JP2884188B2 - 固定化酵素によるヘミセルロースの加水分解の方法および固定化ヘミセルロース分解酵素からなる製品 - Google Patents
固定化酵素によるヘミセルロースの加水分解の方法および固定化ヘミセルロース分解酵素からなる製品Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、固体担体に吸着することにより固定化され
たヘミセルロース分解酵素による、キシロ−オリゴマー
を含有するヘミセルロース基質の加水分解の方法に関す
る。本発明はさらに加水分解の本方法を実行するために
固定担体および該担体に固定されたヘミセルロース酵素
または酵素の混合物の併用に関する。この方法はセルロ
ース工業の廃液を含有するキシロ−オリゴマーからの、
および蒸気分解植物材（steam−exploded plant materi
al）からのキシロースの製造に非常に都合がよい。
たヘミセルロース分解酵素による、キシロ−オリゴマー
を含有するヘミセルロース基質の加水分解の方法に関す
る。本発明はさらに加水分解の本方法を実行するために
固定担体および該担体に固定されたヘミセルロース酵素
または酵素の混合物の併用に関する。この方法はセルロ
ース工業の廃液を含有するキシロ−オリゴマーからの、
および蒸気分解植物材（steam−exploded plant materi
al）からのキシロースの製造に非常に都合がよい。
ヘミセルロース分解酵素、即ちヘミセルラーゼは、キ
シラナーゼ、β−キシロシダーゼおよびエステラーゼを
含み加水分解によってヘミセルロース性材料を活発に切
断する。これらキシラナーゼおよびエステラーゼの間で
は、酵素はキシランおよび、カンバ材のキシランのアセ
チル側鎖を切断し、そして残っているキシロ−オリゴマ
ーは未置換でありおよびβ−キシロシダーゼによっての
み加水分解される。さらに幾つかのあまり知られていな
い付帯の活性がヘミセルロースを加水分解する酵素配合
物中で見出されてきた。ヘミセルロース分解酵素は、例
えばアスペルギルス（Aspergillus）属またはトリコデ
ルマ（Trichoderma）属の菌類のようなある微生物の発
酵により製造される。培養培地それ自体またはそこから
分離された酵素画分をヘミセルロースの加水分解におけ
る酵素製剤として使用できる。
シラナーゼ、β−キシロシダーゼおよびエステラーゼを
含み加水分解によってヘミセルロース性材料を活発に切
断する。これらキシラナーゼおよびエステラーゼの間で
は、酵素はキシランおよび、カンバ材のキシランのアセ
チル側鎖を切断し、そして残っているキシロ−オリゴマ
ーは未置換でありおよびβ−キシロシダーゼによっての
み加水分解される。さらに幾つかのあまり知られていな
い付帯の活性がヘミセルロースを加水分解する酵素配合
物中で見出されてきた。ヘミセルロース分解酵素は、例
えばアスペルギルス（Aspergillus）属またはトリコデ
ルマ（Trichoderma）属の菌類のようなある微生物の発
酵により製造される。培養培地それ自体またはそこから
分離された酵素画分をヘミセルロースの加水分解におけ
る酵素製剤として使用できる。
加水分解反応条件では溶液中で遊離のヘミセルロース
分解酵素は比較的短期間のみそれらの活性を保ってい
る。それらは使用するのに費用がかかりおよび再生が困
難である。固体担体に固定された酵素は遊離酵素よりも
安定であり、およびそれらはまたより容易に再使用が可
能であり、それゆえヘミセルロース分解酵素の固定に対
して幾つかの方法が開発されてきている。
分解酵素は比較的短期間のみそれらの活性を保ってい
る。それらは使用するのに費用がかかりおよび再生が困
難である。固体担体に固定された酵素は遊離酵素よりも
安定であり、およびそれらはまたより容易に再使用が可
能であり、それゆえヘミセルロース分解酵素の固定に対
して幾つかの方法が開発されてきている。
技術的な固定化酵素によるヘミセルロース溶液の加水
分解において一つの大きな問題は溶液の高い塩含量であ
る。イオン性の材料は担体の表層から酵素を解離する傾
向を示し、よってそのカラムはその酵素活性を速やかに
失う。
分解において一つの大きな問題は溶液の高い塩含量であ
る。イオン性の材料は担体の表層から酵素を解離する傾
向を示し、よってそのカラムはその酵素活性を速やかに
失う。
ヘミセルロース分解酵素は例えば、シリカゲル、アル
ミナまたは鋼鉄に〔オグンチメイン,G.B.（Oguntimein,
G.B.）,Proc,Annu,Biochem,Eng.Symp.1978,vol.8,p.27
−37〕，多孔質ガラスに〔ロガスキー,J.他（Rogaski,
J.et al.）,Enzyme Microb.Technol.7（1985）No.8,p.2
7−37〕，ファイバーに〔タボビロフ,I.他（Tavobilov,
I.et al.）Chemical Abstracts 104（1986） 30924n〕
またはベンゾキノンシロクロム担体〔バイセア D.他
（Balcere D.et al.）;Chmical Abstract 100（1984）9
9098f〕に固定化されてきた。シリカゲル担体の使用は
またシミズ（Shimizu）〔Biotecnology and Bioenginee
ring,29（1987）p.36−241〕およびアレンザら（Allenz
a et al.）〔Biotechnology and Bioengineering,Symp.
No.17（1986）ジョン ウィリーおよびサンズ（John Wi
ley ＆ Sons）1987〕によって提案されている。プラス
J.ら（Puls J.et al）（Trans.Tech.Sect.,Can.Pulp
Pap Assoc.3 p.64−72および米国特許4,275,159号）は
多孔性ガラスビーズ、シリカゲルビーズおよび海砂を担
体としてヘミセルラーゼおよびキシラナーゼ画分の固定
化に使用している。
ミナまたは鋼鉄に〔オグンチメイン,G.B.（Oguntimein,
G.B.）,Proc,Annu,Biochem,Eng.Symp.1978,vol.8,p.27
−37〕，多孔質ガラスに〔ロガスキー,J.他（Rogaski,
J.et al.）,Enzyme Microb.Technol.7（1985）No.8,p.2
7−37〕，ファイバーに〔タボビロフ,I.他（Tavobilov,
I.et al.）Chemical Abstracts 104（1986） 30924n〕
またはベンゾキノンシロクロム担体〔バイセア D.他
（Balcere D.et al.）;Chmical Abstract 100（1984）9
9098f〕に固定化されてきた。シリカゲル担体の使用は
またシミズ（Shimizu）〔Biotecnology and Bioenginee
ring,29（1987）p.36−241〕およびアレンザら（Allenz
a et al.）〔Biotechnology and Bioengineering,Symp.
