JPS63196290A

JPS63196290A - 固定化酵素

Info

Publication number: JPS63196290A
Application number: JP2790087A
Authority: JP
Inventors: Teruo Nakakuki; 輝夫中久喜; Masahiro Yoshida; 雅浩吉田; Minoru Okada; 実岡田
Original assignee: Japan Maize Products Co Ltd; Nihon Shokuhin Kako Co Ltd
Current assignee: Japan Maize Products Co Ltd; Nihon Shokuhin Kako Co Ltd
Priority date: 1987-02-09
Filing date: 1987-02-09
Publication date: 1988-08-15

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】「技術分野」本発明は、デンプンから各種サイクロデキストリンを生
成させるサイクロデキストリングルカノトランスフェラ
ーゼを特定の担体に固定化させた固定化酵素に面する。

「従来技術およびその問題点」デンプンにサイクロデキストリングルカノトランスフェ
ラーゼ（Ｃｙｃｌｏｄｅｘ廿１ｎｑｌｕｃａｎｏｔｒａ
ｎｓｆｅｒａｓｅ、以下、ＣＧＴａｓｅと略称する）を
作用させることにより、各種サイクロデキストリン（Ｃ
ｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ　、以下、ＣＤと略称する）が
製造されている。このＣＤは、グルコース分子がα−１
，４−グルコシド結合で結合した環状の非還元性マルト
オリゴ糖で、食品、医薬品、農薬、化粧品、その他の一
般工業分野で広く使用されてあり、工業的にはα−１β
−およびγ−サイクロデキストリンが有用とされている
。

従来、ＣＤの製造は、デンプンスラリーに液化型α−ア
ミラーゼまたはＣＧＴａｓｅを添加しで液化した後、加
熱処理を行なって酵素を失活させ、次いでこのデンプン
液化液にＣＧＴａｓｅを所定！添加して２４〜７２時間
反応させるバッチ反応によって行なわれている。

しかしながら、上記のような従来の方法では、生産量を
高めようとすると反応タンクの規模が大きくなり、反応
時開が２４〜７２時間と長時間かかり、ＣＧＴａｓｅが
使い捨てになるため、酵素使用コストが高くなるという
欠点があった。

「発明の目的」本発明の目的は、ＣＧＴａｓｅを特定の担体に固定化す
ることにより、ＣＧＴａｓｅｊ！使い捨てにすることな
く連続使用できるようにし、それによってＣＤの生産効
率を高めるようにした固定化酵素を提供することにある
。

「発明の構成」本発明者らは、上記目的を達成するため、ＣＧＴａｓｅ
を固定化する技術について鋭意研究した結果、ＣＧＴａ
ｓｅ！多孔貢のキト多孔上−ズに固定化することにより
、ＣＧＴａｓｅが極めて効果的に吸着固定され、さらに
架橋剤で処理することにより、（：ＧＴａｓｅがより一
層強固に吸着固定され、例えば充填床型のカラムリアク
タ一方式でも充分にＣＯの連続生産が可能であることを
見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明による固定化酵素は、多孔質のキトサ
ンと−ズに、サイクロデキストリングル・カットランス
フェラーゼを固定化させたことを特徴とする。

さら１こ、本発明ｆこよるざらｌこ改良された固定化酵
素は、多孔質のキトサンビーズに、サイクロデキストリ
ングルカノトランスフェラーゼを固定化させ、さらに架
橋剤で架橋処理したことを特徴とする。

以下、本発明についてその好ましい態様を挙げてさらに
詳細に説明する。

本発明で使用するＣＧＴａｓｅは、ＣＧＴａｓｅ庄産能
を有する微生物を培養し、その培養上清中から得ること
ができる。　ＣＧＴａｓｅ生産能を有する微生物として
は、例えばバチルス・マセランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍ
ａｃｅｒａｎｓ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　７巻、
１１４頁、１９６８年）、バチルス・メガテリウムＣＢ
、ｍｅｃ＋ａｔｅｒｉｕｍ。

