JPH0525471B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕 本発明は固定化枝切り酵素に関し、詳しくは各
種澱粉糖の製造において使用する、特定の担体に
固定化した枝切り酵素に関する。この固定化枝切
り酵素は、各種固定化アミラーゼと併用すること
によつて澱粉液化液からグルコース、マルトー
ス、マルトオリゴ糖等の澱粉糖を高収率で得るこ
とができる。 〔従来の技術、発明が解決しようとする問題点〕 澱粉液化液からグルコース、マルトース、マル
トオリゴ糖等の澱粉糖を高収率で得るために、ネ
イテイブのグルコアミラーゼやβ−アミラーゼと
ネイテイブの枝切り酸素を併用する方法が知られ
ており、工業的にも実施されている。 近年、これら酵素を固定化してプロセスを連続
化する試みがなされている。グルコアミラーゼが
β−アミラーゼの固定化については可成りの成果
を挙げているが、枝切り酵素の固定化技術に関し
ては事例が少なく、かつ良好な結果も得られてい
ない。 枝切り酵素の固定化技術に関しては、上田ら
［Biotech. and Bioeng.、10，665−676（1978）；
ibid、12，2137−2154（1980）］、高崎ら［微生物
工業技術研究所研究報告書、第50巻、63（1978）；
ibid、第52巻、１（1979）および特開昭59−35954
号公報］等がある。しかし、前者においては得ら
れる枝切り酵素の発現活性が低く、また連続運転
下での安定性も悪く、工業的規模での実施に対し
ては十分なものと云えない。後者においては、微
細な粒子を用いて比較的高い初期の発現活性を得
ているものもあるが、その場合でも活性維持は15
〜20日程度であり、前記各種固定化アミラーゼと
併用するには不十分である。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明者らは、枝切り酵素を固定化するための
担体について検討を重ねた結果、特定の担体を使
用すると、従来よりも高い酵素活性の固定化率を
示し、しかも酵素活性を長期間に亘つて安定的に
維持できることを見出し、かかる知見に基いて本
発明に到達した。 すなわち本発明は、天然高分子キチンを脱アセ
チル化した後、架橋剤で処理し、さらにスペーサ
ーとして脂肪族系または芳香族系の官能基を導入
した多孔質キトサンビーズに、澱粉中のα−１，
６−グルコシド結合を加水分解する枝切り酵素を
固定化させた固定化枝切り酵素に関する。 澱粉中のα−１，６−グルコシド結合を加水分
解する枝切り酵素としては、バチルス・アシドプ
ルリテイカス、クレブシエラ・ニユーモニアなど
の微生物起源のプルラナーゼやシユードモナス・
アミロデラモサ、シトフアーガ属微生物等が生産
するイソアミラーゼを用いることができるが、グ
ルコース生成アミラーゼではほとんどがPH4.0〜
6.0、マルトオリゴ糖生成アミラーゼではほとん
どがPH5.0〜8.5の範囲に至適PHを有するので、枝
切り酵素も同様の安定かつ至適PH範囲を有するも
のを用いることが望ましい。 これら枝切り酵素を効果的に固定化しうる担体
について、本発明者らが検討した結果、特に天然
高分子キチンを脱アセチル化した後、架橋剤で処
理し、さらにスペーサーとして脂肪族系または芳
香族系の官能基を導入した多孔質キトサンビーズ
が好適な担体であることを見出した。より具体的
には、粒状多孔質キトサン（富士紡績社製、商品
名「キトパール」）を挙げることができる。 なお、上記多孔質キトサンとしては自然界に広
く存在し、甲殻類、節足動物などに多く含まれる
天然高分子キチンを脱アセチル化して得られるキ
