KR100483501B1 - 효소 추출 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 셀룰라제를 사용하여 곡류로부터 β-아밀라제를 추출하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 β-아밀라제의 추출에서의 셀룰라제의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 효소 기술에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 곡류로부터 β-아밀라제를 추출하는 방법 및 이러한 추출에서의 효소의 용도에 관한 것이다.
β-아밀라제는 α-1,4-결합을 가수분해하는 전분 분해 효소이다. 이는 예를 들면 박테리아 및 식물에서 발견되는데, 전분쇄의 비-환원성 말단에서 전분을 주로 말토스로 분해한다. β-아밀라제는 예를 들면 그레인중에 풍부하며, 여기서 이는 필요할 경우 전분과 같은 곡류의 영양 저장분을 당으로 전환시킨다. 이러한 곡류에서, 전분은 주로 아밀로스 및 아밀로펙틴의 형태로 저장된다. β-아밀라제는 모든 아밀로스를 말토스로 전환시키는 반면, 아밀로펙틴의 약 60%는 말토스로 전환되며, 나머지는 덱스트린으로 전환된다.
β-아밀라제는 말토스를 생성하기 위하여, 예를 들면 전분 산업에서 사용되는 상업적으로 중요한 효소이다. 다량의 말토스를 함유하는 산물은 예를 들면 제과 및 식료품 산업에 사용된다. β-아밀라제는 박테리아 및 식물 모두로부터 분리되어 왔다. 예를 들면, 이는 바실러스(Bacillus) 박테리아 (미국 특허 제4,970,158호 및 일본 특허 제60126080호)로부터 그리고 열안정성 클로스트리듐(Clostridium) 박테리아 (미국 특허 제4,647,538호)로부터 얻었었다. 말토스 이외에도, 박테리아로부터 유도된 β-아밀라제는 상당량의 말토트리오스를 생성하는 반면, 식물성 β-아밀라제는 비교적 다량의 말토스를 생성하므로, 이들은 가능한한 단맛이 있고 및/또는 발효 가능한 산물을 얻고자 하는 목적의 방법에 더욱 적합하다. 그 외에도, 박테리아로부터 대량의 β-아밀라제를 생성하는 것은 곤란하다. 이러한 산업에서 사용되는 β-아밀라제는 통상의 곡류, 특히 맥류 및 소맥류와 같은 식물성이지만, 또한 대두도 마찬가지로 효소원으로서 사용된다.
β-아밀라제는 성장중에 이것이 저장되는 그레인중에서 형성된다. 그레인은 배아 및 전분 함유 배유, 즉 낟알로 이루어지는데, 여기서 이들은 배반에 의해 서로 분리된다. 배유는 호분층으로 둘러싸이며, 전곡은 과피층, 종피층 및 실제의 각피로 둘러싸여 있다. 소맥은 적절한 각피가 없으나, 과피 및 종피가 딱딱한 외피를 형성한다. β-아밀라제는 주로 배유 및 배반 중에 축적된다. 다량의 β-아밀라제는 호분층의 바로 아래에 배유의 최외층에서 발견된다.
맥류의 β-아밀라제는 심도있게 연구되어 왔다. 이러한 β-아밀라제 및 이의 제법은 문헌[D.E. Briggs, Barley, Chapman & Hall, 런던, 1978; Cook, Barley and Malt, Academic Press, 런던, 1962; J.R.A. Pollock, Brewing Science, Academic Press, 런던, 1979]에 기재되어 있다. 효소의 체계적인 명칭은 1,4-α-D-글루칸 말토히드롤라제(EC 3.2.1.2)이다. 과거에는 곡류의 β-아밀라제가 우선 곡류를 분쇄 및 제분한 후, 이를 물 또는 완충액으로 β-아밀라제를 추출하여 분리하였다. 이러한 유형의 추출물로부터의 효소의 정제는 본래 곤란하며 또한 많은 노동력이 필요한데 이는 관련 효소 이외에도, 추출물이 그레인의 기타의 다수의 가용성 성분을 함유하기 때문이다. 예를 들면 효소에 황산암모늄의 존재하에 중합체를 흡착시켜 이를 함유하는 용액으로부터 β-아밀라제를 분리하는 것을 개선시키고자 하는 시도가 이루어졌었다 (미국 특허 제5,294,341호). 글루텐으로부터 β-아밀라제의 방출은 프로테아제를 사용하여 실험하였다 (JP 63 079 590).
