JPH0342880B2

JPH0342880B2 -

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Publication number: JPH0342880B2
Application number: JP57072537A
Authority: JP
Priority date: 1981-04-27
Filing date: 1982-04-27
Publication date: 1991-06-28
Also published as: FI75189C; FR2504360A1; DE3215650C2; FI75189B; US4376824A; FR2504360B1; JPS57186497A; MX7612E; BE892986A; GB2097400B; SU1449014A3; FI821467A0; FI821467L; GB2097400A; DE3215650A1; CA1178550A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はグルコース／フルクトースシロツプの
製造法に関する。さらに詳しくは、本発明はグル
コース含有未精製澱粉水解物を固定化グルコース
イソメラーゼで処理することからなるグルコー
ス／フルクトースシロツプの製造法に関する。グルコース含有澱粉水解物の製造法はよく知ら
れており、酸−酵素法および酵素−酵素法の２つ
に大別される。酵素−酵素法は後の処理に抵抗
し、そのため全体の効率を低下させるレバーシヨ
ン（reversion）生成物の形成が少ないので、一
般に、この方法が好ましい。酵素−酵素法においては、約30〜40％の澱粉物
質乾燥分を含有する水性スラリーを調製し、これ
に澱粉消化酵素、典型的には細菌性α−アミラー
ゼを加え、このスラリーを80〜90℃に加熱し、澱
粉を部分的に加水分解または液化する。α−アミ
ラーゼは澱粉分子中のα−１，４−グルコシド結
合のランダム開裂を促進する能力を有する内生澱
粉分解酵素であり、種々の微生物、例えば、バチ
ルス属およびアスペルギルス属の微生物によつて
生成され、また、麦芽化穀類にも存在する。 α−アミラーゼ処理は、この酵素が澱粉分子の
α−１，６−グルコシド結合に充分作用しないの
で、澱粉分子の部分的加水分解にとどまる。した
がつて、α−アミラーゼ処理された澱粉の大部分
は種々の分子量のオリゴ糖類およびその断片から
なり、これらは未処理澱粉よりも産生物特異性酵
素による消化を受けやすい。さらに澱粉を加水分
解し、多量のグルコースを含有する水解物を得る
ために、該液化澱粉はグルコース産生酵素によつ
て処理される。通常用いるグルコース産生酵素は
グルコアミラーゼである。酸−酵素法においては、例えば、まず、約35〜
40％の澱粉を含有する水性懸濁液を調製し、それ
に塩酸のような酸を加えることにより澱粉を部分
的に加水分解または液化する。ついで、この酸懸
濁液を高温に加熱し、冷却し、適当な濃度および
PHでグルコアミラーゼで処理して部分的に加水分
解された澱粉をグルコースに変える。グルコースイソメラーゼを担体に吸着または結
合させて得られる固定化生物触媒の使用は、可溶
性酵素または微生物菌体を利用する古い方法に大
いに取つて代りつつある。一般に、固定化酵素は
古い方法に比し、種々の利点があり、ことに、連
続変換法を行なう商業的システムにおいて有利で
ある。かかるシステムを利用する上における経済
性から、固定化酵素の安定性または有効寿命を大
量の基質変換が可能な充分な期間にわたつて維持
することがきわめて重要となる。固定化グルコー
スイソメラーゼの調製法には、セルロース誘導
体、イオン交換樹脂およびその他のポリマー材料
のような不活性担体への酵素の結合もしくは付
着、酵素の包封、酵素の繊維内への取込みなどが
包含される。従来、固定化グルコースイソメラーゼは比較的
短期間の使用でかなり不活性化されるため、連続
酵素法において未精製澱粉水解物を基質として用
いてグルコース／フルクトースシロツプを製造す
る試みは満足するほどに有効ではなかつた。これ
は該酵素の活性を阻害したり、悪影響を及ぼす物
質が未精製澱粉水解物中に存在することに大いに
起因するものと考えられる。本発明者らの研究によれば、澱粉の液化および
糖化に用いられる通常の工程を間に形成される物
質が未精製澱粉水解物中に存在することにより、
固定化グルコースイソメラーゼの安定性または有
効寿命が低下することが示されている。これらの
物質は完全に特徴づけられてはいないが、澱粉水
解物の製造条件がかかる物質の形成を助長し、ま
た、マルツロースやフルクトースのようなケトー
スまたはその前駆体の非酵素的形成を促進しやす
いことによるものと考えられる。したがつて、未
精製水解物中で、非酵素的作用によつて生成され
るこれらの糖の一方または両方の総濃度は、グル
コースイソメラーゼの活性持続に関する限りにお
いて、該水解物の酵素的異性化に対する適合性の
指標とすることができる。従来、一般には、グルコースイソメラーゼによ
るグルコースの異性化に先立ち、グルコース含有
澱粉水解物は公知の方法で充分に精製されてい
る。通常用いられる精製方法には清澄水解物を炭
素およびイオン交換物質で処理して金属イオンお
よび炭水化物分解物質のような望ましくない成分
を除去することが包含される。澱粉液化は、一般に、澱粉粒子の完全な糊化を
確実にするために高温で行なわれる。カルシウム
依存性α−アミラーゼ製剤、例えば、バチルス・
ズブチリス（B.subtilis）由来のものを用いる液
化は該酵素に至適熱安定性を付与するため、澱粉
物質乾燥分（dss）に基き、200ppm程度のカルシ
ウムイオンを必要としうる。石灰の形のカルシウ
ムがこの目的のために澱粉液化においてしばしば
使用され、また、PHを所望のレベルに調整するた
めにも用いられる。しかし、かなりの濃度のカル
シウムイオンの存在は水解物の望ましくない高灰
分含量につながり、また、カルシウムイオンはグ
ルコースイソメラーゼ活性の阻害剤として知られ
ている。α−アミラーゼを用いて製造した澱粉水
解物中においてカルシウムを全く存在させないこ
とは多分不可能であるが、本発明の目的には、該
水解物中のカルシウムイオン含量は、澱粉含量に
基いて約100ppm以下とすべきである。水解物の製造条件を注意深く調整し、水解物中
での非酵素的なケトースの生成助長ならびに高灰
分含量をさけることにより、酵素の安定性または
有効寿命の実質的な低下なしに、固定化グルコー
スイソメラーゼによる異性化に先立つ経費のかか
る水解物の精製工程を省略できる。澱粉を酵素的に液化および糖化して、グルコー
ス／フルクトースシロツプに酵素的に変換するに
適したグルコース含有水解物を得ることに関する
先行技術はエヌ・エイチ・アシエングリーンらの
文献〔N.H.Aschengreen etal.，Starke，
Vol.31，pp.64〜66（1979）〕に簡明に記載されて
いる。この文献は澱粉をフルクトースシロツプに
変換するための４つの工程からなる方法を開示し
ている。すなわち、(1)液化、(2)糖化、(3)精製およ
び(4)異性化である。水解物を製造する第１の工
程、すなわち、澱粉を液化または粘度低下させる
工程は澱粉スラリーをPH６以上、約105℃で約５
分間α−アミラーゼで処理することからなる。ま
た、液化の間の高温におけるα−アミラーゼの活
性維持のためにスラリー中にかなりの濃度のカル
シウムイオンがあることが望ましいことも開示し
ている。また、液化の間、30〜35％dssスラリー
中に最少40ppmのCa⁺⁺を存在させることを特に
推奨している。これは乾燥澱粉重量に基いて114
〜135ppmに相当する。加熱処理につづき、部分
的に加水分解された澱粉はグルコース産生酵素で
処理され、高グルコース含量の水解物が得られ
る。高グルコース含量水解物は清澄化され、精製
され、グルコースイソメラーゼで処理されてグル
コースの一部がフルクトースに変換される。前記の文献に開示されているように、従来、一
般に、酵素の安定性に悪影響を及ぼす物質や最終
製品に望ましくない着色を与える物質を除去する
ため、澱粉水解物から得られたグルコース変換シ
ロツプはグルコースイソメラーゼによる異性化に
先立ち、充分に精製される。典型的には、該文献
に記載されるように、グルコースイソメラーゼに
よる異性化に先立ち、澱粉水解物を炭素およびイ
オン交換物質で処理する。関連する他の文献にはシイ・ビユツケの文献
〔C.Bucke，Topics in Enzyme Fermentation
and Biotechnology，A.Wiseman ed.，Vol.1，
Chap.7（1976）〕が包含され、この文献ではグル
コースイソメラーゼ変換用の基質としてのグルコ
ース食品の品質が検討されている。マドセンらの
文献〔Madsen etal.，Die Starke，Vol.25，No.
９，pp.304〜308（1973）〕には高温において安定
な、カルシウム依存性の低い熱安定性α−アミラ
ーゼ製剤を記載している。ポウルセンら
（Poulsen et al.）の米国特許第4025389号はカル
シウムおよびマグネシウムイオンの濃度および割
合を制限した澱粉水解物を用いるグルコース含有
シロツプのグルコース／フルクトース混合物への
酵素的異性化方法を教示している。エーレンター