トサンがあり、特に粒状化、多孔質化したものや
良好な吸着性能をもたせたものが好ましく、前記
の「キトパール」は好適なものである。これは天
然高分子キチンを脱アセチル化した後、ジカルボ
ン酸、ジアルデヒド、ジイソシアネート等で架橋
して耐酸性を付与したものに、さらにスペーサー
として脂肪族または芳香族系などの官能基を導入
した多孔性ビーズであり、PH安定性、耐薬品性、
熱安定性にすぐれている。この「キトパール」は
粒径0.1〜3.0mm、孔径3.0μｍ以下、比表面積15〜
230m²／ｇであるが、本発明ではこの値に制限さ
れるものではない。 なお、枝切り酵素の固定化方法は特に制限され
ず、たとえば緩衝液中で該酵素と担体を接触させ
る方法を採用することができる。その１例を示す
と、「キトパール」100mgを0.01〜0.20モル濃度の
各種緩衝液（PH4.0〜8.0）で十分に平衡化した
後、枝切り酵素５〜500単位を緩衝液２mlに溶解
して添加し、十分に混合する。次いで、室温にて
0.5〜24時間放置するか、または0.5〜5.0時間往復
振とう処理（120ストローク／分）した後、ガラ
スフイルターで濾過し、続いて種々の緩衝液50ml
で洗浄する。 このようにして得られる固定化酵素は見かけ上
の固定化率が90％以上であり、固定化酵素の発現
活性は担体湿重量１ｇあたり40〜2000単位であ
る。なお、見かけ上の固定化率は次式によつて算
出した値である。 供給した酵素活性−洗浄液中の酵素活性／供給した酵素
活性 ×100（％） 酵素の固定化方法としては、上記方法のほか担
体をカラムに充填したのち酵素溶液を下降法また
は上昇法により通液する方法も適用できる。 ここで、ネイテイブの枝切り酵素および固定化
枝切り酵素の活性は、基質としてプルランまたは
アミロペクチン（もち米澱粉原料）を用いてそれ
らの至適反応条件で反応を行なうことによつて求
めることができる。また、酵素活性はそれぞれの
反応条件で１分間に1μmolのα−１，６−グルコ
シド結合を切断する酵素量を１単位（１国際単位
IU）として表わすことにする。 本発明で得られた固定化枝切り酵素はネイテイ
ブまたは固定化したグルコアミラーゼ、β−アミ
ラーゼまたはマルトオリゴ糖生成アミラーゼ等の
アミラーゼとともに用いて、それぞれの生成する
澱粉糖の収率を高める目的で通常使用される。 すなわち、グルコアミラーゼと併用する場合に
おいては、グルコース純度が90％以上の時１〜３
％収率を高めることが可能であり、固定化グルコ
アミラーゼと固定化枝切り酵素の場合でも95％を
越えるグルコース純度を達成することも可能であ
る。 β−アミラーゼと併用する場合においては、マ
ルトース純度が50％以上の時で、５〜15％収率を
高めることが可能である。 また、マルトオリゴ糖生成アミラーゼと併用す
る場合においては、マルトオリゴ糖の純度が30％
以上の時、３〜８％程度収率を高めることが可能
である。 なお、これら澱粉糖を製造する場合の原料澱粉
としては種々のものが使用できるが、通常馬鈴薯
澱粉、甘薯澱粉、コーンスターチ、ワキシーコー
ンスターチ、キヤツサバ澱粉等を用いる。また、
反応器に通液する澱粉液化液のグルコース当量
（DE）は通常、１〜35、好ましくは５〜20の範囲
にあるものを用いるのが良い。ここで、澱粉液化
液のDEがワキシーコーンスターチの場合１以下、
それ以外の澱粉ではDEが５以下のものは老化が
激しいので、その取扱いに工夫が必要である。一
方、DEが35以上になると、グルコアミラーゼに
よるグルコース生成に対しては逆合成が促進され
てイソマルトース、パノースなどの生成が増大
し、グルコースの収量が低下する。また、各種マ
