JPH0330674A - サイクロデキストリングルカノトランスフェラーゼの固定化による該酵素の作用変換方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、サイクロデキストリングルカノトランスフェ
ラーゼ（ＣＧＴａｓｅと略す）の固定化による該酵素の
作用変換方法に間するものである。

本発明の方法によりＣにＴａ５ｅは環化反応（サイクロ
デキストリン合成反応）または糖転移反応を選択的に行
わせることができるようになり、サイクロデキストリン
またはネオトレハロース、コージビオース、ニゲロース
などを効率的に生産できる。

尚、ここでいう糖転移反応とはマルトース、マルトトリ
オースなとのα−１，４グルカンからα刊、２（コージ
ビオース）、　α−１，３にニゲロース）、　α−１，
４（マルトース）、　α−１，６（イソマルトース）、
α−１，１−β（ネオトレハロース）など′の三糖類、
および五糖類以上の糖を新たに生成する作用であり、こ
れらを転移筒と呼称する。

ＣＧＴａｓｅは本来、分子内転移である環状糖合成反応
（環化、ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ）　：　　分子間転移
である開環糖転移反応（ｃｏｕρｌｉｎｇ）、直鎖糖分
子間糖転移反応（ｄｉｓｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａＬｉｏ
ｎ）および加水分解の４作用を触媒することが知られて
いる。これらの反応は同時に起こるので、各種の糖が生
成し、サイクロデキストリンまたは転移糖を選択的に生
成させることはできなかった。

〔従来の技術〕

これまで、酵素の固定化については各種の方法が開発さ
れ、研究例も多く、ＣＧＴａｓｅについても例えば、　
　Ｔ、Ｋａｔｏ　　ａｎｄ　　Ｋ、１Ｉｏｒｉｋｏｓｈ
ｉ：　　１ｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄＣｙｃｌｏｄｅｘｔｒ
ｉｎ　Ｇｌｕｃａｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　ｏｆ　
ａｎ　Ａｌｋａ−ｏｐｈｉｌｉｃ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　
ｓｐ、　Ｎｏ、３８−２．　Ｃａｒｂｏｈ　ｄｒａｔｅ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ、　２６．５９５（＋９８４）、日本
公開特許公報、昭０３−４２１３９７などがある。

しかし、これらの方法は、単にＣＧＴａｓｅをダイヤイ
オン、ポリアクリロニトリル、シリカゲルなどに固定化
して、本来のＣＧＴａｓｅ活性を全体として発ｉＨさせ
てサイクロデキストリンを生産することを目的とするも
ので、積極的にＣＧＴａｓｅの各種作用を個別に発現さ
せることはできなかった。

また、本発明者らは、これまでＢａｃｉｌｌｕｓＬ旧口
」コ」」のＣＧＴａｓｅを澱粉糖に作用させるとα−１
，４結合以外の結合を持つオリゴ糖が生成することを報
告し、この中でもα−１，１−β結合という自然界では
ほとんど見られない非還元性二ｍｕの製法も確立してい
る（日本公開特許公報、昭６３−２１８４９２）。

〔発明が解決しようとする課題〕

そこで本発明者らは、先ず、ＣＧＴａｓｅの各種作用を
個別に測定する方法を確立した。すなわち、■分子内転
移であるサイクロデキストリン合成活性については、可
溶性澱粉を基質とし反応実施後グルコアミラーゼ処理し
、サイクロデキストリン以外のデキストリンを全てグル
コースとした後にシリカ−ＮＨ２タイプの高速液クロカ
ラムでサイクロデキストリンを定量する方法を用い、　
また■分子間糖転移活性については、マルトースを基質
とし遊離してくるグルコース量をグルコースオキシダー
ゼ法または高速液グロにより定量する方法を用い　た。

水沫を用いて、固定化した（ＧＴａｓｅの全てについて
、二種の反応速度を測定し、何れかの作用を選択的に発
現する固定化酵素剤を見い出し、それを調製することを
目的として鋭意研究を重ねてきた。

