JPH01104155A - 酒類の品質改良法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 仮象直へ捗叩列」 本発明は酒類の品質改良法に関する。

従来の技術 清酒、ビール、ぶどう酒、老酒などのすべての醸造酒中
及びウィスキー、ブランデー、焼酎等の蒸留萌の醪中に
はカルバミドが含まれており、このために酒類に異味を
与え、また加熱殺菌、長期間貯蔵により酒類の香味の劣
化を引き起こすなど品質劣化の大きな原因となっている
。このカルバミドを除去する方法として、ウレアーゼ酵
素剤を酒類または酒類発酵もろみに添加して、１０〜２
０℃の低温で反応させる方法（特公昭５６−２０８３０
）が知られている。

ウレアーゼ（１？：、Ｃ，３，５，Ｉ、５．）はカルバ
ミドをアンモニアと炭酸ガスとに分解する酵素であり、
植物、動物、微生物等広く天然界に分布、存在している
が、従来よりナタマメのウレアーゼやバチルス・バスト
ウリのウレアーゼが、工業的に製造され、実用に供され
ている。

３明が解決しようとする問題点 」−記のウレアーゼは、反応の至ＮｐＨが中性ないしア
ルカリ性に存在し、酸性側では反応がきわめて進行しに
くいばかりでなく、一般的に酵素が失活しやすく、とく
に反応温度が室温以上の場合や、アルコールなどの有機
溶媒を含む反応液中で失活が著しい。そのため、例えば
特公昭５６−２０８３０の方法では、ｐＨ約４．３、ア
ルコール濃度的２０％の清酒に含まれるカルバミドを除
去するのに、きわめて多量のナタマメや細菌由来のウレ
アーゼ（至適叶Ｉ６〜８）の添加を必要とし、しかも長
時間、１０〜２０℃という低温のみでしか反応を実施で
きないなどの欠点を有しており、酒類製造の工業的見地
からは、必ずしも満足な方法とはいえない。

問題点を解決するための手段 本発明者らは、品質のよい酒類を製造する上で、酸性で
かつアルコールを含有する酒類中においても、安定に作
用するウレアーゼが、必須であることを痛感し、鋭意、
研究を進めた結果、至適ｐ　Ｉ−Ｉが２〜５の酸性域に
ある乳酸菌由来のウレアーゼで酒類を処理することによ
り、少量のウレアーゼの添加で、高温でもきわめて短時
間に、酒類中のカルバミドを分解除去しうるとの知見を
得、さらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至っ
た。

すなわち本発明は、酒類を酸性ウレアーゼで処理するこ
とを特徴とする酒類の品質改良法である。

本発明に用いられる酸性ウレアーゼは、カルバミド１モ
ルと水１モルから、アンモニア２モルと炭酸ガス１モル
を生成し、その活性の至適ｐｌ−［域がｐｔ１２乃至５
にあるものをいい、とりわけＩ）Ｉ−１２乃至４．５に
あるものが望ましく、酵素のその他の一般的性質をあら
れすｐＨ安定性、至適温度、温度安定性、基質特異性、
阻害剤の種類、Ｋｒａ値、分子！１を等によっては、と
くに制限をうけない。

酸性ウレアーゼは、通常、酸性ウレアーゼを産生ずる能
力を有する微生物菌株を培養して生産される。微生物菌
株としては、いわゆる「乳酸菌」と呼ばれる種類の細菌
がよく、例えば、ストレプトコッカス居、ペディオコブ
カス属、ロイコノストック属、ラクトバチルス属、ビフ
ィドバクテリウム属の細菌があげられる。その代表例と
して、ストレプトコッカス・フェシウム（Ｓ　Ｌｒｃｐ
ｔｏｃｏｃｃｕｓｒａｃｃｉｕｍ）、ストレプトコッカ
ス・ミチス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　　ｍ１ｔｉ
ｓ）、ラクトバチルス・カゼイ・パル・カゼイ（Ｌａｃ
ｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｃａｓｃｉ　　ｗａｒ。

ｃａｓｃｉ）、ストレプトコッカス・ミティオール（Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　　ｍ１Ｌｉｏｒ）、ストレ
プトコッカス惨ボビス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　
　ｂｏｖｉｓ）、ラクトバチルス−ファーメンタム（Ｌ
　ａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｆ’ａｒｍｃｎｔｕｍ
）、ビフィドバクテリウム・ケリナム （ＩＩＨｉｄｏｂａｃＬｅｒｉｕｍ　　ｃｈｏｅｒｉｎ
ｕｍ）などが好んで用いられるが、菌株はとくに限定さ
、れるものではなく、新たに、乳製品、土壌、酸敗食品
、動物の臓器や排泄物等から分離した株でありでも、酸
性ウレアーゼを産生ずる能力を有するものであれば差し
つかえない。またそれらの菌株に紫外線照射や変異剤処
理を施して、人為的に変異を誘起させた株や、当該酸性
ウレアーゼ活性の発現に必要な遺伝子断片を人為的にと
り出し、それを組み入れた他の微生物菌体であっても、
本発明の方法に使用できる。