ルトオリゴ糖の生成に対してグルコース、マルト
ース等の低分子糖の生成が増大し、かつマルトオ
リゴ糖の収量が低下するので適当でない。なお、
各種澱粉を液化する方法は特に制限はないが、通
常は液化型α−アミラーゼまたは塩酸等の酸で処
理する。 次に、マルトオリゴ糖とはマルトース、マルト
トリオース、マルトテトラオース、マルトペンタ
オース、マルトヘキカオース等を意味する。 固定化アミラーゼと併用する固定化枝切り酵素
の比率については、後者の量が増すほど澱粉糖の
濃度（収率）を高めることができるが、通常発現
活性ベースで前者１に対して後者0.1〜５、好ま
しくは0.2〜２の範囲とする。固定化枝切り酵素
の比率を上限以上としても、相応する効果が奏さ
れない上に、反応器の大きさが比例的に大きくな
るので経済的に好ましくない。 なお、ここで使用する各種固定化アミラーゼの
発現活性は、その使用条件によつて絶対値が大き
く変るので、次のような測定条件を設定して求め
た。すなわち、各種固定化アミラーゼ10mg
（wet）を0.5mlの該アミラーゼに好適なPHの50ｍ
Ｍ緩衝液（50ml三角フラスコ中）に加え、十分に
馴染ませた後、10w／ｖ％可溶性でん粉（Merck
社製）5.0mlを加えて40℃で10分間往復振とう機
により120ストローク／分、４cm幅で振とうしな
がら酵素反応を行ない、生成還元糖をSomogyi
−Nelson法で測定し、発現する活性を求めた。
なお、１単位とは１分間に1μmolのグルコシド結
合を切断する酵素量を意味する。 本発明の固定化枝切り酵素を前記固定化アミラ
ーゼと併用し複合酵素系として用いる場合、反応
器の形態と充填方法は種々の態様が考えられる。
たとえば、２種の固定化酵素を別々の容器に充填
する方法、２種の固定化酵素を混合してから同じ
容器に充填する方法、さらには２種のネイテイブ
酵素を一定の比率で混合した後、同時に固定化
し、容器に充填する方法等がある。 〔実施例〕 次に本発明を実施例により詳しく説明する。 実施例１および比較例１ 酵素としてクレブシエーラ・ニユ−モニア起源
のプルラナーゼ（比活性50IU／mg−タンパク、
天野製薬(株)製）を用い、担体として第１表に示し
たもの（粒状多孔質キトサンを使用した場合が実
施例で他は比較例、以下同じ）を使用して固定化
プルラナーゼを得た。すなわち、担体0.2ｇに対
して40IUの酵素をPH7.0の0.1Mリン酸緩衝液で2.0
mlとしたものを内径20mmの試験管に入れ、室温下
１時間、120ストローク、４cm幅で往復振とうし
ながら酵素を担体に固定化した。次いで、これを
濾過した後、さらに20ｍＭリン酸緩衝液（PH7.0）
を用いてタンパクが溶出しなくなるまで十分に洗
浄して固定化プルラナーゼを得た。 この固定化プルラナーゼについて、次の方法に
より実際に発現する活性を測定した。すなわち、
固定化プルラナーゼ10mg（wet）を0.5mlの10ｍＭ
リン酸バツフアー（PH7.0）（50ml三角フラスコ
中）に加え、十分に馴染ませた後、10w／ｖ％プ
ルラン（林厚生化学研究所製、分子量6.5×10⁴）
5.0mlを加えて40℃で10分間往復振とう機により
120ストローク／分、４cm幅で振とうしながら酵
素反応を行ない、生成還元糖をSomogyi−
Nelson法でマルトトリオースをスタンダードと
して測定し、発現する活性を求めた。なお、１単
位とは１分間に1μmolのグルコシド結合を切断す
る酵素量を意味する。得られた固定化プルラナー
ゼの発現活性の値を第１表に示す。 実施例２および比較例２ 酵素としてバチルス・アシドプルリテイカス起
源のプルラナーゼ（比活性4.9IU／mg−タンパク、