〔課題を解決する為の手段〕

そこで本発明者らは、各種の固定化基材を集め、各種方
法でＣＧＴａｓｅを固定化して、２つの活性測定法を用
いて検討した結果、ＣＧＴａｓｅの活性は固定化担体を
選択することにより、分子内転移であるサイクロデキス
トリン合成活性と分子間糖転移活性をそれぞれ主として
発現することを見い出した。

これまでは、疎水性結合トビをもつ樹脂などに固定化し
たＣＧＴａｓｅについては、その活性を通常、ヨウ素澱
粉反応で澱粉分解活性を検出していたので、転移活性、
サイクロデキストリン合成活性のみが発現していてもネ
ガテブと判定されていた。

尚、ＣＧＴａｓｅのＩＩｖｉ素から精製標品までの各精
製段階における両者の活性比は同じであることから、こ
れらの活性部位は同一酵素蛋白上に存在することが示唆
される。

本発明を以下に示す。

ｌ）サイクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ
を固定化して該酵素の作用を変換する方法・ ２）固定化基材がイオン交換樹脂、キトサンビーズのい
ずれかである上記方法。

３）アニオン交換樹脂および／・またはキトサンビーズ
によりサイクロデキストリングルカノトランスフェラー
ゼを固定化し、糖転移反応を選択的に発現する酵素に変
換する方法。

４）カチオン交換樹脂によりサイクロデキストリングル
カノトランスフェラーゼを固定化し、環化反応を選択的
に発現する酵素に変換する方法。

５）固定化に際し、グルタルアルデヒドなとの架橋剤を
用いる上記２〜４項記載の方法。

固定化基材としては、イオン交換樹脂、″キトサンビー
ズな主として用いたが、この他の固定化基材でも選択す
れば本発明の方法に適用できる。

イオン交換樹脂としては、陰イオン交換樹脂、陽イオン
交換樹脂があり、製品としてはオルガノ社のアンバーラ
イト、三菱化成社のダイヤイオン、ダウ・ケミカル社の
ダウエックスなどがある。

キトサンは、グルコサミンがβ−１，４結合しているセ
ルロース類似の分子構造を持った多糖類で、その分子内
にアミノ基を何している為、グルタルアルデヒド等の架
橋剤を用いて容易に酵素なとの蛋白質を固定化すること
が可能である。最近、キトサンをビーズ状に成形した製
品や、キトサンに４々の架橋処理を行い物理的強度や耐
酸性を高めたビーズ状の製品が市販されている。

以下に固定化方法を述べる。

尚、固定化基材、固定化方法は以下にのべることに限っ
たものではなく、担体としてはＣＧＴａｓｅを固定化で
きるものであれば、本発明の方法に利用できる。

固定化担体としてイオン交換樹脂を用いた場合、吸着法
では、担体１ｇに対しＣＧ　Ｔ　ａ　ｓｅ、　　例えば
Ｂａｃ　ｉ　ｌ　−１ｕｓ　　ｍａｃｅｒａｎｓのＣＧ
Ｔａｓｅを４００国際単位（サイクロデキストリン合成
活性）添加し３０℃、２時間振盪後、０．１Ｍ酢Ｍ緩衝
液（ｐＨ６，０）で洗浄し固定化酵素を得た。

固定化を強固にするために、架橋剤としてグルタルアル
デヒドを用いる方法では担体１ｇに７１シ５工のグルタ
ルアルデヒドを１−加え３０℃、２ｔｌ１間振盪し、緩
ｉｉｊ液で洗浄後は吸着法と同様にＢａｃｉ　ｌ　１ｕ
ｓｆｆｌ　ａ　Ｃｅ　ｒ　ａ　ＩＴ　Ｓの＃累を４００
単債添加し２時間振盪後緩衝ταで洗浄し固定化酵素を
得た。