酸性ウレアーゼを産生ずる菌株の具体例としては、ラク
トバチルス・ファーメンタムＪＣＭ５８６７（ＩＦｏ　
　１４５１１．ＰＥ１’１Ｍ　　Ｐ−８９９０）、ラク
トバチルス・ファーメンタムＪＣＭ　　５８６Ｂ（ＩＦ
Ｏ１４５１２，ＦＥｒｔＭＰ−８９９１）、ラクトバチ
ルス・ファーメンタムＪＣＭ　５８６９（ＩＰＯ１４５
１３，ＦＥＲＭ　　Ｐ−８９９２）、ストレプトコッカ
ス・ミティオールＰＣ−１５４（ＩＰＯ１４６３３，Ｆ
ＥＲＭ　　ｒ’−９４６０）、ストレプトコッカス・ボ
ビスＩ’Ｇ−１８６（ＩＦＯ１４６３４，ＦＥＲＭＰ−
９４６１）あるいはビフィドバクテリウム・ケリナムＰ
Ｃ−３９６（ＩＦ’０　１４６３５．ＦＥＲＭ　　ｒ’
−９４６２）などが挙げられる。

上記のＩＦＯ番号は、財団法人発酵研究所における受託
番号を、またＦＥｒｔＭ　　Ｐ番号は通商産業省工業技
術院微生物工業技術研究所（Ｆｒｔｌ）における受託番
号をそれぞれ示す。上記のラクトバチルス・ファーメン
タム　ＪＣＭ　　５８６７、ラクトバチルス・ファーメ
ンタム　ＪＣＭ５８ＧＢおよびラクトバチルス・ファー
メンタム　ＪＣＭ５８６９は財団法人発酵研究所発行の
［リザーチ・コミュニイケーション（ＲＥＳＥＲＣｌｌ
ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮ）Ｎｏ、　ｌ　３　、第９
４頁、１９８７Ｊ１．：掲載されている。

上記菌株のＦｉｌｌへの寄託はブタペスト条約に基づく
寄託に切換えられて下記のＩｊＥＩＩＭ　　Ｌｌｒ’番
号で同研究所に保管されている。

ラクトバチルス−ファーメンタム　ＪＡＭ５８６７（１
？ＥｎＭ　　ｒ３Ｐ−１４５４）ラクトバチルス・ファ
ーメンタム　ＪＣＭ５８（ｉ８（ｒ；’Ｅｒ１Ｍ　　Ｂ
Ｐ−１４４５）ラクトバチルス・ファーメンタム　ＪＣ
Ｍ５８Ｇ９（Ｆ’ＥｒｔＭ　　ＢＰ−１４４６）ストレ
プトコッカス・ミティオー！し　ＰＣ−１５４（ＦＥＲ
Ｍ　　ｌ３Ｐ−１４４８）ストレプトコッカス・ボビス
　ＰＧ−１８６（ＦＥＲＭ　　ｎＰ−１４４９） ビフィドバクテリウム・ケリナム　ＰＣ−１９６（ＦＥ
Ｉ’ｔＭ　　［３Ｐ−１４５０）上記のラクトバチルス
・ファーメンタムＪＣＭ　　５８６７（［ＦＯ１４５１
１，ＦＥＲＭＩ３Ｆ−１４５４）、ラクトバチルス・フ
ァーメンタムＪＣＭ　　５８６Ｂ（ＩＦＯ１４５１２゜
１？’ＥｒｔＭ　　ｌ３Ｐ−１４４５）およびラクトバ
チルス・ファーメンタ１．ＪｃＭ　　５８６９　　（Ｉ
ｆ；’０１４５１３、ＦＥＲＭ　　ＩＭＰ−１４４６）
は以下の菌学的性質を有する。

（次頁へ続く） （次頁へ続く） また、ビフィドバクテリウム・ケリナムＰＧ−１９６、
ストレプトコッカス・ミテイオールＰＣ−１５４および
ストレプトコッカス・ボビスＰＧ−１８６はそれぞれ以
下の菌学的性質を示す。

上表中、ＮＤは実験を実施していないことを示し、Ｌｙ
ｓ、　ＡｓｐＳＡｌａＳＧｌｕ、　０ｒｎＳＳａｒ、　
ｍ　−ＤＡＰはそれぞれリジン、アスパラギン酸、アラ
ニン、グルタミン酸、オルニチン、セリン、メソジアミ
ノピメリン酸を表わす。上記の菌学的諸性質をもとに、
パージエイズ・マニュアル・オブ・システマティック・
バクテリオロジイ・ボリューム２（１９８６）によって
、その分類学的位置を調べるとＰＣ−１９６株はアラビ
ノース、セロビオース、リボース、ザイロースからの酸
の生成が陽性である点が異なるもののＢｉｒｉｄｏｂａ
ｃｔｃｒｉｕｍｃｈｏｃｒｉｎｕｍとするのが適切であ
り、ＰＣ−１５４株はα−へモリシスが陰性である・点
が異なるものの５ＬｏｒｃｐＬｏｃｏｃｃｕｓ　　ｍＨ
ｉｏｒとするのが適切であり、Ｉ）に−１８６株はエス
クリンの加水分解が陰性である点が異なるものの、５Ｌ
ｏｒｃｐｔｏｃｏｃｃｕｓｂｏｖ　ｉ　ｓとするのが適
切で、ある。

