DE2643800C2 - Verfahren zur Herstellung von Xylose durch enzymatische Hydrolyse von Xylanen - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von Xylose durch enzymatische Hydrolyse von XylanenInfo
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Description
ίο 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man xylanhaltige pflanzliche Rohstoffe durch
Dampf-Druckbehandlung mit Sattdampf bei Temperaturen von 160 bis 2300C während 2 bis 60 Minuten
aufschließt und defibriert, die so aufgeschlossenen pflanzlichen Rohstoffe mit einer wäßrigen Lösung auslaugt
und auf diese Lösung die Enzyme einwirken läßt
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Xylanase, ß-Xylosidase
und gegebenenfalls Uronsäure-abspaltendes Enzym enthaltendes Rohenzym durch Ultrafiltration
trennt in eine Fraktion, die im wesentlichen nur Xylanase enthält, und eine Fraktion, die im wesentlichen nur
/-Xylosidase und gegebenenfalls Uronsäure-abspaltendes Enzym enthält, diese beiden Fraktionen getrennt
an Träger bindet und auf die wäßrige Xylanlösung einwirken läßt
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das Rohenzym in einer
Pufferlösung mti einem pH-Wert von etwa 4 bis 6, vorzugsweise 5 löst und von unlöslichen Bestandteilen
befreit, die Lösung durch einen Ultrafilter mit dem Trennbereich von mindestens etwa MG 80 000 und
höchstens etwa MG 120 000, vorzugsweise etwa MG 100 000 filtriert, den überstand durch ein Ultrafilter mit
dem Trennbereich von mindestens etwa MG 250 000 und höchstens etwa MG 350 000, vorzugsweise etwa
MG 300 000 filtriert und das im wesentlichen /?-Xylosidase und gegebenenfalls Uronsäure-abspaltendes
Enzym enthaltende Filtrat an einen Träger bindet das Filtrat der ersten Ultrafiltration durch einen Ultrafilter
mit dem Trennbereich mindestens etwa MG 10 000 und höchstens etwa MG 50 000, vorzugsweise etwa MG
30 000 filtriert und das im wesentlichen Xylanase enthaltende Filtrat an einen Träger bindet
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das im wesentlichen Xylanase enthaltende
Filtrat durch einen Ultrafilter mit dem Trennbereich mindestens etwa MG 300 und höchstens etwa MG
700, vorzugsweise etwa MG 500 filtriert und den Überstand an den Träger bindet.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet daß man den Träger mit
Glutaralciehyd, Cyclohexylmorpholinoäthyl-carbodiimid-toluolsulfonat (CMC) oder TiCU aktiviert.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Xyiose durch enzymatische Hydrolyse
von Xylanen.
Der Einsatz von nativen, löslichen Enzymen zur Verzuckerung von Holzzellwandpolysaccliariden ist bekannt
(vergl. H. H. Dietrichs: Enzymatischer Abbau von Holzpolysacchariden und wirtschaftliche "Nutzungsmöglichkeiten.
Mitt Bundesforschungsanstalt für Forst- und Holzwirtschaft Nr. 93,1973,153—169). Andererseits ist es
bekannt, die Immobilisierung von Enzymen an unlöslichen Träger vorzunehmen. Immobilisierte Enzyme sind
stabiler und lassen sich leichter handhaben als lösliche Enzyme. Es ist bisher jedoch nicht bekannt, immobilisierte
Enzyme zur Verzuckerung von löslichen Zellwandpolysacchariden einzusetzen.
Zur Hydrolyse von Pflanzenzellwandpolysacchariden eignen sich Enzyme besonders aus Kulturfiltraten von
Mikroorganismen, (Sinner, M.: Mitteilungen der Bundesforschungsanstalt für Forst- und Holzwirtschaft Reinbek-Hamburg
Nr. 104, Hanuar 1975, Claeyssens, M. et al. FEBS Lett. 11,1970,336-388. Reese, E. T. et al. Can].
Microbiol. 19,1973,1065-1074).
Diese Mikroorganismen produzieren eine Vielzahl von Proteinen, u. a. von Hemizellulose-spaltenden Enzymen.
Diese freien, nicht gebundenen Enzyme sind jedoch unter ihren optimale Reaktionsbedingungen nur relativ
kurze Zeit aktiv, maximal einige Tage. Für eine Verwendung in technischem Maßstab sind sie deshalb ungeeignet.
Wenn man versucht die Enzyme aus den Kulturfiltraten von Mikroorganismen, d. h. ungereinigte »Rohenzyme«
an Träger anzulagern, wurden im wesentlichen alle im Rohenzym vorhandenen Proteine, d. h. auch die
jeweils unerwünschten Enzyme an den Träger gebunden werden. Wenn man versucht mit derartigen trägergebundenen
Enzympräparaten Xylane, z. B. Laubholzxylane durch enzymatische Hydrolyse in Xylose zu überführen,
würden außerordentlich große Mengen derartiger trägergebundener Enzyme erforderlich sein, weil ein
großer Teil der nicht benötigten Enzyme nutzlos die Oberfläche des Trägers einnimmt, während nur ein kleiner
Teil der angelagerten Enzyme, nämlich die xylanolytischen Enzyme, ihre katalytische Wirkung entfalten.