또한, β-아밀라제는 알긴산나트륨을 첨가하고, 응결된 효소를 회수하거나(JP 60 027 383) 또는, 효소가 흡착되어 이로부터 회수되는 인산칼슘겔을 형성함으로써(JP 63 248 389) 소맥 전분 생성의 폐액으로부터 분리되어 왔다. 전분 생성으로부터의 폐액은 β-아밀라제의 양호한 공급원이 아닌데, 이는 이것이 매우 묽으며 다량의 기타의 성분을 함유하고 있어서 정제 및 농축이 곤란하게 되며, 그 결과 수율이 저조하게 되기 때문이다.
더 순수한 미정제 추출물을 얻고 그리고 곤란한 하류 공정을 방지하기 위하여서는, 전체가 또는 부분적으로 거피된 그레인으로부터 β-아밀라제를 추출하는 것이 제안되어 왔다. 예를 들면 맥류 그레인은 이의 배유가 분해되지 않는 방식으로 거피되는 경우, 배유의 최외층이 침적수에 대한 불용성 물질의 접근을 막고, 가용성 물질의 접근을 제한하는 일종의 필터의 역할을 한다. 그레인의 기타의 단백질로부터 β-아밀라제를 방출하는 환원 물질의 존재하에 추출을 수행하는 것이 바람직하다(FI 61,516 및 미국 특허 제4,675,296호).
곡류 추출 시간을 단축하며, 효소 수율을 향상시키는 곡류로부터 β-아밀라제를 추출하는 방법을 발명하였다. 이러한 방법은 수행하기가 간편하며, 특히 거피된 곡류의 처리에 적합하며, 또한, 효소의 추가의 정제를 용이하게 한다.
본 발명에 의한 β-아밀라제의 추출 방법은 β-아밀라제의 추출물을 얻기 위하여 수성 매질 내에서 셀룰라제의 존재하에 곡류를 추출시키는 것을 특징으로 한다. 또한, 본 발명은 곡류로부터 β-아밀라제의 추출에 있어서의 셀룰라제의 용도에 관한 것이다.
셀룰라제는 예를 들면 슬러리의 점도를 감소시키고, 단백질로부터 전분을 분리하기 위하여 제분 처리한 곡류로부터 전분의 생성에 사용된다. β-아밀라제의 추출수에 셀룰라제를 첨가하여 β-아밀라제의 수율을 향상시키고, 추출 시간을 단축시킬 수 있다는 놀라운 사실을 발견하기에 이르렀다. 본 발명의 바람직한 구체예는 종속항에 기재되어 있다.
본 발명의 방법은 각종 β-아밀라제 함유 곡류의 추출에, 예를 들면 소맥류, 맥류, 호밀 및 대두의 처리에 적용할 수 있다. 소맥 및 호밀 및, 특히 맥류의 β-아밀라제 추출에 사용되는 것이 바람직하다. 미발아 그레인은 β-아밀라제 이외의 상당량의 효소를 함유하지 않으며, 이러한 이유로 인해서 이러한 그레인으로부터 β-아밀라제를 추출하는 것은 가치가 있는 일이다. 효소는 미거피된 그레인으로부터 추출할 수도 있으나, 거피, 제분, 분쇄 또는 연마된 그레인으로부터 추출되는 것이 바람직하다. 호밀 및 맥류를 거피하는 것이 이롭다. 거피된 맥류 그레인으로부터 추출하여 최상의 결과를 얻는다.
추출물에 대한 그레인 배유로부터 전분의 접근을 방지하기 위하여서는, 실제의 생그레인이 파열되지 않도록 거피를 수행하여야만 한다. 그러나, 실제의 각피는 가능한한 주의하여 거피하여야 한다. 그 이유는 각피가 상당히 두꺼워서 β-아밀라제의 침투를 막기 때문이다. 그리하여 거피된 맥류는 그레인의 실제의 각피를 제거하되 배유는 잔존하도록 처리한 맥류를 의미한다. 실제로, 이는 미거피 그레인의 약 20 중량% 이하가 거피에 의해 제거되는 것을 의미한다. 일반적으로 10∼20%가 각피 물질로서 제거된다. 이러한 경우, 배유의 최상층(과피, 종피 및 호분층)은 일종의 울트라 필터로서 작용하며, 이는 불용성 물질의 접근을 방지하고, 실질적으로 추출수로 가용성 물질의 접근을 방지한다. 이와 같은 방식으로 처리한 그레인으로부터 얻은 추출물은 비교적 순수하며, 이는 추가의 처리, 예컨대 효소의 정제 및 농축을 촉진한다. 일반적으로 효소 산업에서 공지된 방법, 예컨대 가압 여과 및 초여과는 추가의 공정에 사용될 수 있다.