これらの微生物菌株を培養して酸性ウレアーゼを生成さ
けるには、通常の静置培養、振盪培養、通気暁拌培養あ
るいは固体培養などにより、連続的あるいは間歇的に行
なうことができる。用いる培地は、使用される微生物の
生育しうる通常の組成のものでよく、炭素源としては、
炭水化物、油脂、脂肪酸、あるいはアルコール類などの
中から資化しうるちのを適宜選択し、単独または混合し
て使用される。また窒素源としては、例えば、ペプトン
、大豆粉、綿実粉、コーンスヂーブリカー、酵母エキス
、肉エキス、麦芽エキス、ホエー等の有機窒素源のほか
、硫安、塩安、硝安、燐安等の無機窒素源が、必要に応
じて、適宜混合して、または単独で用いられる。培地に
は炭素源、窒素源のほか、生育に必要なミネラル、アミ
ノ酸あるいはビタミンなどの生育必須因子や生育促進物
質を添加するのがよい。さらに酸性ウレアーゼの生成を
誘導するためにカルバミド、ヂオ尿索等を添加すること
もある。培養中のｐ　ｔｒおよび泡の管理の目的で苛性
アルカリ液、炭酸ナトリウム液、カルシウム塩類を適宜
補添したり、消泡剤の添加も有効である。

培養の温度は、用いる微生物の生育に適した温度を選択
すればよ（、通常１５℃乃至５０℃、好ましくは２５℃
乃至４０℃で培養するのが有利である。また培養の時間
は、該閑の生育および酸性ウレアーゼの生成に十分な時
間続行されるが、通常５乃至５０時間を要する。

このようにして培養後、酸性ウレアーゼは、通常、微生
物菌体に含有されている。そこで、培養液から遠心分離
、沈降分離、凝集分離、多孔性膜やセラミックによるろ
過などの方法によって集菌された生菌体を、そのまま、
もしくは凍結乾燥、噴霧乾燥、アセトン乾燥などの手段
を用いて乾燥菌体にして、酸性ウレアーゼ粗酵素として
本発明の方法に用いることができる。さらには菌体を凍
結融解処理、磨砕処理、超音波処理、浸透圧処理、リゾ
チーム処理、界面活性剤処理などの方法を単独らしくは
組合わせて行なうことによって、該酵素を可溶化し、プ
ロタミン処理、塩析、有機溶媒処理、等電点沈澱、電気
泳動、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過、アフ
ィニティークロマトグラフィー、品出などの通常の酵素
の精製手段を適宜組合わせることによって、生菌体より
も比活性の向上しル粗酵索乃至精製酵素を得て、本発明
の方法に用いることも可能である。

次に、酒類を酸性ウレアーゼで処理する方法について説
明する。

当該酵素で酒類を処理する場合の酵素の形態としては、
該酵素を含有する微生物菌体のまま、あるいは通常の方
法で酸性ウレアーゼを抽出精製した粗酵素乃至精製酵素
でよく、さらにはそれらを寒天やカラギーナンなどの天
然高分子、ポリアクリルアミドやウレタン樹脂などの合
成高分子に包括固定化したもの、あるいは活性炭、７セ
ラミツク、デキストラン、アガロース系物質、多孔性ガ
ラス等の担体に結合固定化したものを用いてもよい。

本発明の対象とする酒類としては、清酒、ビール、ぶど
う酒、フルーツワイン、老酒等の醸造酒をはじめ、ウィ
スキー酸、焼耐醪、ブランデー酸などカルバミドを含有
するものであればよく、それらを製造する中間工程品で
もさしつがえない。

例えば清酒の場合、発酵醪、醪を圧濾圧搾した後の上槽
酒、生酒、火入れ後の貯蔵酒、ビン詰め前の清酒等であ
っても該酵素の処理の対象とすることができるが、火入
れ前に該酵素を添加して処理しておくのが、最も好まし
い。

これらの酒類を酸性ウレアーゼで処理する場合、添加す
る酸性ウレアーゼの量は、０．００００１ユニット／−
乃至！ユニット／−１とりわけ０．０００１ユニット乃
至０．１ユニツト／鑓が実用的で、有利に用いられる。

ただし、！ユニットは単位時間（分）当りに、カルバミ
ドを分解して１マイクロモルのアンモニアを放出する酵
素ｍをいう。以下、！ユニットは！Ｕと表示する。

酒類を処理する温度は、通常０℃乃至８０℃、とりわけ
１０℃乃至６０℃が好んで用いられる。

ｐＨは２乃至７、とりわけ１）Ｈ３乃至５がよい。処理
の時間は、酒類中のカルバミドが消失するのに十分な時
間あればよいが、通常２０分乃至２００日間、とりわけ
５時間乃至１２０日間実施される。

酸性ウレアーゼで酒類を処理する別法として酒類を製造
するに際し、アルコール発酵工程中、酸性ウレアーゼを
産生する能力ををする微生物の生菌体を共存させること
によってもまた実施できる。

この場合、酸性ウレアーゼ生産、閑はアルコール発酵終
了前の任意の時期において共存せしめることができる。

たとえば、龜和立時あるいは糖化液製造時に酸性ウレア
ーゼ生産菌を植菌して増殖せしめ、これを用いて常法に
より本発酵（アルコール発酵）を行なわしめる方法が好
ましく適用できる。