Novo社製）を用い、さらに担体として第２表に
示したものを使用して、実施例１と同様にして固
定化プルラナーゼを得た。なお、固定化に際し酢
酸緩衝液（PH4.5）を使用したこと以外はすべて
実施例１の方法に従つて固定化した。得られた固
定化プルラナーゼの発現活性をPH4.5で行なつた
こと以外は実施例１と同様の方法で測定した。得
られた結果を第２表に示す。 第１表 発現活性 担 体 （IU／ｇ−担体） 微弱酸性多孔質吸着樹脂 デユオライトＳ−761 66.1 〃 Ｓ−762 74.9 フエノール系吸着樹脂 デユオライトＡ−７ 61.7 〃 Ａ−562 66.1 Ｓ−568 63.1 粒状多孔質キトサン キトパールBCW3505 135.4 第２表 発現活性 担 体 （IU／ｇ−担体） 微弱酸性多孔質吸着樹脂 デユオライトＳ−761 40.3 〃 Ｓ−762 65.9 デユオライトES−771 31.8 弱酸性カチオン交換樹脂 デユオライトＣ−464 90.6 粒状多孔質キトサン キトパールBCW3505 140.2 比較例 ３ 酵素としてクレブシエーラ・ニユーモニア起源
のプルラナーゼ（比活性50IU／mg−タンパク、
天野製薬(株)製）を用い、担体として第３表に示し
たセライト、パーライトまたは活性アルミナを使
用して実施例１に記載の方法に従つて固定化プル
ラナーゼを得た。得られた発現活性の値を第３表
に示す。 第３表 発現活性 担 体 （Ｕ／ｇ−担体） セライト 22.2 パーライト 31.5 活性アルミナ 13.7 実施例 ３ 酵素としてマルトテトラオース生成アミラーゼ
（シユードモナス・ストツツエリ起源、比活性
80.8IU／mg−タンパク）を用い、固定化用担体と
して粒状多孔質キトサン、「キトパール
BCW3505」（富士紡績社製）を使用して固定化酵
素を得た。すなわち、担体20ｇを50ｍＴ Tris
−HClバツフアー（PH7.0）で十分に平衡化した
後、100mlの同一バツフアーに溶解した20000IU
の酵素を添加し、室温で１時間往復振とう（300
ml三角フラスコ中、120ストローク／分、４cm幅）
しながら酵素を担体に固定化した。次いで、濾紙
で濾過した後、10ｍＭ Tris−HClバツフアー
（PH7.0）でタンパクが溶出しなくなるまで十分に
洗浄し、発現活性が350IU／ｇ−担体の固定化マ
ルトテトラオース生成酵素を得た。 また、枝切り酵素であるプルラナーゼ（クレブ
シエーラ・ニユーモニア起源、比活性50IU／
mg・タンパク）を用いてPH6.0のリン酸バツフア
ーを使用したこと以外は上記と同様の方法で同一
の担体に固定化し、発現活性112IU／ｇ−担体の
固定化酵素を得た。 次に、直径27mm、長さ130mmのガラスカラムを
用いて、一方に固定化マルトテトラオース生成酵
素10mlと固定化プルラナーゼ５mlを混合（発現活
性比で約４：１）して、それぞれ充填した。基質
として26.2％（Ｗ／Ｗ）の澱粉液化液（DE＝８、
PH7.2）を用いて温度45℃、流速30ml／hrの条件
で連続通液した。その結果を第４表に示す。ま
た、上記記載の条件で連続通液したときの単一酵
素系および複合酵素系におけるカラム流出液のマ
ルトテトラオース濃度の経時変化を第５表に示
す。

【表】 枝切り酵素 〓キトパール
BCW3505〓
第５表 カラム流出液のマルトテトラオース濃度（Ｗ／
Ｗ、％）の経時変化反応日数 単一酵素系 複合酵素系 実施例３ ０ 45.2 50.9 10 45.0 50.0 20 44.5 49.0 30 43.9 48.2 実施例 ４ 担体として粒状多孔質キトサン、「キトパール
BCW3505」（富士紡績社製）を用い、リゾプス・