Es sind Verfahren bekannt, um aus einem Gemisch von Enzymen gewisse gewünschte Enzyme in gereinigter
Form zu gewinnen, wobei die unterschiedliche elektronische Ladung, Molekülgröße oder Affinität der Enzyme
zu einem Affektor ausgenutzt werden (Sinner, M. u. H. H. Dietrichs, Holzfofschung 29,1975,168-177, Robinson,
P. J. et al., Biotechnol. Bioeng. 16,1974,1103 -1112).
Es ist weiterhin bekannt, daß am Abbau von pflanzlichen wasserlöslichen Zellwandpolysacchariden zu monomeren
Zuckern mindestens zwei Enzymgruppen beteiligt sind, und zwar Glycanasen, die die Bindungen innerhalb
eines Polysaccharids wahllos mit Ausnahme der Bindungen am Kettenende spalten, und Glycosidasen, die
die von den Glycanasen freigesetzten Oligosaccharide in monomere Zucker zerlegen. So sind im Falle des
Xylanabbaus/?-l,4-Xylanasen sowie ,tf-Xylosidasen erforderlich. Sofern Xylane vorliegen, die als Seitengruppen
4-O-Methylglucuronsäure enthalten, ist zusätzlich ein bisher nicht bekanntes Uronsäure-abspaltendes Enzym
erforderlich. Die einzelnen Enzyme ließen sich u. U. auch vorteilhaft aus verschiedenen Quellen gewinnen.
Es ist bekannt daß sich beide Enzymgruppen hinsichtlich ihres Molekulargewichts und hinsichtlich der
Bedingungen utnerscheiden, bei denen sie ihre optimale Aktivität entwickeln (vergl. Ahlgren, E. et al, Acta
Chem. Scandinavia 21,1967.937—944).
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabenstellung zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von Xylose
durch enzymatische Hydrolyse von Xylanen zu finden, das in einfacher Weise mit hoher Wirksamkeit bzw. hoher
Ausbeute durchführbar ist, wobei hochwirksame an Träger gebundene Enzyme verwendet werden. Es wurde
überraschenderweise gefunden, daß diese Aufgabenstellung in einfacher Weise gelöst werden kann, wenn man
auf die Xylanlösung verschiedene an Träger gebundene Enzymsysteme mit unterschiedlicher Wirkung einwirken
läßt Es wurde weiterhin gefunden, daß in überaus einfacher Weise aus einem Rohenzym durch Reinigung
und Bindung an Träger derartige Enzymsysteme hergestellt werden können.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demgemäß ein Verfahren zur Herstellung von Xylose durch
enzymatische Hydrolyse von Xylanen, das gemäß der Erfindung dadurch gekennzeichnet ist, daß man auf eine
wäßrige Xylanlösung einwirken läßt
a) einen Träger, der von den xylanoly tischen Enzymen im wesentlichen nur Xylanase gebunden enthält,
b) einen Träger, der von den xylanolytischen Enzymen im wesentlichen nur /?-Xylosidase und gegebenenfalls
Uronsäure-abspaltendes Enzym gebunden enthält
Es gibt Uronsäure-haltige Xylane und Xylane, die keine Uronsäure enthalten. Wenn Xylane gemäß der 2c
Erfindung enzymatische gespalten werden sollen, die Uronsäure enthalten, muß der unter i>j genannte Träger
auch Uronsäure-abspaltendes Enzym gehmden enthalten. Wenn die Xylane keine Uronsäure en malten, ist der
Gehalt an Uronsäure-abspaltendem Enzym nicht erforderlich.
Zur Herstellung der an Träger gebundenen gereinigten Enzyme kann man ein Xylanase-,/i-Xylosidase- und
gegebenenfalls Uronsäure-abspaltendes Enzym enthaltendes Rohenzym durch Ultrafiltration trennen in eine
Fraktion, die im wesentlichen nur Xylanase enthält, und eine Fraktion, die im wesentlichen nur^-Xylosidase und
gegebenenfalls Uronsäure-abspaltendes Enzym enthält, und diese beiden Fraktionen getrennt an Träger binden.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung eröffnet einen außerordentlich einfachen und wirksamen Weg, um
in hoher Ausbeute aus den in großen Mengen vorhandenen aus pflanzlichen Rohstoffen stammenden Xylanen
das Monosaccharid Xylose herzustellen. Die Xylose ist ein wertvoller Zucker, der als solcher verwendet oder
gegebenenfalls zu Xylit reduziert werden kann, der wiederum ein wertvoller bisher nur verhältnismäßig schwer
in großen Mengen zugänglicher Stoff ist
Die für das Verfahren gemäß der Erfindung als Ausgangsprodukt eingesetzten Xylane bzw. Xylanbruchstücke
sind Hemizellulosen, die aus pflanzlichen Rohstoffen verschiedener Art gewonnen werden können. Beispiele für
solche pflanzlichen Rohstoffe sind Laubhölzer, Stroh, Bagasse, Getreidespelzen, Maiskolbenreste, Maisstroh
usw. Wenn als pflanzliche Rohstoffe solche verwendet werden, die als Hemizellulosen in erster Linie Xylane
enthalten, z. B. einen Xylangehalt von über etwa 15 Gew.-%, vorzugsweise über etwa 25 Gew.-°/o aufweisen,
können die beim Auslaugen in die wäßrige Phase übergehenden Xylane und Xylanbruchstücke in vorteilhafter
Weise für das Verfahren gemäß der Erfindung eingesetzt werden. Die Xylanlösung wird dabei zweckmäßig
dadurch erhalten, daß man die xylanhaltigen pflanzlichen Rohstoffe einer Dampf-Druckbehandlung mit Sattdampf
bei Temperaturen von etwa 160 bis 2300C während etwa 2 bis 60 Minuten aussetzt und die so aufgeschlossenen
pflanzlichen Rohstoffe mit einer wäßrigen Lösung auslaugt
Ein Verfahren zur Herstellung dieser Xylanlösungen ist im einzelnen beschrieben in der DE-OS 27 32 327.
Die sonstigen Bedingungen bei der Xylanhydrolyse mit Hilfe trägergebundener Enzyme unterscheiden sich
gegenüber der Hydrolyse mit freien Enzymen im wesentlichen dadurch, daß aufgrund der höheren Stabilität der
gebundenen Enzyme höhere Temperaturen gewählt werden können, wodurch die Reaktion beschleunigt wird.