Ｐｒｏ、Ａｍｙｌａｓｅ　Ｓｙｍｐ、　７巻、６１頁、
１９７２年）、バチルス９サー主ユランス（Ｂ、　ｃｉ
ｒｃｕｌａｎｓ、同８巻、２１頁、１９７３年）、バチ
ルス・ステアロサーモフィラス（８、ｓｔｅａｒｏｔｈ
ｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　、澱粉科学、２９巻、７頁、１
９８１年）、バチルス・オーベンシス（８，ｏｈｂｅｎ
ｓｉｓ　、特開昭４９−１２４２８５”号）、好アルカ
リ性バチルスのいくつかの細菌（Ａ９ｒｉｃ、　Ｂｉｏ
ｌ。

Ｃｈｅｍ、　、４０巻、７５３頁、１９７６年）、ある
いはクレブシェラ・ニューモニアエ（にｌｅｂｓｉｅｌ
ｌａｐｎｅｕｍａｎ：ａｅ％　Ａｒｃｈ、　　Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ、、　■巻、　２７１　頁、１９７７年）な
どが知られている。

上記微生物を培養する培地としては、例えばポリペプト
ン、大豆粕、酵母エキス、アミノ酸混液、硫酸アンモン
、硝酸アンモンなどを窩素源とし、可溶性デンプン、デ
キストリンあるいはデンプンを酸や酵素で液化した液化
デンプンなどを炭素源とし、これに各種ミネラルやビタ
ミン類を添加した液体培地を用いることができる。そし
て、上記微生物をこれらの液体培地を用いて好気的に培
養することにより、その培養液中にＣＧＴａｓｅを生成
させることができる。なお、本発明において固定化させ
るＣＧＴａｓｅとしては、上記培養液の上溝をそのまま
用いでもよく、上記培養液の上清から一般的な酵素精製
法ｔこよフて精製したものを用いてもよい。

さらに、本発明の好ましい態様によれば、好アルカリ性
のバチルス属に属する微生物によって生成されたＣＧＴ
ａｓｅが使用される。この場合、培地としては、陽性化
デンプンを炭素源とする培地を用いることにより、Ｃ訂
ａＳＳを効率的に生成させることができる（特願昭６１
−１１４３６１号参照）。

本発明に用いる固定化用担体である多孔質のキトサンと
一層とは、自然界に広く存在し、甲殻類、節足動物など
に多く含まれる天然高分子のキチンを、脱アルカリ化し
てキトサンとし、このキトサンを粒状化、多孔質化して
良好な吸着性能をもたせたものである。多孔質のキトサ
ンど一層の粒径に関しては、粒径があまり小さいと充填
床型のカラムリアクタ一方式で用いる場合、圧力損失が
太きくなり、カラム通液が困難となる。一方、粒径があ
まり大きいと、表面積が小さくなり、その結果、酵素吸
着能も小さく、担体重量あたりの比活性が小ざくなるた
め、カラム容積が大きくなり、経済的に不利である。こ
のため、多孔質のキトサンビーズの粒径は、好ましくは
０．１〜３．０ｍｍ、さらに好ましくは０．２〜２．０
　ｍｍとされる。このような多孔質のキトサンビーズと
して具体的には、例えば「キトバール８ＣＷ３００３．
３００５．３５０３．３５０５など」　（商品名、富士
紡績■製）が好適である。これは、天然高分子のキチン
を脱アセチル化した後、ジカルボン酸、ジアルデヒド、
ジイソシアネート等で架橋して耐酸性を付与したものに
、さらにスペーサーとして脂肪族系または芳香族系など
の官能基を導入した多孔質ビーズであり、ｐＨ安定性、
耐酸性、熱安定性に優れている。この「キトバール」は
、粒径０．１〜３．０　ｍｍ、孔径３、Ｏｕｍ以下、比
表面積１５〜２３０　ｒｒｒ／９である。