곡류를 물과 같은 수성 매질 또는 가능한한 완충액내에서 추출한다. 추출시, pH는 일반적으로 6.0∼6.5가 된다. 추출은 환원 조건하에서 수행되는 것이 바람직하다. 상당량의 환원 활성이 사용되어 그레인의 구조 단백질에 결합된 β-아밀라제를 방출한다. 환원 조건은 그 자체로서 공지된 방법으로 정렬되는데, 실제로 SO2를 사용하여 예를 들면 메타중아황산나트륨 및/또는 아황산나트륨을 첨가하는 것으로 정렬된다. 거피된 그레인:수성 매질의 비는 5:8∼2:3 (w/v)인 것이 바람직하다. 본 발명의 방법은 예를 들면 거피된 맥류 19 톤 및, 메타중아황산나트륨 0.5% 및 아황산나트륨 0.5%를 함유하는 물 29 ㎥를 첨가한 스틸 실로(steel silo)내에서 추출 공정을 수행하는 산업적 규모의 공정에 적합하다.
전술한 방법으로 맥류를 추출함으로써, 맥류의 β-아밀라제 총 함량의 약 45∼50%를 포함하는 추출 수율을, 그레인 내부에 잔존하는 수분을 분리하지 않고도 얻을 수 있다. 이러한 경우, 추출 시간은 약 72 시간이다. 셀룰라제를 추출수에 첨가하는 경우, 곡류 중의 β-아밀라제의 총량의 65% 정도를 추출할 수 있으며, 추출 시간은 약 60 시간으로 단축된다.
셀룰로스는 글루코스 단위가 β-1,4-글루코시드 결합에 의해 결합되는 직쇄형 글루코스 다당류이다. 이는 종종 리그닌 및 헤미셀룰로스와 함께 존재하는 식물의 세포벽에서 발견된다. 셀룰로스의 분해 반응에 참여하는 효소를 셀룰라제로 간주한다. 셀룰라제는 전분 제조, 종이 매스 처리, 직물 처리, 양조장에서의 β-글루칸의 분해에서, 그리고 제과점에서의 소맥분 품질의 개선에서 공업적으로 사용된다. 본 발명에 의한 공정에서, 셀룰라제는 생그레인의 모든 각피 아래의 표면 구조를 분해한다.
시판되는 셀룰라제 제품은 바실러스속과 같은 박테리아로부터 또는 효모 [예를 들면 사카로마이세스(Saccharomyces)] 또는 곰팡이와 같은 진균으로부터 유도된다. 다량의 셀룰라제는 특히 진균 곰팡이로부터 분리된다. 가장 통상적으로 사용되는 셀룰라제 생성 곰팡이는 후미콜라(Humicola)속, 푸사륨(Fusarium)속, 마이셀리옵토라(Myceliopthora)속, 아스페르질루스(Aspergillus)속, 페니실륨(Penicillium)속 및 트리코더마(Trichoderma)속에 속한다. 몇몇의 생성 균주는 유전적으로 변형된다. 본 발명은 진균 곰팡이, 특히 트리코더마 곰팡이로부터 유도된 셀룰라제를 사용하는 것이 바람직하다.
시판되는 효소 제제는 수개의 효소 활성을 함유하며, 이의 함량 및 비율은 제조업자마다 약간씩 상이하다. 본 발명은 생성물이 적어도 셀룰라제, 헤미셀룰라제 및 β-글루카나제 활성을 포함하여야 하는 것이 중요하다. 즉, 본 명세서에서, 셀룰라제는 적어도 셀룰로스, 헤미셀룰로스 및 β-글루칸을 분해하는 효소 제제를 칭한다. 본 출원인에 의해 테스트된 모든 시판되는 셀룰라제 제품 (지넨코 인터내셔날, 롬 엔지머 게엠베하 및 노보 노르스크 제조) 모두는 β-아밀라제의 수율을 개선시킨다. 셀룰라제, 헤미셀룰라제 및 β-글루카나제 활성은 문헌[Novo's Handbook of Practical Biotechnology, 1986]에 기재되어 있다.
