró usando un rotavapor Buchi R-220 a 65 °C a 85 °C a 57 g/100 g (°brix).

Ejemplo 6

Comparación de la producción de MIMO con cal, sucrato de calcio o hidróxido de sodio

Usando cal en lugar de NaOH para el control del pH, se produjo GlcOS a partir de Leuconostoc mesenteroides ATCC 13146 según el método de Chung y Day (2004, Poult. Sci., 83:1302-6)). El progreso fue monitorizado a través de TLC. Los productos GlcOS (indicados por flechas en la Figura 2) eran principalmente polisacáridos GP3 (grado de polimerización, panosa) a GP6 con valores de R^fno correspondientes ni a maltooligosacáridos (M2-M5) ni a isomaltooligosacáridos (IM2-IM4).

Una vez completadas las fermentaciones, evaluadas por TLC, se compararon los rendimientos de GlcOS (GP>3), manitol y maltosa producidos usando control de pH con NaOH al 5 % cal al 5 % sucrato de calcio al 5 %, con 12,5% de maltosa en términos de GlcOS total según lo determinado por HPLC. La Tabla 1 muestra la producción de GlcOS por porcentaje en peso de la alimentación de carbohidratos.

Tabla 1

Usando cal, los rendimientos (% de GlcOS (GP>3) por cantidad total de carbohidratos de entrada) fueron similares (42,4±0,51 %) al control de NaOH (41,1±1,50 %) (Tabla 1). En todas las fermentaciones, la producción de GOS (GP>3) y manitol se completó aproximadamente a las 15 y 21 h posteriores a la inoculación, según el tipo de control de pH usado (Figura 4). Con sucrato de calcio al 5 %, la producción final de GlcOS (387,7 g) fue mayor que con NaOH (Tabla 2) y el rendimiento de 40,0±1,35 % (GlcOS (GP>3) por cantidad total de carbohidratos de entrada) fue ligeramente inferior al 42,4± 1,50 % observado usando NaOH al 5 % (Tabla 1).

Tabla 2

Una fermentación de dos litros requería 16,2 g de NaOH, 26,3 g de cal y 21,5 g de sucrato de calcio para mantener el pH óptimo. Se calcularon los costes de NaOH o cal en relación con el rendimiento del producto respectivo y se dan en la Tabla 2.

Ejemplo 7

Control de pH de patrones de producto de maltosil-isomaltooliaosacáridos

Los maltosil-isomaltooligosacáridos se producen por fermentación de sacarosa en presencia de maltosa por el organismo. L. mesenteroides ATCC 13146. Generalmente, el pH del medio de fermentación cae desde su pH inicial preferido de 6,5-6,8 a 5,5-4,5 a medida que crece el organismo. En este ejemp lo, se produjeron maltosilisomaltooligosacáridos a partir de la fermentación a tres pH diferentes (pH 6,5, pH 6,0 y pH 5,5).

Las fermentaciones por lotes se realizaron en fermentadores BioFlo de 10 l (New Brunswick Scientific, New Brunswick, NJ). Los fermentadores se inocularon a partir de cultivos de siembra en matraces de fase logarítmica tardía al 1,0 % (100 ml) de volumen de trabajo. Las fermentaciones se realizaron a 28 °C con agitación a 200 rpm. Para mantener la fermentación, se configuró inicialmente el medio a un pH de 6,5, y se dejó caer durante la fermentación a un pH de 5,5, y después se mantuvo a un pH de 5,5 usando NaOH 10 N alimentado mediante control de pH automático. Si se requerían diferentes valores de pH del proceso, se usaba el mismo proceso, excepto que el control automático se configuraba para comenzar con el pH de fermentación deseado.

