JPS632595B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はカチオン性コロイドシリカ上にグルコ
アミラーゼを固定化せしめた不溶性活性酵素複合
体およびその製造方法に関する。本発明による不
溶性酵素複合体を使用することによつてぶどう糖
を製造することができる。

澱粉は非常に高分子の重合体の炭水化物であ
る。そのアンヒドログルコース単位と言はれる単
量体としての単位はぶどう糖から導びかれ、澱粉
の完全な加水分解からはぶどう糖が得られる。米
国に於てはぶどう糖はコーンスターチから製造さ
れ；ヨーロツパに於てはコーンスターチ及びばれ
いしよ澱粉から製造され；日本に於てはコーンス
ターチ及び白色の甘藷澱粉から製造される。

1960年までは、ぶどう糖は酸分解により澱粉か
ら製造された。この製造方法としては、120ない
し145℃の温度に於て澱粉を塩酸又は硫酸と加熱
し、次いで加水分解混合物を炭酸ナトリウムで中
和し、精浄化し次いでぶどう糖を結晶化される手
段が含まれる。不幸にも、ぶどう糖の収率は比較
的多量の戻り生成物、即ちぶどう糖分子の再結合
によつて形成される生成物の形成によつて低下さ
れる。又加水分解反応の高温度及び低PH価のため
に生成されたぶどう糖のあるものはヒドロキシメ
チルフルフロール、レビユリン酸及び着色体に転
換される。このような分解生成物の形成は不可逆
的であり、これらが形成された限りに於て、希望
するぶどう糖の収率には勿論負の効果を与える。
更になお、塩酸の使用又はある場合には硫酸の使
用及び次いで行なわれるこれら酸のアルカリによ
る中和は無機塩の形成が起り、これは最終目的ぶ
どう糖生成物の結晶化を妨げる。

最近、澱粉のぶどう糖への加水分解は酵素によ
り行なはれている。このような目的のために使用
される主役の酵素はグルコアミラーゼであつた
し、今後も然りである。この酵素は澱粉から一時
に唯１個のぶどう糖分子のみを開裂せしめること
によつて澱粉を効果的に加水分解する。しかし実
際上の問題として、グルコアミラーゼの作用を施
す前に、先ず澱粉を稀薄化せしめることが必要で
ある。この稀薄化段階は酸か又は酵素により行う
ことが出来る。澱粉は約10〜20のD.E.値に稀薄化
せしめ、次いでグルコアミラーゼを以て処理す
る。この２段階方法は、使用する稀薄化段階の性
質に従つて酸−酵素法又は酵素−酵素法と呼ばれ
る。

酸−酵素法に於ては澱粉は20ないし40％の澱粉
及び塩酸のような酸を含む水性懸濁液中に液化さ
れ及び加水分解される。この懸濁液は次いで約１
ないし4.5のPH価に於て、高温、即ち70ないし160
℃に加熱されて澱粉は液化され及び部分的に加水
分解される。酸−酵素法の代表的なものは米国特
許第2305168号；第2531999号；第2893921号；第
3021944号；及び第3042584号明細書に記載されて
いる。

酵素−酵素法に於ては、20ないし40％の澱粉及
び細菌α−アミラーゼのような液化酵素を含む水
性懸濁液中で約85ないし約105℃の温度に於て液
化され及び部分的に加水分解される。液化され及
び部分的に加水分解された澱粉のデキストロース
相量は一般に約20以下であり、殊に約10以下であ
る。次いで混合物は約95℃以上の温度、殊に110
ないし150℃の温度に処理して完全な澱粉溶液と
することを確保する。澱粉加水分解物は次いで95
℃より低い温度に冷却し、更に細菌α−アミラー
ゼによる処理を行ない約20までのデキストリン当
量（D.E.）に澱粉を加水分解する。この方法は米
国特許第3853706号明細書に記載され特許請求さ
れている。