多孔質キトサンビーズからなる担体に、ＣＧＴａｓｅを
吸着させる方法としては、特に制限はなく、例えば緩衝
液中で担体と酵素とを接触させる方法を採用することが
できる。その−例を示すと、「キトバールＢＣＷ　３５
０５　Ｊ　１００　ｍ９を１０〜１００ｍＭの各種緩衝
液（ｐＨ５〜１０）で充分に平衡化した猪、担体１９（
湿重量）に対して、ＣＧＴａｓｅ２〜Ｉ０００ｍｑ　（
酵素活性１０３単位／ｍ＋−酵素）、好ましくは５〜５
００　ｍ９１Ｆｒｂる０次いで、室温で１〜２４時間放置するか、または０
．５〜５時間往復振とう処理（例えば１２０ストロ一ク
／分、３ｃｍ幅）した後、ろ紙またはガラスフィルター
でろ過し、続いて緩衝液でタンパク賞が溶出しなくなる
まで洗浄すればよい。

上記のようにして、本発明による固定化酵素を得ること
ができる。しかし、本発明によるさらに改善された固定
化酵素においては、上記固定化処理の後、さらに架橋剤
による架橋処理がなされる。この架橋処理は、架橋剤に
より多孔質キトサンビーズとＣＧＴａｓｅとを分子的に
結合させて、酵素の吸着性をより強固にするものである
。この場合、架橋剤としては、グルタルアルデヒド、エ
ビクロロヒドリンなどの公知のいずれのものも使用でき
る０例えばグルタルアルデヒドを用いる場合、架橋処理
は、濃度０．１〜５．０　Ｗ／Ｖ％、好ましくは０．２
〜３．０　Ｗ／Ｖ％のグルタルアルデヒド溶液を、上記
固定化酵素に接触させて２０〜３００分間、好ましくは
３０〜２４０分間処理し、その後、緩衝液でグルタルア
ルデヒドが溶出しなくなるまで洗浄することによって行
なうことができる。

上記のような方法で固定化した酵素の酵素タンパク貢あ
たりの見かけ上の固定化率は、約５０％以上となる。こ
の場合、見かけ上の固定化率とは、次式で算出した値で
ある。

また、酵素の固定化方法としては、上記の方法の他に、
多孔質キトサンビーズからなる担体をカラムに充填した
後、酵素液を下降法または上昇法により通液して固定化
し、さらに必要に応じて架橋剤の溶液を同様にして通液
する方法なども採用できる。

こうして得られた本発明の固定化酵素は、ネイティブ酵
素と比較すると、至適温度曲線はほぼ同様の傾向を示す
が、至適ｆ）８曲線は固定化することにより、やや酸性
側での活性が増大する傾向がある。

なお、本発明において、酵素活性は、下記のようにしで
測定された値である。すなわち、アミロース（ＯＰ・１
１２、材厚生物化学研究所製）　２５ｍ９を１Ｎ力セイ
ソーダ溶液２ｍｌに充分溶解した復、ｌＮ１Ｍ酸で中和
し、さらに０．１ＭリンＭ！ｌ衝液（ｐＨ７，０）で５
０　ｍβに定容する。こうして調製したアミロース溶液
３００ｕβに適当に水で希釈した酵素液２００μβを添
加し、４０℃で１０分間酵素反応を行なった稜、０．２
Ｎ塩酸を加えて酵素反応を停止する。さらに、純水４ｍ
ｌと、０．０２％ヨウ素−０，２％ヨウ化カリウム溶液
０．５ｍｌとを加えて、発色する青色呈色度を分光光度
計を用いて波長７００　ｎｍの吸光度を測定する。一方
、ブランクとして、アミロース溶液、塩酸混合液に、酵
素液、純水、ヨウ素溶液を順次加えて同様に青色呈色度
を測定し、ブランク値ＣＢ）と酵素反応値（Ａ）との青
色呈色度の差より、酵素活′ｌ！壱以下の式により算出
する。

（ただし、ｔは反応時間（分）、Ｅは酵素液２００Ｕβ
中の酵素量（９）　、２０は定数である。）本発明によ
る固定化酵素を用いた場合のＣＤの生成方法は、特に限
定されないが、例えば固定化酵素をカラムに充填し、基
質として澱粉加水分解物等の水溶液を用い、これを上記
カラムに連続通液することにより、ＣＤを効率的に生成
することができる。このように、基質を連続通液して反
応を行なうことができるので、大型の反応タンク等を用
いずに生産量を高めることができる。また、ＣＧＴａｓ
ｅの活′Ｉ！を長期間に亙り保持することができるので
、高価なＣＧＴａｓｅを有効に利用して製造コストを低
減することが可能となる。なお、反応タンク等に固定化
酵素を支持させておき、このタンクに基質を入れて一度
に反応を行なわせるバッチ式にも適用することができる
。