Temperaturen im Bereich von 30—6O0C, vorzugsweise im Bereich von 40—45° C, ergeben in der Regel optimale
Ergebnisse.
Es ist weiterhin von Vorteil, daß im Gegensatz zu den freien Enzymen, die einen relativ engen Optimal-pH-Bereich
aufweisen, mit ciün gebundenen Enzymen in einem erheblich weiteren Bereich gearbeitet werden kann. Die
jeweiligen oberen und unteren Grenzwerte hängen von den jeweiligen konkreten Enzymen ab. Im allgemeinen
kann man sagen, daß zweckmäßig im Bereich von pH 3 bis 8, vorzugsweise 4 bis 5 gearbeitet werden kavin, um
optimale Hydrolyse zu erzielen. Damit erübrigt sich in der Reed der Zusatz von Puffer zur Einstellung genauer
pH-Werte.
Die Konzentration der Xylane in der Lösung kann in verhältnismäßig weifen Grenzen schwanken. Die obere
Grenze wird bestimmt durch die Viskosität der Lösungen und diese wiederum durch den DP (Durchschnittspolymerisationsgrad)
der Xylane: im Mittel kann mit einer oberen Grenze von etwa 8%, in manchen Fällen etwa
6% gerechnet werden. Die untere Grenze ist im wesentlichen dadurch' gegeben, daß ein Arbeiten in zu
verdünnten Lösungen unwirtschaftlich werden kann. Es ist besonders vorteilhaft, die nach der oben erwähnten
österreichischen Patentanmeldung erhaltenen Xylan-Lösungen ohne weitere Verdünnung einzusetzen.
Die enzymatische Hydrolyse wird so lange durchgeführt, bis im wesentlichen die gesamten Xylane zu Xylose
abgebaut wurden, was durch Analyse der Lösung leicht festgestellt werden kann. Es wird dazu .auf den Vergleichsversuch
verwiesen. Im Chargenverfahren kann ein vollständiger Abbau zu Xylose nach etwa 4 Stunden
erreicht werden.
Das Verfahren gemäß der Erfindung kann aber auch in kontinuierlicher A'eise dadurch ausgeführt werden,
daß die Xylanlösung durch eine Säule geleitet wird, die mit den gemäß der Erfindung verwendeten Enzympräparaten
gefüllt ist. Im Sf.ulenbetrieb läßt sich die Inkubationszeit leicht durch Säulenabmessungen und die Durchflußgeschwindigkeit
steuern.
Besonders gute Ergebnisse erhält man nach dem Verfahren gemäß der Erfindung, wenn man nach dem oben
beschriebenen Verfahren hergestellte Enzympräoarate verwendet, die man also dadurch erhält, daß man ein
Xylanase, /f-Xyiosidase und gegebenenfalls Uronsäure-abspaltendes Enzym enthaltendes Rohenzym durch
Ultrafiltration trennt in eine Fraktion, die von den xylanolytischen Enzymen im wesentlichen nur Xylanase
enthält, und eine Fraktion, die von den xylanolytischen Enzymen im wesentlichen nur^-Xylosidase und gegebenenfalls
Uronsäure-abspaltendes Enzym enthält, und diese beiden Fraktionen getrennt an Träger bindet. Als
Rohenzyme werden dabei vorzugsweise Kulturfiltrate von Mikroorganismen verwendet, die diese Enzyme
produzieren. Derartige Mikroorganismen sind in großer Zahl bekannt, z. B. Trichoderma viride, Bacillus pumilus,
verschiedene Aspergillus-Arten und Penicillium-Arten. Aus Mikroorganismen erhaltene Rohenzympräparate
sind bereits vielerorts als Handelsprodukte erhältlich, und sie können im Sinne der Erfindung verwendet werden.
Besonders bevorzugt sind naturgemäß solche Präparate, die eine besonders starke xylanolytische Wirkung
besitzen. Beispiele hierfür sind Celluzyme 450 000, Cellulase 20 000 und 9X, Cellulase Onozuka P 500 und SS,
Hemicellulase NBC.
Nachfolgend wird eine Aufstellung von Mikroorganismen gegeben, die besonders viel Enzym mit xylanolytischer
Wirkung produzieren. Weiterhin sind Literaturstellen genannt, worin derartige Mikroorganismen und ihre
optimalen Kulturbedingungen angegeben sind.
Aspergillus niger Penicillium
wnrlmanni
Trichoderma viride
Fusarium roseum Trichoderma viride
Fusarium moniliforme Bacillus pumilus Coniophora cerebella
Bacillus No. C-59-2
für Xylosidafe Reese et al., Can.). Microbiol. 19, 1973, !065— !074
für Xylanase Reese u. Mandels, Appl. Microbiol. 7, 1959,378-387
für Xylanase
für Xylanase Gascoigne u.Gascoigne, J. Gen. Microbiol. 22, 1960,242-248
für Xylanase
für^-Xylosidase Simpson, F. J, Canadian J. Microbiol. 2,
1956.28-38
für Xylanase King.Fuller, Biochem. J. 108,
1968,571-576
für/f-Xylanase äußerst thermostabil
breites pH-Optimum 2 Tage-Kultur
K. Horikoshi u. Y. Atsukawa, Agr. Biol.Chem.37,1973,2097-2103
Weitere Angaben über Mikroorganismen mit starken xylanolitischen Enzymen können aus den nachfolgenden
Literaturstellen entnommen werden:
/?-Xylosidasen
Aspergillus niger Botryodiplodia sp. Penicülium wortmanni
Chaetomium trilateraie
Bacillus pumilus ß-\—-4-Xylanasen
Trichoderima viride
Reese, E. T. et al. Can. J. Microbiol. 19,
1973,1065-1074
Kawaminami, I. u. H. Izuka, J. Ferment. Technol. 48,
1970,169-176
Simpson, F. J, Can. J. Microbiol. 2.1956.28—38
Reese, F. T. u. M. Mandels, Appl. Microbiol. 7,1959,378-387
Nomura, K. et al, J. Ferment Technol. 46,1968,634-640 Takeniski, S. et al, J. Biochem.