Se usó cromatografía líquida de alta resolución (HPLC Agilent 1200 con un detector de índice de refracción diferencial a 45 °C, BioRad Aminex HPX-87K a 85 °C eluido con agua al 100 % a 0,6 ml/min) para el análisis cuantitativo de carbohidratos. Se usó una curva de tres puntos compuesta de maltosa, panosa, manitol, glucosa y fructosa para estandarizar el instrumento. Los patrones finales de maltosil-isomaltooligosacáridos producidos diferían según el pH mantenido durante el proceso de fermentación. Como se muestra en la Figura 6, un gráfico de barras de los datos de la Tabla 3, un pH más bajo producía oligómeros más largos (GP 4-7) de maltosil-isomaltooligosacáridos, mientras que un pH más alto procuraba los oligómeros más cortos maltosa o panosa (GP 2-3).

Tabla 3

La Figura 7 muestra el efecto que tiene la relación de sacarosa:maltosa (S/M) sobre la distribución del peso molecular a un pH fijo de 5,5. A medida que aumenta la S/M, también lo hace la distribución del peso molecular. Se realizaron experimentos adicionales a tres pH de fermentación diferentes. Se compilaron los perfiles de cada componente de carbohidrato durante estas fermentaciones a tres pH diferentes e incluyeron la monitorización de la densidad de crecimiento celular, sacarosa, maltosa, manitol, monómeros (glucosa, fructosa) y polímeros de maltosilisomaltooligosacáridos (GP 3-7).

Ejemplo 8

Efecto de la relación de sacarosa:maltosa sobre la composición del producto

Los oligosacáridos se produjeron según el método descrito anteriormente. Sin embargo, se varió la relación de sacarosa a maltosa (S/M) con el fin de determinar las relaciones óptimas para la producción de maltosilisomaltooligosacáridos en diversos intervalos de grado de polimerización (GP). Las muestras de fermentación se analizaron mediante HPAEC-PAD (cromatografía de intercambio iónico de alta presión utilizando un Thermo Dionex ICS-5000 con una columna Carbopac PA-100 y un detector amperométrico pulsado).

A modo de referencia, la Figura 8 demuestra el efecto del pH cuando la S/M se fija en 2:1. Está claro que cuanto más se acerca el pH al óptimo de la enzima, mayor es la proporción de oligosacáridos de mayor peso molecular. También es evidente que la conversión de maltosa se vuelve más eficaz a pH < 6,8 y que la panosa se glicosila a mayor tasa.

Ejemplo 9

Uso de diferentes m icroorganismos productores de dextransacarasa

Leuconostoc spp. ATCC 13146 y kimchi se evaluaron a través del mismo proceso que el expuesto para la presente invención. El jugo de Kimchi se secuenció por PCR para revisar el ARNr 16S para determinar las especies bacterianas en el jugo de kimchi y se confirmó la presencia de Leuconostoc spp. (que comprende el 72,5 % de las bacterias presentes en el jugo) capaz de producir dextransacarasa. Véase la Tabla 4 a continuación. En el caso de NRRL 1299, la especie se cultivó a partir de aislamientos secados por congelación revividos proporcionados por la ATCC. Con kimchi, el jugo de fermentación activo se usó como inoculo. En cada caso, después de que se prepararon los medios de azúcar y nutrientes, se esterilizó en el fermentador y luego se inoculó. El inóculo se preparó cultivando las bacterias hasta DO-1 (densidad óptica o absorbancia a 660 nm mediante espectrofotómetro u V-VIS). El pH en el fermentador se ajustó con hidróxido de sodio a 6,5 en la fermentación inicial. La fermentación de los medios se llevó a cabo durante 25 a 65 horas hasta completarse como se describe en la presente invención. Durante la fermentación, se dejó que el pH cayera a 5,5 y luego se mantuvo en 5,5 mediante la adición controlada de hidróxido de sodio. A continuación, las células se retiraron mediante centrifugación y el líquido transparente resultante se decoloró con carbono en polvo. A continuación, el caldo resultante se purificó por cromatografía. El licor purificado resultante se concentró a 55 a 65 brix y el jarabe resultante se centrifugó para retirar las proteínas y otros sólidos.