셀룰라제는 예를 들면 엔도셀룰라제, 엑소셀룰라제, 엑소셀로바이오히드롤라제 및 셀로바이아제로 분할될 수 있다. 엔도셀룰라제, 즉, 1,4-β-D-글루칸 글루카노히드롤라제는 분자내의 셀룰로스의 β-1,4-결합을 무작위로 분해하며, 올리고당을 형성한다. 엑소셀룰라제, 즉, 1,4-β-D-글루칸 글루코히드롤라제는 분자의 말단에서 β-1,4-결합을 분해하여 글루코스를 방출한다. 셀로바이오스에 대한 이의 효과는 느리다. 엑소셀로바이오히드롤라제, 즉, 1,4-β-D-글루칸 셀로바이오히드롤라제는 분자의 비-환원 말단에서 전술한 결합을 분해하여 셀로바이오스를 형성하며, 셀로바이아제, 즉, β-D-글루코시드 글루코히드롤라제는 셀로바이오스를 글루코스로 분해한다. 셀룰로스를 글루코스로 가수분해하는 것은, 분자의 내부 및 치환된 기질을 분해하나 결정화된 셀룰로스를 분해하지는 않는 엔도글루카나제 (1,4-β-D-글루칸 글루카노히드롤라제, EC 3.2.1.4), 결정화된 셀룰로스를 분해하는 셀로바이오히드롤라제 (1,4-β-D-글루칸 셀로바이오히드롤라제, EC 3.2.1.91) 및, 셀로바이오스 및 셀로올리고당을 글루코스로 분해하는 셀로바이아제인 β-글루코시다제(β-D-글루코시드 글루코히드롤라제, EC 3.2.1.21)을 필요로 한다.
헤미셀룰로스를 분해하는 효소군, 즉 천연에서 발견되며 펩토스, 예를 들면 아라비난, 갈락탄, 만난 및 크실란을 함유하는 다당류는 헤미셀룰라제로 칭한다. β-글루카나제는 β-D-글루칸, 즉 β-1,3 및 β-1,4 결합 모두를 함유하며 분지쇄를 포함할 수 있는 글루코스중합체를 분해한다. β-글루칸은 예를 들면 그레인의 배유의 세포벽에서 발견된다. 라이커나제(lichenase)는 β-1,3 및 β-1,4 결합을 함유하는 β-글루칸의 β-1,4 결합을 분해하는 엔도-β-글루카나제 (1,3·1,4-β-D-글루칸-4-글루카노히드롤라제)이다. 라미나리나제 (1,3-β-D-글루칸-3-글루카노히드롤라제)는 β-1,3 결합, 예컨대 라미나린형 탄수화물의 β-1,3 결합만을 함유하는 β-글루칸을 분해하며, 엑소글루카나제 (1,3-β-D-글루칸 글루코히드롤라제)는 β-1,3-글루칸의 β-1,3-결합을 분해하여 주로 글루코즈를 형성한다.
β-아밀라제의 추출시에, 예를 들면 지넨코 인터내셔날에서 생산하는 셀룰라제 제제 Spezyme CE 및 GC 440을 사용하여 유용한 결과를 얻었었다. 이는 유전자 변형된 트리코더마 론기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum) 균주로부터 유도되며, 이는 셀룰로스, 헤미셀룰로스 및 β-글루칸을 매우 효율적으로 분해한다. 이의 활성은 카르복시메틸 셀룰로스(RBB-CMC)에 대한 효능으로서 나타내는데, 이러한 경우, RBB-CMC 활성은 1,400 IU/g 이상이 된다. 셀룰라제 활성 이외에, GC440은 β-글루카나제, β-글루코시다제, β-자일로시다제, 자일라나제 및 아세틸에스테라제 활성을 갖는다. GC 440의 통상적인 배취는 평균 약 7,000∼9,000 U/㎖의 DNS-CMC, 약 6,000∼8,000 U/㎖의 β-글루카나제, 약 80∼90 U/㎖의 β-글루코시다제, 약 500∼600 nkat/㎖의 β-자일로시다제, 약 1,700∼2,000 nkat/㎖의 아세틸에스테라제, 약 700∼1,400 U/㎖의 RBB 크실라나제 및 약 1,900∼2,100 U/㎖의 DNS 크실라나제를 함유한다. 또한, 등록상표 Rohalase Sep로 시판되는 롬 엔짐 게엠베하에서 생산하는 셀룰라제를 사용하여 매우 양호한 결과를 얻을 수 있다. 이러한 제제는 트리코더마 레에세이(Trichoderma reesei) 균주로부터 유도되며, 이는 상당량의 β-1,4-엔도글루카나제 활성(적어도 4,700 CU/g) 및 자일라나제(적어도 3,000 XylH/g) 및 소량의 셀로바이오하드롤라제 활성을 갖는다. 또한, β-1,3-글루카나제 활성, 즉 라미나리나제를 포함한다. 전술한 효소 제제를 사용할 경우, 셀룰라제의 적량은 곡류의 0.015 중량% 이상, 바람직하게는 0.020 중량% 이상, 예를 들면 0.018∼0.040 중량%, 특히 0.024∼0.030 중량%가 된다.