ルら（Ehrenthal et al.）の米国特許第4230802
号はグルコースからフルクトースへの酵素的異性
化における基質として未精製のグルコースシロツ
プの利用法に関する。澱粉変換泥を含有する基質
をコバルトおよび／またはマグネシウム塩の添加
なしに異性化するものである。ワロン（Walon）
の米国特許第4235965号はバチリス・リケニホル
ミス（B.licheniformis）由来のα−アミラーゼ
を用いて高固形分濃度で液化澱粉を製造する芳香
に関する。商業ベースのグルコース／フルクトー
スシロツプの製造に関する評論はビイ・ジエイ・
シユナイダー〔B.J.Schnyder，Die Starke，
Vol.26，No.12，pp.409〜412（1974）〕によつてな
されている。固定化グルコースイソメラーゼを用
いるグルコース含有澱粉水解物の酵素的異性化に
関する特許方法の例としてはトンプソンら
（Thompson et al.）の米国特許第3909354号が挙
げられる。２工程液化技術による低DE澱粉水解
物の製造法は、例えば、米国特許第3551293号、
第3654081号、第3663369号、第3783100号、第
3853706号および第3912590号ならびに西独特許第
2216854号に教示されている。異性化に先立ち澱粉水解物を精製することは、
前記のアシエングリーンらおよびシユナイダーの
文献に加え、スカレツトらの文献〔Scallet et
al.，Die Starke，Vol.26，No.12，pp.405〜408
（1974）〕およびアシエングリーンの文献
〔Achengreen，process Biochemistry.May，
1975，pp.17〜19〕にも開示されている。澱粉を注意深く調節された条件下で液化および
酵素的糖化を行なうと、澱粉物質乾燥分に基き、
約100ppm以下のカルシウムイオンが存在し、非
酵素的に生成したケトースのモル比が約２以下
（ヘキソース単位100モル当りのモル数）のグルコ
ース含有水解物が得られる。この未精製水解物を
固定化グルコースイソメラーゼと接触させてグル
コース／フルクトースシロツプを得る。本発明の目的を達成するには澱粉水解物製造条
件の注意深い調節が必要である。コーンのウエツト・ミリングのような通常の出
所から得られる澱粉を洗浄し、30〜35％の澱粉物
質乾燥分を含有する水性スラリーを調製する。好
ましくは、該スラリーは、例えば、乾燥分基準で
硫酸化灰分として約0.2％以下のような低イオン
含量を有する。根および穀類原料から得られる他
の澱粉も水解物の製造に用いることができ、例え
ば、馬鈴薯澱粉、小麦澱粉、ソルガム澱粉、ワキ
シーメイズ澱粉などが挙げられる。本発明におけるグルコース含有澱粉水解物は酸
−酵素法または酵素−酵素法によつて製造でき
る。酸−酵素法においては、澱粉はまず、温和な
酸処理で液化され、ついで、酵素を用いて液化澱
粉をグルコースに変換する。典型的な酵素−酵素
法においては、澱粉をα−アミラーゼで処理して
液化し、ついで、グルコアミラーゼを用いて液化
澱粉をグルコースに変換する。該グルコース含有
澱粉水解物の製造には酵素−酵素法が好ましい。固定化グルコースイソメラーゼ処理に先立つ精
製の不要なグルコース含有澱粉水解物の製造には
液化および糖化の間の反応条件の注意深い調節が
要求される。採用する温度、時間およびPHを、グ
ルコースイソメラーゼの安定性に悪影響を及ぼす
物質の実質的な量の生成を抑制するようなものと
すべきである。また、異性化のための基質のカルシウム含量を
最小にする必要がある。ある種のα−アミラーゼ
製剤は液化の間の活性を発揮するために高カルシ
ウムイオン濃度の存在を要求することがよく知ら
れている。液化の間に高濃度のカルシウムが存在
する場合、異性化に先立ち、水解物からカルシウ
ムイオンを除去する必要がある。カルシウムイオ
ンを除去する公知のいずれの方法も使用できる。
例えば、グルコース含有液体をシユウ酸で処理
し、ついで、過する。活性化および熱安定性のために高濃度の添加カ
ルシウムイオンの存在を必要としないα−アミラ
ーゼ製剤を用いて液化することが望ましい。バチ
ルス・リケニホルミスから由来するα−アミラー
ゼ製剤（Termamy1−60L α−アミラーゼ，
Novo Enzyme Corp.）を用いると満足する結果
が得られた。この製剤は、良好な熱安定性および
広範なPH域にわたる活性およびカルシウム依存性
の低いことによつて特徴づけられる。用いること
のできる他の適当なα−アミラーゼ製剤はTaka
−Therm（Miles Laboratory，Elkhart，
Indiana）およびHi−Tempase（Biocon Inc.，
Lexington，Kent−ucky）である。澱粉の糊化および液化を行なう期間および採用
する温度は相互に依存する。もし、澱粉スラリー
を低糊化温度で非常に短い期間加熱すると、より
耐熱性の澱粉粒子の大部分が末糊化の状態で残
り、スラリーの粘度低下においてα−アミラーゼ
は満足するほどに有効ではない。一般に、糊化温
度範囲の低温部の温度、例えば、コーンスターチ
の場合、約80℃以下を採用すると、実質的な量の
澱粉が未糊化で残り、そのために実質的に酵素作
用を受けないために不満足な結果を与える。一
方、もちろん、α−アミラーゼの存在で糊化は起
るが、採用する温度は用いる酵素製剤の活性に悪
影響を及ぼすほど高くしてはならない。ことに重要なことは、液化および糖化の間の反
応条件を、ケトースの化学的または非酵素的生成
を促進しないように維持することである。さらに
詳しくは、水解物のカルシウムイオン濃度が澱粉
物質乾燥分に基いて約100ppm以下、非酵素的に
生成するケトースのモル比が約２以下となるよう
に条件を維持すべきである。カルシウムイオン濃
度が約30ppm以下、非酵素的に生成するケトース
のモル比が約１以下の水解物が好ましい。「モル
比」はヘキソース単位100モル当りの非酵素的に
生成するケトースのモル数として定義される。液
化の間の温度、時間、PHが相互に依存するため、
これらの因子は比較的狭い範囲で調節しなければ
ならない。澱粉粒子のポリマー構造は粒子が糊化するまで
はα−アミラーゼによつて感知されるほどには影
響されない。糊化は、澱粉粒子が膨潤し、澱粉分
子相互の結合力が糊化を起すに充分な程度に弱め
られるような温度で澱粉を水中で加熱することに
より行なわれる。一般に、α−アミラーゼは熱感
受性であり、100℃より上の温度で変性する傾向
にあり、酵素の効果を持続させるために、液化の
間には100℃以下の温度を採用する。粒子状の澱
粉分子を結合する力は強さが異なり、ある粒子は
100℃以下の温度で糊化し、α−アミラーゼの作
用を受けやすくなるが、他のものは未糊化のまま
残り、酵素の作用に抵抗する。したがつて、この
α−アミラーゼによる澱粉の液化を２工程で行な
い、その間に簡単にオートクレーブ処理を行なう
ことが好ましい。第１の工程の間に、澱粉は部分
的に糊化し、ある程度液化して部分水解物を与え
る。オートクレーブ処理の目的は、第１の工程の
間に糊化しなかつたいずれの澱粉粒子をも糊化さ
せることである。ついで、第２の液化工程におい
て、澱粉水解物は所望のレベルまでさらに粘度が
低下する。本発明の方法においては、液化の間に基質をPH
約６以下に維持することが重要である。約６より
上のPHにおいては、ことに、高温および／または
長期の反応期間を採用する場合、イソメラーゼの
活性を阻害する分解生成物が形成される可能性が
ある。液化は、PH約5.0〜6.0、好ましくは、約5.2
〜約5.4の範囲にて、澱粉の糊化温度範囲で、か
つ、澱粉の酵素液化に適した温度において２工程
で行なうことが有利である。ウエツト・ミル・コ
ーン・スターチの場合、通常、PHを液化に望まし
い範囲の上の方に調整することが必要である。一
般に、α−アミラーゼによる液化、ことに、カル
シウム依存性α−アミラーゼ製剤を用いる反応に
おいては、PHを調整するために、例えば、石灰ま
たは炭酸カルシウムのようなカルシウム化合物が
使用される。カルシウムはグルコースイソメラー
ゼの活性に悪影響を及ぼすので、水解物へカルシ
ウムイオン源を過剰に添加することをさけるのが
好ましい。しかし、カルシウムイオンを加えた場
合、本発明の目的を達成するには、異性化前にそ
れを除去する必要がある。液化反応の間のPH調整
に用いることのできる多くの物質があるが、多く
の微生物から由来するグルコースイソメラーゼは
至適活性にマグネシウムを要求するので、可溶性
マグネシウム化合物をこの目的に使用することが
有利である。スラリーに添加するα−アミラーゼの量は種々
の因子に依存するが、基本的にはその酵素製剤の
固有の活性、スラリー中の澱粉濃度および所望の
澱粉分解変換度合によつて決定される。一般に、
２工程液化系においては、第２工程には第１工程
と同等またはそれより幾分少ないα−アミラーゼ
活性量を添加する。２工程の間にオートクレーブ
処理を採用する場合は、第１工程において残存す
るいずれのα−アミラーゼ活性も実質的に破壊さ
れる。典型的には、澱粉物質乾燥分１ｇ当り、第
１工程においては約６〜約10リクエホンス
（liquefons）のα−アミラーゼ活性を、また、第
２工程においては約５〜約10リクエホンスのα−
アミラーゼ活性を与える。両工程において採用する液化温度は約100℃以