いずれの方法に於ても消化された澱粉は、次い
でグルコアミラーゼのような他の酵素によつてぶ
どう糖又はぶどう糖含有シロツプに転換される。
グルコアミラーゼ製剤は例えばアスペルギルスフ
エニシイス、アスペルギルスニガー、アスペルギ
ルスアワモリのようなアスペルギルス属に属する
ようなある種の真菌類の菌株及びリゾーブス種及
びある種のエンドーミセス種からのある種の菌株
から製造される。グルコアミラーゼは澱粉の加水
分解を澱粉分子の非還元性末端から始まりα−
１・４−結合又はα−１・６分岐点に於て単一の
グルコース単位に開裂するように作用する。市販
のグルコアミラーゼ酵素製剤は主として存在する
グルコアミラーゼに加うるに、例えば少量のプロ
テアーゼ、セルラーゼ、α−アミラーゼ及びトラ
ンスグルコシダーゼのような数種類の酵素を含
む。

澱粉からぶどう糖を製造するために固定化酵素
技術を使用することによつて著るしい利益が展開
された。固定化により酵素の安定性を増大せし
め、酵素原料は繰返へし再使用することが出来及
び更に反応の精密な制御が可能となる。グルコア
ミラーゼの固定化のために種々の方法が記載され
ている。

グルコアミラーゼの固定化のために詳細な配慮
されて、酵素を固定化する技術の評論を行つた言
及が米国特許第4011137号明細書に記載されてい
る。

最近コロイドシリカ上に酵素を固定化せしめる
方法が報告されている。米国特許第3802997号明
細書にはコロイドシリカは酵素を結合させるため
に使用することが出来るとのことを記載してい
る。しかしこの特許による方法では、酵素が担体
に結合される以前に酵素の基質を担体と結合する
ことが必要であることを教示している。この方法
では生成物を分離するためには経費を要する凍結
乾燥又は噴霧乾燥の段階を必要とする。米国特許
第3796634号明細書ではコロイドシリカが酵素の
ための担体として使用することが記載されてい
る。この場合に於ては酵素を架橋結合させて、シ
リカに化学的に結合させるためにグルタルアルデ
ヒドが使用された。又は別法として、最初にポリ
エチレンイミンをシリカと結合させ、次いで酵素
を架橋剤によりシリカ表面上のポリアミンに結合
させている。これら両特許に記載された方法では
非常に微細に分割された粒子が得られている。こ
のように微細な酵素含有粒子は回分反応から除去
するのが困難であり、又これらをカラム操作のた
めに使用せんと試みた場合には圧の低下が起り管
理不可能となる。

1977年３月23日付出願の、なお出願中の米国特
許シリースナンバー第780374号明細書の記載では
グルコースイソメラーゼ酵素はコロイドシリカに
結合される。酵素の結合性はグルタルアルデヒド
の使用によつて改良され及び粒子の大きさは混合
物を凍結し、それを少なくとも２時間を要して解
凍することによつて増大される。ここに製造され
た顆粒又は薄片は20〜100メツシユの粒子寸法を
有し、これはカラム異性化反応に於て良好な流動
性を得るためには充分の大きさである。しかしこ
れら特許にはいずれもグルコアミラーゼの結合に
就いては何ら実施例が記載されていない。

本発明者は今回、カチオン性コロイドシリカの
小さい粒子は、PH価を約6.5に上昇せしめてゲル
化し、次いで冷凍及び解凍を行なうことにより大
きな粒子を凝集させることが出来ることを見出し
た。更にコロイドシリカをグルコアミラーゼの存
在のもとにこの方法で凝集させた場合には酵素は
活性の形で固定化されることを見出した。酵素を
シリカに結合させるためには何ら架橋剤を必要と
することなく、粒子を水性溶液に懸濁せしめても
又はこれを以て洗滌しても溶解されることはな
い。

それとは対照的に、コロイドシリカを先ず凝集
せしめ、次いで酵素と接触せしめた場合は、シリ
カには極めて僅少の酵素が結合されるに過ぎな
い。本酵素組成物の重要な有利性としては、それ
が比較的に圧縮され得ないことにある。例えば15
分、2000rpmの遠心分離操作の回転のもとに於て
何ら容積の変化を示さない。この非被圧縮性は良
好な粒子寸法と合俣つてこの酵素組成物を反応帯
を通して圧力低下の最小に於て固定床反応器中で
酵素による転換を行なうのに極めて適する。この
構成物のこれら性質は膨張型反応床（上昇型）反
応器、連続撹拌式タンク反応器及び回分式反応器
中で酵素転換を行うために重要である。