No.17（1986）ジョン ウィリーおよびサンズ（John Wi
ley ＆ Sons）1987〕によって提案されている。プラス
J.ら（Puls J.et al）（Trans.Tech.Sect.,Can.Pulp
Pap Assoc.3 p.64−72および米国特許4,275,159号）は
多孔性ガラスビーズ、シリカゲルビーズおよび海砂を担
体としてヘミセルラーゼおよびキシラナーゼ画分の固定
化に使用している。
すべてのこれらの先行技術での固定化技術では、酵素
は添加剤を使用して担体上で固定され、それは担体の表
面で活性化しおよび／または担体および酵素間に共有結
合の形態をとる。上述の米国特許4,275,159号〔プラス
他（Puls et al.）〕に記述されているこの方法では主
にキシラナーゼを含有している酵素画分および主にβ−
キシロシダーゼを含有している酵素画分は、両者の場
合、固定剤としてグルタルアルデヒド、カルボジイミド
または四塩化チタンを使用した異なる担体に別々に固定
化され、ならびに結果的に２種類の酵素製剤がキシラン
の加水分解に使用される。
は添加剤を使用して担体上で固定され、それは担体の表
面で活性化しおよび／または担体および酵素間に共有結
合の形態をとる。上述の米国特許4,275,159号〔プラス
他（Puls et al.）〕に記述されているこの方法では主
にキシラナーゼを含有している酵素画分および主にβ−
キシロシダーゼを含有している酵素画分は、両者の場
合、固定剤としてグルタルアルデヒド、カルボジイミド
または四塩化チタンを使用した異なる担体に別々に固定
化され、ならびに結果的に２種類の酵素製剤がキシラン
の加水分解に使用される。
オグンティメインら（Oguntimein et al.）〔Biotech
nol.Bioeng.22（1980）p.1127−1142）はアスペルギニ
ス ニガー（Aspergillus niger）から製造された市販
の酵素製剤から精製したβ−キシロシダーゼの10種の異
なる担体への固定化を研究している。固定化を行うこと
は非常に困難であり、活性および安定性についての十分
な結果はただ四塩化チタンを用いてアルミナに固定した
酵素およびグルタルアルデヒドを用いた多孔性アルキル
アミンシリカゲルに固定された酵素のみで得られてい
る。
nol.Bioeng.22（1980）p.1127−1142）はアスペルギニ
ス ニガー（Aspergillus niger）から製造された市販
の酵素製剤から精製したβ−キシロシダーゼの10種の異
なる担体への固定化を研究している。固定化を行うこと
は非常に困難であり、活性および安定性についての十分
な結果はただ四塩化チタンを用いてアルミナに固定した
酵素およびグルタルアルデヒドを用いた多孔性アルキル
アミンシリカゲルに固定された酵素のみで得られてい
る。
ウェックストレム,L.（Weckstrm,L.）およびレイソ
ラ,M.（Leisola,M）〔Advances in Biotechnology.M.ム
ー−ヤング（Moo−Young）およびC.W.ロビンソン（C.W.
Robinson）編、Proc.6th Inter.Ferment.Symp.London C
anada July 20−25 1980,Pergamon Press 1981,p.21−2
6〕は、アスプルギルス ニガーから製造された酵素お
よび、グルタールアルデヒドを用いてフェノールホルム
アルデヒド樹脂〔デュオライト S 761（DUOLITE S 76
1）〕に固定化された酵素製剤によって亜硫酸廃液に含
まれるキシランの加水分解を研究している。コントロー
ル実験では酵素は固定剤を用いずに担体に吸着される。
実験はグルタールアルデヒドは樹脂中に吸着された酵素
活性を維持するのに必要であることを示した。グルター
ルアルデヒドで固定化さた酵素配合物の半減期は約30日
である。
ラ,M.（Leisola,M）〔Advances in Biotechnology.M.ム
ー−ヤング（Moo−Young）およびC.W.ロビンソン（C.W.
Robinson）編、Proc.6th Inter.Ferment.Symp.London C
anada July 20−25 1980,Pergamon Press 1981,p.21−2
6〕は、アスプルギルス ニガーから製造された酵素お
よび、グルタールアルデヒドを用いてフェノールホルム
アルデヒド樹脂〔デュオライト S 761（DUOLITE S 76
1）〕に固定化された酵素製剤によって亜硫酸廃液に含
まれるキシランの加水分解を研究している。コントロー
ル実験では酵素は固定剤を用いずに担体に吸着される。
実験はグルタールアルデヒドは樹脂中に吸着された酵素
活性を維持するのに必要であることを示した。グルター
ルアルデヒドで固定化さた酵素配合物の半減期は約30日
である。
酵素のような両性タンパク質はイオン交換体に吸着さ
れることが可能であることもまた周知である。この吸着
はさまざまな溶液からの精製酵素の単離に使用されてき
た。米国特許第4,168,250号はイオン交換担体に酵素を
固定化する一つの方法を示している。ヨーロッパ特許第
222838号〔デービス他（Davies et al.）1987〕から強
陽イオン交換体へのガンマグロブリンの固定は公知であ
る。
れることが可能であることもまた周知である。この吸着
はさまざまな溶液からの精製酵素の単離に使用されてき
た。米国特許第4,168,250号はイオン交換担体に酵素を
固定化する一つの方法を示している。ヨーロッパ特許第
222838号〔デービス他（Davies et al.）1987〕から強
陽イオン交換体へのガンマグロブリンの固定は公知であ
る。
ヘミセルロース分解酵素を固定する方法の先行技術の
欠点は酵素活性のレベルが常に十分に長期間に申し分な
く保持しないことである；他方、固定化において使用さ
れる固定剤よって、担体の再生は複雑すぎるため工業的
方法では適用できないことである。
欠点は酵素活性のレベルが常に十分に長期間に申し分な
く保持しないことである；他方、固定化において使用さ
れる固定剤よって、担体の再生は複雑すぎるため工業的
方法では適用できないことである。
本発明の目的は長期間の間、酵素がその活性を実質的
に劣化しないで保持するように固定化された酵素によっ
てヘミセルロース溶液を加水分解する方法を提供するこ
とである。担体は再生するのが容易であり、そしてヘミ
セルロース基質は例えばセルロース工業からの廃液およ
び蒸気分解植物材の水性抽出物のようにイオン性成分の
高いレベルを含むヘミセルロース溶液であってよい。
に劣化しないで保持するように固定化された酵素によっ
てヘミセルロース溶液を加水分解する方法を提供するこ
とである。担体は再生するのが容易であり、そしてヘミ
セルロース基質は例えばセルロース工業からの廃液およ
び蒸気分解植物材の水性抽出物のようにイオン性成分の
高いレベルを含むヘミセルロース溶液であってよい。
これら目的は本発明に従い、固定剤なしでの弱陽イオ
ン交換担体に固定されたヘミセルロース分解酵素または
酵素の混合物を使用して達成される。
ン交換担体に固定されたヘミセルロース分解酵素または
酵素の混合物を使用して達成される。
更に本発明はキシロ−オリゴマーを含んでいるヘミセ
ルロース溶液の加水分解の方法に関し、その方法は弱酸
性の範囲内の値になるようにヘミセルロースの溶液のpH
を調整すること、および該溶液を固定剤の添加をするこ
となく弱陽イオン交換担体に固定化されたヘミセルロー
ス分解酵素と接触させることを特徴している。本発明は
さらにまたこの方法に有用で弱陽イオン交換担体および
固定剤を用いずに弱陽イオン交換担体に固定されたヘミ
セルロース分解酵素または酵素の混合物からなる酵素製
剤に関する。
ルロース溶液の加水分解の方法に関し、その方法は弱酸
性の範囲内の値になるようにヘミセルロースの溶液のpH
を調整すること、および該溶液を固定剤の添加をするこ
となく弱陽イオン交換担体に固定化されたヘミセルロー
ス分解酵素と接触させることを特徴している。本発明は
さらにまたこの方法に有用で弱陽イオン交換担体および
固定剤を用いずに弱陽イオン交換担体に固定されたヘミ