また本発酵中の適宜の時期、好ましくは全発酵期間の中
期までに酸性ウレアーゼ生産菌を植菌し培養してもよい
。

酒類の紙に酸性ウレアーゼ生産菌を生育させる場合、酸
性ウレアーゼの植菌時期は特に限定されないが、好まし
くは酵母添加前の状態のものに植菌し、酸性ウレアーゼ
生産菌が充分に増殖したのちに酵母を植菌して、以後は
通常の操作で　を製造し、仕込に使用する。また、原料
又は原料糖化液に酸性ウレアーゼ生産菌を生育させる場
合は、原料（例、蒸米、麹米、麦芽、麦汁、ぶどう果汁
、でんぷん）又は原料糖化液に酸性ウレアーゼ生産菌を
植菌し、充分増殖さＵ・たのちに仕込に使用する。

酸性ウレアーゼ生産菌の培養温度は特に限定しないが、
好ましくは２８〜４０℃である。また酸性ウレアーゼ生
産菌の増殖数は特に限定されないが、好ましくは１０８
／−以上である。酸性ウレアーゼ生産菌の増殖したｄ声
るいは原料又は原料糖化液の使用時期は、酒類の仕込時
及びアルコール発酵終了するまでの醪のいずれの時期に
使用してら良い。例えば清酒の場合、籾温、仲添、留添
の仕込時又は発酵中の醪の全期間いずれの時期に使用し
ても良い。更に酸性ウレアーゼ生産菌を生育ｉｎめた献
、あるいは原料または糖化液の使用量は特に限定されな
いが、好ましくは３〜１５％である。

又梳に用いる場合、酸性ウレアーゼ生産菌が乳酸などの
酸産生菌であれば、酵母添加時ζこ酸を添加する必要は
ないが、酸を生産しない菌の場合には、酵母添加前に乳
酸などの酸を通常の駁に使用するのと同ｍ程度を添加す
ればよい。

本発明において、アルコール発酵の温度、時間等の培養
条件は常法に準じて実施すればよく、またその後の製造
条件たとえばろ過、滓引、火入れ、貯蔵、熟成なども特
に変更する必要はない。

実施例 以下に実施例をもって、本発明の内容をより具体的に示
す。これらはいずれも本発明の内容を例示するものにす
ぎず、本発明の範囲を限定するものではない。

なお、培養物の酸性ウレアーゼ活性は、適宜希釈した培
養液から遠心分離によって集菌し、無菌脱イオン水に懸
濁したのち、尿素を含む０，２Ｍクエン酸バッファー（
ｐｌ（４、０）と等ｍ混合し、３７℃で３０分間反応さ
Ｕ゛で生成したアンモニアを、ニトロプルジッド法で比
色定量する方法で測定し、単位時間（分）当りに１マイ
クロモルのアンモニアを生成する酵素ｍを！ユニット（
Ｉ　Ｕ）として表示した。

実施例１ グルコース０．５％、ポリペプトン１．０％、酵母エキ
ス１．０％、肉エキス０．５％１食塩０．５％、炭酸カ
ルシウム１゜、０％、寒天１．５％からなる培地中に穿
刺、生育したＬ　ａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｒｃｒ
ｍｃｎｔｕｍＪＣＭ　５８６７（ＩＦＯ１４５１１，Ｆ
ＥＲＭＢＰ−１４５４’）を、グルコース２．０％、無
水酢酸ナトリウム２．０％、ポリペプトン１．０％、肉
エキス１．０％、酵母エキス０．２％、食塩０．５％、
硫酸マンガン（約４水塩）０．００５％、ｐｌ−Ｉ７゜
０（３０％苛性ソーダにて中和）からなる滅菌培地５０
　ｒｎｌを含む２００　＋Ｊ容三角フラスコ２本に接種
して、３７℃で２４時間、静置培養した。このシード培
養物をそれぞれ、同じ組成からなる滅菌培地ＩＱを含む
２１２容三角フラスコ２本に移植し、３７℃で２４時間
、静置培養した。この培養物のウレアーゼ活性を測定し
たところ、Ｏ，ｌＵ／ｂ４であった。

この培養液を遠心分離して菌体を集め、０．０５Ｍ燐酸
緩衝液（ｐＩ−１７、２）で２回洗滌後、３０１ｄの０
．０５Ｍ燐酸緩衝液（ｐＩ−１７，２）、０．０２Ｍの
ＥＤ　ｉ’Δおよび０．０１Ｍのジチオスレイトールを
含む液に懸濁して、超音波処理を行ない、その上清液を
硫安分画して、４０％から７０％飽和の両分の沈澱物を
集め、１０滅の０．０５Ｍ燐酸緩衝液に溶解したのち、
−晩透析し、凍結乾燥することによって、２６０．４ｍ
ｇの酸性ウレアーゼ粗酵素粉末を得た。ウレアーゼ活性
は０．５［Ｊ／ｍｇであり、精製収率は７６．７％であ
った。

木組酵素粉末の一般的性質は以下のようであった。

至適ｐｌ−１ｐｌ−１２〜４．５ 至適温度　　６０℃〜７０℃ ｐＨ安定性　　３７℃、２時間処理で１）［１２〜ｌＯ
で安定 温度安定性　　ｐｉ−［４，２時間処理で６０℃迄、安
定 次に、この粗酵素粉末を０．０２Ｕ／ｒＪおよび０、Ｉ
Ｕ／ｄになるように清酒（アルコール２０％。