(Tokyo) 73.335—343
A. batatae
A. oryzae Fusarium roseum P.janthinellum
Chaetomium trilateral Coniophora cerebella
Trametinae Coriolinae
Trichlolomateae Coprinaceae Fomitinae roplyporinae
Bacillus No. C-59-2 Sreptomyces xylophagus Bacillus subtilis
Fukui, S. u. M. Sato, Bull, agric.
chem.Soc. Japan 21,1957,392-393
chem.Soc. Japan 21,1957,392-393
Fukui, S., J. Gen. Appl. Microbiol. 4,1958,39-50
Gascoigne, J. A. u. M. M. Gascoigne,
J. Gen. Microbiol. 22,1960,242-248
J. Gen. Microbiol. 22,1960,242-248
Takenishi, S. u. Y. Tsujisaka, J. Ferment.
Technol.51,1973,458-463
Technol.51,1973,458-463
Iizuka, H. u. Kawaminami, Agr. Biol.
Chem.33,1969,1257-1263
Chem.33,1969,1257-1263
King, N. J-, Biochem. J. 100,1966,784-792
Kawai, M., Nippon, Nogei Kagaku Kaishi 47,1973,529-34
(aus einem Screening Test unter Basidiomyceten)
(aus einem Screening Test unter Basidiomyceten)
Horikoshi, K. u. Y. Atsukawa, Agr.
Biol. Chem. 37,1973,2097 - 2103
Biol. Chem. 37,1973,2097 - 2103
Iizuka, H. u. T. Kawaminami, Agr.
Biol. Chem. 29,1965,520-524
Biol. Chem. 29,1965,520-524
Lyr,H.Z.Allg.Mikrobiol. 12,
1972,135-142
1972,135-142
Das an dem Träger gebundene gereinigte Enzym wird vorzugsweise dadurch hergestellt, daß man eine
Ronenzym-Lösung von unlöslichen Bestandteilen, zweckmäßig durch normale Filtration befreit, die Lösung
durch ein Ultrafilter mit dem Trennbereich von mindestens etwa MG 80 000 und höchstens etwa MG 120 000,
vorzugsweise etwa 100 000 filtriert, den Überstand durch ein Ultrafilter mit dem Trennbereich von mindestens
elwa MG 250 000 und höchstens etwa MG 350 000, vorzugsweise etwa MG 300 000 filtriert und das irr.
wesentlichen /?-Xylosidase und gegebenenfalls Uronsäure-abspaltendes Enzym enthaltende Filtrat an einen
Träger bindet, das Filtrat der Ultrafiltration mit dem zuerst genannten Trennbereich durch einen Ultrafilter mit
dem Trennbereich von mindestens etwa MG 10 000 und höchstens etwa MG 50000, vorzugsweise etwa MG
30 000 filtriert und das im wesentlichen Xyianase enthaltende Filtrat an einen Träger bindet. Zur Durchführung
dieses Verfahrens wird das Rohenzym zweckmäßig in der etwa 10- bis 30fachen, vorzugsweise der etwa
20fachen Menge Wasser gelöst.
Eine noch stärkere Reinigung der im wesentlichen Xyianase enthaltenden Fraktion kann dadurch ausgeführt
werden, daß man das im wesentlichen Xyianase enthaltende Filtrat nach der Filtration durch einen Ultrafilter mit
dem Bereich von etwa MG 10 000 bis 50 000 durch einen Ultrafilter mit dem Trennbereich von mindestens etwa
MG 300 und höchstens etwa MG 700, vorzugsweise etwa MG 500 filtriert und den Überstand an den Träger
bindet. Durch diese zusätzliche Ultrafiltration wird die Xyianase konzentriert. Gleichzeitig wird die größte
Menge der Kohlenhydrate, die bis zu etwa 40% des Ausgangsmaterials betragen kann, im Ultrafiltrat abgeschieden.
Wenn im Sinne der Erfindung die Worte »im wesentlichen« in Zusammenhang mit den genannten Enzymen
gebraucht werden, so wird darunter verstanden, daß. die in der jeweiligen Fraktion enthaltenen Enzyme im
Hinblick auf xylanolytische Wirkung im wesentlichen aus dem jeweils genannten Enzym bestehen bzw. daß die
jeweilige Fraktion als Enzym in erster Linie das jeweils genannte Enzym enthält. Nach Durchführung der
Reinigungsoperation wird z. B. eine Xylanase-Fraktion erhalten, in der ein Gehalt an ^-Xylosidase praktisch
nicht mehr nachweisbar ist Das Gleich gilt in umgekehrtem Sinne für die /ί-Xylosidase-Fraktion. Im Sinne der
Erfindung, insbesondere zur Durchführung des Verfahrens zur Herstellung von Xylose durch enzymatische
Hydrolyse von Xylanen können aber auch solche Träger verwendet werden, die nicht einen so hohen Reinheitsgrad
an dem jeweiligen Enzym aufweisen. Beispielsweise werden die vorteilhaften Ergebnisse gemäß der
Erfindung auch dann erhalten, wenn unter dem Begriff »im wesentlichen« verstanden wird, daß das jeweilige
Enzym mindestens etwa 80%, vorzugsweise mindestens etwa 90% und besonders bevorzugt mindestens etwa
95% der jeweiligen gewünschten Hauptaktivität ausmacht
Es ist überraschend, daß durch diese einfache Ultrafiltration eine Auftrennung des Rohenzymes in die
gewünschten Komponenten möglich ist, die auf diese Weise in hoher Reinheit erhalten werden. Besonders
überraschend und vorteilhaft ist, daß in der Fraktion, die die /?-Xylosidase enthält auch das Uronsäure-abspal-
If tende Enzym enthalten ist. Xylanase und/?-Xylosidase allein sind nicht in der Lage, die durch das Einwirken der
"fs Xylanase auf die Xylan-Kette gegebenenfalls mitentstandenen sauren Xylanbmchstücke in der Abbaulösung
■■·'■' weiter zur monomeren Xylose zu spalten. Die sauren Xylooligomeren müssen erst durch die katalytische
ι: Wirkung des Uronsäure-abspaltenden Enzymes vom Säurerest befreit werden, ehe sie weiter bis zur Xylose
[v 5 hydrolysiert werden.