セルロース分解酵素または酵素の混合物からなる酵素製
剤に関する。
本発明はヘミセルロース分解酵素、好ましくはβ−キ
シロシダーゼが、弱陽イオン交換担体にうまく固定化さ
れるという予期しない発見に基づくものである。グルタ
ールアルデヒドのような酵素固定剤の使用は必要としな
い。
シロシダーゼが、弱陽イオン交換担体にうまく固定化さ
れるという予期しない発見に基づくものである。グルタ
ールアルデヒドのような酵素固定剤の使用は必要としな
い。
本発明において使用に適する弱陽イオン交換担体はマ
クロポーラスのアクリレート樹脂であるデュオライト
C 464（DUOLITE C 464）およびポリスチレンで補強され
た凝集カルボキシメチルセルロースを包含する。
クロポーラスのアクリレート樹脂であるデュオライト
C 464（DUOLITE C 464）およびポリスチレンで補強され
た凝集カルボキシメチルセルロースを包含する。
本発明で使用されるヘミセルロース分解酵素は通常ト
ルコデルマ属の微生物の発酵によって生成されるヘミセ
ルラーゼ類に属している。この種類の最も重要なキシラ
ン分解酵素はキシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、アセ
チルエステラーゼおよびα−グルクロニダーゼである。
これらの酵素は硫酸アンモニウム沈澱法または限外ろ過
法のような公知の画分手法で酵素溶液から単離される。
微生物の発酵で使用される培養培地自体またはその溶液
から分離された酵素画分を本発明の方法に使用すること
が可能である。好ましくは、ヘミセルロース基質中に含
まれているキシランが始めにキシロ−オリゴマーに前加
水分解されている場合は、本発明の方法は歯（fungus）
トリコデルマ・ロンジブラチアタム（Trichoderma long
ibrachiatum）〔品種名トリコデルマ・リーサイ（Trich
oderma reesei）〕によって製造された酵素の混合物、
またはβ−キシロシダーゼのようなその画分を使用す
る。
ルコデルマ属の微生物の発酵によって生成されるヘミセ
ルラーゼ類に属している。この種類の最も重要なキシラ
ン分解酵素はキシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、アセ
チルエステラーゼおよびα−グルクロニダーゼである。
これらの酵素は硫酸アンモニウム沈澱法または限外ろ過
法のような公知の画分手法で酵素溶液から単離される。
微生物の発酵で使用される培養培地自体またはその溶液
から分離された酵素画分を本発明の方法に使用すること
が可能である。好ましくは、ヘミセルロース基質中に含
まれているキシランが始めにキシロ−オリゴマーに前加
水分解されている場合は、本発明の方法は歯（fungus）
トリコデルマ・ロンジブラチアタム（Trichoderma long
ibrachiatum）〔品種名トリコデルマ・リーサイ（Trich
oderma reesei）〕によって製造された酵素の混合物、
またはβ−キシロシダーゼのようなその画分を使用す
る。
固定化は単に担体と緩衝された酵素溶液との混合によ
り行われる。酵素溶液はおおよそ3.5ないし５のpH範囲
内で緩衝される。酵素溶液は十分な固定化を確実にする
ために１ないし４時間担体と接触される。加水分解がカ
ラム中で行われる場合、固定化は使用されるカラムで行
うことができる。
り行われる。酵素溶液はおおよそ3.5ないし５のpH範囲
内で緩衝される。酵素溶液は十分な固定化を確実にする
ために１ないし４時間担体と接触される。加水分解がカ
ラム中で行われる場合、固定化は使用されるカラムで行
うことができる。
得られた酵素製剤は高イオン濃度においてさえも非常
に安定である。これは、塩溶液によって担体から酵素が
溶離される先行技術からは非常に予期できないものであ
り；本発明の酵素製剤では、しかしこれらはこの方法で
分離され得なかった。
に安定である。これは、塩溶液によって担体から酵素が
溶離される先行技術からは非常に予期できないものであ
り；本発明の酵素製剤では、しかしこれらはこの方法で
分離され得なかった。
加水分解に使用された固定化酵素が活性を失った後、
使用したカラムは再生される。好ましくは希水酸化ナト
リウム溶液で、消耗した酵素を洗い去る。吸着した不純
物ならびに消耗した酵素は洗浄で除去される。次に担体
をその弱酸によった元の帯電状態に回復させそして最後
に水で洗浄する。その後カラムは新たな酵素液が装填さ
れる。
使用したカラムは再生される。好ましくは希水酸化ナト
リウム溶液で、消耗した酵素を洗い去る。吸着した不純
物ならびに消耗した酵素は洗浄で除去される。次に担体
をその弱酸によった元の帯電状態に回復させそして最後
に水で洗浄する。その後カラムは新たな酵素液が装填さ
れる。
所望ならば担体をより効果的な技術で洗浄することが
できる。ポリマー性の担体は化学的に安定であり、高温
で強い化学物質で洗浄されうる。殆どの場合では水酸化
ナトリウムでの１回洗浄が担体の回復に十分である。
できる。ポリマー性の担体は化学的に安定であり、高温
で強い化学物質で洗浄されうる。殆どの場合では水酸化
ナトリウムでの１回洗浄が担体の回復に十分である。
本発明による固定化酵素製造を使用した場合、担体を
数度再生できる。例えば、６回再生した後にもカラムの
特性に、顕著な変化は見られなかった。方法の経済性と
しては、担体材料は高価なため、再生は主な利点であ
る。本発明の方法においては、固定剤を使用しないため
再生は容易に行われる。
数度再生できる。例えば、６回再生した後にもカラムの
特性に、顕著な変化は見られなかった。方法の経済性と
しては、担体材料は高価なため、再生は主な利点であ
る。本発明の方法においては、固定剤を使用しないため
再生は容易に行われる。
本発明の加水分解工程は蒸気分解植物材およびセルロ
ース工業の廃液からのキシロース製造によく適合する。
個々の精製酵素画分が酵素の混合液の代わりに使用され
る場合、個々の固定化酵素は連続的なカラム中で使用で
き、または基質はオリゴ糖の分子量を減らすため、部分
的に遊離の酵素混合物で前加水分解されることも可能で
ある。例えばキシラナーゼおよびエステラーゼで酵素的
に前加水分解された蒸気分解カンバ材抽出物の加水分解
において固定化β−キシロシダーゼを、使用する場合、
優れた結果が得られる。
ース工業の廃液からのキシロース製造によく適合する。
個々の精製酵素画分が酵素の混合液の代わりに使用され
る場合、個々の固定化酵素は連続的なカラム中で使用で
き、または基質はオリゴ糖の分子量を減らすため、部分
的に遊離の酵素混合物で前加水分解されることも可能で
ある。例えばキシラナーゼおよびエステラーゼで酵素的
に前加水分解された蒸気分解カンバ材抽出物の加水分解
において固定化β−キシロシダーゼを、使用する場合、
優れた結果が得られる。
以下に続くのは本発明を実施例によってより詳細に説
明しようとするものである。
明しようとするものである。
得られる酵素活性は以下のように分析評価される〔ポ
ータンネン,K.およびプラス,J.トリコデルマ・リーサイ
β−キシロシダーゼの特徴および可溶性キシランの加水
分解へのそれの使用（Poutanen,K.and Puls,J.,Charact
eristics of Tricoderma reesei β−xylosidase and i
ts use in the hydorlysis of solubilized xylans）、
Applied Microbiology and Biotechnology 1988;再版47
刊（Publication 47）、テクニカル リサーチ センタ
ー オブ フィンランド（Technical Research Centre
of Finland），エスポー（Espoo）1988,付 ４〕： β−キシロシダーゼ活性は基質として5mM p−ニトロ
フェニル−β−Ｄ−キシロピラノシド（PNPX,シグマ（S
ygma N−2132）、0.05Mクエン酸リン酸緩衝液、pH 4.5
を使用して分析評価される。酵素試料200μｌを基質1.8
mlと50℃で10分間インキュベートする。反応を1M炭酸水