下、好ましくは、約82〜約95℃、さらに好ましく
は、約84〜88℃が望ましい。この範囲の液化温度
において、約１〜約３時間の加熱で満足する結果
が得られる。第１液化工程では、好ましくは、DE約６〜約
12の部分水解物が得られる。第１液化工程につづ
き、スラリーをオートクレーブ処理に付して、未
糊化澱粉を実質的に含まない部分水解物を得ても
よい。この部分液化澱粉をオートクレーブ処理に
長期間さらすと、グルコースイソメラーゼに悪影
響を及ぼす物質が形成され、イソメラーゼの安定
性を持続させるために、異性化に先立つてそれを
除去しなければならなくなる。したがつて、オー
トクレーブ処理の時間および温度は、各々、約２
分以内、約160℃までとすべきである。好ましい
オートクレーブ処理条件は約125℃で約１分間で
ある。第１の工程に存在するα−アミラーゼはこのオ
ートクレーブ処理で実質的に不活化されるので、
第２工程にさらに酵素を添加する必要がある。通
常、該添加するα−アミラーゼの量は第１工程に
おけると同じである。第２工程の間に、実質的に
全てが糊化された澱粉粒子は前記と同様な条件下
で酵素作用を受け、好ましくは、約14〜約20の
DEを有し、生もしくは戻り澱粉を実質的に含有
しない粘度の低下した水解物を与える。典型的に
は、該水解物のDEは約16である。液化澱粉調製物は、ついで、該部分水解澱粉を
酵素的にグルコースに変換するに適した条件下で
グルコース産生酸素により処理される。典型的に
は、この目的に用いる酵素はグルコアミラーゼ
（アミログルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、グ
ルコース産生酵素などともいわれる）である。グ
ルコアミラーゼは種々の微生物によつて産生さ
れ、澱粉またはアミロデキストリン分子の非還元
末端からグルコース部分を順序に加水分解する外
生澱粉分解酵素である。グルコアミラーゼ産生微
生物にはアスペルギルス属、リゾープス属および
エンドマイセス属に属する糸状菌が包含される。液化澱粉調製物の糖化は澱粉のグルコースへの
変換が高率で行なわれるような条件下で行なう。
好ましくは、水解物のグルコース含量が92％以
上、さらに好ましくは、94％以上となるようにす
る。また、該条件は、グルコアミラーゼを用いる
糖化反応において起ることが知られている遊離グ
ルコース分子の再合成によるオリゴ糖類の生成を
促進しないようなものとすべきである。グルコアミラーゼの処理は、必要であれば、液
化澱粉懸濁液を約30％の固形分含量に希釈し、反
応PHを約4.0〜約5.0、好ましくは、約4.6に調整し
て行なう。充分な量のグルコアミラーゼ製剤を加
えて澱粉物質乾燥分１ｇ当り、約0.12〜約0.30グ
ルコアミラーゼ単位とし、懸濁液を約54〜約62℃
で所望の変換度合を得るに充分な期間加熱する。
好ましい保持期間は約30〜約80時間である。もつ
とも好ましい条件は該澱粉懸濁液を約58℃で約60
時間保持することである。異性化に適した基質を得るために、つぎに、糖
化液を過して非澱粉残渣を除去し、好ましく
は、液は乾燥分含量が約50％になるように蒸発
させる。この濃縮液にグルコースイソメラーゼ賦
活剤からなる可溶性塩類を加えてもよく、水酸化
ナトリウム溶液でPHを約7.0〜約8.5に調整する。
ついで、典型的には、液体は約50〜約70℃で約20
〜約60分間加熱され、沈澱物および高PH域で生成
しやすい懸濁物質を去する。好ましい条件は、
過前に約60℃で約30分間加熱することである。
糖化液の長期の加熱あるいは異性化前における約
70℃より上の温度での加熱（ことに、PHをアルカ
リ域に調整した後の）はさけることが好ましい。
アルカリ性条件下では、異性化に先立つかかる加
熱により、グルコースイソメラーゼの活性を阻害
する分解生成物が生じる可能性がある。未精製基質の異性化は、適当な条件下、基質を
固定化グルコースイソメラーゼの床を充填したカ
ラムに通す連続法によつて有利に行なわれる。固
定化グルコースイソメラーゼの固定床を用いてグ
ルコースをフルクトースに異性化する適当な方法
の例は米国特許第3909354号および第3788945号に
教示されている。異性化に先立つ水解物の精製を省略できる経済
的利点に加えて、本発明の方法を行なうことによ
り、他の利点も実現できる。すなわち、液化およ
び糖化条件を非酵素的に生じるケトースの濃度を
低くするように維持することにより、澱粉のグル
コースへの変換を高率で行なうことができる。ま
た、出発澱粉スラリーおよび後の工程の間の灰分
含量を低く保つことができるので、グルコース／
フルクトースシロツプ最終製品の脱ミネラル化に
多大のイオン交換能を必要としない。つぎに本明細書における用語の定義および分析
法を説明する。デキストロース当量（DE）デキストロース当量（DE）とは、存在する還
元糖濃度をデキストロースとして表現したもの
で、乾燥分の％として計算される。スタンダー
ド・アナリテイカル・メソツズ・オブ・ザ・メン
バー・カンパニー・オブ・コーン・インダストリ
ー・リサーチ・フアウンデイシヨン・インコーポ
レイテツド（Standard Analytical Methods of
the Member Companies of the Corn Industry
Reserch Foundation，Inc.，1001 Connecticut
Ave.，N.W.Washington，D.C.20036）に記載さ
れるＥ−26法によつて測定。細菌性α−アミラーゼ活性細菌性α−アミラーゼ製剤の活性はスタンダー
ド・テスト・メソツドAATCC103−1965
（Standard Test Method，ATCC103−1965，
Bacterial α−Amylase Enzyme Used in
Desizing，Assay of，1967Ed.，Technical
Manual of the American Association of
Textile Chemists and Colorists，Vol.43，pp.
B−174，Ｂ−175）の変性により測定した。この変法はつぎのとおりである。 (1) 化学的に純粋な（c.p.）水酸化ナトリウム
25.3ｇおよびc.p.リン酸二水素カリウム340ｇを
水に溶解し、２に稀釈して澱粉基質用の緩衝
液を調製する。 (2) 緩衝液125mlを、冷却し、ペースト化した澱
粉基質に加え、ついで、この基質を500mlとす
る。 (3) 澱粉基質のPHを測定し、必要ならば、PH6.20
±0.05に調整する。 (4) 酵素試料稀釈のために0.025モル塩化カルシ
ウム溶液を用いる。これは、無水c.p.塩化カル
シウム11.1ｇを水に溶解し、容量４にして調
製する。 (5) BAUからリクエホンスへの変換式は、 BAU×2.85＝リクエホンスである。グルコアミラーゼ活性グルコアミラーゼ活性単位（GU）は、以下の
方法において、60℃、PH4.5において１時間当り、
１ｇのデキストロースの生成を触媒する酵素の量
として定義される。部分水解澱粉（例えば、Maltrin−10、Grain
Processing Co.，Muscatine，Iowaの製品）の、
PH4.5の20ｍＭ酢酸塩緩衝液を含有する10％溶液
10mlを60℃に保持したキヤツプ付反応器に入れ
る。0.03〜0.15GUを含有するグルコアミラーゼ
溶液１mlを加え、混合し、60℃で１時間保持す
る。１時間インキユベーシヨン後、予め定めた量
の1M水酸化ナトリウムを加え、PH8.5〜10.5とし
て酵素反応を停止させる。ついで、混合液を室温
まで冷却する。得られた分析用水解物2.5mlをDE測定に用いる
と同様なフエーリング溶液25mlに入れる。混合液
を沸騰させ、DE測定に用いると同様な１当り
５ｇのデキストロースを含有するデキストロース
標準液で滴定する。対照混合液を同様に調製し、
前記と同様に滴定する。ただし、グルコアミラー
ゼ溶液１mlは１時間のインキユベーシヨン後、水
酸化ナトリウム溶液を加えた後に添加する。グル
コアミラーゼ活性は次式から算出される。 GU／ｇ＝0.002V（Ｃ−Ａ／Ｗ）式中、Ｖは分析用水解物の容量（ml、通常は
11.2ml）；Ｃは対照混合液の滴定に要したデキス
トロース標準液のml数；Ａは分析用水解物の滴定
に要したデキストロース標準液のml数；Ｗは酵素
液１ml当りの酵素重量である。固定化イソメラーゼ活性固定化イソメラーゼ活性はつぎのようにして測
定される。 1400〜2200IGIUを含有する固定化イソメラー
ゼ試料を秤取する。この試料をデキストロース分
析溶液125ml（予め65℃に加温）および0.1Mトリ
スヒドロキシメチルアミノメタン（THAM）溶
液（PH7.8）10mlで250ml容フラスコに洗い込む。
デキストロース分析溶液はデキストロース
3.33M、硫酸マグネシウム20ｍＭ、亜硫酸ナトリ
ウム10ｍＭ、THAM100ｍＭおよび塩化コバル
ト１ｍＭを含有する（PH7.8）。このデキストロー
ス溶液は65℃におけるPHが7.0である。フラスコ
を65℃の水浴につけ、１時間振とうする。この混
合液を、ガラス繊維にのせ、１ｇの過助剤をし
いた45mmの粗いガラス斗を通して真空過す
る。フラスコおよび酵素ケーキを少量の100ｍＭ
THAM緩衝溶液（PH7.8）ですすぎ、全量を
100mlとする。この洗浄した酵素を、デキストロース分析溶液