ijl Die Anlagerung der gereinigten Enzymfraktionen an Träger erfolgt nach an sich bekannten Verfahren. Es sind
ki verschiedene Anlagerungsverfahren bekannt, die sich nach Art der Bindung (Adsorption, kovalente Bindung an
>f der Trägeroberfläche, kovalente Quervernetzung, Einschluß u. a.) und Schwierigkeitsgrad und Aufwand bei der
Ü Herstellung der Bindung unterscheiden. Bevorzugt sind solche Verfahren, die eine dauerhafte Bindung gewähr-
|] ίο leisten (kovalente Bindung), die auch bei höhermolekularen Substraten Diffusionsbehinderungn gering halten
jV; und die einfach durchzuführen sind. Für das Verfahren gemäß der Erfindung haben sich als besonders vorteilahft
f\ erwiesen:
f. 1. Bindung überGlutaraldehyd(Weetall, H. H.,Science 166,1969,615-617),
jf! 15 2. Bindung über Cyclohexylmorpholinoäthyl-carbodiimidtoluolsulfonat (CMC) Line, W. F. et al., Biochim.
p Biophys. Acta 242,1971,194 - 202),
3. Bindung über TiCI4 (Emery, A. N. et al., Chem. Eng. (London) 258,1972,71 -76).
Als Träger können für das Verfahren gemäß der Erfindung alle auf diesem technischen Gebiet üblichen
Träger eingesetzt werden, wie Stahistäub, Tiianoxid, Feidspäi und ändere Mineralien, Seesand, Kieselgur,
poröses Glas und Kieselgel. Die verwendbaren Träger sind jedoch nicht auf diese Beispiele beschränkt. Als
poröses Glas kann z. B. das Handelsprodukt CPG-550 eingesetzt werden, und als Kieselgel das Handelsprodukt
Merckogel SI-1000. Zur Herstellung der Träger-Enzymbindung nach Methode 1 und 2 ist es günstig, die Träger
über Nacht im Rückfluß mit etwa 5 bis 12%, vorzugsweise etwa 10% ^-Aminopropyltriäthoxysilan ir. Toluol zu
erhitzen. Durch diesen Schritt wird das jeweilige Trägermaterial mit einer primären Aminogruppe ausgestattet.
Bei Methode Nr. 3 ist dieser Schritt nicht notwendig.
Nach intensiver Waschung mit geeigneten Lösungsmitteln wie Toluol und Aceton folgt die Aktivierung der
Träger. Dieser Schritt besteht bei Methode 1 darin, daß der jeweilige Träger in etwa 3 bis 7%, vorzugsweise
etwa 5%ige Glutaraldehyd-Lösung des Anlagerungspuffers gerührt wird. Ein Puffer-pH von 6,5 hat sich als
günstiger erwiesen als ein Puffer-pH von pH 4. Je höher der Anlagerungs-pH, desto mehr Protein wird
gebunden. Da die Enzyme aber im schwach sauren Bereich stabil sind, kommt für die Anlagerung ein pH von
6—73, vorzugsweise von 6,5 in Frage.
Nach 60 Minuten Inkubation, teilweise unter Vakuum, hat es sich als günstig erwiesen, die überschüssige
Glutaraldehyd-Lösung abzusaugen. Das Trägermaterial wird zweckmäßig noch einmal gründlich gewaschen,
ehe es mit der Enzymlösung inkubiert wird.
Bei Methode 2 wird der Alkylaminträger zweckmäßig erst mit dem zu kuppelnden Enzym 5 Minuten gut
verrührt, ehe das die Kupplung startende Reagenz CMC zugegeben wird. Die zugegebene Menge an CMC ist
kritisch. Bei zu geringer Zugabe an CMC wird nur wenig Enzym gebunden. Bei zu hoher Gabe an CMC besteht
Gefahr der Quervernetzung mit Aktivitätsverlust für das Enzym. Auf 1 g Träger und 150 mg Enzym hat sich eine
Menge von etwa 350 bis 450 mg, vorzugsweise von etwa 400 mg CMC als günstig erwiesen. Der pH-Wert wird
während der ersten 30 Minuten der Inkubation zweckmäßig mit 0,1 η HCl auf pH 3 bis 5, vorzugsweise etwa 4,0
gehalten. Dieser pH-Wert hat sich als günstiger erwiesen als ein pH-Wert von 6,5. CMC-Methode und TiCU-Methode
eignen sich besonders für Enzyme, die im sauren Bereich stabil sind. Die höchsten Proteinmengen werden
im sauren Bereich gebunden.
Bei Methode 3 besteht die Aktivierung des Trägers darin, daß der unbehandelte Träger in etwa 6 bis 15%ige,
vorzugsweise etwa 12,5% ige wäßrige TiCU-Lösung gerührt wird. Das überschüssige Wasser wird abgedampft
und das Reaktionsprodukt bei 45° C im Vakuumtrockenschrank getrocknet Anschließend wird es intensiv mit
dem Anlagerungspuffer gewaschen, ehe es mit der anzulagernden Enzymlösung inkubiert wird.