本発明に従えば、グルコアミラーゼの存在下に
カチオン性コロイドシリカをPH約6.5に高め、次
いで凍結し、解凍することによつて得られたもの
であることを特徴とする、カチオン性コロイドシ
リカ上にグルコアミラーゼを固定化せしめた不溶
性活性酵素複合体ならびに (a) グルコアミラーゼ溶液をカチオン性コロイド
シリカを接触せしめ、 (b) 上記混合物を約6.5にそのPH値を高めること
によつてゲルに転換せしめ、 (c) 上記ゲルを約−15℃以下に約24時間保持せし
めて凍結し、 (d) 凍結した固形物を約20℃に放置することによ
つて解凍し、そして (e) 得られた固形物の酵素含有粒子を分離するこ
とを特徴とする、カチオン性コロイドシリカ上
にグルコアミラーゼを固定化せしめた不溶性活
性酵素複合体の製造方法 が提供される。

なお、参考までに記載すれば、上記方法によつ
て製造された不溶性活性酵素複合体を用いて澱粉
加水分解物を約4.0ないし4.5のPH価において処理
し、そして生成物ぶどう糖を回収するという方法
により、澱粉加水分解物からぶどう糖又はぶどう
糖含有シロツプを製造することができる。

本発明に於て使用するコロイドシリカはシリカ
粒子の水性コロイド分散体である。このような製
品はルドツクス（LUDOX）なる商品名のもとに
デユポン会社から市販されている。ルドツクス製
品は大抵負に負荷された粒子である。しかし、使
用して好ましいルドツクスはルドツクス−130M
（LUDOX130M）であり、このものは正に負荷さ
れたコロイド粒子である。市販されているコロイ
ドシリカはその直径が７〜24ナノメータの範囲の
粒子寸法を有するが、コロイドシリカは粒子寸法
に関係なくいかなる形のものでも本発明に使用す
ることが出来る。

本発明に使用されるグルコアミラーゼはよく知
られている菌類アミラーゼ製剤、殊にアスペルギ
ルス属、エンドーミセス属又はリゾーブス属のも
のから選ばれたものはいずれも使用することが出
来る。殊に好ましいものとしては、菌類アミラー
ゼ製剤が水性媒質中粘土性物質を以て処理して好
ましからぬトランスグルコシダーゼが除去され
た、米国特許第3042584号（Kooi等）明細書に記
載された方法で得られるグルコアミラーゼであ
る。

グルコアミラーゼ単位は下記のようにして測定
する： 基質は10〜20D.E.にα−アミラーゼ稀薄化した
ワキシーとうもろこし澱粉加水分解物を水に溶解
し、更に溶液100ml当り4.0ｇの乾物量にまで稀釈
したもの。上記溶液をピペツトで正確に50mlを
100mlの定量フラスコ中に測り込む。フラスコに
は1.0モル酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液（PH4.3）
5.0mlを添加する。フラスコは60℃の水浴中に放
置し、10分後にこれに適当な酵素製剤を添加す
る。酵素製剤を添加してから正確に120分後に、
溶液を0.5N水酸化ナトリウムを以てフエノール
フタレイン終点に調整する。次いで溶液を室温に
まで放冷し、稀釈する。ぶどう糖として計算した
還元糖値は稀釈した試料及び酵素製剤が添加され
ていない対照に基ずいて測定される。

グルコアミラーゼ活性は下記の如くして計算さ
れる： Ａ＝Ｓ−Ｂ／２×Ｅ （式中 Ａ＝酵素製剤１ml（又は１ｇ）当りのグルコア
ミラーゼ活性単位 Ｓ＝酵素転換された試料中の還元糖（100ml当
りのｇ） Ｂ＝対照中の還元糖（100ml当りのｇ） Ｅ＝使用した酵素製剤の量（ml又はｇ） なおＳは100ml当り１ｇを超過してはいけない。

出発原料として使用した澱粉加水分解物は上記
の如く酸液化によつても又は酵素液化転換法によ
つても製造することが出来る。

本発明に従つて、澱粉加水分解物は、ぶどう糖
を製造するために単に固定化グルコアミラーゼ製
剤のみを使用して処理した。操作法は回分式又は
カラム法で行なつた。

デキストロース当量又はD.E.値なる用語は、シ
ユールル法（Schoorl merhod）（エンサイクロ
ペデイア、オブ、インダストリアル・ケミカル、
アナリシス、第巻、41〜42頁）により測定した
ぶどう糖百分率として表わした澱粉加水分解物中
に溶解された固体としての還元糖含量に関する。