125ml（予め65℃に加熱）を含有する250ml容フラ
スコに入れる。酵素は10ｍＭ THAM緩衝液
（PH7.8）10mlでフラスコ中に定量的に洗い込み、
フラスコを正確に60分間振とうする。ついで、氷酢酸12.0mlを加え、この酸性混合液
をさらに15分間振とうする。この混合液を、ガラ
ス繊維をのせ、約１ｇの過助剤をしいた45mmの
粗いガラス斗を通して真空過する。フラスコ
および斗内容物を、約400mlの液が得られる
まで脱ミネラル水で洗浄する。2dｍセルを用い、
25℃で測定した旋光度をR₂とする。同様に、ただし、酵素を加えずにブランクの処
理を行なう。ブランクの旋光度も25℃で測定し、
R₁とする。異性化の度合（）は次式から算出
する。Ｉ＝（R₂−R₁）／αCpL 式中、αはデキストロースがフルクトースに完
全に変換したときの比旋光度変化；Cpは溶液中
の糖濃度（0.15ｇ／ml）；Ｌは偏光計の管の長さ
（2dｍ）である。イソメラーゼ活性の固定活性単位（FAU）は
次式から算出される。 FAU／ｇ＝JC／k_ftw 式中、k_fは速度定数（1.21Ihr^-1FAU^-1mgグル
コース）；ｔは反応時間（１時間）；ｗは試料重量
（ｇ）；Ｃは125ml反応混合液当りの初期濃度（mg）
（75000mgグルコース）であり、Ｊはつぎのように
定義される。Ｊ＝〔Ie（Ks／Cm＋１）＋Ie²（Ks／Kp−１
）〕ln（Ie／Ie−Ｉ）−IeI（Ks／Kp−１）式中、Ieはフルクトース・モル分率で表わした
平衡時の異性化度合；Ｉはフルクトース・モル分
率で表わした異性化度合；Cmはグルコースの初
期モル濃度（3.33M）；Ksはグルコースのミハエ
リス（Michaelis）定数（0.7M）；Kpはフルクト
ースのミハエリス定数（1.43M）である。 1IGIUは15.8FAUに等しい。 IGIU IGIUはインターナシヨナル・グルコース・イ
ソメラーゼ・ユニツト（International Glucose
Isomerase Unit）の略であり、はじめにグルコ
ース２モル／、硫酸マグネシウム0.02モル／
および塩化コバルト0.001モル／を含有する溶
液中、PH6.84〜6.85（0.2Mマレイン酸ナトリウム）
において、60℃で１分間当り、１マイクロモルの
グルコースをフルクトースに変換する酵素量であ
る。グルコースイソメラーゼの測定はエヌ・イ
ー・ルロイドら〔N.E.Lloyd et al.，Cereal
Chem.，49，No.５，pp.544〜553（1972）〕記載の
方法により行なつた。糖類の測定水解物のグルコース、フルクトース、マルツロ
ースおよび他の糖類の測定は高圧液体クロマトグ
ラフイーを用いて行なつた。方法はスタンダー
ド・アナリテイカル・メソツズ（Standard
Analytical Methods，Corn Refiner′s
Association，Inc.）に記載されているＥ−61法
である。異性化率（％フルクトース）異性化反応の結果得られるフルクトース％はつ
ぎのとおり測定する。基質（異性化前の未精製水解物）５mlを100ml
容フラスコに入れ、脱イオン水で稀釈して100ml
当り、乾燥固形分約2.5ｇの濃度とする。別途、
基質を、固定化グルコースイソメラーゼを充填し
たカラムに通し、その溶出液５mlを脱イオン水で
100mlに稀釈する。稀釈した基質（ｓ）および溶
出液(i)の旋光度を測定する。定数(K)はつぎの式から誘導される。Ｋ＝ｄ×100／Ｌ（〔α_d〕−〔α_f〕）Ｋ＝59.08 式中、ｄは稀釈倍率（20）；Ｌは偏光計セルの
長さ（0.2000dｍ）；〔α_d〕−〔α_f〕は純グルコース
が純フルクトースに変換される際の水銀灯源で測
定した比旋光度変化（169.3°）である。したがつて、％フルクトース，d.b.＝59.08（α_s−α_i）／Ｃ式中、α_sは基質の旋光度；α_iは溶出液の旋光
度；Ｃは基質１ml当りの乾燥固形分のｇ数であ
る。グルコースイソメラーゼの安定性測定反応速度（k_f）および酵素の半減期（τ）の算
出本明細書記載の異性化反応におけるグルコース
イソメラーゼの安定性または半減期はつぎの等式
に適当な値を代入することにより測定される。 ln（Ie−Io／Ie−Ｉ）＝k_fE_te_-0.693t/〓／CR 式中、Ioは反応器供給物の異性化率〔Ｆ／（Ｆ
＋Ｃ）〕；Ｉは反応器溶出液の異性化率〔Ｆ／
（Ｆ／Ｇ）〕；Ieは平衡状態におけるＩ（65℃で
0.514または60℃で0.505）；k_fは初期反応速度定数
〔ｇ（Ｇ＋Ｆ）hr^-1IGIU^-1〕；E_tは酵素活性
（IGIU）；Ｃは基質濃度（グルコースｇ／ml）；Ｒ
は流速（ml／hr）；τは酵素の半減期（時間）；ｔ
は反応器運転時間（時間）；Ｆは全炭水化物乾燥
分に基くフルクトースの重量分率；Ｇは全炭水化
物乾燥分に基くグルコースの重量分率である。初期反応速度定数（k_f）およびタウ（τ）は前
記の等式をつぎのように変形して計算される。 log〔Rln（Ie−Io／Ie−Ｉ）〕＝logk_fE_t／Ｃ−0.3
0102t／τlog〔Rln（Ie−Io／Ie−Ｉ）〕を時間に対してプロツトしたときの傾斜は−
0.30102／τに等しいから、τ＝−0.30102／傾斜
である。かかるプロツトの時間Ｏにおける切点
（Xo）は式 Xo＝RlnIe−Io／Ie−Ｉで示され、これを用いて初期反応速度定数（k_f）
が求められる。すなわち、 k_f＝Ｃ×10^Xo／E_t である。初期反応速度定数（k_f）と酵素の半減期を示す
因子（τ）の積は工程の全効率の適当な指標とな
る。k_fτ値が高い程、グルコースからフルクトー
スへの変換についての工程の効率が高くなり、か
つ、酵素の半減期に対する工程の効率が高くな
る。つぎに実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説
明するが、これらに限定されるものではない。実施例１この実施例では連続法で行なう本発明の製造法
を説明し、本発明の製造法により達成されるグル
コースイソメラーゼの高い安定性を示す。この実
施例および以下の実施例で用いるグルコースイソ
メラーゼは、米国特許第3788945号に記載される
ごとく、DEAEセルロース上に固定されたもので
ある。コーン・ウエツト・ミリング操作から回収され
たコーン・スターチを脱イオン水で洗浄し、澱粉
物質乾燥分33％を含有するスラリーを調製する。
酸化マグネシウムでスラリーのPHを5.2に調整し、
充分な量のα−アミラーゼ（Termamyl−60L）
を加え、澱粉物質乾燥分１ｇ当り、７リクエホン
スのα−アミラーゼを活性とする。スラリーを径
１／２インチのステンレス・スチール・コイルに通
し、その中え、86℃で2.5時間保持する。この第
１加熱処理工程の後、スラリーを径1/8インチの
ステンレス・スチール・コイルに送り、その中
で、50〜100psiの圧力下、約115〜130℃で約１時
間保持する。ついで、スラリーを約86℃に冷却
し、第１加熱工程におけると同量のα−アミラー
ゼを添加し、第３の加熱コイルに通す。このコイ
ルは第１加熱工程におけるコイルと同条件を有
し、スラリーはこの中で86℃で２時間加熱され
る。液化した澱粉スラリーは脱イオン水で乾燥固形
分30％に稀釈させ、多段撹拌タンク式反応器シス
テム中で糖化が行なわれる。充分な量の過助剤
（Dicalite CP−175，GREFCO，Inc.）を加えて
乾燥分に基く濃度を１％とし、塩酸でPH4.5に調
整する。液化澱粉調製物をシステムの第１の反応
器に入れ、充分な量のグルコアミラーゼ製剤
（AMG−150，Batch SN 3075，Novo Enzyme
Corp.）を加えて澱粉物質乾燥分１ｇ当り、
0.27GUとする。反応器内容物を58℃に加熱し、
同温度に保持した７つの反応器中を順次通過させ
る。各反応器における平均保持時間は7.5時間で
ある。糖化サイクルの終了時に、反応器内の生成
液体を、予め過助剤を被覆した過機で、10イ
ンチHgの減圧下に過して存在するいずれもの
非澱粉質残渣を除去する。グルコースイソメラーゼによる異性化に適した
基質とするために、該液体を連続式エバポレータ
ーで乾燥固形分約50％まで濃縮する。まず、液体
を86℃に加熱し、この温度で４分間保持し、つい
で、25インチHgの減圧下、58℃で蒸発させる。
Mg（HSO₃）₂の溶液を加え、液体中、0.002モルの
濃度とし、ついで、水酸化ナトリウム溶液でPH
7.8（25℃で測定）に調整する。この基質液体は混
合コイルに通し、つぎに、ホワツトマンNo.３紙
をしいた過機で過する（コイル、過機とも
に58℃に保持）。異性化は、過した基質を直列に接続し、60℃
に保持した４つの固定床反応器に直接通過させて
行なう。反応器はいずれも径１インチ、長さ６イ
ンチのガラスカラムで、種々の量の固定化グルコ
ースイソメラーゼを充填してある。各反応器に充
填するグルコースイソメラーゼの量は2300〜
5000IGIUの範囲である。使用した反応器を装填
位置からはずし、新たな反応器をその位置に取り
付けることのできるような条件下で反応器を操作
する。異性化は１分当り、基質2.4mlの流入速度
で行ない、最終流出液中のフルクトース濃度を42
〜46％とする。各反応器における保持時間経過
後、流出液の試料を採取し、分析する。該未精製
水解物の異性化の結果を第１表に示す。