Die Inkubation des aktivierten Trägers mit der Enzymlösung ist nach mehreren Stunden, z. B. über Nacht
beendet. Der Zeitraum der Inkubation ist nicht besonders kritisch. Die Inkubation wird zweckmäßig bei Normaltemperatur
durchgeführt.
Die trägergebundenen Enzympräparate werden nach dem Anlagerungsvorgang zweckmäßig über eine Fritte
mit 1 M NaCl in 0,02 M Phosphatpuffer pH 4 und anschließend mit 0,02 M Phosphatpuffer pH 5 gewaschen, bis
kein Enzym mehr im Waschwasser nachgewiesen werden kann.
Gemäß dem Verfahren der Erfindung wird eine außerordentlich weitgehende Reinigung der Enzyme durchgeführt,
die für den Abbau der Xylane benötigt werden. Man erhält somit Träger mit einer außerordentlich
hohen spezifischen katalytischen Aktivität, und die enzymatische Hydrolyse von Xylanen läßt sich vorteilhaft
ausführen. Besonders überraschend ist, wie der nachfolgend beschriebene Vergleichsversuch zeigt, daß die
Ausbeute an Xylose gemäß dem Verfahren ganz beträchtlich größer ist als dann, wenn man Xylanase, ß-Xylosidase
und Uronsäure-abspaltendes Enzym gemeinsam an einen Träger bindet und versucht die enzymatische
Hydrolyse von Xylanen dadurch auszuführen, daß man auf eine wäßrige Xylanlösung diesen alle drei Enzyme
enthaltenden Träger einwirken läßt.
In der Beschreibung und in den Beispielen handelt es sich bei % um Gewichts-%, soweit nichts anderes
angegeben ist Die Gewinnung bzw. Isolierung und Reinigung der gewünschten in Lösung vorliegenden Stoffe
erfolgt, soweit sie zweckmäßig ist, nach den a-uf dem Gebiet der Zuckerchemie üblichen Verfahren, z. B. durch
Einengen der Lösungen, Versetzen mit Flüssigkeiten, in denen die gewünschten Produkte nicht oder schwer
löslich sind, Umkristallisation usw. »Atro« tedeutet »absolut trocken«.
Faserstoffrückstände (%) | nach Behandlung |
nach Waschen | mit NaOH |
mit H2O | r· /- OO |
S3 | 71 |
87 | 68 |
86 | 66 |
82 | 71 |
85 | 67 |
90 | 65 |
82 | 68 |
88 | |
Aufschlußprozeß
400 g Rotbuchenholz in Form von Hackschnitzeln, lufttrocken, wurden im Defibrator mit Dampf für 6 bis 7
Minuten bei 185— 190°C, entsprechend einem Druck von etwa 12 at., behandelt und etwa 40 Sekunden defibriert.
Der so erhaltene feuchte Faserstoff wurde mit insgesamt 4 1 Wasser aus dem Defibrator hrausgespült und
auf einem Sieb gewaschen. Die Ausbeute an Faserstoff betrug 83%, bezogen auf das eingesetzte Hob (airo).
Der gewaschene und abgepreßte Faserstoff wurde anschließend in 5 1 l%iger wäßriger NaOH bei Raumtemperatur
suspendiert und nach 30 Minuten durch Filtration und Abpressen vom alkalischen Auszug abgetrennt.
Nach Waschen mit Wasser, verdünnter Säure und wiederum Wasser betrug die Ausbeute an Faserstoff 66%,
bezogen auf das eingesetzte Holz (atro).
In entsprechender Weise wurden andere Holzarten, auch in Form grober Sägespäne, sowie Stroh in gehäckselter
Form behandelt. Die Mittelwerte der Ausbeuten an Faserstoffen, bezogen auf die Ausgangsmaterialien
(atro) betrugen:
Ausgangsmaterial
Roibudie S3 66
Pappel
Birke
Eiche
Eukalyptus
Weizenstroh 90 67
Gerstenstroh
Haferstroh
Kohlenhydratzusammensetzung der wäßrigen und alkalischen Auszüge
Aliquote Anteile der unter Baispiel 1 gewonnenen wäßrigen und alkalischen Auszüge wurden einer Totalhydrolyse
unterworfen. Die quantitative Bestimmung des Einzel- und Gesamtzucker erfolgte mit Hilfe des Biotronic-Autoanalyzers
(vgl. M. Sinner, M. H. Simatupang und H. H. Dietrichs, Wood Science and Technology 9
(1975), S. 307—322). Im Autoanalyzer wurde außerdem der Totalhydrolyse unterworfenes Holz untersucht,
F i g. 1 zeigt die erhaltenen Diagramme für Rotbuche.
Auszug Gelöste Kohlenhydrate
Gesamt (%, bez. Anteile (%, bzeogen Auszug)
Ausgangsmaterial atro) Xylose Glucose
40
Rotbuche,
H2O 13,5
NaOH 7,0
45 Eiche,
H2O 13,2
NaOH 6,8
Birke,
H2O 11,2
NaOH 7,3
Pappel,
H2O 83 /o b
NaOH 6,5
Eukalyptus,
H2O 9,5
NaOH 5,0 au J
Weizen,
H2O 7,0
NaOH 83
Gerste,
H2O 6,1
NaOH 95
69 83 |
PO PO |
65 81 |
11 5 |
77 84 |
U) OO |
76 83 |
6 3 |
71 80 |
U) OO |
OO Ui OO U) |
21 3 |
41 88 |
Ul Ul |
(Fortsetzung)
Hafer,
H2O 5,1 44 20
NaOH 4,4 88 3
Trennung und Konzentrierung von Xylanase und^Xylosidase
aus einem Enzym-Handelspräparat
i:. 220 g des im Handel erhältlichen Rohenzym-Präparates »Celluzyme« wurden in 4,81 0,02 M AmAc Puffer
(Ammoniumacetat-Puffer) pH 5 gelöst Der unlösliche Rückstand wurde teilweise über eine Fritte entfernt.
