JPS60126080A - β−アミラ−ゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、バチルス属に属するβ−アミラーゼ生産菌を
培地に培養してβ−アミラーゼを生成蓄積せしめ、これ
を採取する方法において、培地に添加剤としてチオグリ
コール酸またはその塩を含有せしめてβ−アミラーゼの
生産を増強する方法に関する。

β−アミラーゼ〔系統名：１．４−α−Ｄ−グルカンマ
ルトハイドロラーゼ（１＋４−　ｔｘ　−Ｄ　−Ｇｌｕ
ｃａｎｍａｌｔｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ）　＋ＥＣ３，２
，１，２）は澱粉、グリコーゲン、デキストリンなどか
らマルトースを分離する酵素として有用である。従来β
−アミラーゼの供給源としては主として高等植物、たと
えば大麦麦芽、小麦、大豆、甘藷などが知られている。

近年バチルス属などの微生物にβ−アミラーゼの生産能
が見いだされたが、多くは生産性が低く実用に至ってい
るものは少ない。従来、バチルス属微生物によるβ−ア
ミラーゼ生産の改良法としては、たとえばバチルス・メ
ガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ　
）を澱粉を含む培地に培養する方法（特公昭５３−４５
３９３号公報）、バチルス・セレウス（Ｂ、　ｃｅｒｅ
ｕｓ　）を培養するに際し、バリウムイオンあるいは化
エン酸または酒石酸を存在せしめた培地を用いる方法、
種培養を特定のｐＨで行う方法（特公昭５３−５７４８
号公報、同５２−３０５９０号公報、同５２−３０５８
９号公報）などが知られている。

本発明者らはバチルス属微生物によるβ−アミラーゼの
生産について鋭意研究したところ、これらバチルス属産
生のβ−アミラーゼは、通気攪拌工法部培養を行うと、
せっかく生産されたβ−アミラーゼが失活してしまうと
いう現象に気がついた。従来、バチルス属のβ−アミラ
ーゼは、チオール酵素であること、チオール基と可逆的
にメルカプチドを形成する試薬、たとえばＰ−クロロマ
ーキュリ安息香酸によって阻害され、この阻害はシスチ
ンのようなチオール化合物を過剰に加えることにより直
ちに回復することが知られている〔八ｇｒ、　Ｂｉｏｌ
、　Ｃｈｅｌｌｌ、　（アグリカルチュラルロジカル・
ケミストリー）第３８巻，　１０２３〜１０２９頁（１
９７４）　、同第４０巻，　１５２３〜１５３０頁（１
９７６）および同第４３巻．７１９〜７２６頁（１９７
９）　）。そこで、本発明者らは各種チオール化合物を
培地に添加してβ−アミラーゼの生産を試験したところ
、意外にもチオグリコール酸またはその塩のみがβ−ア
ミラーゼの失活防止に効果のあることを見いだし、本発
明の完成に至ったものである。

本発明法において培地の添加剤として使用するチオグリ
コール酸またはその塩とは、チオグリコール酸、チオグ
リコール酸ナトリウム、チオグリコール酸アンモニウム
などである。これら添加剤の培地への添加量は、菌の生
育に阻害とならない濃度であればよく、好ましくはｏ．
ｏｏｏｔ〜０．０５％（Ｗ／Ｖ）の範囲である。培地へ
の添加時期は、培養の最初、または培養の途中のいずれ
でもよいが、好ましくは菌が生育してβ−アミラーゼが
生産され始めた時期に添加するのがよい。添加回数は、
−回でもまた数回添加してもよい。