【表】異性化液体の定期的な分析値の平均はつぎのと
おりである（乾燥固形分重量に基く値、d.b.）。フルクトース％：44.3 グルコース％：51.6 DP₂₊％：4.1※ カルシウムppm：30 硫酸化灰分％：0.28 乾燥固形分％：48.6 ※ジおよびそれより多糖の糖類を包含する。このデータおよび第１表のデータは、特定の条
件下で得られた未精製澱粉水解物を固定化グルコ
ースイソメラーゼによる異性化に付すことによ
り、フルクトースを高率で含有するグルコース／
フルクトースシロツプが製造できることを示す。
このデータはまた、前記の条件下で酵素が良好な
安定性または半減期（τ）を示し、高率の酵素効
率（k_fτ）が達成されていることを示している。実施例２この実施例では澱粉の液化および糖化条件の差
異の、グルコース含有基質中における非酵素的ケ
トース生成に及ぼす影響およびグルコースのフル
クトースへの異性化に用いるグルコースイソメラ
ーゼの安定性に及ぼす影響を説明する。バチルス・リケニホルミス由来のα−アミラー
ゼ製剤およびバチルス・ズブチルス由来のより高
カルシウム依存性のα−アミラーゼ製剤を用いて
別々に澱粉の液化を行なう。液化は２工程で行な
い、その間にオートクレーブ処理をして実質的に
粒状または未糊化澱粉を含まない部分水解物を得
る。各々、乾燥分33％を含有する２つの澱粉スラリ
ーを調製する。１つのスラリー（基質Ａ）を本発
明における液化条件でバチルス・リケニホルミス
由来のα−アミラーゼ製剤で処理する。他のスラ
リー（基質Ｂ）をバチルス・ズブチルス由来のα
−アミラーゼ製剤（Gex−Lo−HC，
Wallerstein Co.）で処理し、この製剤を用いて
澱粉を液化する場合に通常採用される好ましい条
件に付す。これらの液化条件を第２表に示す。