Anschließend wurde die Enzymlösung über einen Teflonfilter klarfiltriert Es folgte die Ultrafiltration der
Enzyriilosung am Ultrafiltrationsgerät
Folgende Ultrafilter wurden verwendet (in der Reihenfolge der Anwendung):
Trennbereich MG 100 000
Trennbereich MG 3öö ööö
Trennbereich MG 30 000
Trennbereich MG 500
Die gereinigte Rohenzym-Lösung wurde also zunächst mittels des Filters mit dem Trennbereich MG 100 000
filtriert Danach befand sich die Xylanase überwiegend im Ukrafiltrat Die /9-Xylosidase und ein bisher unbekanntes Enzym, das für die Abspaltung der 4-O-Methylglucuronsäure von sauren Xylooligomeren verantwortlich ist, befanden sich überwiegend im Überstand.
Der Überstand dieser Ultrafiltration wurde nun durch den Ultrafilter mit dem Trennbereich MG 300 000
filtriert Am Ende dieser Behandlung war die /?-Xylosidase zusammen mit der Uronsäure-abspaltenden Enzymaktivität nur in der klaren Lösung des Ultrafiltrats nachweisbar, während der dickflüssige dunkelbraune Überstand keine/?-XyIosidaseaktivität und keine Uronsäure-abspaltende Aktivität enthielt
Das bei der ersten Ultrafiltration erhaltene Filtrat wurde auf folgende Weise aufgearbeitet:
wurden im Überstand abgeschieden.
Ultrafiltration an DM 5:
Die Xylanase befand sich im Überstand; sie wurde durch diesen Schritt konzentriert Gleichzeitig wurde die
größte Menge der Kohlenhydrate (im Ausgangsmaterial: 39%) im Ultrafiltrat abgeschieden.
In der nachfolgenden Tabelle sind die Aktivitäten an Xylanase, /7-Xylosidase und Uronsäure-abspaltenden
Enzym angegeben. Bei den angegebenen Werten handelt es sich um »units«. 1 Unit ist die Enzymmenge, die den
Zuckergehalt der Abbaulösung (1 % Buchenholzxylan für Xylanase, 2 m Mol p-Nitrophenylxylopyranosid für
/?-Xylosidase, 0,2 μg/μl 4-O-Methylglucuronosylxylotriose für das Säure-abspaltende Enzym) bei 37°C um
1 uMol Xylose für Xylanase und /?-Xylosidase und 1 μΜοΙ 4-O-Methylglucuronsäure für das Säureabspaltcndc
Enzym erhöht
50 | Celluzyme gelöst | Xylanase | /?-Xylosidase | Glucuronsäu- |
Ultrafilter-Trennbereich MG 100 000 | re- | |||
Überstand | abspaltende | |||
Ultrafilter-Trennbereich MG 100 000 | Aktivität | |||
55 | Ultrafiltration | 34 560 U | 1541 U | 2568 U |
Ultrafilter-Trennbereich MG 300 000 | 7 968 U | 1290U | 1996 U | |
Ultrafiltration | ||||
Ultrafilter-Trennbereich MG 30 000 | 24 480 U | 13 U | 524 U | |
60 | Ultrafiltration | |||
Ultrafilter-Trennbereich MG 500 | 1011 U | 1817 U | ||
Überstand | ||||
21 173 U | ||||
65 | 19 730 | |||
Der Nachweis der Xylanase mit Buchenholzxylan als Substrat erfolgte reduktometrisch (SLJMNER, vgL
HOSTETTLER, F, E. BOREL u. H. DEUEL, HeIv. Chim. Acta 34,1951,2132-39). Zur Messung der/-Xylosidase-Aktivität
wurde die auf 1,5 ml verdünnte p-Nitrophenylxylosid-Lösung mit 2 ml 0,1 M Boratpuffer pH 9,8
versetzt. Die Extinktion des freigewordenen p-NitrophenoIs wurde direkt bei 420 nm bestimmt Die Menge an
p-Nitrophenol wurde über eine Eichkurve abgelesen und in Xylose umgerechnet Als Substrat des Uronsäureabspaltenden
Enzyms diente 4-O-MethylglucuronosybcyIotriose. Die Abbaulösungen wurden säulenchromatografisch
analysiert (SINNER, M. H. SIMATUPÄNG u. H. H. DIETRICHS, Wood Sci.TechnoL9,1975,307-22.)
Die freigesetzte Menge an 4-O-Methylglucuronsäure wurde in μΜοΙ/Min. berechnet
Anlagerung der Enzyme an Träger
Als Enzymträger wurde poröses Glas (CPG-550) gewählt Die xylanolytischen Enzyme wurden Ober Glutaraldehyd
(WEETALL, H. H, Science 166,1969,615—17) an den Enzymträger gebunden.
1 g des als Träger verwendeten porösen Glases wurden über Nacht mti 10% ^-Aminopropyltriäthoxysilan in
Toluol am Rückfluß erhitzt Dadurch wurde der Träger mit einer primären Aminogruppe ausgestattet Anschließend
wurde intensiv mit Toluol und Aceton nacheinander gewaschen. Danach wurde der Träger mit 20 ml einer
5%igen Glutaraldehydlösung in einem 0,02 Phosphat-Puffer bei pH 6,5 gerührt Zunächst wurde 15 min unter
Vakuum (0,4 bar) gerührt, dann wurde 45 min unter Normaldruck weiter inkubiert Danach wurde ab^saugt
und das Trägermaterial wurde gründlich mit 200 ml Puffer gewaschen.