Tabla 4

La evaluación de kimchi por PCR (ARNr 16S) como se describe anteriormente demuestra que la fermentación con especies mixtas de Leuconostoc es capaz de producir dextransacarasa y el producto MIMO deseado. Además, especies de Pediococcus, tales como Pediococcus pentosaceus, también pueden producir productos MIMO deseables. Los datos que se muestran en la Figura 9 demuestran que pueden usarse microorganismos productores de dextransacarasa que no sean L. mesenteroides en el método de la presente invención tanto individualmente como en cultivos mixtos.

Ejemplo 10

Producción a escala comercial (referencia)

L. citreum se adquirió de la American Type Culture Collection (ATCC 13146, Manassas, VA). Después del reaislamiento, la cepa se almacenó en un congelador a -74 °C en glicerol al 20 %. Este cultivo de dos litros se cultivó a 27 °C en un medio compuesto de sacarosa (100 g/l), maltosa (50 g/l), extracto de levadura (5 g/l), MgSO⁴-7H²O (0,2 g/l), FeSO⁴-7H²O (0,01 g/l), NaCl (0,01 g/l), MnSO⁴-7H²O (1,5 g), CaCl2 (0,05 g/L), KH2PO4 (3 g/l a pH 6,5). Se disolvieron extracto de levadura (0,075 kg), MgSO⁴(1,46 g, anhidro), FeSO⁴-7H²O (1,5 g), NaCl (0,15 g), MnSO⁴H²O (20 mg), CaCl2 (0,8 g) y KH2PO4 (40,00 g) en agua destilada (12,6 kg) y se ajustaron a pH 7 usando NaOH (3,2 g, 50 %) antes de la inoculación. La mezcla se sometió a autoclave durante 15 min a 120 °C. Las soluciones de maltosa-^O (0,864 kg) y sacarosa (1,910 kg) se esterilizaron antes de transferirlas al fermentador.

En la puesta en marcha, todo el sistema se enjuagó, limpió y esterilizó. A continuación, se cargó el fermentador con maltosa, sacarosa y nutrientes en las cantidades indicadas anteriormente. Los materiales se mezclaron completamente. El inóculo se cultiva hasta DO-1 (densidad óptica o absorbancia a 660 nm mediante espectrofotómetro UV-VIS).

La fermentación se continuó hasta completarse. Las células del inóculo se retiraron del contenido del fermentador y se desecharon. El caldo se decoloró como se describe anteriormente.

Ejemplo 11

Producción a escala comercial utilizando etapas opcionales de retirada de cenizas y cristalización

Después de la recolección, las células se retiran por centrifugación a 9-14 k*g durante 20 a 30 min. Después de retirar las células, el licor se concentra a aproximadamente 35-40 brix antes del tratamiento con carbón activado (0,5-3,0 % p/p, Carbochem DC-50 o equivalente) para decolorar el licor. Después de la filtración y el lavado, el licor decolorado tiene aproximadamente 35 brix. Este licor se somete a cromatografía SAC y WBA como se describe anteriormente para una mayor purificación.

Como alternativa, después de la decoloración, el caldo se somete a retirada de cenizas o se concentra a 56-59 brix para la cristalización. La cristalización ocurre durante la noche a temperatura ambiente. El manitol cristalizado se separa por centrifugación (~400 g/lote de 15 l) y el licor se refrigera a 5 °C durante la noche. Luego se puede centrifugar una segunda cosecha de manitol, produciendo, por ejemplo, aproximadamente 100 g/15 l por lote). Luego, el licor se concentra a 63-65 brix para procurar el producto IMMO final.

Como alternativa, los MIMO se pueden concentrar a 30-40 brix, luego se secan por pulverización para procurar un producto en polvo.

Ejemplo 12

Producción de maltosil-isomaltooligosacáridos (MIMO) a escala de termentador de 3.000 litros

El producto MIMO preparado en este ejemplo se preparó en condiciones BPFa y kosher parve. Los detalles del proceso que no se mencionan específicamente en el presente documento son los mismos que los de los Ejemplos 10 y 11. A menos que se especifique lo contrario, todo el equipo se limpió en el lugar antes de ser utilizado o reutilizado en las etapas del proceso. Se tuvo cuidado de higienizar todos los equipos y líneas y mangueras de transferencia de acuerdo con los estándares BPFa en la industria de biofermentación para productos para consumo humano.