β-아밀라제는 20℃∼45℃의 온도에서 셀룰라제의 존재하에 추출될 수 있다. 온도는 25℃∼32℃가 바람직하고, 예를 들면 29℃∼31℃이다. 추출 시간은 30∼72 시간이 될 수 있으며, 일반적으로 48 시간 이상, 예를 들면 48∼66 시간, 특히 55∼62 시간이다. 30℃에서의 적절한 추출 시간은 약 60 시간이다. 추출을 완료한 후, 그레인, 그로트(groat) 또는 분말류를 예를 들면 체를 사용하여 추출수로부터 분리하며, β-아밀라제를 추출수로부터 회수하고, 필요할 경우 이로부터 정제 및/또는 농축시킨다.
추출후, 이와 같이 추출 및 분리된 곡류를 예를 들면 전분 생산을 위해 사용할 수 있다. 본 발명에 의하면, β-아밀라제를 추출하고, 추출물을 곡류로부터 분리한 후, 전분을 분별하고, 곡류로부터 분리한다. 효소를 미분쇄 그레인으로부터 추출하였을 경우, 추출된 그레인을 우선 제분하고, 그후 전분 생산 공정을 그 자체로 공지된 방법에 의해 수행하고, 즉, 제분된 그레인을 물에 혼합하고, 곡류를 체 및 원심력을 사용하여 분별 처리하였다. 제분시, 통상적으로 셀룰라제를 β-글루카나제와 함께 첨가하여 점도를 낮추고 단백질로부터 전분을 분리한다.
이하의 실시예는 본 명세서에 개시된 구체예에 의하여 제한되지 아니하면서 본 발명을 예시한다.
실시예 1
β-아밀라제의 측정
곡류로부터의 β-아밀라제 총량을 측정하기 이전에 모든 각피를 거피시키고, 분석하고자 하는 곡류를 건조시 고운 가루로 제분하고, 이의 10 g을 100 ㎖ 삼각플라스크병에 넣었다. 100 ㎖의 0.5% (w/v)의 아황산나트륨 용액을 첨가하고, 물질을 적절히 혼합하였다. 혼합물을 병에 24 시간 동안 방치하였으며, 병을 가끔씩 흔들어 주었다. 그후, 이를 적절히 혼합하고, 얇은 여과지(MN 640W)로 여과하였다. 여액을 증류수를 사용하여 1:50의 비로 희석하고, 이의 활성을 이하의 방법으로 측정하였다. 이러한 효소 분석을 후술하는 실시예에서 추출물의 β-아밀라제 함량의 측정으로서 사용하였다.
β-아밀라제는 문헌[Food Chemical Codex IV, General Test and Apparatus, 485]에 기재된 바와 같이 측정하였다.
본 명세서에서 DP 단위(당화력)는 20℃에서 1 시간 동안 기질 100 ㎖로부터 Fehling 용액 5 ㎖를 환원시키기에 충분한 환원당의 함량을 생성하는 5% 시료 희석액 0.1 ㎖ 중의 효소의 함량으로 정의한다 (측정법은 DP의 정의에 상응하지 않는다).
효소 활성은 pH 4.6, 20℃에서 30 분간 전분의 가수분해에 의해 측정하였다. 생성된 환원당은 알칼리 페리시안화물을 사용하여 적정분석법으로 측정하였다. 전분 기질을 생성하기 위하여, 전분 (건조 물질) 20 g을 물 약 50 ㎖와 혼합하였다. 비등수 약 500 ㎖을 첨가하고, 혼합물을 정확하게 2 분간 비등시켰다. 아세트산염 완충액(0.5 M, pH 4.6) 20 ㎖를 저온의 전분액에 첨가하고, 이를 증류수로 1 ℓ로 희석하였다. 20℃로 템퍼링 처리된 전분 기질 200 ㎖를 피펫으로 250 ㎖의 매스 플라스크에 넣고, 희석된 효소 시료 10 ㎖를 첨가하고, 물질을 잘 혼합하였다. 시료를 30 분간 수조 중에서 20℃에서 정확하게 30 분간 항온 처리하고, 0.5 N NaOH 20 ㎖를 첨가하였다. 이 물질을 잘 혼합하고, 이를 250㎖로 희석하였다. 효소 희석액 10 ㎖ 및 0.5 N NaOH 20 ㎖를 피펫으로 0-시료용 250 ㎖ 매스 플라스크에 넣었다. 이 물질을 잘 혼합하고, 전분 기질 200 ㎖를 첨가하고, 이를 250 ㎖로 희석하였다.