「発明の実施例」実施例１固定化用担体として、「キトパールＢＣＷ３５０５」（
商品名、冨士紡ｅａｒ！＠製）を用い、２０ｍＭ（７）
リン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で充分に平衡化した後、担
体１９（湿重量）あたり、好アルカリ薗が生産するＣＧ
Ｔａｓｅ　（日本食品化工■製）を同緩衝液に溶解して
１０００単位添加し、室温で１時間往復振どう（１２０
ストロ一ク／分、３ｃｍ幅）して担体に酵素を吸着させ
た後、ろ紙またはグラスフィルターでろ過し、得られた
固定化酵素を上記緩衝液でタンパク貢が溶出しなくなる
まで洗浄した。

こうして得られた固定化酵素１０ｍβを、ガラスカラム
（１，５φｘｌｏｃｍ）に充填した。一方、デンプン加
水分解物のスプレードライ品である［パインデックス井
１００Ｊ（商品名、松谷化学工業■製）の９．０Ｗ／Ｗ
％水溶液に、防腐剤としてアジ化ソーダを０．０２　Ｗ
／Ｖ％添加して、基質溶液を調製した。そして、この基
質溶液を、上記のカラムに、ｐＨ６，５、温度５５℃、
空塔速度５Ｖ（Ｓｐａｃｅ　Ｖｅｌｏｃｉｔｙ）２、Ｏ
ｈｒ−’の条件下で連続通液した。

こうして連続的に酵素反応を行なわせ、β−ＣＤの生成
における相対活性の経時変化を測定した結果を第１図中
の・−・に示す、また、１日、５日、１０日、２０日お
よび３０日のａ−ＣＯの生成量を第１表の上欄に示す、
このように、時間の経過と共に酵素の相対活性は低下す
るものの、連続処理が可能なことがわかる。

なお、ＣＤの生成量は、ｒ　Ａｍ１ｎｅｘ　ＨＰＸ　４
２Ａ　　カラム」　（商品名、バイオ・ラド社製）を用
い、高速液体クロマトグラフィーで分析した。

実施例２実施例１と同様にして、固定化用担体の「キトパールＢ
ＣＷ　３５０５　Ｊ　　（商品名、富士紡績■製）に、
好アルカリ菌が生産するＣＧＴａｓｅ　（日本食品化工
■製）を固定化させた。さらに、２０ｍＭのリン酸緩衝
液（ｐＨ７，０）テ希釈した０、５　％（Ｗ／Ｖ）グＡ
ｔ　タ／Ｌ。

アルデヒド溶液に、上記の固定化酵素を添加し、室温で
１時間紙やかに往復振とう（２０ストロ一ク／分、３　
ｃｍ幅）しながら、架橋処理を行なった。その後、上記
緩衝液で充分に洗浄して、架橋剤処理固定化酵素を得た
。

こうして得られた固定化酵素を、実施例１と同様にしで
、カラムに充填し、基質溶液を連続通液して、連続反応
実験を行なった。

この固定化酵素を用いたβ−ＣＤの生成における相対活
性の経時変化を測定した結果を、第１図中。

の○−○に示す、また、１日、５日、１０日、２０日お
よび３０日のβ−ＣＤの生成量を笥１表の下欄に示す、
このように、この架橋剤で処理した固定化酵素において
は、相対活性の経時的変化が極めて少なくなり、３０日
経過後も７０％以上の相対活性を保持しでいる。

第１表（フローリアクターによるβ−ＣＤの生成量（χ
）の経時的変化）実施例３実施例１と同様にしで、固定化用担体の「キトパールＢ
ＯＷ　３５０５　Ｊ　　（商品名、富士紡績■製）に、
好アルカリ菌が生産するＣＧＴａｓｅ　（日本食品化工
■製）を固定化させた。その後、Ｉ　Ｗ／Ｖ％グルタル
アルデヒド溶液を用い、実施例２と同様にして２時間架
橋処理を行ない、充分に洗浄しで、架橋剤処理の固定化
酵素を得た。

