SU611596A3 - Способ получени фермента -1,6 глюкозидазы - Google Patents
Способ получени фермента -1,6 глюкозидазыInfo
- Publication number
- SU611596A3 SU611596A3 SU752101415A SU2101415A SU611596A3 SU 611596 A3 SU611596 A3 SU 611596A3 SU 752101415 A SU752101415 A SU 752101415A SU 2101415 A SU2101415 A SU 2101415A SU 611596 A3 SU611596 A3 SU 611596A3
- Authority
- SU
- USSR - Soviet Union
- Prior art keywords
- glucosidase
- amylase
- medium
- enzyme
- units
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C13—SUGAR INDUSTRY
- C13K—SACCHARIDES OBTAINED FROM NATURAL SOURCES OR BY HYDROLYSIS OF NATURALLY OCCURRING DISACCHARIDES, OLIGOSACCHARIDES OR POLYSACCHARIDES
- C13K7/00—Maltose
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2411—Amylases
- C12N9/2425—Beta-amylase (3.2.1.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2451—Glucanases acting on alpha-1,6-glucosidic bonds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01002—Beta-amylase (3.2.1.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01033—Amylo-alpha-1,6-glucosidase (3.2.1.33)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/832—Bacillus
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/832—Bacillus
- Y10S435/834—Bacillus cereus
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТА а-1,6-ГЛЮКОЗИДАЗЫ
Изобретение относитс к вопросам биохимии, а именно к способам получени а-1,6-глюкозидазы и |3-амилазы одновременно. Известен способ получени а-1,6-глюкозидазы путем культивировани микроорганизмов, принадлежащих к роду Bacillus на питательной среде, в которой в качестве источников углерода и азота используют продукты неполного гидролиза крахмала или мальтозы и гидролизат железа или смесь их с солью аммони 11. При этом поддерживают температуру среды на уровне 30° С и рН 7,0-7,3. Известен также способ получени |3-амилазы с помощью шкроорганизмов, относ щихс к разновидности Bacillus, например Bacillus poiymyха . Bacillus megaterium. Таким образом, известные способы получени ,6-глюкозидазы и -амилазы независимые, преду сматривающие использование не одной и той же культуры, а различных. Как известно, cs-1,6-глюкозидазу и Д-амилазу используют при производстве мальтозы из крахмала , которое ведут двум стади ми: на первой стадии обеспечивают воздействие на крахмал первого фермента, а на второй - второго. Таким образом, дл получени указанные знзимов культивируют соответствующие микроорганизмы по отдельности, а при осуществлении процесса получени мальтозы создают различные услови дл осуществлени последовательно двух производственных стадий. Все эти недостатки усложн ют процесс. Целью изобретени вл етс разработка способа , обеспечивающего получение одновременно с ферментом а-1,6-глюкозидаза фермента )3-амилаза. Дл достижени указанной цели из рода Bacillus дл культивировани на питательной среце, содержащей источники, углерода, азота и минеральные соли, при работе по прецлагаймому способу используют щтаммы Bacillus cereuc var. mycosi des (PERM N 2391) илиBad I us sp. УТ 1002 (FERM №2837) или Bacillus sp. УТ 1003 (PERM № 2838). Baci 11 us cereus была представлена Fermentation Research institute of Cluba-shi, JlSpan согласно . FERM № 2391 20 декабр 1973 г. Bacillus sp. УТ 1002 и Bacillus sp. УТ 1003 были представлены этим же институтом 12 декабр 1974 г согласно FERM N 2837 и FERM N 2838. Ниже представлена характеристика этих микроорганизмов . Bacillus cereus липоидна ра1зновидность (FERM № 2391), Палочка размером (1,1-1,4) х X (4,2-7,0) мкм, обычно наход щемс в длинной или короткой цепи подобно :алесени или Actinomyces . Неподвижна , грам-положительна , сп ранпш без ощутимого разрастани . Штательный бульон. Хороший рост, осадо Питательный косой агар. Обильное прораста филаментный, распределен по поверхности, кре вато-белый. Гдюкозо-асп агиновый агар. Нет хорошего роста. Филаментный. Глюкозо-нитратный агар. Нет роста, а если есть - очень незначительный. Тиразиновый косой агар. Хороший рост, филаментный, слегка коричневый. Использование