Unter Verwendung dieses aktivierten Trägermaterials wurden zwei trägergebundene Enzympräparate hergestellt:
a) 1 g des aktivierten Trägers wurde mit 5 ml der nach Beispiel 3 erhaltenen 657 units Xylanase-Enzymlösung
über Nacht gerührt Danach wurde über eine Fritte mit 1 m NaCl in 0,02 M Phosphatpyffer pH 4 und
anschließend mit 0,02 m Phosphatpuffer pH 5 gewaschen, bis kein Enzym mehr im Waschwasser nachweisbar
war.
Das so erhaltene Präparat 1 enthält pro g 64 units wirksamer Xylanase gebunden.
b) Es wird wie unter a) verfahren, wobei jedoch 5 ml der gemäß Beispie! 3 erhaltenen Lösung verwendet
werden, die 33 units /?-Xylosidase und 60 units Uronsäure-abspaltende Enzyme enthält Das erhaltene
Präparat 2 enthält pro g etwa 33 unitsy^-Xylosidase und 60 units Uronsäure-abspaltende Enzyniz gebunden.
Hydrolyse von Buchenholzxylan
2 ml der gemäß Beispiel 1 durch Waschen mit Wasser erhaltenen Xylanlösung aus dem Aufschluß von
Buchenholz (die Lösung enthält 13% Xylan) wurden mit 60 mg des Präparates 1 und 60 mg des Präparates 2, die
gemäß Beispiel 4 erhalten wurden, bei 400C im Schüttelwasserbad inkubiert. Die Hydrolyse des Xylans wurde
analytisch säulenchromatografisch unter Verwendung eines Ionenaustauscherharzes (Handelsprodukt Durrum
DA X-4) verfolgt. (SINNER, M, M. H. SIMATUPÄNG und H. H. DIETRICHS, Wood Sei. Technol. 9, 1975,
307—22). Nach vier Stunden war das Buchenholzxylan in seine monomeren Bestandteile Xylose und 4-O-Methylglucuronsäure
hydrolysiert F i g. 2 zeigt das Chromatogramm nach vierstündigem Inkubieren. Es ist daraus
ersichtlich, daß in der Lösung ein vollständiger Abbau des Xylans zu Xylose erfolgte. Die Lösung enthält keine
Xylobiose. In der Figur steht die Abkürzung GIcA für 4-O-Methylglucuronsäure.
45 Vergleichsversuch 1
Es wurde wie in Beispiel 5 gearbeitet, wobei jedoch ein Enzympräparat verwendet wurde, das wie im Beispiel
4 beschrieben hergestellt worden war, wobei jedoch die Enzymlösungen, die die Xylanase sowie die ^-Xylosidase
und das Uronsäure-abspaltende Enzym enthielten, gemeinsam im Gemisch an den Träger gebunden wurden.
Es wurden zwei ml der im Beispiel 5 verwendeten Xylanlösung mit 60 mg des Präparates bei 4O0C inkubiert, das
gemeinsam Xylanase, ^-Xylosidase und das Uronsäure-abspaltende Enzym enthielt.
A ußerdem wurde in einem weiteren Vergleichsversuch in gleicher Weise verfahren, wobei lediglich 60 mg des
gemäß Beispiel 4 hergestellten Präparates 1 verwendet wurden (trägergebundene Xylanase).
Der Xylanabbau der drei Lösungen wurde wie in Beispiel 5 beschrieben über drei Stunden säulenchromatografisch
verfolgt. Xylobiose- und Xylosegehalt der Lösungen sind in F i g. 3 aufgetragen. In dieser Figur sind
ebenfalls aufgetragen die Gehalte an Xylobiose und Xylose der Lösung von Beispiel 5 (Xylanase und/ff-Xyiosidase
sowie Uronsäure-abspaltendes Enzym getrennt immobilisiert, gemeinsam inkubiert). Aus der F i g. 3 ist
folgendes ersichtlich:
Die gemeinsam immobilisierten Enzyme hatten zwar nach 1 h schon einen großen Teil des vorhandenen
Xylans (13 mg/ml) zu Xylobiose hydrolysiert die Konzentration des gewünschten Endabbauprodukts Xylose
stieg jedoch mit steigender Inkubationszeit nicht weiter an.
Die trägergebundene Xylanase hat schon nach 30 Minuten den größten Teil des vorliegenden Xylans zu
oligomeren Zuckern abgebaut. Der Gehalt an Xylose stieg naturgemäß nicht weiter an denn das Endabbauprodukt
der Xylanase ist im wesentlichen Xylobiose.
Die nach Beispiel 5, d. h. gemäß der Erfindung getrennt immobilisierten, aber gemeinsam inkubierten Enzyme,
hatten die Xylanlösung nach 30 Minuten zu Xylobiose und Xylose und sauren Zuckern abgebaut. Mit steigender
Inkubationszeit stieg durch das Einwirken der /7-Xylosidase die Xylosekonzentration, dementsprechend nahm
der Xylobiosegehalt der Abbaulösung ab. Nach 4 h war Totalhydrolyse zu Xylose und 4-O-Methylglucuronsäure
erreicht, wie aus der F i g. 2 (vgl Beispiel 1) ersichtlich ist
Hierzu 3 Blatt Zeichnungen
10
Claims (1)
1. Verfahren zur Herstellung von Xylose durch enzymatische Hydrolyse von Xylanen, dadurch gekennzeichnet,
daß man auf eine wäßrige Xylanlösung einwirken läßt
5
5
a) einen Träger, der von den xylanolytischen Enzymen im wesentlichen nur Xylanase gebunden enthält,
b) einen Träger, der von den xylanolytischen Enzymen im wesentlichen nur/?-Xylosidase und und gegebenenfalls
Uronsäure-abspaltendes Enzym gebunden enthält
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