ぶどう糖シロツプは高圧液体クロマトグラフイ
ーを使用して分析した。成分はカルシウム型のカ
チオン交換樹脂から水で溶離した。溶離した成分
はデイフアレンシヤルレフラクトメータにより検
出した。非ぶどう糖含水炭素はエレクトロニツク
インテグレータを使用して測定した。ぶどう糖は
その差から求めた。一般法は“アナリシス・オ
ブ、カーポヒドレート、ミツクスチヤース・バ
イ・リクイド・クロマトグラフイー”（Am.Soc.
Brew.Chem.Proc.1973年、43〜46頁）中に記載
されている。使用した樹脂はBio−Rad.
Laboratories社、リツチモンド、カリフオルニヤ
製のカルシウム型のアミネツクスQ15−５
（Aminex Q15−５）である。

コロイドシリカと接触させる酵素は溶液中、水
で適当に稀釈した後に使用した。稀釈は酵素を安
定化させる塩類の溶液又はPHを保持せしめる緩衝
溶液を使用して行うことが出来る。グルコアミラ
ーゼの場合は、１ml当り５〜200単位の濃度が好
ましい。コロイドシリカはそのまゝ又は10ないし
30重量％に水で適当に稀釈して使用する。

固定化後その活性を保持しているような酵素は
いずれも本方法に使用することが出来る。酵素と
してはグルコアミラーゼ、プルラナーゼ、α−ア
ミラーゼ、β−アミラーゼ及びイソアミラーゼの
ようなカルボヒドラーゼが好ましい。

コロイドシリカは酵素の存在するもとにPH価を
調整してゲル化させる。これは稀酸又は稀アルカ
リ又は酸性又は塩基性塩を以て行なう。グルコア
ミラーゼとカチオン性コロイドシリカとの場合に
は、PH価を稀水酸化ナトリウム溶液で調整するよ
りも稀炭酸ナトリウム溶液でPH価を調整する方が
好ましい。ゲル化のための最適PH価は使用する酵
素の安定性及び性質により定められる。

ゲル化した混合物はグルタルアルデヒドのよう
な架橋剤の添加によつて安定化される。驚異的に
もグルコアミラーゼとカチオン性コロイドシリカ
との場合はこのような架橋剤を使用せずして良好
な結果が得られた。

ゲルは混合物の凍結点以下の任意の便宜な温
度、殊に−15ないし−20℃の範囲に於て凍結され
る。冷却の時間は温度、凍結すべき物質の容積及
びその他の冷却条件により変化する。混合物は凍
結点以下に、混合物が完全に凍結するために充分
長い時間保つべきである。

凍結混合物はゆつくり解凍し、通常15ないし25
℃の室内中で解凍される。しかし酵素の不活性化
を起さない限り、任意の温度で行なうことが出来
る。

酵素混合物のゼラチン化、凍結及解凍の操作条
件は、酵素活性が保持され及び粒子で充填された
カラムを通してシロツプが流動することが出来又
は過又は遠心分離による回分反応から粒子の回
収が容易であるように充分な寸法及び構造を有す
るような粒子が得られるように調整する。更に酵
素含有粒子の構造は、基質の拡散を可能ならしめ
て酵素反応が起り得るものでなくてはならない。
希望する粒子寸法及び構造はコロイドシリカの最
初の濃度を調整することにより、基質と共に又は
これを使用せずに塩類の存在のもとに於けるゲル
化及び凍結により及び凍結及び解凍の速度によつ
て達成することが出来る。

本発明の固定化酵素組成物は、酵素活性の非実
用的損失を起すことなく反応の実際上の速度を与
えるような温度に於て澱粉加水分解物と接触され
る。グルコアミラーゼに於ては、実用的温度は20
ないし70℃であり、殊に40ないし50℃の範囲の温
度が好ましい。

本発明の実施に当つて広い範囲の加水分解物濃
度を使用することが出来る。これは５ないし60％
の固形物範囲であり得るが；低：D.E.値を有する
基質では、高濃度の固形物濃度に於ける使用のた
めには余りに粘稠にすぎると言える。