素ナトリウム1mlを加えて停止し、遊離したｐ−ニトロ
フェニルを400nmで測定する。活性はカタールで表現さ
れる。
ータンネン,K.およびプラス,J.トリコデルマ・リーサイ
β−キシロシダーゼの特徴および可溶性キシランの加水
分解へのそれの使用（Poutanen,K.and Puls,J.,Charact
eristics of Tricoderma reesei β−xylosidase and i
ts use in the hydorlysis of solubilized xylans）、
Applied Microbiology and Biotechnology 1988;再版47
刊（Publication 47）、テクニカル リサーチ センタ
ー オブ フィンランド（Technical Research Centre
of Finland），エスポー（Espoo）1988,付 ４〕： β−キシロシダーゼ活性は基質として5mM p−ニトロ
フェニル−β−Ｄ−キシロピラノシド（PNPX,シグマ（S
ygma N−2132）、0.05Mクエン酸リン酸緩衝液、pH 4.5
を使用して分析評価される。酵素試料200μｌを基質1.8
mlと50℃で10分間インキュベートする。反応を1M炭酸水
素ナトリウム1mlを加えて停止し、遊離したｐ−ニトロ
フェニルを400nmで測定する。活性はカタールで表現さ
れる。
キシラナーゼ活性は基質として１％ブナ材キシラン
〔エブリンゲロヴァ他（Ebringerova et al.）,Holzfor
schung 21（1967）p.74−77の方法により調整されたも
の〕を使用して分析評価される。pH5.3の0.05Mクエン酸
−リン酸緩衝液に粉砕されたキシランをホモジナイズし
および温めることによって懸濁する。酵素試料（0.2m
l）を基質溶液1.8mlと50℃で５分間インキュベートす
る。形成された還元糖をDNS−試薬〔サムナー,J.B.およ
びソマーズ,G.F.,グルコース用のジニトロサリチル法
（Sumner,J.b.and somers,G.F.,Dinitorsalisylic meth
od for glucose.）ラボラトリー エクスパーリメンツ
イン バイオロジカル ケミストリー（Laboratory e
xperiments in biological chemistry）．アカデミック
出版，ニューヨーク1949年、P38−39〕、を加え、５分
間煮沸し、冷却しそして540nmで吸光度を測定して評価
する。対照となる糖はキシロースを使用しそして活性を
カタールで表す。
〔エブリンゲロヴァ他（Ebringerova et al.）,Holzfor
schung 21（1967）p.74−77の方法により調整されたも
の〕を使用して分析評価される。pH5.3の0.05Mクエン酸
−リン酸緩衝液に粉砕されたキシランをホモジナイズし
および温めることによって懸濁する。酵素試料（0.2m
l）を基質溶液1.8mlと50℃で５分間インキュベートす
る。形成された還元糖をDNS−試薬〔サムナー,J.B.およ
びソマーズ,G.F.,グルコース用のジニトロサリチル法
（Sumner,J.b.and somers,G.F.,Dinitorsalisylic meth
od for glucose.）ラボラトリー エクスパーリメンツ
イン バイオロジカル ケミストリー（Laboratory e
xperiments in biological chemistry）．アカデミック
出版，ニューヨーク1949年、P38−39〕、を加え、５分
間煮沸し、冷却しそして540nmで吸光度を測定して評価
する。対照となる糖はキシロースを使用しそして活性を
カタールで表す。
アセチルエステラーゼは基質として1mM α−ナフチル
アセテート0.05Mクエン酸緩衝液溶液、pH5.3を使用して
分析評価する。基質を始めにエタノールの少量に溶解す
る。酵素試料0.2mlを基質溶液1.8mlと共に50℃で10分間
インキュベートし、その後、pH4.3の20％トゥイーン20
（Tween 20）を含有している1M酢酸緩衝液に溶解した0.
01％ファスト コーリンス Ｖ 塩（Fast Corinth V S
alt）1mlを添加する。10分後535nmにおける吸光度を読
み取る。活性をカタールで表す。
アセテート0.05Mクエン酸緩衝液溶液、pH5.3を使用して
分析評価する。基質を始めにエタノールの少量に溶解す
る。酵素試料0.2mlを基質溶液1.8mlと共に50℃で10分間
インキュベートし、その後、pH4.3の20％トゥイーン20
（Tween 20）を含有している1M酢酸緩衝液に溶解した0.
01％ファスト コーリンス Ｖ 塩（Fast Corinth V S
alt）1mlを添加する。10分後535nmにおける吸光度を読
み取る。活性をカタールで表す。
本発明の加水分解方法のために固定されるべき適当な
酵素は酵素製剤、登録商標マルチフェクト Ｋ（Multif
ect K）、カマター（Cultor）社製でキシラナーゼ活性8
4000nkat/mlを含有する。
酵素は酵素製剤、登録商標マルチフェクト Ｋ（Multif
ect K）、カマター（Cultor）社製でキシラナーゼ活性8
4000nkat/mlを含有する。
以下に続く担体材料は当実施例で使用される： 登録商標スペザイム GCD（Spezyme GCD）；カルター
社製 凝集ジエチルアミノエチルセルロース陰イオン交
換樹脂、本実施例ではDEAEと略す； ポリスチレンで補強された凝集カルボキシメチルセル
ロース、弱陽イオン交換樹脂、本実施例ではCMCと略
す； 登録商標デュオライト S 761（DUOLITE S 761）；デ
ュオライトインターナショナル（Duolite Internationa
l）社製、ロームアンドハース（Rohm ＆ Haas）社；吸
着樹脂、本実施例ではDOULadsと略す； 登録商標デュオライト ES 562（DUOLITE ES 562）；
デュオライトインターナショナル社製、ロームアンドハ
ース社；陰イオン交換樹脂、本実施例ではDOULaniと略
す； 登録商標デュオライト C 464（DUOLITE C 464）；デ
ュオライトインターナショナル社製、ロームアンドハー
ス社；弱陽イオン交換樹脂、本実施例ではDOULcatと略
す； 登録商標ジアトマセラス アース スタンダード ス
ーパー セル（Diatomaceous Earth Standard Super Ce
ll）；ジョーンズ−マンヴィル（Johns−Manville）社
製； 粒状活性炭、ケムビロン CPG（Chemviron CPG）社
製。
社製 凝集ジエチルアミノエチルセルロース陰イオン交
換樹脂、本実施例ではDEAEと略す； ポリスチレンで補強された凝集カルボキシメチルセル
ロース、弱陽イオン交換樹脂、本実施例ではCMCと略
す； 登録商標デュオライト S 761（DUOLITE S 761）；デ
ュオライトインターナショナル（Duolite Internationa
l）社製、ロームアンドハース（Rohm ＆ Haas）社；吸
着樹脂、本実施例ではDOULadsと略す； 登録商標デュオライト ES 562（DUOLITE ES 562）；
デュオライトインターナショナル社製、ロームアンドハ
ース社；陰イオン交換樹脂、本実施例ではDOULaniと略
す； 登録商標デュオライト C 464（DUOLITE C 464）；デ
ュオライトインターナショナル社製、ロームアンドハー
ス社；弱陽イオン交換樹脂、本実施例ではDOULcatと略
す； 登録商標ジアトマセラス アース スタンダード ス
ーパー セル（Diatomaceous Earth Standard Super Ce
ll）；ジョーンズ−マンヴィル（Johns−Manville）社
製； 粒状活性炭、ケムビロン CPG（Chemviron CPG）社
製。
CMC担体の製造 ポリスチレンで補強された凝集カルボキシメチルセル
ロース担体は米国特許第3,823,133号および4,168,250号
に示されているように製造できる。押出機中でポリマ
ー、精製繊維状セルロース、充填剤（例えば金属酸化物