キトサンビーズを用いた場合も同様にして固定化酵素を
得た。

架橋剤を用いる場合、架橋剤としてはグルタルアルデヒ
ドが広く用いられているが、この他、ビスジアゾベンジ
ジン、ヘキサメチレンジイソシアナート、　トルエンジ
イソシアナート、ヘキサメチレンジイソチオシアナート
、Ｎ、Ｎ’−エチしンビスマレインイミドなとがあり、
これらを選択するかまたは組み合わせて用いることもで
き、ゲニピンを架橋剤として用いる場合は、ゲニピンを
ｌ工（Ｗ／Ｖ）とし、担体と酵素との架橋反応は４０℃
で一夜行った。

この他の共有結合法、イオン結合法、物理的吸ｍｌ法、
架橋法、包括法など各種の固定化法でも本発明の方法を
適用できる。また、本発明に基づいて、他の固定化基材
およびまたは各種架橋剤との」合せての固定によりＣＧ
Ｔａｓｅ作用を変換できる可能性は充分に予想できる。

固定化用の酵素剤としては１ｌａｃｉｌｌｕｓ　ｍａｃ
ｅｒａｎに躯、好アルカリ性Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、
などのＣＧＴａｓｅ生産菌由来のものであればいずれで
も使用でき、精製酵素から粗酵素標品までの各種ｅｌｌ
！段階のものが用いられるが、担体当りの活性を高める
ためには澱粉吸脱着ζこより部分精製した酵素標品、さ
らには硫安塩析により精製した酵素剤の使用が望ましい
。

これらの方法で得られた固定化酵素について、蛋白の固
定化率及び活性の発現率について調べた結果を表１に示
す１表中、ＣＥＲはカチオン交）！！！樹脂、ＡＥＲは
アニオン交１９樹脂、ＣＢはキトサンビーズである。ま
たグルタルアルデヒド、処理したものについては（Ｇ）
で示した。蛋白の固定化率については、洗浄Ｚ夜中の蛋
白量を測定して添加蛋白量から差し弓くことによって求
め、酵素活性については前述の三方法について実施し初
発活性を１０ｏｚとしたときの発現率で示した。■がサ
イクロデキストリン合成活性で、■が転移活性を示す。

尚、ここでの活性表示は１分間に各々１μモルのサイク
ロデキストリン合成能、グルコース生成能である。

カチオン交換樹脂にっては、蛋白吸着率は何れにおいて
も高いｌｌ！Ｉを示した。活性発現についてはＮｏ、ｌ
がサイクロデキストリン合成活性で高い値を示したが、
その他は痕跡程度であり、転移活性は全く発現しなかフ
た。

アニオン交換樹脂については、蛋白吸着率は担体により
差異があるが、固定化後の活性発現についてはグルタル
アルデヒド処理の有無に係らずサイクロデキストリン合
成活性がほとんど発現せず転移活性が３０〜４０ｘの発
現率であった。

キトサンビーズについては、何れも９０２程度の蛋白吸
Ｉｆ率を示し、アニオン交換樹脂と同様にサイクロデキ
ストリン合成活性はほとんど示さず、転移活性について
は何れも５０ｘ程の高い活性発１３１率を示した。

表Ｉ　　ＣＧＴａｓｅの固定化による各種活性の発現率
このように大まかに、ＣＧＴａｓｅは■アニオン交換樹
脂およびまたはキトサンビーズにより固定化し、糖転移
反応を選択的に発現する酵素に変換することができ、■
カチオン交換樹脂により固定化し、環化反応を選択的に
発現する酵素に変換することができる。

以下に実施例をあげて本発明をさらに詳しく説明するが
、これらに限定されるものではない。

〔実施例〕

実施例１．担体く三菱化成製、カチオン交換樹脂、すに
−１０）　Ｉｇに対しＢａｃｉｌｌｕｓ　　ｍａｃｅｒ
ａｎｓ　　の精製酵素を４００国際単位（サイクロデキ
ストリン合成活性）添加し、２時間振盪後、酢酸緩衝液
で洗浄し、蛋白固定化率９３Ｘ、サイクロデキストリン
合成活性発現率２？ｔの固定化酵素を得た６本固定化酵
素は糖分子間転移作用を殆ど示さず、したがって、可溶
性澱粉を基質として用いた場合、過剰のヨウ素液の反応
液への添加によりヨウ素−澱粉反応の青色を示す。