基質のPH価は、使用する酵素により変化する最
適PH価を以て、3.5ないし7.0の範囲に変化させ得
る。グルコアミラーゼに於ては4.2ないし4.5のPH
価範囲が好ましい。

固定化グルコアミラーゼ組成物を使用する本発
明の方法は、炭水化物の高パーセンテージがぶど
う糖であるようなシロツプを製造するために使用
することが出来る。生成物中のぶどう糖のパーセ
ンテージは、加水分解物と酵素との間の接触時
間、温度、使用する加水分解物の濃度及び使用す
る加水分解物の組成を変化せしめることによつて
調製することが出来る。このようにして制御され
たぶどう糖の量を有するシロツプ並びに高ぶどう
糖含量を有するシロツプを製造することが出来
る。

本発明方法は又、炭化水物の種々に変化するパ
ーセンテージのものがマルトースであるようなシ
ロツプを製造するために使用することが出来る。
これは固定化されたグルコアミラーゼ組成物の代
りに固定化されたβ−アミラーゼ組成物を使用す
ることによつて達成される。

本発明を更に下記諸例により例解するが、諸例
中の“部”及び“パーセンテージ”は総べて特に
断わらない限り、夫々重量部及び重量パーセント
を示す。

例 １ カチオン性コロイドシリカ（LUDOX130M）
の30％分散体５mlに水４ml及び水２ml中のグルコ
アミラーゼの112単位の溶液を添加する。得られ
た懸濁液のPH価は4.4であり、これを室温で15分
間振盪する。次にグルタルアルデヒドの25％溶液
0.045mlを添加する。そのPH価は0.1N水酸化ナト
リウム溶液を添加して6.5に調整する。混合物と
して形成されたゲルは室温に於て20分間振盪す
る。ゲルは−20℃に於て24時間凍結せしめる。こ
の凍結した物質を室温中にもたらし、撹拌せずに
３時間放置すると、固体及び液体層に分離する。
固体は吸引過により集め、水135mlに洗滌する。

液及び洗液は合一して分析したが、活性酵素
は全く存在しなかつた。固定化酵素は結合された
グルコアミラーゼ活性を示した。固体の水性懸濁
液は顕微鏡下で検した。透明小盤の直径は１から
380μいろいろであつた。粒子の大抵のものは直
径が100μないし150μであつた。

例 ２ 例１記載の方法を、総べての原料の３倍量を使
用して繰返えした。グルコアミラーゼ活性度は１
ｇにつき14単位であつた。

例 ３ 例２記載の方法を、グルタルアルデヒドを添加
せずに繰返えして行なつた。乾燥固体１ｇにつき
17単位のグルコアミラーゼが活性型で結合され
た。

このことは架橋剤として使用されるグルタルア
ルデヒドが存在しない場合には、カチオン性コロ
イドシリカには更に多量のグルコアミラーゼが活
性型で結合されることを示している。

例 ４ 本例では例３記載の方法を行なつたが、唯その
うち0.1N水酸化ナトリウム溶液の代りに１％炭
酸ナトリウム溶液を使用してPH価を6.5に調整し
た。結合活性度は、乾燥固体１ｇにつきグルコア
ミラーゼ24単位であつた。

例 ５ 本例はゲル化及び凍結によつて予じめ形成され
たカチオン性コロイドシリカ粒子はグルコアミラ
ーゼを極めて僅少量しか結合しないことを示す。

30％のカチオン性コロイドシリカ
（LUDOX130M）15ml及び水10mlの混合物に振盪
下１％炭酸ナトリウム溶液10mlを除々に加える。
ここで混合物のPH価は6.5に上昇する。この白色
のゲルを−24℃で24時間凍結させる。混合物を室
温に於て２時間放置し、次いで吸引過により固
形物を集め、水洗する。