0.05 N의 페리시안화물 제제는 페리시안화칼륨[K3Fe(CN)6] 16.5 g 및 탄산나트륨(Na2CO3) 22 g을 물에 용해하고, 이를 1 ℓ로 희석하여 생성하였다. A-P-Z 용액은 염화칼륨(KCl) 70 g 및 황산아연 (ZnSO4×7H2O) 20 g을 증류수 700 ㎖에 용해하고, 농아세트산 200 ㎖을 첨가하고, 이를 1 ℓ로 희석하여 생성하였다. 요오드화칼륨 용액은 요오드화칼륨(KI) 50 g을 증류수 100 ㎖에 용해시키고, 50%의 수산화나트륨(NaOH) 2 방울을 첨가하여 생성하였다. 페리시안화물 제제 10 ㎖ 및 시료 5 ㎖를 250 ㎖의 매스 플라스크에 피펫으로 넣었다. 이를 잘 혼합하고, 이를 비등수조에서 정확하게 20 분간 가열하였다. 용액을 냉각시키고, A-P-Z 제제 25 ㎖ 및 KI 용액 1 ㎖를 첨가하였다. 혼합물을 0.05 N의 황산나트륨 용액으로 청색이 사라질 때까지 적정하였다(암청색→백색).
β-아밀라제 활성은 하기 수학식 1에 의하여 연산하였다.
상기 수학식에서, V0는 적정시 0-시료에 의한 소비량(㎖)이고,
V1은 적정시 시료에 의한 소비량(㎖)이고,
K는 희석율이다.
실시예 2
β-아밀라제의 추출 시간에 대한 셀룰라제의 효과를 연구하였다. β-아밀라제는 셀룰라제를 사용하지 않고 그리고 이를 사용하여 맥류로부터 추출하였다. 거피기를 사용하여 거피된 맥류 10 ㎏을 0.5%의 메타아황산나트륨과 0.5%의 아황산나트륨을 포함하는 물 15 ℓ에서 추출하였다. 또한, 지넨코에서 생산하는 GC440 셀룰라제를 제2의 배취에 첨가하였으며, 셀룰라제의 함량은 거피된 맥류 중량의 0.029%에 해당한다. 추출은 30℃에서 수행하였다. 추출에 사용된 그레인의 활성은 155 DP°/g이고, 이는 실시예 1에 의해 측정하였다. 결과를 하기 표 1 및 표 2에 기재하였다.
| 셀룰라제를 사용하지 않은 추출 | |
| 시간(h) | 추출 용액 중의 β-아밀라제 활성(DP°/㎖) |
| 10 | 20 |
| 24 | 47 |
| 30 | 55 |
| 48 | 83 |
| 60 | 92 |
| 66 | 98 |
| 72 | 102 |
| 96 | 86 |
| 셀룰라제를 사용한 추출 | |
| 시간(h) | 추출 용액 중의 β-아밀라제 활성(DP°/㎖) |
| 10 | 23 |
| 24 | 55 |
| 30 | 70 |
| 48 | 92 |
| 60 | 104 |
| 66 | 104 |
| 72 | 100 |
| 96 | 90 |
이러한 결과에 의하면, 추출수에 셀룰라제를 첨가함으로써 β-아밀라제의 추출 시간을 단축시킨다는 것을 알 수 있다.
실시예 3
추출 수율에 대한 셀룰라제의 효과를 연구하였다. β-아밀라제 활성이 155 DP°/g인 거피된 맥류 10 ㎏을 0.5%의 메타아황산나트륨 및 0.5%의 아황산나트륨을 함유하는 물 15 ℓ에서 추출하였다. 추출을 30℃에서 셀룰라제를 사용하지 않거나 또는 셀룰라제의 존재하에 수행하였다.
셀룰라제를 사용하지 않은 추출 시간은 72 시간이었다. 사용한 맥류량의 총 활성은 1,550 kDP°이었다. 활성이 95 DP°/㎖인 추출물 8,175 ㎖는 추출물을 체로 분별하여 얻었다. 그리하여 얻은 추출물의 총 활성은 776.6 kDP°이고, 추출 수율은 50.1%이었다.