цитрата. Положительное. Молоко. Пептонизаци . Картофель. Хороший рост, желтовато-белы слегка коричневый. Желатин. Разжижает. Получение аммиака. Положительное. Получение ацетилметшткарбшюла. Положи тельное. Восстановление нитрата до нитрита. Отриц тельное. Катапаза. Положительна . Получение индола. Отрицательное. Гидролиз крахмала. Положительный. Бульон с NaCI. В бульоне с 4% NaCI не р виваетс . Bacillus sp. УТ 1002 (PERM № 2837). Палочка размером (1-12) х (5-6) мкм, н ; подвижна , грам-положительна , встречающа с в виде короткой или длишГой цепи. Питательный бульон. Осадок. Питательный косой агар. Незначительный рост. Молоко. Медленна пепгонизаци . Картофель. Хороший рост, распредел етс по поверхности, желтовато-белый. йСслатин. Разжижение. Получение аммиака. Положительное. Восстановление нитрата в нитрит. Положи ное. Каталаза. Положительное. Ацетилметилкарбонил. Производитс . Цитратнатри . Незначительный рост. Органический источник азота. Необходим роста. Карбогидрат. Из глюкозы, фруктозы, гала тозы, маннозы, лактозы, сорбита, глицерина, тр галозы, крахмала и гликогена образуетс кисл а не газ. Температура роста. Произрастает при темп туре не выше 50° С, оптимальна температура 3 35С. Эта культура вьщелена из почвьь Bacillus sp. УТ 1003 (PERM N 2838). Палочка размером (1-1,6) х (2-7) мкц, подвижна , грам-положительна , встречаетс в де короткой или длинной цепи. Питательный бульон. Хороший рост, обра Питательный косой агар. Хороший рост, распредел етс по поверхности, желтовато-бе ый. Глюкоза-аспарагиновый агар. Незначительный рост. Молоко. Пептонизаци без коагул ции. Желатин. Медленное разжижение. Получение аммиака. Положительное. Ацетилметилкарбинол. Производитс . Цитрат. Используетс как источник углерода. Карбогидрат. Глюкоза, фруктоза, галактоза, манноза, а-арабиноза, D-ксилоза, лактоза, сукроза , мальтоза, трегалоза, раффиноза, маннит, сорбит , глицерин, инсулин используютс без образовани газа. Температура роста. Максимальна 45° С, оптимальна 30-33° С. Культура вьщелена из почвы. Предлагаемый способ заключаетс в следующем . Одну из указанных культур культивируют в среде,включающей источники углерода к азота. В качестве первых используют мальтозу, крахмал, гидролизаты последнего (декстрин), в качестве вторых - пептон, казеин, экстракты м са, дрожжей , воду после замачивани зерна, сено, соевый жмых. Источьшки азота при необходимости пополн ют неорганическими сол ми - фосфатом, солью магни , солью бари и солью кальци . В случае использовани воды после замачивани зерна из нее предварительно удал ют вещество , ингибирующее образование /З-амилазы. Дл увеличени выхода а-1,6-глюкозидазы и |3-амилазы добавл ют в среду соли марганца или различные его соединени , например сульфат марганца . В первом случае соли марганца добавл ют в среду в количестве пор дка 1x10 -1х10 мол , во втором случае соединение марганца добавл ет в среду в количестве пор дка 1x10 мол . В среду добавл ют цитрат и/или тартрат в количествах пор дка 0,01-1%. При использовании цитрата или тартрата натри их внос т в среду в количестве 0,1%. В среду добавл ют также (дл увеличени выхода ферментов рапсовое сем , рапсовый жмых, экстракт. Культивируют бактерии в услови х аэрации при 20-40° С в течение 24-72 час. При культивировании рН среды мен етс от 5,5 до 9,5, оптимальное значение 6-8. Полученные энзимы имеют чеистую структуру . Их регенерируют фильтрацией культуральной жидкости, затем фильтрат концентрируют путем добавлени ацетона, этанола, метанола или изопропанола и образовани осадка. Дл осаждени примен ют также сульфат аммони . Получают /3-амилазу и а-1,6-глюкозидазу в смеси в виде осадка , насыщенного сульфатом аммони . Дл регенерации ферментом используют также такие адсорбенты, как крахмал, активировантов с помощью крахмала улучшаетс , если его предварительно нагреть до 40-65° С. Адсорбированную Э-амилазу элюируют раствором , содержащим 1-10% мапыоэы, или раствором , содержащим растворимый крахмал, декстрин мальтозу. Адсорбированные на активированном угле энзимы могут