本発明法で使用する微生物はバチルス属に属するβ−ア
ミラーゼ生産菌であればいずれでもよく、例えばバチル
ス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ　）、
バチルス・メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ　
）　＼バチルス・サーキュランス（　Ｂ．　ｃｉｒｃｕ
ｌａｎｓ）　、バチルス・ポリミキサ（Ｂ．　ｐｏｌｙ
ｍｙｘａ　）などが示される。より具体的にはバチルス
・セレウス　ＩＦＯ３００１、バチルス・セレウス・バ
リエータス・ミコイデス（Ｂ．　ｃｅｒｅｕｓ　ｖａｒ
．　ｍｙｃｏｉｄｅｓ　）　ＩへＭ　１１９０、バチル
ス・メガテリウム　１４Ｍ１０３０、バチルス・サーキ
ュランス　ＩＦＯ　３３２９　、バチルス・ポリミキサ
ＩＦＯ　３０２０　、バチルス・ポリミキサ＾ＴＣＣ　
８５２３などの保存菌株が例示される。

本発明法によりβ−アミラーゼを製造するには、まずバ
チルス属に属するβ−アミラーゼ生産菌株を培地に培養
して、培養物中にβ−アミラーゼを蓄積せしめる。培養
方法は、細菌の一般的な培養方法が用いられる。たとえ
ば、使用する培地としては、微生物が資化し得る炭素源
、窒素源、無機物および発育素、並びにチオグリコール
酸またはその塩を含む合成培地または天然培地が用いら
れる。炭素源としてはシュークロース、アミロース、ア
ミロペクチン、ポテトスターチ、コーンスターチ、コー
ンミール、ワキシースターチ、デキストリン、有機酸な
ど、窒素源としてはミルクカゼイン、ポリペプトン、大
豆カゼイン、酵母エキス、肉エキスなど、無機塩として
は塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、リン酸二カリウ
ム、塩化亜鉛、塩化バリウム、硫酸カリウム、硫酸銅、
塩化第二鉄、酸化カルシウム、リン酸−ナトリウム、リ
ン酸二ナトリウムなど、発育素としてはビタミンＢ１、
ビオチン、ビタミンＢ６、Ｄ−パントテン酸ナトリウム
、イノシトールなどが用いられる。

また、培養中の発泡を抑えるために、界面活性剤、シリ
コン、植物油などの消泡剤を添加することもできる。

培養は、通常振盪または通気攪拌下好気的条件のもとに
おこなうのがよい。培養温度は菌が生育しβ−アミラー
ゼが生産される範囲内であればいずれの温度でもよいが
、好ましくは２５〜３５°Ｃである。培地のｐＨは通常
７．５〜９．０の範囲が好ましい。

培養時間はβ−アミラーゼの生産が最大に達する時間を
選べばよく、通常５０〜７０時間である。

以上のようにして得られた培養物からβ−アミラーゼを
採取するには、その理化学的性質を利用して、公知の蛋
白質の精製法を適宜組み合わせて行うことができる。た
とえば、培養物をろ過もしくは遠心分離して菌体を除い
たのち、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどを用い
た塩析〜エタノール、メタノール、アセトンなどを用い
た有機溶媒沈澱、活性炭、シリカゲル、アルミナ、ヒド
ロキシアパタイト、セルロースなどを用いた吸着クロマ
トグラフィー、イオン交換樹脂、イオン交換セルロース
、イオン交換セファデックスなどを用いたイオン交換ク
ロマトグラフィー、セファデックス、バイオゲルなどを
用いたゲルろ過、電気泳動、限外ろ過、透析などの公知
の方法を任意の順序で適宜組み合せ、または繰り返すこ
とにより精製する。

次に、本発明におけるβ−アミラーゼ活性の単位につい
て説明すると、０．５％可溶性澱粉液（ｐＨ７，０、リ
ン酸緩衝液）を基質として４０℃、３０分間反応せしめ
、生じた還元糖量をフェーリング・レーマン・ジュール
（Ｆｅｈｌｉｎｇ−ＬｅｈＩｌａｎｎ−３ｃｈｏｏｌ）
法により測定したとき、１０ｍｇのグルコースに相当す
る還元力のマルトースを生成する酵素量を１単位とした
。