해당 추출은 거피된 맥류 중량의 0.025%에 해당하는 함량의 GC440을 첨가하여 셀룰라제의 존재하에 수행하였다. 추출 시간은 60 시간이었다. 사용된 맥류량의 총 활성은 1,550 kDP°이었다. 활성이 102°DP/㎖인 추출물 9,825 ㎖는 추출물을 체로 분별하여 얻었다. 그리하여 얻은 추출물의 총 활성은 1,002.2 kDP°이고, 추출 수율은 64.7%이었다.
이러한 결과에 의하면, 추출수에 셀룰라제를 첨가함으로써 β-아밀라제의 수율이 증가되었다.
실시예 4
β-아밀라제의 추출에 대한 온도의 효과를 연구하였다. 거피된 맥류를 전술한 실시예에 기재된 바와 같은 방법으로 여러 온도에서 셀룰라제의 존재하에 추출하였다. 셀룰라제 GC440의 사용량은 거피된 맥류 중량의 0.027%에 해당하며, 추출 온도는 20℃, 25℃, 30℃ 또는 40℃이었다. 그 결과를 도 1에 도시한다. 최상의 결과는 30℃에서 얻었다.
실시예 5
밀로부터의 β-아밀라제 수율에 대한 셀룰라제의 효과를 연구하였다. β-아밀라제 활성이 128 DP°/g인 분쇄된 소맥 10 ㎏을 0.5%의 메타아황산나트륨 및 0.5%의 아황산나트륨을 함유하는 물 15 ℓ에서 추출하였다. 추출을 30℃에서 셀룰라제를 사용하지 않고, 또는 셀룰라제의 존재하에 수행하였다.
셀룰라제를 사용하지 않은 추출 시간은 72 시간이었다. 사용된 소맥량의 총 활성은 1,280 kDP°이었다. 활성이 55°DP/㎖인 추출물 9,175 ㎖는 추출물을 체로 분별하여 얻었다. 그리하여 얻은 추출물의 총 활성은 504.6 kDP°이고, 추출 수율은 39.4%이었다.
해당 추출은 분쇄된 소맥에 그로트 중량의 0.036%에 해당하는 GC440 셀룰라제를 첨가하여 셀룰라제의 존재하에 수행하였다. 추출 시간은 60 시간이었다. 사용된 소맥량의 총 활성은 1,280 kDP°이었다. 활성이 72 DP°/㎖인 추출물 10,080 ㎖는 추출물을 체로 분별하여 얻었다. 그리하여 얻은 추출물의 총 활성은 725.8 kDP°이고, 추출 수율은 56.7%이었다.
이러한 결과에 의하면, 추출수에 셀룰라제를 첨가함으로써 β-아밀라제의 수율이 증가되었다.
실시예 6
도정 처리된 소맥으로부터의 β-아밀라제의 수율에 대한 셀룰라제의 효과를 연구하였다. 소맥은 쌀 도정기를 사용하여 표면을 파열시키고, 최상부를 제거하고, 즉 대부분의 과피를 제거하고, 종피를 약간 손상시켜 도정시킨다. β-아밀라제 활성이 128 DP°/g인 도정밀 10 ㎏을 0.5%의 메타아황산나트륨 및 0.5%의 아황산나트륨을 함유하는 물 15 ℓ에서 추출하였다. 추출을 30℃에서 셀룰라제를 사용하지 않고, 또는 셀룰라제의 존재하에 수행하였다.
셀룰라제를 사용하지 않은 추출 시간은 72 시간이었다. 사용된 소맥량의 총 활성은 1,280 kDP°이었다. 활성이 15 DP°/㎖인 추출물 9,780 ㎖는 추출물을 체로 분별하여 얻었다. 그리하여 얻은 추출물의 총 활성은 146.7 kDP°이고, 추출 수율은 11.5%이었다.
해당 추출은 도정 소맥 중량의 0.036%에 해당하는 함량의 GC440 셀룰라제를 분쇄된 소맥에 첨가하여 셀룰라제의 존재하에 수행하였다. 추출 시간은 60 시간이었다. 사용된 소맥량의 총 활성은 1,280 kDP°이었다. 활성이 35 DP°/㎖인 추출물 9,250 ㎖는 추출물을 체로 분별하여 얻었다. 그리하여 얻은 추출물의 총 활성은 323.8 kDP°이고, 추출 수율은 25.3%이었다.