またはケイ酸塩）および潤滑剤（例えばステアリン酸マ
グネシウム、ステアリン酸アルミニウム、または適当な
油）を混合し、そして混合物を加熱して可塑状態にす
る。混合物を次に押出し、そして冷却した製品を粉砕し
そして平均粒子サイズ100ないし1000μｍ、好ましくは3
50ないし850μｍの範囲になるよう篩をかける。カルボ
キシメチル誘導体を得られたポリスチレンで補強された
凝集製品からクロロ酢酸により誘導し、硫酸ナトリウム
を使用して反応混合物における水活性を減少させる。製
造した製品のイオン交換容量は0.1ないし0.2mequiv/gで
ある。
ロース担体は米国特許第3,823,133号および4,168,250号
に示されているように製造できる。押出機中でポリマ
ー、精製繊維状セルロース、充填剤（例えば金属酸化物
またはケイ酸塩）および潤滑剤（例えばステアリン酸マ
グネシウム、ステアリン酸アルミニウム、または適当な
油）を混合し、そして混合物を加熱して可塑状態にす
る。混合物を次に押出し、そして冷却した製品を粉砕し
そして平均粒子サイズ100ないし1000μｍ、好ましくは3
50ないし850μｍの範囲になるよう篩をかける。カルボ
キシメチル誘導体を得られたポリスチレンで補強された
凝集製品からクロロ酢酸により誘導し、硫酸ナトリウム
を使用して反応混合物における水活性を減少させる。製
造した製品のイオン交換容量は0.1ないし0.2mequiv/gで
ある。
カルボキシメチル化を以下に示す実施例によって説明
する。
する。
硫酸ナトリウム150gを水335mlに40℃で溶解する。50
％NaOH溶液85gを添加する。ポリスチレンで補強された
および350ないし850μｍの粒子サイズをもつ凝集セルロ
ース樹脂150gを得られたアルカリ溶液に懸濁し、懸濁液
を70℃に加熱する。50％クロロ酢酸水溶液75gを１時間
かけてゆっくり加え、続いて50％NaOH65gを加え、およ
び最後に別の50％クロロ酢酸75gもまた１時間かけて添
加する。懸濁液を次に70℃でさらに30分間保ちそして次
に40度に冷却する。スラリーを1M硫酸150mlでpH6.5まで
中和し、上澄みが透明になり、細かい粒子がなくなるま
で水を傾瀉する。生成物を85℃で水で洗浄して可溶性残
渣が溶解するように１夜置き、再度傾瀉し、溢れさせ
る。得られた生成品のイオン交換容量は0.16mequiv/gで
ある。
％NaOH溶液85gを添加する。ポリスチレンで補強された
および350ないし850μｍの粒子サイズをもつ凝集セルロ
ース樹脂150gを得られたアルカリ溶液に懸濁し、懸濁液
を70℃に加熱する。50％クロロ酢酸水溶液75gを１時間
かけてゆっくり加え、続いて50％NaOH65gを加え、およ
び最後に別の50％クロロ酢酸75gもまた１時間かけて添
加する。懸濁液を次に70℃でさらに30分間保ちそして次
に40度に冷却する。スラリーを1M硫酸150mlでpH6.5まで
中和し、上澄みが透明になり、細かい粒子がなくなるま
で水を傾瀉する。生成物を85℃で水で洗浄して可溶性残
渣が溶解するように１夜置き、再度傾瀉し、溢れさせ
る。得られた生成品のイオン交換容量は0.16mequiv/gで
ある。
実施例１ トリコデルマ・ロンジブラチアタム（Trichoderma lo
ngibrachiatum）〔品種名トリコデルマ・リーサイ（Tri
choderma reesei）〕培地からの酵素溶液を本発明に従
って使用される弱陽イオン交換樹脂である２種類の異な
る担体（CMCおよびDUOLcat）に固定化する。使用する酵
素溶液の活性は以下の通りである： キシラナーゼ 13865nkat/ml β−キシロシダーゼ 4200nkat/ml エステラーゼ 720nkat/ml 固定化は以下の２つの組成物を使用して行われた。
ngibrachiatum）〔品種名トリコデルマ・リーサイ（Tri
choderma reesei）〕培地からの酵素溶液を本発明に従
って使用される弱陽イオン交換樹脂である２種類の異な
る担体（CMCおよびDUOLcat）に固定化する。使用する酵
素溶液の活性は以下の通りである： キシラナーゼ 13865nkat/ml β−キシロシダーゼ 4200nkat/ml エステラーゼ 720nkat/ml 固定化は以下の２つの組成物を使用して行われた。
1.20g 担体材料 96ml 0.05M クエン酸ナトリウム 緩衝液（pH5.0） 4ml 酵素溶液 2.20g 担体材料 92ml 0.05M クエン酸ナトリウム 緩衝液（pH5.0） 8ml 酵素溶液 担体材料を酵素溶液と＋４℃で４時間にわかり混合す
る。次に混合物をろ過し、および結合酵素の活性を測定
する。
る。次に混合物をろ過し、および結合酵素の活性を測定
する。
比較のため酵素を幾つかの実験においてグルタールア
ルデヒド（2.5％溶液80ml）に１時間攪拌することによ
り固定する。残留アルデヒドを0.05Mのクエン酸ナトリ
ウム緩衝液約２リットルで洗い流す。グルタールアルデ
ヒドに固定の後再度酵素活性を測定する。
ルデヒド（2.5％溶液80ml）に１時間攪拌することによ
り固定する。残留アルデヒドを0.05Mのクエン酸ナトリ
ウム緩衝液約２リットルで洗い流す。グルタールアルデ
ヒドに固定の後再度酵素活性を測定する。
これらの固定化試験からの結果を以下の表１ないし３
に示す。全ての実験においては酵素活性はグルタールア
ルデヒドによる固定化の前（表中「結合型」）および後
（表中「固定型」）に測定する。
に示す。全ての実験においては酵素活性はグルタールア
ルデヒドによる固定化の前（表中「結合型」）および後
（表中「固定型」）に測定する。
表１ないし３から見られるように、すべての酵素は弱
陽イオン交換樹脂に吸着され（CMCおよびDUOLcat）、お
よび固定化生成品は高い全活性を持つ。グルタールアル
デヒドを用いた固定はこの系を改良しない。
陽イオン交換樹脂に吸着され（CMCおよびDUOLcat）、お
よび固定化生成品は高い全活性を持つ。グルタールアル
デヒドを用いた固定はこの系を改良しない。
実施例２ 固定化酵素の加水分解効果をカラム実験において試験
する。カラム実験は４本の実験室規模カラムにおいて行
う。カラムのサイズは50mlまたは100mlである。酵素は
４時間酵素溶液中に担体を浸漬することによりカラム上
に固定化される。担体を次にクエン酸緩衝液溶液で洗浄
する。50mlカラムを他の処理を行わずに固定化酵素／担
体配合物で満たす。100mlカラムには比較として、酵素
の固定のためグルタールアルデヒド（GA）を用いて処理
（１時間）した酵素／担体配合物で満たす。
する。カラム実験は４本の実験室規模カラムにおいて行
う。カラムのサイズは50mlまたは100mlである。酵素は
４時間酵素溶液中に担体を浸漬することによりカラム上
に固定化される。担体を次にクエン酸緩衝液溶液で洗浄
する。50mlカラムを他の処理を行わずに固定化酵素／担
体配合物で満たす。100mlカラムには比較として、酵素
の固定のためグルタールアルデヒド（GA）を用いて処理
（１時間）した酵素／担体配合物で満たす。
固定化で使用された酵素溶液の分析： β−キシロシダーゼ 552nkat/ml キシラナーゼ 25000nkat/ml エステラーゼ 240nkat/ml 固定化： 50ml 酵素溶液 350ml 0.05Mクエン酸 緩衝液 pH ５ 100g 担体 結果得られる固定化系の特徴は以下の表４で明らかに
なる。
なる。
連続的な加水分解のため、蒸気の酵素配合物を使用し
て以下のカラムを調整した。
て以下のカラムを調整した。
1.100mlカラムを乾燥酵素/CMC担体組成物19.9gで満た
す。グルタールアルデヒドを用いて固定した後の活性は
以下のとおりである。
す。グルタールアルデヒドを用いて固定した後の活性は
以下のとおりである。
β−キシロシダーゼ 300nkat/g キシラナーゼ 3180nkat/g エステラーゼ 137nkat/g 2.100mlカラムを乾燥酵素／デュオライト組成物26.3g
で満たす。グルタールアルデヒドを用いて固定した後の
活性は以下のとおりである。
で満たす。グルタールアルデヒドを用いて固定した後の
活性は以下のとおりである。