以下、試験例および実施例を以て本発明の詳細な説明す
る。

試験例 可溶性デンプン１．０％、ミルクカゼイン３．５％、酵
母エキス０．１％、塩化ナトリウム０．０１％、硫酸マ
グネシウム・７水塩０．１％、リン酸二カリウム０．４
％、グリシン０．０７５％、ビタミンＢ１塩酸塩２ｐｐ
Ｈ１、クエン酸ナトリウム０．０３％およびα−サイク
ロデキストリン０．１％からなる組成の培地（ｐＨ８，
２）　５０−を５００ｒＩｄ！容の坂ロフラズコに入れ
て殺菌後、第１表に示すごとく、バチルス属の保存菌株
を接種して振盪培養した。培養開始後０時間または１６
時間の各−回、または１６時間と３０時間の二回、チオ
グリコール酸ナトリウム、還元型グルタチオン、Ｌ−シ
スティン塩酸塩または２−メルカプトエタノールを、各
々の時間に０．０１％または０．００１％添加して、２
８℃において６０時間培養した。培養液のβ−アミラー
ゼ活性を測定し、添加剤を加えない場合の活性を１００
％としたときの相対値を第１表に示す。同表かられかる
ように、チオール化合物のなかでもチオグリコール酸ナ
トリウムにのみβ−アミラーゼの増産効果が認められ、
還元型グルタチオン、Ｌ−システィン塩酸塩および２−
メルカプトエタノールは効果が弱いか全く効果が無く、
むしろ高濃度（０，０１％）においては阻害的である。

実施例　１ 可溶性デンプン１．０％、ミルクカゼイン３．５％、酵
母エキス０．１％、塩化ナトリウム０．０１％、硫酸マ
グネシウム・７水塩０．１％、リン酸二カリウム０．４
％、グリシン０．０７５％、ビタミンＢ１塩酸塩２ｐｐ
ｍ　、クエン酸ナトリウム０．０３％およびα−サイク
ロデキストリン０．１％からなる組成の培地（ｐＨ８，
２）　５０ｍ１！を５０〇−容の坂ロフラスコに入れて
殺菌後、バチルス・ポリミキサＩＰ０３０２０株を接種
して振盪培養した。培養開始後、１６時間または１６時
間と４０時間の二面、チオグリコール酸、チオグリコー
ル酸ナトリウムまたばチオグリコール酸アンモニウムを
０．０１％または０．００１％添加して、２８°Ｃにお
いて６０時間培養したのち、培養液のβ−アミラーゼ活
性を測定した。添加剤を加えない場合の活性を１００％
としたときの相対値を第２表に示す。本発明法によって
β−アミラーゼが著しく増産されることがわかる。

第２表 実施例　２ ポテトスターチ０．５％、ポリペプトン２．０％、リン
酸二カリウム０．３％、硫酸マグネシウム７水塩０．１
％からなる組成の培地（ｐｌ＋　７．５）　５０ｍｅを
５００ｍｆ’容坂ロフラスコに入れて殺菌後、バチルス
・セレウス　ＩＦｏ　３００１株−白金耳を接種し、２
８℃で７時間振盪培養し種培養液とした。次いで、実施
例１と同じ組成の培地１５βの入った３０ｊ２容ジャー
ファーメンタ−に上記種培養液を接種して、温度２８°
Ｃ１通気量１．５１７分、攪拌回転数２０Ｏｒｐｍで培
養した。培養開始後１６時間と３０時間の二面、チオグ
リコール酸ナトリウムを各０．０１％添加して、６０時
間培養した。

培養液のβ−アミラーゼ活性を測定したところ、添加剤
を加えない場合と比較して１６９％の活性を示した。培
養液を遠心分離して菌体を除いたのち、上清を限外ろ過
濃縮し、次いでアルコール沈降をすることにより粗β−
アミラーゼ粉末９６ｇを得た。

特許出願人　天野製薬株式会社

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. バチルス属に属するβ−アミラーゼ生産菌を培地に培養
   してβ−アミラーゼを生成蓄積せしめ、これを採取する
   方法において、チオグリコール酸またはその塩を培地に
   添加することを特徴とするβ−アミラーゼの製造法。