カルバミド３０１）Ｐｎ＋、ｐｔＩ　４　、３．）に溶
解し、３０℃に保持して、清酒中のカルバミドの分解反
応を行なわせたところ、表１に示す結果が得られた。

なお対照として、市販のナタマメのウレアーゼを１０Ｕ
／Ｉ）１１！の濃度で使用して比較した。すなわちナタ
マメのウレアーゼではｔ　ｏ　ｕ／ｙの濃度で５日間処
理して６、清酒中のカルバミドは約半分に迄しか減少し
ないのに対し、酸性ウレアーゼは、０、ＩＵ／に１の微
ｍで、わずか１日で完全にカルバミドを分解していた。

０、ｌ０ＬＩ／蔵　　３０　　　　０　　　　０　　　
０ナタマメウレア ーゼＩＯ，ＯＵ　　　３０　　　１８　　　１４　　１
３／　ｒｔｌ なお、酸性ウレアーゼ活性はｐｉ（４，０で、またナタ
マメウレアーゼ活性はｐＩ−１７，０で、生成したアン
モニアをニトロプルジッド法で比色定量して測定し、清
酒中のカルバミドは、ウレアーゼで分解後、生成したア
ンモニアをＮＡＤＰ＋依存グルタミン酸デヒドロゲナー
ゼを用いる酵素法で測定した。

以下の実施例でも同様に測定した。

実施例２ 生酒（アルコール２０％、カルバミド３０ｐｐｍ。

ｐｔＩ４．３）に、実施例１で取得した酸性ウレアーゼ
机酵素粉末を０．０１Ｕ／ｌ−または０，００３０／ｄ
になるように添加し、１０℃と１５℃に保存してカルバ
ミドの分解を行った。その結果、表２に示すように生酒
中のカルバミドは、酸性ウレアーゼ０．００３ｔＪ／ノ
ｉＪ、１０℃で８日間処理すると完全に分解した。なお
、これらの清酒を対照（酸性ウレアーゼ粗酵素粉末の無
添加品）の清酒と比較して、官能検査を行ったところ、
異味が少なく品質的により好ましい乙のであった。

実施例３゜ 実施例１と同様に培養して得られた　ＬａｃＬｏｂａ−
ｃｉｌｌｕｓ　Ｉ’ｃｒｍｃｎｌｕｎ＋　　Ｊ　０Ｍ５
８　Ｇ　７　（Ｉ　ＰＯ１４５１１、ＦＥＲＭ　　Ｂｌ
”−１４５４）の培養液４（ｌを遠心分離機で集菌し、
凍結乾燥して２．０ｇの乾燥菌体を得た。この乾燥菌体
の酸性ウレアーゼ活性は、０．３５Ｕ／＋＋＋ｇであっ
た。

一方、生酒（アルコール２０％、カルバミド３０ｐｐｍ
、　ｐＨ４、３）を７５℃で１分間加熱段閑した後、急
速に３０℃まで冷却し、これに上記乾燥菌体を酸性ウレ
アーゼ活性として０．０１Ｕ／Ｍｌまたは０゜ＱＯ３Ｕ
／ｒｄになるように添加し、そのまま３０℃に保持した
。その結果、清酒中に含まれるカルバミド濃度の経過変
化は、表３のようであった。

表３ 実施例４゜ 清酒（アルコール２０％、カルバミド３０ｐｐｍ。

ｐｔｒ４．３）を６２℃、１５分間加熱殺菌したのち、
５５℃まで急冷した時点で、実施例！で取得した酸性ウ
レアーゼ粗酵素粉末を、０，００３Ｕ／蔵になるように
無菌的に添加溶解し、室温まで急冷した後、通常の清酒
の貯蔵を行った。その結果、貯蔵中のカルバミド濃度の
経過変化は表４のようになった。

表４゜ 実施例５゜ 醗酵の完了した清酒醪（アルコール１８％、カルバミド
３０１）ｐｍ、　ｐｌＩ４．２）に実施例１で取得した
酸性ウレアーゼ粗酵素粉末を、０．０１Ｕ／１．１．に
なるように添加し、以後１３℃に保持し３日後に」；槽
した。その結果、表５に示すように醪中のカルバミドは
、３日間で完全に分解された。また、この酪を圧濾圧搾
した後の上槽酒中にも、カルバミドは検出されなかった
。

表５゜ 実施例６ ビール（アルコール ｐｐｍＳｐＨ　４　、　２　）に、実施例！で取得した
酸性ウレアーゼ机酵素粉末を、０．００３Ｕ／ｄの濃度
に溶解した。このビールを１０℃で３日間保持したとこ
ろ、ビール中のカルバミド濃度の経口変化は表６のよう
であった。すなわち、３日間でカルバミドを完全に分解
できた。このビールを、酸性ウレアーゼを加えないもの
と比較して官能検査を行なったところ、異味が少なくよ
り好ましいものであった。