Se tomaron muestras durante todo el proceso de fermentación y purificación para monitorización continua del CC, como se resume en la Tabla 5.

Tabla 5

Los siguientes reactivos y materiales de partida se disolvieron en 3,7 litros de agua OI (3,7 litros): fosfato monobásico de potasio (0,0118 kg), sulfato de magnesio anhidro (0,000431 kg), sulfato ferroso heptahidratado (0,000045 kg), sulfato de manganeso monohidratado (0,000045 kg), cloruro de sodio (0,000045 kg), y cloruro de calcio dihidratado USP (0,00024 kg), extracto de levadura (pureza bacteriológica; 0,0221 kg), sacarosa (azúcar pura de caña extrafina granulada; 0,53021 kg); maltosa (Sunmalt-S[N] maltosa monohidratada; 0,2935 kg). El pH inicial se ajustó a 7,0 usando hidróxido de sodio al 50 % FCC (0,005 kg). Este medio se dividió en seis matraces Fernbach, se taparon, se sometieron a autoclave a 121 °C durante 15 minutos y luego se enfriaron a temperatura ambiente.

Se descongelaron a temperatura ambiente L. citreum (B-742; ATCC 13146), previamente conservados como alícuotas de 1,0 ml de una mezcla de caldo/glicerol 1:1 p/p). Se inocularon asépticamente cinco matraces con 1,0 ml del L. citreum preparado. El sexto matraz sirvió como control sin inocular. Todos los matraces se agitaron a 27 °C a 150 rpm durante la noche (16 horas) hasta que la densidad óptica (DO) fue > 1. La DO⁶⁰⁰de una muestra de cada matraz se midió en un espectrofotómetro Shimadzu. También se realizó un examen microscópico de una muestra de cada matraz para buscar el crecimiento de L. citreum y descartar contaminación. Los cultivos sanos de los cinco matraces se transfirieron asépticamente a un recipiente a presión estéril de 7,57 l.

Para producir la solución madre de azúcar y sal, se cargó un fermentador de 4542 l con 1440 kg de agua OI, sacarosa (azúcar pura de caña extrafina granulada; 498,96 kg); maltosa (Sunmalt-S[N] maltosa monohidratada; 200,0 kg), cloruro de sodio (0,037 kg) y cloruro de calcio hidratado USP (0,204 kg). La mezcla se agitó a fondo antes de transferirla por filtración estéril a los tanques de producción de siembra y almacenamiento.

Se preparó un fermentador de siembra de 1136 l equipado con dos sondas de pH y un rociador de aire para la fermentación mezclando 238 kg de agua OI, 2,76 kg de extracto de levadura (pureza bacteriológica), 1,48 kg de fosfato de potasio monobásico, 54,2 gramos de sulfato de magnesio anhidro, 5,7 gramos de sulfato ferroso heptahidratado y 5,7 gramos de sulfato de manganeso monohidratado.

La solución madre de azúcar y sal (309,2 kg) se transfirió asépticamente al termentador de siembra mediante esterilización por filtración. Inmediatamente después de la transferencia, se añadieron 10 kg de agua OI a un recipiente a presión de 56,8 l, el recipiente se presurizó y el agua se filtró asépticamente en el tanque de siembra. Se añadieron 20 kg de agua OI adicionales para ajustar el Brix de la mezcla de fermentación.

El tanque de siembra se inoculó con los cultivos combinados sanos a través de líneas asépticas. Se registró el pH del tanque. Se dejó que ocurriera la fermentación sin ajuste de pH durante 16 horas a 27,0 °C ± 1,0 y aireación. El pH se monitorizó cada 2 horas y la DO⁶⁰⁰se midió cada cuatro horas.