この固定化酵素１０ｄ７：、ガラスカラム（１，５Φｘ
　ＩＯｃｍ）に充填し、基質として「パインデツクス井
１００Ｊ（商品名、松谷化学工業■製）の５Ｗ／Ｗ％水
溶液を用いて、ｐＨ６〜７、温度５５℃の条件下で、空
塔速度５Ｖ（ｈｒ−’）を変化させて通液し、空塔速度
５Ｖ（ｈｒ−’）がＣＤの生成量に及ぼす影響について
検討した。この結果を第２図に示す、なお、第２図中、
「全ＣＤＪはＣＤ全量の生成量、「β−ＣＤＪはβ−Ｃ
Ｄの生成量、「γ−ＣＤ　Ｊはγ−ＣＤの生成量、［α
−ＣＤ　Ｊはα−ＣＤの生成量である。

第２図から、ＳＶ　Ｏ，Ｉｌ＋〜１．Ｏｈｒ−’の範囲
で、最大のβ−ＣＤ生成量が得られることがわかる。

「発明の効果」以上説明したように、本発明によれば、固定化用担体と
して多孔質のキトサンビーズを用いたので、ＣＧＴａｓ
ｅを効果的に固定化して、基質溶液の連続通液による酵
素反応が可能となり、また、バッチ反応においても酵素
の反復使用が可能となる。

したがって、酵素の消費が節約でき、ＣＤの製造コスト
を低減することができる。また、連続通液による反応を
行なえば、大型の反応タンク等を用いずに生産！を高め
ることができる。さらに、多孔質のキトサンビーズにＣ
ＧＴａｓｅを固定化した後、架橋剤で架橋処理すること
により、酵素をより強固に吸着固定することができ、Ｃ
Ｄ生成反応中における酵素の離脱を少なくし、酵素活性
をさらに安定させることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図はカラムフローリアクタ一方式によるＣＤの連続
生産における固定化酵素の相対活性の経時変化を示す図
、第２図はカラムフローリアクタ一方式によるＣＤの連
続生産における空塔速度ＳＶとＣＤ生成量との関係を示
す図である。特許出願人　　　　日本食品化工株式会社代理人　　　
　　弁理士　松井　反問　　　　　　弁理士　三浦邦夫同　　　　　　弁理士　笹山善美第１図０．１　　　　　　　　０．５　　１．０　　　　　　
　　５．Ｏ５，Ｖ、　　　　（ｈｒ　　）第２図手続ネ甫正書（自発）昭和６２年　３月１３日特許庁長官　　黒　１）明　雄　殿昭和６２年特許願第２７９００号２、発明の名称固定化酵素３、補正をする者名称　日本食品化工株式会社頽者　野１）８吉４、代理ひ、６、補正の内容（１）明細書第１１頁第１８〜１９行の「好アルカリ菌
が生産するＣＧＴａｓｅ　（日本食品化工■製）」を「
好アルカリ性Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、Ｎｏ３８−２菌
（徴工研菌寄第６１４号）の生産するＣＧＴａｓｅ　（
名糖産業■製）」に補正する。（２）明細書第１３頁第７〜８行の「好アルカリ菌が生
産するＣＧＴａｓｅ　（日本食品化工■製）」を「好ア
ルカリ性Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、Ｎｏ３８−２菌（微
工研菌寄第６１４号）の生産するＣＧＴａｓｅ　（名糖
産業■製）」に補正する。（３）明細書第１４頁表の上第４〜５行の「好アルカリ
菌が生産するＣＧＴａｓｅ　（日本食品化工■製）」ヲ
「好アルカリ性Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、Ｎｏ３８−２
菌（徴工研菌寄第６１４号）の生産するＣＧＴａｓｅ　
（名糖産業■製）」に補正する。以上

Claims

【特許請求の範囲】

（１）多孔質のキトサンビーズに、サイクロデキストリ
ングルカノトランスフェラーゼを固定化させたことを特
徴とする固定化酵素。
（２）多孔質のキトサンビーズに、サイクロデキストリ
ングルカノトランスフェラーゼを固定化させ、さらに架
橋剤で架橋処理したことを特徴とする固定化酵素。