表６ 実施例７ 実施例１と同様に培養して得られた Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｒｅｒｍａｎｔｕｍＪ
ｃＭ　　５８Ｇ７（ＩＦＯ　　１４５１１，ＦＥｒｔＭ
　　Ｉ’３Ｐ−１４５４）の培養液４Ｑを遠心分離機で
集菌し、凍結乾燥して２．０ｇの乾燥菌体を得た。この
乾燥菌体の酸性ウレアーゼ活性は、０．３５Ｕ／ｍｇで
あった。この乾燥菌体を清酒（アルコール２０％、カル
バミド３　０ｐｐｍ，　ｐＨ４．３）に０　、　５　１
！ｇｇ／−の濃度で懸濁し、５０℃で６時間保持したと
ころ、カルバミドは完全に消失した。

実施例８ ぶどう酒（アルコール１２．１％、カルバミド１３、２
ｐｐｍ，　ｐｌ−Ｉ３．７）に、実施例７で取得した酸
性ウレアーゼを含有する乾燥菌体を、０．０３Ｕ／　ｒ
ｒｒｆｌとなるように添加し、１５℃で５日間保持しノ
こところ、ぶどう酒中のカルバミドは完全に消失した。

また、このぶどう酒をろ過して菌体を除き、菌体を加え
ないぶどう酒と官能的に比較したところ、異味が少なく
より好ましいものであった。。

実施例９ ウィスキー醪（アルコール５．３％、カルバミド５　、
０　ｐｐｍ、叶１４．３）に、実施例！で取得した酸性
ウレアーゼ粗酵索粉末を０．０’ｌＵ／ｈ４の濃度で添
加し、２２℃で２４時間保持したところ、醪中のカルバ
ミドは完全に分解された。

この酸性ウレアーゼを添加した醪と、無添加の醪をガラ
ス製蒸溜装置でそれぞれ２回蒸溜して、アルコール分５
０％のウィスキーを得た。この両者を官能検査で比較し
たところ、本処理品の方が５°４味が少なくより好まし
いものであった。

実施例【Ｏ 米焼耐醪（アルコール！７．５％、カルバミド３０　ｐ
ｐｍ５ｐｔ−ｉ　３．８　）に、実施例７で取得した酸
性ウレアーゼを含をする乾燥菌体を、０．０３Ｕ／−に
なるように添加して、１５℃で２日間保持したところ、
醪中のカルバミドは完全に分解されていた。

この菌体添加醪と、無添加醪を減圧蒸溜して、アルコー
ル分４０％の焼酎を得た。これらを官能検査で比較した
ところ、本処理の方が異味が少なくより好ましい乙ので
あった。

実施例ＩＩ グルコース０．５％、ポリペプトン１．０％、酵母エキ
ス１．０％、肉エキス０．５％３食塩０．５％、炭酸カ
ルシウム１．０％、寒天１．５％からなる培地中に穿刺
、生育したＬ　ａｃｔｏｂａｃＨｌｕｓ　　ｒａｒｍａ
ｎＬｕｍＪＣＭ　５８６７（ＩＦＯ１４５１１，ＦＥｆ
ｌＭ［（Ｐ−１４５４）を、グルコース２．０％、無水
酢酸ナトリウム２．０％、ポリペプトン１．０％、肉エ
キス１．０％、酵母エキス０．２％、食塩０．５％、硫
酸マンガン（約４水塩）０．００５％、ｐ　Ｉ−ｆ７．
０（３０％苛性ソーダにて中和）からなる滅菌培地５０
０−を含むＩＱ容三角フラスコ２本に接種して、３７℃
で２４時間、静置培養し、生菌数を２．４　Ｘ　Ｉ　Ｏ
”／＋ｄｌとした。このシード培養物を１１００００ｒ
ｐで１０分間遠心分離し、得られた菌体を５００−の滅
菌水で洗浄し、再度遠心分離した。得られた洗浄菌体を
滅菌水１０蔵に懸濁した。

白米３０ｋｇと麹米３０ｋｇに相当する蒸米と麹に水１
２０Ｑ加え、５５℃で５時間糖化し、得られた糖化液を
７０℃に昇温させ５分間保持して加熱殺菌後、３５℃に
冷却した。これに、上記のＬａｃＬｏｂａｃｉｌｌｕｓ
　　ｆｅｒｍｅｎＬｕｍ　Ｊ　ＣＭ　　５８６７の生菌
体懸濁液ｌＯ−を添加し植菌した。次いで、３５℃で２
日間培養した。培養後の上記乳酸菌数を２Ｘ１０’／−
とした。次に品温を２８℃まで下げ、酒酵母協会−７を
２ＸＩＯ’／−となるように植菌し、４日間培養後籾温
を行ない、１日踊りとし、仲添、留添を行なったのち通
常の温度経過で発酵を行なわせ・、１９日０に四段及び
アルコールを添加したのち上槽した。本実施例の仕込配
合表を表７に、又６ｖ）経過を表８に、更に上槽時の清
酒の分析結果を表９に示した。この結果から明らかなよ
うに、対照に比べ酸性ウレアーゼ生産乳酸菌を使用した
和切仕込んだ醪では、生成したカルバミドは酸性ウレア
ーゼによって分解されて、上槽酒中にはカルバミドはほ
とんど検出されなかった。又酒質についても対照に比べ
濃醇な酒質であり、良好であった。