【表】

【表】これらの液化澱粉調製物を各々、乾燥固形分30
％に稀釈し、PH4.3に調整し、グルコアミラーゼ
0.41GUg^-1dssを添加する。糖化は58℃において、
基質Ａについては32時間、基質Ｂについては55時
間行なう。糖化液を過し、減圧下、35℃におい
て乾燥固形物50％まで濃縮する。グルコースイソメラーゼによる異性化用の３種
の基質を調製する。基質Ａは前記基質ＡにMg
（HSO₃）₂を加えて濃度0.0025Mとし、水酸化ナト
リウム溶液でPH7.8に調整して得る。基質Ｂを得
るには前記基質Ｂを、まず、PH4.8で化学量論量
のシユウ酸で処理し、基質のカルシウム含量を乾
燥分に基いて30ppmまで減少させる。ついで、こ
の液体を過し、液にMg（HSO₃）₂を加えて濃
度0.0025Mとし、MgOでPH6.0、ついで、水酸化
ナトリウムでPH7.8まで調整する。基質Ｃは充分
量の結晶デキストロースを脱イオン水に溶解し
て、50％デキストロース溶液を得、これに、Mg
（HSO₃）₂を加えて濃度0.0025Mとし、MgOでPH
6.0、ついで、水酸化ナトリウムでPH7.8として調
製する。これらの基質を、各々約800IGIUの固定化グル
コースイソメラーゼを充填し、65℃に保持したジ
ヤケツト付ガラスカラム（１インチ×12インチ）
に通して異性化を行なう。基質は0.3ml／分の流
速でカラム中を流下させる。異性化は17日間連続
して行なう。基質およびカラム流出液の試料を毎
日採取し、フルクトースおよびグルコースの濃度
を測定し、異性化反応のパラメータを算出する。
基質ＡおよびＢともに異性化に先立ち精製操作は
行なわない。結果を第３表に示す。