デレマー起源のグルコアミラーゼ（新日本化学(株)
製）を固定化した。すなわち、担体のキトサンを
20ｍＭ酢酸緩衝液（PH5.5）で十分に平衡化した
後、100ml容の三角フラスコに湿重量で10ｇの担
当を秤量し、これにグルコアミラーゼを担体１ｇ
あたり1050単位（液量10ml）添加した。次いで、
室温で１時間往復振とう（120ストローク／分）
して固定化した。さらに、20ｍＭ酢酸緩衝液（PH
5.0）で蛋白質が溶出しなくなるまで十分に洗浄
し、固定化グルコアミラーゼ標品を得た。得られ
た固定化グルコアミラーゼの発現活性は435IU／
ｇ−担体であつた。 また、枝切り酵素であるプルラナーゼ（クレブ
シエーラ・ニユーモニア起源、比活性50IU／
mg・タンパク）を用いてPH6.0のリン酸バツフア
ーを使用したこと以外は上記と同様の方法で同一
の担体に固定化し、発現活性112IU／ｇ−担体の
固定化酵素を得た。 次に、直径10mm、長さ150mmのガラスカラムを
用いて、一方に固定化グルコアミラーゼ５ml、他
方に固定化グルコアミラーゼ５mlと固定化プルラ
ナーゼ５mlを混合（発現活性比で約４：１）し
て、それぞれ充填した。基質として30.3％（Ｗ／
Ｗ）のコーンスターチ液化液（DE＝11、PH5.5）
を用いて温度50℃、流速3.3ml／hrの条件で連続
通液した。結果を第６表に示す。また、反応温度
を45℃としたこと以外は上記記載の方法に従つ
て、カラム流出液のグルコース濃度が95％以上に
なるように通液速度を変化させ、連続的に通液し
た。 そのときの通液速度の経時的変化を第７表に示
す。なお、通液速度は次式により求められる空間
速度（hr^-1）で表わした。 空間速度（hr^-1）＝通液量（ml／hr）／床容積（ml）

【表】 枝切り酵素 〓キトパール
BCW3505〓

【表】 実施例 ５ 担体として多孔質キトサン「キトパール
BCW3505」（富士紡績社製）を用い、β−アミラ
ーゼ（大豆起源、長瀬産業(株)製）を常法により固
定化した。得られた固定化β−アミラーゼの発現
活性は230IU／ｇ−担体であつた。 また、同一の担体にクレブシエーラ・ニユーモ
ニア起源のプルラナーゼを実施例３に記載の方法
に従つて固定化した。この酵素の発現活性は
112IU／ｇ−担体であつた。 次に、直径10mm、長さ150mmのガラスカラムを
用いて、一方に固定化β−アミラーゼ５ml、他方
に固定化β−アミラーゼ５mlと固定化プルラナー
ゼ2.5mlを混合（発現活性比で約４：１）して、
それぞれ充填した。基質として25％（Ｗ／Ｗ）の
澱粉液化液（DE＝８、PH6.0）を用いて、温度50
℃、流速4.9ml／hrの条件で連続的に通液した。
結果を第８表に示す。 また、上記記載の条件で連続通液したときの単
一酵素系および複合酵素系におけるカラム流出液
のマルトース濃度の経時変化を第９表に示す。

〔発明の効果〕

本発明の固定化枝切り酵素は、その再利用が可
能であるばかりでなく、各種アミラーゼと併用す
ることによつて、目的とする澱粉糖の収率を高め
ることができる。とりわせ、各種固定化アミラー
ゼと併用した場合には、完全な連続運転により各
種澱粉糖を高収率で製造することができる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 天然高分子キチンを脱アセチル化した後、架
   橋剤で処理し、さらにスペーサーとして脂肪族系
   または芳香族系の官能基を導入した多孔質キトサ
   ンビーズに澱粉中のα−１，６−グルコシド結合
   を加水分解する枝切り酵素を固定化させた固定化
   枝切り酵素。