β−キシロシダーゼ 250nkat/g キシラナーゼ 2413nkat/g エステラーゼ 75nkat/g 3.50mlカラムを乾燥酵素/CMC担体組成物12.5gで満た
す。固定化は行われない。活性は以下のとおりである。
す。固定化は行われない。活性は以下のとおりである。
β−キシロシダーゼ 346nkat/g キシラナーゼ 2970nkat/g エステラーゼ 126nkat/g 4.50mlカラムを乾燥酵素／デュオライト担体組成物1
2.5gで満たす。固定化は行われない。活性は以下のとお
りである。
2.5gで満たす。固定化は行われない。活性は以下のとお
りである。
β−キシロシダーゼ 236nkat/g キシラナーゼ 3272nkat/g エステラーゼ 68nkat/g 加水分解される基質はキシロース11g/lおよびキシラ
ンオリゴマー23g/lを含有する蒸気分解カンバ材抽出物
（蒸気分解条件210℃、４分間）である。溶液の総乾物
含量は70g/lであり、およびpHは５に調整する。ろ過さ
れた溶液を各々のカラムの底に送り込みそしてカラム１
ないし４内でのその流量はそれぞれ14.4ml/h、15.0ml/
h、6.9ml/hおよひ6.8ml/hである。温度は45℃にする。
溶離液中のキシロースを２日、４日および７日後測定す
る。結果を以下の表５に示す。
ンオリゴマー23g/lを含有する蒸気分解カンバ材抽出物
（蒸気分解条件210℃、４分間）である。溶液の総乾物
含量は70g/lであり、およびpHは５に調整する。ろ過さ
れた溶液を各々のカラムの底に送り込みそしてカラム１
ないし４内でのその流量はそれぞれ14.4ml/h、15.0ml/
h、6.9ml/hおよひ6.8ml/hである。温度は45℃にする。
溶離液中のキシロースを２日、４日および７日後測定す
る。結果を以下の表５に示す。
結果はカラム活性が７日の実験の間は顕著な劣化の無
いことを示す。グルタールアルデヒドを用いた固定はカ
ラム安定性に影響を示さない。
いことを示す。グルタールアルデヒドを用いた固定はカ
ラム安定性に影響を示さない。
実施例３ 固定化酵素を蒸気分解カンバ材からのヘミセルロース
溶液の加水分解で実験する。
溶液の加水分解で実験する。
固定化は、温度が22℃であること、グルタールアルデ
ヒドを用いた固定が行われない他は実施例１で記載され
たのと同様に行う。
ヒドを用いた固定が行われない他は実施例１で記載され
たのと同様に行う。
担体： 1.セルロース−ベースのCMC担体；粒子サイズ350ないし
850μm;イオン交換容量0.15mequiv/ml;密度0.25ないし
0.38g/ml。
850μm;イオン交換容量0.15mequiv/ml;密度0.25ないし
0.38g/ml。
2.デュオライト C 464;pH3.8;含水量57ないし62％；密
度0.75g/ml。
度0.75g/ml。
酵素溶液： β−キシロシダーゼ 5400nkat/ml エステラーゼ 400nkat/ml キシラナーゼ 99100nkat/ml 固定化： 1.50ml 酵素溶液 25ml 0.05M クエン酸緩衝液 pH5 37.5g CMC担体 2.50ml 酵素溶液 25ml 0.05M クエン酸緩衝液 pH5 37.5g デュオライト Ｃ 464担体 各々の実験に対しカラムを固定化酵素で満たし、カン
バ材加水分解物をカラムを通して送り込む。加水分解物
の濃度は9.0重量％およびpH5である。組成物はキシロー
ス10g/lおよびオリゴマー32g/lを含有する。温度は45℃
である。カラムを通して溶液はゆっくり送り込まれ。そ
のため総加水分解時間は４時間である。固定化された酵
素の不活性化の可能性の検査のためカラム実験を26日間
継続し、溶液におけるキシロース濃度を測定する。理論
的キシロース収量は乾物に基づき55％である。
バ材加水分解物をカラムを通して送り込む。加水分解物
の濃度は9.0重量％およびpH5である。組成物はキシロー
ス10g/lおよびオリゴマー32g/lを含有する。温度は45℃
である。カラムを通して溶液はゆっくり送り込まれ。そ
のため総加水分解時間は４時間である。固定化された酵
素の不活性化の可能性の検査のためカラム実験を26日間
継続し、溶液におけるキシロース濃度を測定する。理論
的キシロース収量は乾物に基づき55％である。
結果を以下の表６に示す。
交換率は非常に高く、理論値（遊離酵素を用いて55
％）に近い。際立った不活性化は実験期間では見られな
かった。
％）に近い。際立った不活性化は実験期間では見られな
かった。
担体はアルカリ溶液による失活した酵素の洗い流し、
酸による活性化、水による洗浄および新たな酵素をカラ
ムに供給することにより再生される。酵素は担体に固定
化されおよび工程は継続可能である。
酸による活性化、水による洗浄および新たな酵素をカラ
ムに供給することにより再生される。酵素は担体に固定
化されおよび工程は継続可能である。
実施例４ 固定化酵素による加水分解を２種のキシロ−オリゴマ
ー溶液で行う：溶液１はカンバ材加水分解物のクロマト
グラフィーによる分離物から得られ、溶液２は遊離の
（固定化されてない）酵素による前加水分解を施された
蒸気分解カンバ材抽出物である。前加水分解以前におい
ては溶液の組成は以下に示す通りである。
ー溶液で行う：溶液１はカンバ材加水分解物のクロマト
グラフィーによる分離物から得られ、溶液２は遊離の
（固定化されてない）酵素による前加水分解を施された
蒸気分解カンバ材抽出物である。前加水分解以前におい
ては溶液の組成は以下に示す通りである。
溶液２はポリマーの大きさを減少させるため遊離（固
定化されてない）酵素による前加水分解がなされる。続
いて行う固定化と同様の酵素溶液が使用される；前加水
分解温度は40℃でおよびpH5である。基質1gあたり酵素
溶液0.015mlを加える。前加水分解の後、溶液をろ過す
る。得られた前加水分解溶液２はキシロース30g/lを含
有する。
定化されてない）酵素による前加水分解がなされる。続
いて行う固定化と同様の酵素溶液が使用される；前加水
分解温度は40℃でおよびpH5である。基質1gあたり酵素
溶液0.015mlを加える。前加水分解の後、溶液をろ過す
る。得られた前加水分解溶液２はキシロース30g/lを含
有する。
トリコデルマによる発酵によって得られたヘミセルラ
ーゼ酵素はpH5のクエン酸緩衝液中、室温（＝20ないし2
4℃）で４時間混合することにより、弱陽イオン交換樹
脂（デュオライト C 464）に固定化される。
ーゼ酵素はpH5のクエン酸緩衝液中、室温（＝20ないし2
4℃）で４時間混合することにより、弱陽イオン交換樹
脂（デュオライト C 464）に固定化される。
酵素活性を測定する： キシラナーゼ 47000nkat/g エステラーゼ 174nkat/g β−キシロシダーゼ 1200nkat/g β−キシロシダーゼ固定化収量は100％、キシラナー
ゼ収量76％およびエステラーゼ収量70％であった。
ゼ収量76％およびエステラーゼ収量70％であった。
加水分解はカラム中、以下に示す条件の下での連続工程
として行われる： カラム容積 10ml 流量 １カラム容積/h 温度 45℃ カラムを15日間使用した場合の結果： 15日間の実験においてはカラムの深刻な劣化または消
耗はなかった。再生を試験する目的でカラムを水酸化ナ
トリウムで洗浄し、酸で活性化し、水で洗浄し、新たな
酵素を入れる。
として行われる： カラム容積 10ml 流量 １カラム容積/h 温度 45℃ カラムを15日間使用した場合の結果： 15日間の実験においてはカラムの深刻な劣化または消
耗はなかった。再生を試験する目的でカラムを水酸化ナ
トリウムで洗浄し、酸で活性化し、水で洗浄し、新たな
酵素を入れる。
実施例５ デュオライト C 464およびCMC担体を再生実験で使用
する。
する。
担体をカラム中で0.5M水酸化ナトリウム（４カラム容
量）を使用して50℃で洗浄する。次に担体を0.5M硫酸で
回復し、水で濯ぎおよびクエン酸緩衝液でpH5に緩衝す
る。
量）を使用して50℃で洗浄する。次に担体を0.5M硫酸で
回復し、水で濯ぎおよびクエン酸緩衝液でpH5に緩衝す
る。
新しい酵素をカラムに加えそして固定化する（固定剤