Luego se cargó el tanque de fermentación de 4542 l con 1332 kg de agua OI, 15,01 kg de extracto de levadura (pureza bacteriológica), 8,01 kg de fosfato monobásico de potasio, 292,2 gramos de sulfato de magnesio anhidro, 30,0 gramos de sulfato ferroso heptahidratado y 30,0 gramos de sulfato de manganeso monohidratado. La mezcla se agitó a 50 rpm para disolver los ingredientes secos. El pH se registró en 5,70, pero no se ajustó. El tanque se mantuvo a 37 °C durante dos horas adicionales mientras se aseguraba que el rociador de aire continuaba funcionando correctamente.

A continuación, los medios se esterilizaron a 121 °C durante 60 minutos. El tanque se enfrió a 27 °C mediante una ligera aireación a través de la línea de rociadores. La solución madre de azúcar y sal preparada previamente se transfirió asépticamente (1676,1 kg) mediante esterilización por filtración. El pH inicial era de 5,71. La solución de siembra preparada previamente (31,0 kg) se transfirió asépticamente al fermentador de producción. Se abrió el suministro de aire al espacio de cabeza. El pH se midió de nuevo y se ajustó a aproximadamente 7,0 usando una solución de hidróxido de sodio al 50 %.

Se dejó que continuara la fermentación en el tanque a 27 °C ± 1,0, con aireación en el espacio de cabeza y agitación. El pH se mantuvo a 5,5 ± 0,05 usando una solución de hidróxido de sodio al 50 %. Se monitorizaron DO⁶⁰⁰, Brix e inspección microbiológica como se indica en la Tabla 5. Se dejó que continuara la fermentación hasta que se completó y la fructosa no fue detectable. A continuación, el tanque de fermentación se enfrió a 10 °C.

Las células bacterianas de L. citreum gastadas se retiraron del caldo de fermentación mediante microfiltración, seguido de seis etapas de diafiltración a una presión de entrada de hasta 20 psi. Brevemente, el caldo de fermentación se filtró a presión a través de membranas de microfiltración para asegurar la retirada de la mayor cantidad posible de residuos celulares. El material celular retenido por los microfiltros se lavó con 750 kg de agua OI seis veces para potenciar la recuperación y el rendimiento del producto. Los permeados acuosos se combinaron para concentración y decoloración.

La mezcla de productos se concentró usando un evaporador de película fina calentado. Periódicamente, se tomaron muestras de la mezcla de productos concentrados y se determinó el nivel Brix mediante un medidor portátil. La concentración se interrumpió cuando el nivel Brix llegó a 40.

El caldo de fermentación concentrado se decoloró usando carbono activado en polvo (26,25 kg, CA-50S). La mezcla de productos se calentó a 65 °C y se añadió carbono junto con Celite© 545 (21.0 Kg). La suspensión resultante se agitó durante aproximadamente 30 minutos antes de reducir la temperatura a 50 °C. El carbono activado se retiró presionando la mezcla de productos a través de un filtro prensa Sperry que se revistió previamente con más Celite 545 (21,0 kg) suspendido en 300 kg de agua OI. A continuación, la mezcla de productos se recirculó a través del filtro prensa prerrevestido hasta que el filtrado se hizo transparente. Finalmente, se bombeó a través de un filtro de refinado de 1 micra. Se recuperó producto MIMO adicional lavando el filtro prensa Sperry añadiendo 250 kg de agua OI, agitando el contenido del tanque y luego recirculando a través del filtro prensa hasta que el filtrado era transparente. Nuevamente, este filtrado se bombeó a través de un filtro de refinado de 1 micra.

En lotes de tamaño apropiado (1350 l a 40 Brix en total, 6 etapas de alimentación de 225 l cada una para un total de seis ciclos de alimentación/regeneración), se utiliza la cromatografía de intercambio iónico (IEX) para retirar la ceniza (compuesta por minerales no consumidos durante el proceso de fermentación), compuestos orgánicos coloreados residuales, ácidos orgánicos, proteínas y aminoácidos. El producto combinado resultante se evapora a una concentración de 56 Brix. Luego, el producto se enfría a temperatura ambiente mientras se agita para facilitar la cristalización del manitol restante. Los cristales de manitol se retiran mediante centrifugación en cesta o filtrando los cristales de manitol cristalino. Los cristales se lavan con agua fría para retirar el producto, que se conserva para su uso futuro. El producto se evapora a una concentración de 65 Brix.