表７　　　　仕込配合　　　　　　　　　（ｋｇ）酒母
　籾温　仲添　留添　四段　　計 総米　　６０　１３０　２５５　４７５　　８０　１０
００蒸米　　３０　　９５　２００　３９５　　８０　
　　ｇ（１０麹米　　３０　　３５　　５５　　８０　
　　　　２００汲水　　１２０　　ｔｏｏ　　３２０　
６２０　１５０　１３１Ｇ（以　下　余　白） 表８１んの経過 酵寸添加後口数　　　　　　　１２３４５ボーメ（［３
０’）　　　　対　照　１１．３　１０．１　８．９　
７，７　６．１本発明　１３．５　１０，５　７．８　
６．６　６．０アルコール（Ａｌｃ）　　対　照　　　
　１．５　３．６　５．８　７．０（％）　　本発明　
　　　１．５　５．０　６．３　６．７酸度（ｉ’、Δ
）　　　対　照　４．１０　５．１０　５，７５　６，
３２　７．１０本発明　５．５８　８．２８１０．１８
　９．８５　９．９０アミノ酸度　　　　対　照　２．
０　１．７２　１．８５　１．８０　１．９０（Ａ、Ａ
）　　　　本発明　５．３０　４．５７　３，７７　３
．６０　３．４５乳酸（ｐｐｒｒｌ）　　　　　対　照
　５１０　６１５　７００　８１０　９２０２０本発明
０９４　１１５７　１２３０　１２７０　１２６０表９
　上検層の分析結果 ｒ３ｅ’　　Ａｌｃ　　Ｔ、Ａ　　Ａ、Ａ　カルバミド
（ｐｐｍ）対照−２，３１９，９１，８０１，７５１５
，：（本発明　−２，０１９，９１，８５１，８２０，
０実施例＋２ 白米６０ｋｇと麹米４０ｋｇに相当する蕉米と麹を混合
し、これに水を１８０１２加えて、５５℃で５時間糖化
した。得られた糖化液を直しに７０℃まで昇温させ５分
間保持し、加熱殺菌後３５℃に冷却した。冷却した糖化
液に実施例ＩＩと同様にして得たＬ　ａｃｔｏｂａｃｉ
ｌｌｕｓ　　ｒｅｒｍｅｎｔｕｍ　　Ｊ　ＣＭ５８６７
の生菌体懸濁液４０〃ｌを植菌し、３５℃で２日間培養
後、本微生物の菌数を２Ｘ１０”／威とした。この糖化
液（四段Ａ）の全ｍを１２日目醪に添加し、１８０目に
四段Ｂとアルコールを添加して上槽した。本実施例の仕
込配合表を表１０に、又醪中のカルバミドの経時変化を
表１１に示した。この表より、酸性ウレアーゼ生産乳酸
菌を使用した四段（四段Ａ）を添加した醪のカルバミド
は添加後減少し、上槽時では０になり酸性ウレアーゼに
より、カルバミドが分解されていることか明らかである
。父上検層にもカルバミドは検出されなかった。更に、
上検層の酒質については官能検査の結果、濃醇でかつさ
れやかな良い酒であった。

表１０　　　仕込配合表　　　　　　　　　　　　　（
ｋｇ）酒母　籾温　仲添　留添　四段（＾）四段（Ｂ）
　　計総米　　５０　１２５　２３５　４３０　　１０
０　　　６０　　１０００麹米　　２５　　３５　　４
５　　６０　　４０　　　　　　　２０５恭米　　２５
　　９０　１９０　３７０　　６０　　　６０　　７９
５汲水　１００　１００　２９０　５５０　　１８０　
　　１２０　　１３４０表！■　　醪中のカルバミドの
変化　　　　（ｐｐｍ）醪［１数（口’）　　１２　　
１３　　１４　　１６　　１８　　上検層対照　２１　
２４　２６　２８　３０　２４本発明　　　２１　　１
１　　３　　１．２　　０　　　０実施例１３ 市販ＣＡＭ半流動培地（日本製薬）に生育した、５ｔｒ
ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　　ｌｌ１ｉｔｉｏｒ　Ｐ　Ｇ　
−１５４（［Ｆ’　Ｏｌ　４６３３、ＦＥｎＭ　　ＢＰ
−１４４８）をグルコース３％、ポリペプトン１．５％
、肉エキス１％、酵母エキス０．８％、食塩０．５％、
無水酢酸ナトリウム０．２％、硫酸マンガン（約４水塩
）　　０．００５％、硫酸コバルト（７水塩）０．００
１％、ｐＩ−ｔ７．０（３０％苛性アルカリにて中和）
からなる滅菌シード培地５０−を含む２００−容三角フ
ラスコに接種して、３４℃で２４時間、静置培養した。

このシード培養物５ｔｄを同じ組成からなる滅菌培地１
０（ＬＪを含む２００ｔＩｒｌ容三角フラスコに移植し
３２℃で２日間静置培養した。この培養物の酸性ウレア
ーゼ活性を定量したところ、酵素力価は０．６Ｕ／ｄで
あった。

上記の方法で得られた培養液３ｒｄを、３０００　ｒｐ
ｍｌ　１０分間遠心分離して菌体を集め、水洗・遠心分
離後、１−の滅菌水に懸濁したのち、イソブタノールを
５０μＱ添加し、５０℃で１５分間処理したものを酵素
液とし、０．２Ｍクエン酸バッファーを用いて至適ｐＨ
を調べた。その結果を表１２に示す。