は使用しない）。100カラム容量の蒸気分解カンバ材抽
出物をカラムに送り込む。
は使用しない）。100カラム容量の蒸気分解カンバ材抽
出物をカラムに送り込む。
この一巡を６回繰り返す。結果を以下の表７に示す。
結果よりβ−キシロシダーゼのデュオライト担体への
結合は２種の他の酵素の結合が僅かに劣化したのにも係
わらず殆ど変化なく残存することが結果から明らかであ
る。CMC担体の再生は完全には成功ではないが全ての酵
素の結合はある程度までは劣化する。実験は、吸着力に
おいて著しい減少なく固定化を同じ担体で数回繰り返す
ことが可能であることを示した。
結合は２種の他の酵素の結合が僅かに劣化したのにも係
わらず殆ど変化なく残存することが結果から明らかであ
る。CMC担体の再生は完全には成功ではないが全ての酵
素の結合はある程度までは劣化する。実験は、吸着力に
おいて著しい減少なく固定化を同じ担体で数回繰り返す
ことが可能であることを示した。
実施例６ 実験は個々のヘミケルラーゼ酵素の結合、弱陽イオン
交換担体にあるβ−キシロシダーゼおよびそのキシロ−
オリゴマー加水分解能力の研究のため行われた。
交換担体にあるβ−キシロシダーゼおよびそのキシロ−
オリゴマー加水分解能力の研究のため行われた。
トリコデルマ・ロンジブラチアタムによって製造さ
れ、 以下の活性を持つ酵素溶液： キシラナーゼ 200000nkat/ml アセチルエステラーゼ 1000nkat/ml β−キシロシダーゼ 4200nkat/ml を溶液に基づき20重量％の硫酸アンモニウムを添加し、
軽く掻き混ぜそして＋４℃で24時間放置しておくことに
よって、２つの画分（ＡおよびＢ）に分離する。画分を
５分間、2000rpmの遠心分離により分離する。β−キシ
ロシダーゼは54％の収量でもって画分Ａ中に濃厚化さ
れ、得られた純度は3.3倍である。この画分における他
のキシラン分解酵素の量は非常に少ない（表８参照）。
β−キシロシダーゼはMP10,000の分離範囲を持つ、Ａ
アミコンウルトラフィルターPM10（A Amicon ultra fil
ter PM 10）を用いた塩含有量４％までの溶液Ａの限外
ろ過（UF）によってさらに精製される。塩の除去はさら
にβ−キシロシダーゼの純化程度を増加することを包含
する（表８参照）。
れ、 以下の活性を持つ酵素溶液： キシラナーゼ 200000nkat/ml アセチルエステラーゼ 1000nkat/ml β−キシロシダーゼ 4200nkat/ml を溶液に基づき20重量％の硫酸アンモニウムを添加し、
軽く掻き混ぜそして＋４℃で24時間放置しておくことに
よって、２つの画分（ＡおよびＢ）に分離する。画分を
５分間、2000rpmの遠心分離により分離する。β−キシ
ロシダーゼは54％の収量でもって画分Ａ中に濃厚化さ
れ、得られた純度は3.3倍である。この画分における他
のキシラン分解酵素の量は非常に少ない（表８参照）。
β−キシロシダーゼはMP10,000の分離範囲を持つ、Ａ
アミコンウルトラフィルターPM10（A Amicon ultra fil
ter PM 10）を用いた塩含有量４％までの溶液Ａの限外
ろ過（UF）によってさらに精製される。塩の除去はさら
にβ−キシロシダーゼの純化程度を増加することを包含
する（表８参照）。
１時間、25℃およびpH3.7で混合した。限外ろ過した
画分Ａ（β−キシロシダーゼ 4600nkat/ml）60mlおよ
び樹脂20mlを使用して、β−キシロシダーゼをデュオラ
イト C 464に固定化する。洗浄した後、樹脂は結合β
−キシロシダーゼ11000nkat/mlを含有する。
画分Ａ（β−キシロシダーゼ 4600nkat/ml）60mlおよ
び樹脂20mlを使用して、β−キシロシダーゼをデュオラ
イト C 464に固定化する。洗浄した後、樹脂は結合β
−キシロシダーゼ11000nkat/mlを含有する。
そこで固定されたβ−キシロシダーゼを酵素的にキシ
ランおよびアセチル側鎖を切断するために前加水分解さ
れた蒸気分解カンバ材抽出物からのキシロ−オリゴマー
の加水分解に使用する。前加水分解においては乾物1gあ
たりの酵素量は：キシラナーゼ1280nkat、β−キシロシ
ダーゼ25nkatおよびアセチルエステラーゼ7nkatであ
り；加水分解期間は24時間、pH5および温度45℃であ
る。前加水分解において使用される抽出物の組成物は： 乾物、％ 10 pH 4.3 導電率、mS/cm ７ 炭水化物 キシロース溶液に基づく重量％ 1.3 グルコース溶液に基づく重量％ 0.1 オリゴ糖 溶液に基づく重量％ 4.5 前加水分解された抽出物を担体を介して以下の条件で
送り込む。
ランおよびアセチル側鎖を切断するために前加水分解さ
れた蒸気分解カンバ材抽出物からのキシロ−オリゴマー
の加水分解に使用する。前加水分解においては乾物1gあ
たりの酵素量は：キシラナーゼ1280nkat、β−キシロシ
ダーゼ25nkatおよびアセチルエステラーゼ7nkatであ
り；加水分解期間は24時間、pH5および温度45℃であ
る。前加水分解において使用される抽出物の組成物は： 乾物、％ 10 pH 4.3 導電率、mS/cm ７ 炭水化物 キシロース溶液に基づく重量％ 1.3 グルコース溶液に基づく重量％ 0.1 オリゴ糖 溶液に基づく重量％ 4.5 前加水分解された抽出物を担体を介して以下の条件で
送り込む。
カラム容量 10ml 流量 ２カラム量/h 温度 45℃ pH 4.3 固定化酵素による加水分解を30日間の連続工程で続け
る、その後溶液をそのキシロースおよびオリゴ糖量につ
いて分析評価する。結果を以下に示す： 観察期間（30日）中のキシロース収量の減少は最初の
値に比べ単に５％であった。
る、その後溶液をそのキシロースおよびオリゴ糖量につ
いて分析評価する。結果を以下に示す： 観察期間（30日）中のキシロース収量の減少は最初の
値に比べ単に５％であった。
実施例７ 固定化ヘミセルラーゼをポーランドのセルローザ ス
ウィーシー（Celuloza Swiecie）社から得られる副産物
からのブナ材前加水分解物に含まれるキシロ−オリゴマ
ーの加水分解で試験する。ブナ材前加水分解物のキシロ
−オリゴマーは、固定化ヘミセルラーゼを用いた加水分
解前にクロマトグラフィー分離によって純化し、および
その組成は以下のとおりである。
ウィーシー（Celuloza Swiecie）社から得られる副産物
からのブナ材前加水分解物に含まれるキシロ−オリゴマ
ーの加水分解で試験する。ブナ材前加水分解物のキシロ
−オリゴマーは、固定化ヘミセルラーゼを用いた加水分
解前にクロマトグラフィー分離によって純化し、および
その組成は以下のとおりである。
固定化は実施例６において記述したヘミセルラーゼ製
剤で行われる。固定化においてはヘミセルラーゼは0.5m
l/gデュオライトC464担体で使用され、および結合は25
℃、pH4.5における４時間の攪拌によって行われる。デ
ュオライト C464への結合量は キシラナーゼ 78960nkat/原重量に基づく樹脂ｇ β−キシロシダーゼ 2050nkat/原重量に基づく樹脂ｇ アセチルエステラーゼ 250nkat/原重量に基づく樹脂ｇ ブナ材前加水分解物は下記の条件下で連続的なカラムの
操作で加水分解される： カラム容量 10ml 流量 ２カラム量/h pH 5.5 温度 40℃ 以下に示すキシロース収量はカラム操作の実施中に得ら
れたものである：
剤で行われる。固定化においてはヘミセルラーゼは0.5m
l/gデュオライトC464担体で使用され、および結合は25
℃、pH4.5における４時間の攪拌によって行われる。デ
ュオライト C464への結合量は キシラナーゼ 78960nkat/原重量に基づく樹脂ｇ β−キシロシダーゼ 2050nkat/原重量に基づく樹脂ｇ アセチルエステラーゼ 250nkat/原重量に基づく樹脂ｇ ブナ材前加水分解物は下記の条件下で連続的なカラムの
操作で加水分解される： カラム容量 10ml 流量 ２カラム量/h pH 5.5 温度 40℃ 以下に示すキシロース収量はカラム操作の実施中に得ら
れたものである：