La mezcla de productos se enfría nuevamente a temperatura ambiente mientras se agita para facilitar la cristalización de cualquier manitol restante. La mezcla de productos se enfría aún más a 4 °C con agitación para facilitar la cristalización de cualquier manitol restante. Cualquier manitol cristalino resultante se retira mediante una centrífuga de cesta o por filtración del producto final y los cristales se lavan nuevamente con agua OI fría para recuperar cualquier producto MIMO restante. El agua de lavado se conserva para uso futuro. El producto final es un líquido transparente, incoloro y ligeramente viscoso.

Ejemplo 13

Mejoras en el rendimiento por fermentación a azúcares totales más altos

Típicamente, los procesos de producción de fermentación para MIMO no se ejecutan con sólidos totales altos para evitar problemas relacionados con el choque osmótico del organismo de trabajo. El trabajo anterior (12 lotes completos de 15,5 kg) indicaba que la fermentación con aproximadamente un 17,6 % de azúcar total da la distribución y el rendimiento adecuados del producto y es reproducible. Por tanto, aumentar el contenido de azúcar total (AT) debería aumentar el rendimiento del producto. Aquí, el 44 % se da como producto total recuperado a escala piloto, no como rendimiento en el fermentador a escala de producción, que es típicamente del 56 al 58 %. El AT puede aumentarse por tanto hasta que el organismo pierda productividad o comience a rechazar su condición, metabólicamente, para protegerse a sí mismo, p.ej. mediante la producción de glicerol o etanol, que son contaminantes indeseables en un producto final. Una segunda limitación de la fuerza osmótica es la resistencia de la enzima a la deformación de su conformación preferentemente activa debido a una hidratación y/o cosustrato insuficientes (p. ej., agua, en el caso de enzimas hidrolíticas).

Con el fin de intentar abarcar un intervalo razonable de concentraciones de trabajo, se ejecutó una fermentación de dos kilogramos con una relación de sacarosa:maltosa de 2,75:1 y un AT del 30 %. La fermentación se comportó de forma idéntica al 30 % de AT que en el método establecido fermentando al 17,6 %. El rendimiento, la pureza y la distribución del producto fueron idénticos una vez normalizados sobre los sólidos secos refractivos totales (SSR). Para los cálculos de rendimiento, el % p/p y los valores derivados se dan a continuación en la Tabla 6 y la Tabla 7.

Tabla 6

Tabla 7

Estos datos muestran que los rendimientos de un lote de 3000 kg al 17,7 % de AT no son significativamente diferentes del lote de 2 kg fermentado al 29,4 % de AT, 58,48 frente a 57,71 %, respectivamente. La distribución del peso molecular promedio (DPM) en masa también era similar a 763,77 frente a 759,06 Da (diana 760 Da) para AT fermentado al 17,7 % y al 29,4 %, respectivamente. Además, el aumento de AT aumentaba el rendimiento de 318,85 kg a un cálculo de 542,5 kg/lote mejorando el rendimiento recuperable en, en el peor de los casos, un 49,28 % y en el mejor de los casos, un 70,14 %.

Ejemplo 14

Retirada de manitol mediante cristalización de los MIMO

Como se describe en el Ejemplo 12, el producto MIMO puede procesarse adicionalmente al final del proceso descrito para retirar cualquier resto de manitol para mejorar aún más la pureza del producto final. Este ejemplo describe mejoras en el proceso de retirada de manitol mediante cristalización.