이러한 결과에 의하면, 추출수에 셀룰라제를 첨가함으로써 β-아밀라제의 수율이 증가되었다는 것을 알았다.
상기한 바에 의하면, 셀룰라제를 사용함으로써 β-아밀라제의 추출 시간이 단축되며, 이의 수율이 증가된다.
도 1은 시간에 대한 β-아밀라제의 수율에 대한 온도의 영향을 도시한다.
Claims (18)
- 곡류로부터 β-아밀라제를 추출하는 방법으로서,상기 방법은 β-아밀라제를 함유하는 추출물을 얻기 위하여 수성 매질 중에서 셀룰라제의 존재하에 곡류를 추출한 후, 상기 매질로부터 β-아밀라제를 회수하는 것을 특징으로 하고,상기 셀룰라제는 셀룰라제, 헤미셀룰라제 및 β-글루카나제로부터 선택되는 활성을 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, β-아밀라제는 맥류, 소맥류 또는 호밀로부터 추출되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, β-아밀라제는 거피된 맥류로부터 추출되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, β-아밀라제는 거피, 제분, 분쇄, 연마 및 이들의 조합으로부터 선택된 공정에 의하여 처리된 곡류의 그레인으로부터 추출되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 추출은 환원 조건하에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 환원 조건은 그레인의 구조 단백질에 결합된 β-아밀라제를 방출할 수 있는 환원 활성을 제공하도록 변형되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 환원 조건은 메타중아황산나트륨 및 아황산나트륨으로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물을 첨가함으로써 얻어지는 SO2 함유 물에 의하여 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 거피된 맥류는 메타중아황산나트륨 및 아황산나트륨으로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물을 첨가함으로써 얻어지는 SO2 함유 물을 사용하여 5:8∼2:3 (w/v) (거피된 맥류: SO2 함유 물) 비로 추출하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 추출은 25℃∼33℃의 온도에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 추출 시간은 48∼66 시간인 것을 특징으로 하는 방법.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 셀룰라제는 곰팡이의 셀룰라제를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 트리코더마(Trichoderma) 곰팡이의 셀룰라제를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 셀룰라제는 후미콜라(Humicola), 푸사륨(Fusarium), 마이셀리옵토라(Myceliopthora), 아스페르질루스(Aspergillus), 페니실륨(Penicillium), 트리코더마(Trichoderma) 및 이들의 조합으로부터 선택된 속의 셀룰라제를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, β-아밀라제는 제분된 그레인으로부터 추출되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 회수된 β-아밀라제는 정제, 농축 및 이의 조합으로부터 선택된 처리에 의하여 처리되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제9항에 있어서, 추출은 29℃∼31℃의 온도에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제10항에 있어서, 추출 시간은 55∼62 시간인 것을 특징으로 하는 방법.
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| PA0109 | Patent application |
Patent event code: PA01091R01D Comment text: Patent Application Patent event date: 20020204 |
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| A201 | Request for examination | ||
| PA0201 | Request for examination |
Patent event code: PA02012R01D Patent event date: 20020402 Comment text: Request for Examination of Application Patent event code: PA02011R01I Patent event date: 20020204 Comment text: Patent Application |
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| PG1501 | Laying open of application | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| PE0902 | Notice of grounds for rejection |
Comment text: Notification of reason for refusal Patent event date: 20041008 Patent event code: PE09021S01D |
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| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| PE0701 | Decision of registration |
Patent event code: PE07011S01D Comment text: Decision to Grant Registration Patent event date: 20050228 |
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| GRNT | Written decision to grant | ||
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Comment text: Registration of Establishment Patent event date: 20050407 Patent event code: PR07011E01D |
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Payment date: 20050408 End annual number: 3 Start annual number: 1 |
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| PG1601 | Publication of registration | ||
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Payment date: 20080402 Start annual number: 4 End annual number: 4 |
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| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20090403 Start annual number: 5 End annual number: 5 |
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Payment date: 20100331 Start annual number: 6 End annual number: 6 |
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Payment date: 20110325 Start annual number: 7 End annual number: 7 |
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Payment date: 20120327 Start annual number: 8 End annual number: 8 |
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| FPAY | Annual fee payment | ||
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20130325 Start annual number: 9 End annual number: 9 |
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Payment date: 20140401 Start annual number: 10 End annual number: 10 |
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Payment date: 20150320 Start annual number: 11 End annual number: 11 |
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| LAPS | Lapse due to unpaid annual fee | ||
| PC1903 | Unpaid annual fee |