【表】第３表のデータは、未精製異性化基質のマルツ
ロース含量が低い場合にもつともよい酵素安定性
および変換効率が得られることを示している。未
精製基質Ｂを用いた場合の安定性および効率は実
質的に低く、この基質は高いマルツロース含量を
有し、通常、バチルス・ズブチルスのα−アミラ
ーゼを用いる場合に採用される高PHおよび高温条
件で調製されたものである。基質として結晶デキ
ストロースを用いた異性化反応の結果は、この物
質がグルコースイソメラーゼの活性を阻害する成
分を全く含まないものではないことを示してお
り、未精製基質の調製条件の重要性をさらに強調
するものである。実施例３この実施例では、澱粉液化の際のPHおよびオー
トクレーブ処理温度の異性化酵素の安定性および
変換反応の効率に及ぼす影響を説明する。５つの同等のコーン・スターチ試料（乾燥分に
基き33％）を、２工程操作により、Termamyl−
60Lα−アミラーゼを用い、以下の第５表に示す
種々のPH、オートクレーブ温度で液化する。液化
の時間、温度、酵素量条件は第４表のとおりであ
る。

【表】各液化澱粉試料20づつを、0.41GUg^-1dssの
グルコアミラーゼ製剤（AMG−150Batch
SN3068，Novo Enzyme Corp.）を用いて糖化
する。試料をPH4.3に調整し、58℃で32時間加熱
する。この糖化液を過し、乾燥分50％に濃縮
し、酸化マグネシウムでPH6.5に調整する。各試
料にMg（HSO₃）₂を加え、濃度0.0025Mとし、最
後に水酸化ナトリウムでPH7.8（25℃で測定）とす
る。この液のグルコースおよびマルツロースを分
析し、ケトースのモル比を測定する。この未精製液を、固定化グルコースイソメラー
ゼを充填し、60℃に保持した１インチ径のガラス
カラムに0.3ml／分の流速で通す。各カラムの酵
素の総活性は800IGIUである。異性化の結果を第
５表に示す。第５表から明らかなごとく、基質のマルツロー
ス含量は液化PHおよびオートクレーブ温度に影響
される。第５表のデータに示すごとく、マルツロ
ース含量はイソメラーゼ半減期と逆の関係で変化
し、マルツロース前駆体の非酵素的形成を促進す
る液化条件は酵素の安定にも悪影響を及ぼしてい
ることを示している。また、このデータは糖化の
間に形成されるグルコースの量がマルツロース濃
度と逆の関係にあることも示している。

【表】実施例４この実施例では、異性化に先立つ未精製基質の
加熱温度のグルコースイソメラーゼ安定性および
異性化反応の効率に及ぼす影響を説明する。澱粉を実施例１に示すと同様な条件下で液化
し、実施例３と同じ条件下で糖化する。糖化液
を、過助剤（Dicalite）を用いて過し、乾燥
分50％に濃縮する。この濃縮液に５％Mg
（HSO₃）₂溶液を加えて濃度0.0025Mとし、水酸化
ナトリウムでPH7.8（25℃）に調整する。基質を数部分に分け、各々、第６表に示す温度
に保持した１インチ・ジヤケツト付カラムに通
す。カラム中で30分間保持した後、基質を冷却
し、過し、グルコースおよびケトースの分析を
行なう。加熱しない基質も同様に分析する。各基質を、各々、精製せずに、800IGIUの活性
を有する固定化グルコースイソメラーゼを充填
し、65℃に保持したジヤケツト付ガラスカラムに
通して異性化する。異性化は、カラム中の基質流
速0.3ml／分で500時間行なう。結果を第６表に示
す。第６表のデータに示すごとく、高処理温度は、
好条件下で液化および糖化して得られる基質中の
非酵素的なケトース、ことに、フルクトースの生
成を促進する。同時に、基質中のグルコース濃度
が減少する。

【表】実施例５この実施例では従来法によつて調製された未精
製澱粉水解物のグルコースイソメラーゼ安定性お
よび異性化の変換効率に及ぼす影響を説明する。澱粉水解物の製造法は前記のアシエングリーン
の文献（Process Biochemistry，1975年５月）
に教示されており、基質を充分に精製してグルコ
ースイソメラーゼの活性を阻害する物質を除去す
る必要があることを強調している。コーン・ウエツト・ミリング操作で得られたコ
ーン・スターチを脱イオン水で乾燥分33％のスラ
リーとする。スラリーのPHを酸化マグネシウムで
6.5に調整し、バチルス・リケニホルミス由来の
α−アミラーゼ製剤（Termamyl−60L）の充分
量を加え、20リクエホンスg^-1dssとする。スラリ
ーを12ml／分の流速でステンレス・スチール・コ
イルに通し、105〜107℃で７分間保持する。つい
で、スラリーを95℃に冷却し、第２のコイル中、
その温度で1.5時間保持する。糖化前にDE18.6、
ヨウ素テストによる生澱粉不含の部分水解物（乾
燥分33％）を60℃に保持する。この液化澱粉を乾燥分30％に稀釈し、PH4.5に
調整し、充分な量のグルコアミラーゼ製剤
（Novo AMG−150）を加え、0.25GUg^-1dssとす
る。前記のPHを保持しながら、この消化物を60℃
で48時間加熱する。ついで、この糖化液を、過
助剤（Dicalite CP−175）を用いて過し、
液を真空エバポレーター中、43℃で乾燥分49.6％
に濃縮する。この液の分析値はグルコース含量約
95％、マルツロース含量約0.2％である。異性化用の基質を調製するため、Mg（HSO₃）₂
を加えて濃度0.002Mとし、水酸化ナトリウム溶
液でPH7.9に調整する。この液を65℃で20分間保
持し、ついで、過する。基質は精製することなく固定化グルコースイソ
メラーゼによる異性化に付す。異性化は、
1000IGIUの活性を有する固定化グルコースイソ
メラーゼを充填し、65℃に保持した径１インチの
カラムに流速0.4ml／分で基質を通過させて行な
う。異性化は570時間行なう。対照として、結晶
デキストロース溶液を同じ条件下で異性下する。
結果を第７表に示す。これらの結果は、カルシウムの低い、かつ、非
酵素的に形成されたケトースの低い基質は異性化
に先立つ精製が不要なことを示している。これは
従来受け入れられている教示と全く反対である。