En un método, el producto de IEX ("IEX de salida" en la Tabla 8) se evaporó a 56° Brix y se dejó cristalizar ("XL n.° 1") a temperatura ambiente. Los cristales de manitol se retiraron (torta n.° 1) a través de una centrífuga de cesta equipada con una bolsa de filtro de polipropileno con poros de 10 pm o un filtro de presión Nutsch con una placa/criba equivalente a 10 pm. La torta se lavó con 500 ml de agua fría (aprox. 125 % de torta p/p) y los lavados se recogieron para reciclarlos ("lavado n.° 1"). El licor resultante ("licor n.° 1") se enfrió a 2-5°C y se dejó cristalizar ("XL n.° 2"). Los cristales de manitol se retiraron ("torta n.° 2") a través de una centrífuga de cesta equipada con una bolsa de filtro de polipropileno con poros de 10 pm o un filtro de presión Nutsch con una placa/criba equivalente a 10 pm. La torta se lavó con 500 ml de agua fría (aproximadamente 125 % de torta p/p) y los lavados se recogieron para reciclarlos ("lavado n.° 2"). Los cristales se retiran como antes, y el licor resultante se envía a concentración final a un Brix de producto de 63-64°. La Tabla 8 muestra un balance de masas típico, dado como los promedios de 11 lotes.

Tabla 8

En un método mejorado, el producto de IEX ("IEX de salida") se evaporó a 56° Brix y se dejó cristalizar (XL n.° 1) a temperatura ambiente. Los cristales de manitol se retiraron ("torta n.° 1") a través de una centrífuga de cesta equipada con una bolsa de filtro de polipropileno con poros de 10 pm o un filtro de presión Nutsch con una placa/criba equivalente a 10 pm. La torta se lava con 500 ml de agua fría (aprox. 125 % de torta p/p) y los lavados se recogen para reciclar ("lavado n.° 1"). El licor resultante ("licor n.° 1") se dejó cristalizar ("XL n.° 2") a temperatura ambiente. Una vez enfriada y observada la cristalización, se enfrió toda la mezcla a 2-5 °C y se dejó cristalizar hasta completarse. Los cristales de manitol se retiraron ("torta n.° 2") a través de una centrífuga de cesta equipada con una bolsa de filtro de polipropileno con poros de 10 pm o un filtro de presión Nutsch con una placa/criba equivalente a 10 pm. La torta se lavó con 500 ml de agua fría (aproximadamente 125 % de torta p/p) y los lavados se recogieron para reciclarlos ("lavado n.° 2"). Los datos de este experimento se muestran a continuación en la Tabla 8. El producto tiene un brix de 63-64 °Brix y estaba listo para pasteurización y envasado como material comercial.

Como alternativa, después de purificar la mezcla de productos usando IEX como se describe anteriormente, la mezcla de productos se evapora a 56 brix, luego se enfría a temperatura ambiente mientras se agita para estimular la formación de cristales del manitol presente. Después de aproximadamente 12 a aproximadamente 16 horas, los cristales se retiran mediante centrifugación en cesta, o utilizando un filtro de criba vibratoria, o usando un filtro Nutsch, o usando combinaciones de estas técnicas que son bien conocidas por los expertos en la materia. El líquido restante se evapora a 65-66 brix, luego se enfría a temperatura ambiente mientras se agita para estimular la formación de cristales durante 12 a 16 horas. La mezcla se enfría a 4 °C para estimular la cristalización de cualquier manitol restante. Es necesario un proceso de cristalización de dos etapas, es decir, uno que use dos temperaturas diferentes, para dejar que los cristales se formen correctamente. Después de aproximadamente 12 a aproximadamente 16 horas, los cristales se retiran mediante centrifugación en cesta, o utilizando un filtro de criba vibratoria, o usando un filtro Nutsch, o usando combinaciones de estas técnicas. El producto ya está listo para su pasteurización y envasado como material comercial.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para la preparación de oligosacáridos que comprende:

(a) poner en contacto una materia prima que comprende sacarosa y maltosa en una relación dentro de un intervalo de 2:1 a 3,5:1 con bacterias productoras de dextransacarasa en un medio de cultivo acuoso; (b) fermentar la materia prima con las células bacterianas mientras el pH del medio de cultivo se controla dentro del intervalo de 5,5 a 6,0;