この固形物の試料２ｇを0.05モル酢酸ナトリウ
ム緩衝液PH4.3〜4.5の50mlと共に１時間振盪す
る。固形物は過して集め、更に酢酸ナトリウム
緩衝液PH4.3を以て洗滌する。固形物には、0.04
モル酢酸ナトリウム緩衝液15ml中のグルコアミラ
ーゼの150単位の溶液を添加し、そのPH価を酢酸
を以て4.3に調整する。この混合物は室温に於て
一夜振盪する。固形物を集め、水200mlを以て洗
滌する。分析により、結合されずに残留するグル
コアミラーゼは139単位になることを示した。結
合された活性度は１ｇにつき２単位であつた。

例 ６ カチオン性コロイドシリカ（LUDOX130M）
の30重量％溶液180ml及び蒸留水120mlの混合物に
振盪下グルコアミラーゼ3990単位を含む溶液60ml
を添加する。この混合物は室温で15分間振盪す
る。次にこれに炭酸ナトリウムの１％溶液140ml
を振盪下２時間を要して滴下して加える。得られ
た濃稠の白色ゲルを−20℃に於て凍結室中に24時
間放放置する。

次にこれを室温に５時間放置して解凍する。固
形物を集め、蒸留水400mlで洗滌する。次にビー
カーに移し、傾斜により水で４回洗滌して微細粒
子を分ける。乾燥担体１ｇにつき16単位のグルコ
アミラーゼが活性型で結合された。

例 ７ ガラス製カラム（内径30mm、長さ190mm）に例
６のようにして製造したグルコアミラーゼを含む
LUDOX130Mを100ml添加する。29D.E.のα−ア
ミラーゼで稀薄化した澱粉加水分解物の25％水性
溶液を、１時間につき0.5床容積（BVH）の速度
でカラム中を通過させる。加水分解物のPH価は
4.3に調整し、微生物の生育を抑制するために
0.025％プロピルパラセプトを添加する。カラム
の温度はウオータージヤケツトを使用して45℃に
保持する。カラムから流出したシロツプの炭水化
物組成は高圧液体クロマトグラフイーで測定す
る。平均組成を次に示す： ぶどう糖 90.9±0.5 二糖類 2.2％ 三糖類 0.6％ 四糖類以上の多糖類 6.3％ 溶離液中の糖類組成は８日間の操作の開殆んど
一定に保持された。溶離液中には活性グルコアミ
ラーゼは全く検出されなかつた。

例 ８ 可溶性グルコアミラーゼを以て消化せしめた
29D.E.澱粉加水分解物から製造した71D.E.澱粉加
水分解物を、上記例５に使用した29D.E.澱粉加水
分解物の代りに出発原料として使用した。カラム
は45℃及びPH4.3に於て３日間操作を続けた。高
圧液体のクロマトグラフイーによる炭化水物生成
物の分析結果を下記の平均値で示す： ぶどう糖 93.1±0.4％ 二糖類 2.0％ 三糖類 0.6％ 四糖類以上の多糖類 4.3％ カラムを連続的に14日間使用した後に固定化酵
素複合体の試料をカラムから採取する。これには
１ｇ当り14単位のグルコアミラーゼを含むことが
判明した。

これらの結果は、本発明方法により固定化され
たグルコアミラーゼは澱粉加水分解物をぶどう糖
シロツプに転換することが出来及びこれは連続的
カラム操作に於て長期間この目的のために使用す
ることが出来ることを示している。

本発明については特定の態様を以て記載した
が、これは更に変化せしめ及び酵素及び澱粉加水
分解技術に熟達したものにとつて明白であるよう
な応用又は変化が可能である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ グルコアミラーゼの存在下にカチオン性コロ
   イドシリカをPH約6.5に高め、次いで凍結し、解
   凍することによつて得られたものであることを特
   徴とする、カチオン性コロイドシリカ上にグルコ
   アミラーゼを固定化せしめた不溶性活性酵素複合
   体。 ２ (a) グルコアミラーゼ溶液をカチオン性コロ
   イドシリカと接触せしめ、 (b) 上記混合物を約6.5にそのPH値を高めること
   によつてゲルに転換せしめ、 (c) 上記ゲルを約−15℃以下に約24時間保持せし
   めて凍結し、 (d) 凍結した固形物を約20℃に放置することによ
   つて解凍し、そして (e) 得られた固形物の酵素含有粒子を分離するこ
   とを特徴とする、カチオン性コロイドシリカ上
   にグルコアミラーゼを固定化せしめた不溶性活
   性酵素複合体の製造方法。