この表より明らかなように、本発明の菌株はいずれも、
゛酸性域で強い尿素分解活性を示した。

表１２ 次に、上記の培養液８０−を遠心分離して菌体を集め、
５０％エタノール溶液に４時間浸漬して殺菌し、遠心分
離後凍結乾燥した。得られた乾燥菌体量は１６．９ｍｇ
であり、酸性ウレアーゼ活性はｌ　、４４　Ｕ／ｍｇで
あった。

この乾燥菌体を清酒（アルコール２０％、カルバミド３
０ｐｐｍｓ　ｐＴ■４．３）に、酸性ウレアーゼ活性と
して、０　、　ＯＩ　Ｕ／ｎｉｌになるように添加し、
３０℃に保持して、清酒中のカルバミドの分解反応を行
なわせたところ、表１３に示す結果が得られた。

表１３ 実施例１４ 市販ＣＡＭ半流動培地（日水製薬）に生育した、表１４
に掲げる各菌株を、滅菌した市販ＣＡＭブイヨン培地（
日水製薬）５０ｒＪを含む２００１．１．容三角フラス
コに接種して、３４℃で２４時間、静置培養した。この
シード培養物５１１ｄｌを同じ市販ＧＡＭブイヨン培地
に硫酸マンガン（約４水塩）０．００５％を添加して滅
菌した培地１００蔵を含む２０〇−容三角フラスコに移
植し、３２℃で３日間静置培養した。この培養物の酸性
ウレアーゼ活性を定ｍしたところ、表１４に示すような
酵素力価であった。

表１４ 培養液当りの酸性 菌　　株　　　　　　　　　　ウレアーゼ力ｌ＋１Ｉｉ
（Ｕ　／　ｒＪ　） Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　　ｂｏｖｉｓ　　ＰＧ−
１８６（ＩＦＯ１４６３４，ＦＥＲＭ　ＢＰ−１４４９
）　　　　　　０．４ＢＩｒ［ｄｏｂａｃｔｏｒｉｕｍ
　　ｃｈｏｅｒｌｎｕｍＰＧ−１９６（ＩＦＯ１４６３
５，ＦＥＲＭ　ＢＰ−１４５０）　　　１．２上記の方
法で得られた各菌株の培養液５−を、３０００　ｒｐｍ
、１０分間遠心分離して菌体を集め、水洗・遠心分離後
、ｌ−の滅菌水に懸濁したのち、イソブタノールを５０
μＱ添加し、５０℃で１５分間処理したものを酵素液と
し、０．２Ｍクエン酸バッファーを用いて至適ｐｉｔを
調べた。その結果を表１５に示す。表より明らかなよう
に、本発明の菌株はいずれも、酸性域で強い尿素分解活
性を示した。

表１５ ｐＨ相対活性（％） ＰＣ−１８６ＰＣ−１９６ Ｇ　　　　　　　　７０　　　　　３５８　　　　　　
　１７　　　　　３Ｂ 次に、上記の方法で得られたＰＧ−１８６株およびＰＣ
−１９６株の培養波谷８０−を遠心分離して菌体を集め
、５０％エタノール溶液に４時間浸漬して殺菌し、遠心
分離後凍結乾燥した。各菌株の乾燥菌体量はそれぞれ３
０．２ｍｇ、６４．Ｏｍｇであり、酸性ウレアーゼ活性
はそれぞれ０．３８Ｕ／ｍｇ、　　０　、６　Ｕ／ｍｇ
であった。

次に、これらの乾燥菌体を清酒（アルコール２０％、カ
ルバミド３０ｐｐｍ、　ｐｔ１４．３）に、酸性ウレア
ーゼ活性として、０．０１Ｕ／＋ａｅになるように添加
し、３０℃に保持して、清酒中のカルバミドの分解反応
を行なわせたところ、表１６に示す結果かられた。

表１６ 経過口数 ウレアーゼの種類　　　０日　２日　４日　ＢＥＩＩＯ
口ＰＣ−１８６株山来　　３０　　１０　　０　　０　
　０ＰＧ−１９６株山来　　３０　　１８　　８　　１
　　０発明の効果 本発明により酒類を酸性ウレアーゼで処理する方法は、
従来知られているナタマメ等の中性乃至アルカリ性ウレ
アーゼを用いて処理する方法に比べて、ウレアーゼの使
用量がきわめて少量ですみ経済的である。たとえば、本
発明方法によると、ウレアーゼの使用量は従来法にくら
べて酵素単位ｍで約１／１００〜Ｉ／１００００．添加
重量テ約１／Ｉ　Ｏ−１／１００あるいはそれ以下でカ
ルバミドを完全に分解除去することが可能である。

このために、処理後、酒類中の残存ウレアーゼに起因す
る品質の低下は、実質上、殆ど無視でき、従来法にくら
べると極めて有利である。

また、本発明によると、酒類が有する通常のｐ　ｒ−ｉ
、すなわち、３〜５という酸性下であっても高温で短時
間にカルバミドを分解することが可能であり、作業性が
よく、工業的に有利にカルバミドを分解除去できる。ま
た、酸性ウレアーゼ生産菌を酒類の発酵終了前の適宜の
工程で共存せしめる方法を採用することらでき、簡易に
カルバミドを除去できる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 酒類を酸性ウレアーゼで処理することを特徴とする酒類
   の品質改良法