実施例２．担体（三菱化成製、アニオン交換樹脂、Ｖ＾
−２０）を用いた以外は実施例１と同様にして固定化率
。４５ｚ１　　転移活性発現率４１Ｘの固定化酵素を得
た。

本固定化酵素のサイクロデキストリン合成活性発現率は
０．２ｘと著しく低い。

実施例３．担体（三菱化成製、アニオン交換樹脂、ＷＡ
−３０）　Ｉｇに対し、５Ｉのグルタルアルデヒド（架
橋剤）を１−加え、２時間振盪し、酢酸緩衝液で洗浄後
は実施例１と同様にして、固定化率６４１、転移活性発
現率４７にの固定化酵素を得た０本固定化酵素のサイク
ロデキストリン合成活性発現率は０．４ｘと著し　く　
低い。

実施例４．担体く富士紡績製、キトサンビーズ、ＢＣｌ
ｌ−２５１０）を用いた以外は実施例１と同様にして固
定化率９４Ｋ、転移活性発現率４２にの固定化酵素を得
た０本固定化酵素のサイクロデキストリン合成活性発現
率は０．２ｘと著しく低い。

実施例５、担体（富士紡績製、キトサンビーズ、ＢＣＷ
−２５１０）を用いた以外は実施例３と同様にして固定
化率９１！、転移活性発現率４８Ｘの固定化酵素を得た
０本固定化酵素のサイクロデキストリン合成活性発現率
はＯ，ｌＸと著しく低い。

〔発明の効果〕

ＣＧＴａｓｅを固定化担体を選択して固定化することで
酵素の反応様式を変化させ、多糖分子内転移であるサイ
クロデキストリン合成活性または糖分子間転移反応であ
るα・１，４グルカンからのニゲロース、ネオトレハロ
ース、コージビオース、イソマルトース合成反応を主と
して起こさせ、これらの糖を選択的に生成させることが
できる。さらに、酵素の繰り返し利用ができ、経済性が
著しく高まる。

したがって、本発明の方法で製造された酵素剤はサイク
ロデキストリン、ネオトレハロース、ニゲロース、コー
ジビオースなどの食品素材を連続的に効率的に製造する
システム用に利用できる。

基質としてはマルトース純品に限らず、マルトース混合
物、デキストリン、マルトトリオ−スル澱粉までの混合
物でもよい。固定化酵素カラムにより得られた反応液は
通常の脱塩、脱色工程、例えば陽イオン交換樹脂及び陰
イオン交換樹脂等のカラムに通液することて連続的に精
製することができる。

本発明のシステムを用いれは、サイクロデキストリンま
たはニゲロース、ネ第１・レバロースなとを主として含
む糖混合２夜が得られるが、　さらに、これらの純度を
高めるには、固定化酵素反応工程と、市販のゲル濾過剤
やイオン交換樹脂、活性炭等のカラムクロマトグラフィ
ー、または種々の膜を用いた膜外ＭＪ縮などと組み合わ
せることも考えられる。カラムクロマトグラフィー、ま
たは膜分離等で得られた、これら以外の糖類は、副産物
として利用することもてきる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）サイクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ
   を固定化して該酵素の作用を変換する方法。 ２）固定化基材がイオン交換樹脂、キトサンビーズのい
   ずれかである請求項１記載の方法。 ３）アニオン交換樹脂および／またはキトサンビーズに
   よりサイクロデキストリングルカノトランスフエラーゼ
   を固定化し、糖転移反応を選択的に発現する酵素に変換
   する方法。４）カチオン交換樹脂によりサイクロデキス
   トリングルカノトランスフェラーゼを固定化し、環化反
   応を選択的に発現する酵素に変換する方法。 ５）固定化に際し、グルタルアルデヒドなどの架橋剤を
   用いる請求項２、３、４記載の方法。