(c) retirar las células bacterianas; y

(d) refinar;

2. El método de la reivindicación 1, en el que la relación de sacarosa y maltosa se mantiene en 2,33:1 o en 2,75:1

3. El método de la reivindicación 1 o 2, en el que la práctica de las etapas (a) a (c) es una operación continua, se realiza como un lote, se realiza como una operación por lotes alimentados, se realiza como un proceso de enzima inmovilizada, o se realiza como un proceso celular inmovilizado.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la relación de sacarosa a maltosa se ajusta durante el proceso de fermentación mediante la adición de más sacarosa o más maltosa.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las bacterias productoras de dextransacarasa son Leuconostoc mesenteroides, Leuconostoc citreum, Leuconostoc gasicomitatum, Leuconostoc kimchi, Leuconostoc mesenteroides ATCC 13146, Leuconostoc mesenteroides NRRL B-742, Leuconostoc mesenteroides subesp. mesenteroides (Tsenkovskii) van Tieghem (ATCC)® 1 1449™) NRRL B-1299, Weisella confusa, Weissella cibaria, Lactococcus spp, Penicillium aculeatum, Pediococcus spp (pentosaceus), Streptococcus mutans, Streptococcus oralis, Streptococcus sanguinis, o Lactobacillis sp (reuteri).

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el pH se controla mediante:

la adición de un ácido o una base al medio de cultivo; o

la adición de una base que comprende un hidróxido o carbonato de metal alcalinotérreo.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el pH se controla añadiendo sucrato de hidróxido de calcio

8. El método de cualquier reivindicación anterior, en el que las células bacterianas se retiran por centrifugación, filtración o clarificación.

9. El método de cualquier reivindicación anterior, en el que:

el refinado retira las impurezas insolubles o

comprende la decoloración o

comprende la retirada de cenizas o

comprende la retirada de proteínas o comprende la retirada de ácidos orgánicos, o

comprende el uso de carbón activado, o

comprende el uso de carbono activado, o

comprende el uso de una resina aniónica de base débil, o comprende el uso de una resina catiónica de ácido fuerte para retirar iones metálicos, o

comprende un proceso de dos etapas que usa un ácido fuerte seguido de una base débil, o comprende la retirada de la proteína por calentamiento, luego la evaporación del medio de cultivo acuoso seguido de centrifugación o filtración, o

comprende la retirada de la proteína usando una resina aniónica de base débil, o

comprende la retirada de ácidos orgánicos usando una resina de intercambio catiónico de ácido fuerte de tipo gel de pureza cromatográfica en forma de calcio (SAC-Ca++), o

comprende la retirada de ácidos orgánicos usando una resina aniónica de base débil, o

comprende la retirada de manitol, o

comprende la retirada de manitol mediante cromatografía líquida continua o pulsada, o

comprende la retirada de manitol usando evaporación seguida de una o dos etapas de enfriamiento para iniciar la cristalización y la precipitación, o

comprende combinaciones de estas etapas.

10. El método de cualquier reivindicación anterior, en el que la composición final de los oligosacáridos producidos comprende isomaltooligosacáridos con uno o más grupos de enlace a (1 ^4 ) en el extremo reductor y a (1^6 ) con un grado de polimerización entre 3 y 10 o entre 3 y 9.

11. El método de la reivindicación 9, en el que los isomaltooligosacáridos comprenden además la ramificación a(1^4), a (1 ^3 ) y/o a (1^2).

12. El método de cualquier reivindicación anterior, que comprende además proporcionar los oligosacáridos como una solución concentrada.

13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, que comprende además proporcionar los oligosacáridos como un polvo producido por secado o por secado por pulverización o por secado por congelación.

14. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los oligosacáridos finales producidos están esencialmente libres de cenizas, ácidos minerales, proteínas residuales, alcoholes de azúcar y ácidos orgánicos.