【表】実施例６この実施例では酸−酵素法によつて調製された
未精製水解物の異性化について説明する。コーン・ウエツト・ミリング操作で得られた澱
粉を脱イオン水で乾燥分33％のスラリーとする。
濃塩酸でPH2.2に調整する。スラリーを22ml／分
の流速で加圧下にステンレス・スチール・コイル
に送り、135〜140℃で約４分間保持し、ついで、
大気圧まで減圧する。水酸化ナトリウム溶液を連
続的に加えてPH4.0〜4.4に調整し、温度を60℃に
下げる。液化澱粉の平均D.E.は18である。実施例５と同様に、ただし、PH4.4で総糖化時
間を約62時間として、この液化澱粉約70を糖化
し、過し、濃縮する。この50.3％dssの糖化液
を酸化マグネシウムでPH5.8に調整し、Mg
（HSO₃）₂を加えて濃度0.002Mとし、さらに水酸
化ナトリウムでPH7.8に調整する。ついで、実施
例５と同じ条件下で糖化液を加熱処理し、過
し、異性化する。異性化は667時間行なう。第８表の結果は、この未精製酸−酵素基質の異
性化が結晶デキストロース基質の異性化に匹敵す
ることを示している。

【表】この結果は、酸−酵素法による澱粉水解物にお
ける非酵素的に形成されるケトースが少なく、予
め精製しなくても効率よく異性化されることを示
している。実施例７この実施例では、本発明の方法でのグルコース
のフルクトースへの異性化におけるバチルス・コ
アギユランス（B.coagulans）由来のグルコース
イソメラーゼの使用を説明する。実施例３と同じ条件下、ただし、液化PHおよび
オートクレーブ処理温度を変えて２種の澱粉水解
物を調製する。これらの調製物ＡおよびＢについ
ての条件は第９表のとおりである。

【表】これらの澱粉水解物のマルツロース含量につい
ての分析値は調製物Ａで＜0.1％、調製物Ｂでは
平均1.10％であつた。各調製物を過し、真空下で50％dssに濃縮し、
Mg（HSO₃）₂を加えて濃度0.0025Mとし、ついで、
水酸化ナトリウム溶液でPH7.9に調整する。この
未精製澱粉水解物調製物を、各々、流速0.4ml／
分で、60℃に加熱したコイルに通し、20分間滞留
させ、過し、ついで、0.4ml／分の流速で、65
℃に保持したジヤケツト付ガラスカラムに通して
異性化する。各カラムには総活性800IGIUの固定
化グルコースイソメラーゼ（Sweetzyme−Type
Ｓ，Batch No.70122，Novo Industrie
Denmark製）を充填してある。結果を第10表に示す。

【表】第10表のデータは、未精製水解物中のマルツロ
ース濃度を低くするような条件に保つことが重要
であることを示している。本発明の方法によつて調製された澱粉水解物を
異性化反応において使用することから生ずるグル
コースイソメラーゼの安定性および全変換効率に
対する良好な効果により、従来必要とされていた
異性化に先立つ水解物の精製を省略することがで
きる。澱粉を液化し、糖化し、ついで、処理する
条件を注意深く調節することにより、未精製水解
物から商業的規模でグルコース／フルクトースシ
ロツプが得られる経済的な製法を可能とするまで
に、グルコースイソメラーゼに影響を及ぼす物質
の含量の少ない基質を得ることができる。

Claims

【特許請求の範囲】１未精製グルコース含有澱粉水解物を固定化グ
ルコースイソメラーゼに接触させて少なくともグ
ルコースの一部をフルクトースに変換する方法の
おいて、該未精製グルコース含有澱粉水解物のカ
ルシウムイオン含量が水解前の澱粉物質乾燥分に
基づき約100ppm以下であり、かつ、未精製グル
コース含有澱粉水解物中の非酵素的に形成される
ケトースのモル比がヘキソース単位100モル当た
り、約２モル以下であることを特徴とする未精製
澱粉水解物からのグルコース／フルクトースシロ
ツプの製造法。２該未精製グルコース含有澱粉水解物が制御さ
れた条件下に澱粉を液化および糖化することから
なる酸−酵素法によつて調製されたものである前
記第１項の製造法。３該未精製グルコース含有澱粉水解物が制御さ
れた条件下に澱粉を液化および糖化することから
なる酵素−酵素法によつて調製されたものである
前記第１項の製造法。４カルシウムイオン依存性の低いα−アミラー
ゼを用いて澱粉を液化する前記第２項または第３
項の製造法。５該α−アミラーゼがバチルス・リケニホルミ
ス（B.licheniformis）由来のものである前記第
４項の製造法。６澱粉を、約30ppm以下のカルシウムイオンの
存在下で液化する前記第２項〜第５項いずれか１
つの製造法。７澱粉の液化を２工程で行い、その間にオート
クレーブ処理する前記第２項〜第６項いずれか１
つの製造法。８澱粉をPH約５〜６で液化する前記第２項〜第
７項いずれか１つの製造法。９澱粉をPH約5.2〜5.4で液化する前記第８項の
製造法。１０澱粉をD.E.約16まで液化する前記第２項〜
第９項いずれか１つの製造法。１１液化澱粉を、乾燥分に基づき、硫酸化灰分
約0.2％以下のイオン含量の澱粉スラリーから調
製する前記第２項〜第１０項いずれか１つの製造
法。１２グルコース含有水解物のグルコース含量
が、水解前の澱粉物質乾燥分に基づき約92％以上
である前記第１項〜第１１項いずれか１つの製造
法。１３グルコース含有水解物のグルコース含量が
水解物の澱粉物質乾燥分に基づき約94％以上であ
る前記第１２項の製造法。１４液化澱粉を約54〜62℃で約30〜80時間グル
コアミラーゼで糖化してグルコース含有水解物を
得る前記第１項〜第１３項いずれか１つの製造
法。１５糖化をPH約４〜約５で行う前記第１４項の
製造法。１６糖化をPH約4.6で行う前記第１５項の製造
法。１７未精製水解物のマルツロース含量が、水解
前の澱粉物質乾燥分に基づき約４％以下である前
記第１項〜第１６項いずれか１つの製造法。１８未精製水解物の非酵素的に形成されるフル
クトース含量が、水解前の澱粉物質乾燥分に基づ
き約１％以下である前記第１項〜第１７項いずれ
か１つの製造法。１９固定化グルコースイソメラーゼに接触させ
る前に、未精製水解物を約50〜約70℃で約20〜約
60分間加熱する前記第１項〜第１８項いずれか１
つの製造法。２０未精製水解物を約60℃で約30分間加熱する
前記第１９項の製造法。２１未精製水解物を、その中のグルコースの少
なくとも一部をフルクトースに異性化するに適し
た条件下、少なくとも１つの固定化グルコースイ
ソメラーゼの床に通す前記第１項〜第２０項いず
れか１つの製造法。２２固定化グルコースイソメラーゼの床が
DEAEセルロースまたはアニオンイオン交換樹脂
に吸着または結合されたグルコースイソメラーゼ
からなる前記第２１項の製造法。