フロントページの続き (72)発明者 サルッキ マーヤ―リーナ フィンランド国，エスエフ―02460 カ ントフィク ブリッサクセント． ２ ディ ２ (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12P 19/14 C12N 11/08 ＣＡ（ＳＴＮ)
Claims (10)
- 【請求項１】ヘミセルロースオリゴ糖および所望により
イオン性成分を含有している水溶液のpHを弱酸性の範囲
内の値に調整し、該溶液を、トリコデルマ（Trichoderm
a）属の微生物の発酵から得られる酵素の混合物または
それらの画分よりなり、かつ固定剤を添加することなく
再生可能な弱陽イオン交換担体に固定されたヘミセルロ
ース分解酵素または該酵素の混合物と接触させ、そして
該溶液からのキシロースを回収することを特徴とする；
固定化酵素でキシロオリゴマーを含有するヘミセルロー
ス基質を加水分解する方法。 - 【請求項２】トリコデルマ属の微生物がトリコデルマ・
ロンジブラチアタム（Trichoderma longibrachiatum）
〔品種名トリコデルマ・リーサイ（Trichoderma reese
i）〕であることを特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】弱陽イオン交換担体がポリスチレンで補強
された凝集カルボキシメチルセルロースであることを特
徴とする請求項１または２に記載の方法。 - 【請求項４】弱陽イオン交換担体がデュオライト C 46
4（DUOLITE C 464）であることを特徴とする請求項１ま
たは２に記載の方法。 - 【請求項５】キシロ−オリゴマーを含有するヘミセルロ
ース基質が、蒸解もしくは蒸解液からの廃液またはそれ
らの一部のような木材加工業からの廃液であることを特
徴とする請求項１ないし４のいずれかに記載の方法。 - 【請求項６】キシロ−オリゴマーを含有するヘミセルロ
ース基質が蒸気分解植物材（steam−exploded plant ma
terial）の水抽出物であることを特徴とする請求項１な
いし４のいずれかに記載の方法。 - 【請求項７】弱陽イオン交換担体および固定剤を添加を
することなく該担体で固定化された、トリコデルマ（Tr
ichoderma）属の微生物の発酵から得られる酵素の混合
物またはそれらの画分からなる、ヘミセルロース分解酵
素または酵素の混合物からなることを特徴とする再生可
能な担体で固定化された酵素からなる酵素製剤。 - 【請求項８】トリコデルマ属の微生物がトリコデルマ・
ロンジブラチアタム（Trichoderma longibrachiatum）
〔品種名トリコデルマ・リーサイ（Trichoderma reese
i）〕であることを特徴とする請求項７に記載の酵素製
剤。 - 【請求項９】弱陽イオン交換担体がポリスチレンで補強
された凝集カルボキシメチルセルロースであることを特
徴とする請求項７または８に記載の酵素製剤。 - 【請求項１０】弱陽イオン交換担体がデュオライト C
464（DUOLITE C 464）であることを特徴とする請求項７
または８に記載の酵素製剤。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI894206 | 1989-09-06 | ||
| FI894206A FI85384C (fi) | 1989-09-06 | 1989-09-06 | Foerfarande foer hydrolysering av hemicellulosa med immobiliserade enzymer och produkt som omfattar ett immobiliserat hemicellulolytiskt enzym. |
| PCT/FI1990/000206 WO1991003566A1 (en) | 1989-09-06 | 1990-09-03 | A process for the hydrolysis of hemicellulose by immobilized enzymes and a product comprising an immobilized hemicellulolytic enzyme |
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|---|---|
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| AU (1) | AU6275590A (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| US7812153B2 (en) * | 2004-03-11 | 2010-10-12 | Rayonier Products And Financial Services Company | Process for manufacturing high purity xylose |
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| CA2638159C (en) | 2008-07-24 | 2012-09-11 | Sunopta Bioprocess Inc. | Method and apparatus for treating a cellulosic feedstock |
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| EP2438183A2 (en) | 2009-05-26 | 2012-04-11 | Lali, Arvind Mallinath | Method for production of fermentable sugars from biomass |
| ES2458554T3 (es) | 2009-08-24 | 2014-05-06 | Abengoa Bioenergy New Technologies, Inc. | Procedimientos de producción de etanol y coproductos a partir de biomasa celulósica |
| EP2427561A4 (en) | 2009-11-04 | 2013-01-02 | Abengoa Bioenergy New Technologies Inc | HIGHLY EFFICIENT ETHANOL PRODUCTION PROCESS AND COPRODUCT THEREOF WITH HIGH PROTEIN SUPPLEMENT |
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| BR112017005579A2 (pt) | 2014-09-19 | 2018-04-17 | Xyleco Inc | sacarídeos e composições e misturas de sacarídeo |
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| DE2643800C2 (de) * | 1976-09-29 | 1986-10-30 | Fritz Werner Industrie-Ausrüstungen GmbH, 6222 Geisenheim | Verfahren zur Herstellung von Xylose durch enzymatische Hydrolyse von Xylanen |
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| ZA839115B (en) * | 1982-12-14 | 1984-07-25 | Cpc International Inc | Continuous enzymatic process for producing maltose from starch and starch hydrolysates |
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