использоватьс как св занные энзимы. Так, /3-амилаза адсорбируетс в количестве 8000-12000 единиц, а а-1,6-глюкозидаза в количестве 500-1000 единиц на 1 г активированного уг л . Адсорбированные энзимы сохран ют свою активность на уровне 90-100% от ее первоначального значени . Ферменты хорошо адсорбируютс и на диатомовых веществах, например перлите, и сохран ют в таком состо нии активность на высоком уровне (50-70% от первоначального значени ). Характеристики энзимов - /3-амилазы и а- 16-глюкозидазы, полученных описываемым спосо бом, приведены ниже. |3-Амилаза. Действие. Энзим производит мальтозу из крахмала, амилозы, амилопектина, гликогена, дек стрина и др. Специфичность в отнощешш воздействи субстрат. Степень гидролиза мальтозы в амилозу ближе к 100% и крахмала в мальтозу к 60%. Энзим не гидролизует а-1,6-глюкозидазную св зь, ко тора содержитс в амилопектине, гликогене, декстрине и т.п. рН реакции составл ет 3-10, оптимальное значение около 7,0. Температура реакции до 65° С, оптимальна около . Дезактиваци . Около 20% активности тер етс через 10 мин пребывани при 55°С. При 70°С через 10 мин наступает полна дезактиваци . рН-Устойчивость. Энзим неустойчив в кислой среде при рН ниже 5,0. Стабилен в интервале рН 6-10,0. Ингибнрование. Ингибируетс п-хлормеркурбензоатом и ,в некоторой степени монойодацетатом Активность после ингибировани п- хлормеркурбензоатом восстанавливаетс путем добавлени цистеина... +4 Сильно Ингибируетс ионами Си . Нд Ад, а также ионом Fe , Способ очистки. Энзим фракционируют путем осаждени из культурального бульона в результате насыщени 30-50% сульфата аммони с последующей высокоэффективной очисткой на хроматографической колонке с использованием Sephadex G-100. Измерение активности энзима. Энзимный раствор внос т в 2 мл 0,1 И раствора фосфзтного буфера (рн 7,0), содержащего 2,0% растворимо крахмала, и доливают дистиллированную воду до общего obbcivra 4 мл. Смесь инкубируют при лпОг .. ti. UpnftT 1 ЦЯС с начала реакции производит 1 мг мальтозы, обозначают как 1 единица. От 1,6- Глюкозидаза. Действие. Этот энзим гидролизует а-1,6-гл1окозидазную смесь амилопектина, который уже был в некоторой степени гидролизован Э-амилазой. Специфичность по субстрату. Энзим производит мальтотриазу путем гидролиза Ь(-1,6-глюкозиддзной св зи пуллулана. В случае реакции с амилопектшюм не наблюдаетс усилени йодной крас щей способности. Энзим про вл ет активность на амилопектине, предварительно гидролизованном в некоторой степени амилазой. Энзим не действует на изомальтозу. рН реакции в пределе 5-10, оптимальное значение около 6-6,5. Температура реакции около 50° С, оптимальна около 50° С. Дезактиваци . Около 50% активности тер етс после 10-минутной выдержки при 50° С. Полна дезактиваци наступает через 10 мин пребьшани при 65°С. рН-Стабильность. Энзим устойчив при рН 6-9, нестабилен в кислой среде и относительно устойчив вщелочной. Ингибирование. Энзим в некоторой степени Ингибируетс п-хпормеркурбензоатом и незначительно - монойодацетатом. Значительное isiHni6Hpyющее действие оказывают ионы Но и Ад, инги р- + бируетс также ионом Fe Способ очистки. Энзим фракционируют из культуральной жидкости путем осаждени 60-70% сульфата аммони с последующей очисткой на хроматографической колонке с использованием Sephadex G-100. Измерение энзимной активности. Активность измер ют по реакции, при которой в качестве субстрата используют пуллулан. Энзим производит из пуллулана мальтотриозу. Дн этого некоторое количество энзима добавл ют к 0,5 мл 0,1 М раствора фосфата буфера (рН 7,0), содержащего 1% пуллулана. Смесь довод т до общего объема пор дка 0,1 мл дистиллированной водой. Затем ее инкубируют при 40° С в течение 60 мин. Количество энзима, которое производит 1 мг мальтотриозы, обозначают как 1 единица. Из препарата можно независимо выделить /3-амилазу и «-1,6-глюкозидазу. Дл этого жидкость насьицают сульфатом аммони до концентрации 30-50%. Происходит осаждение j3-амилазы. Затем насыщаю жидкость сульфатом аммони до концентрации 60-70%. При этом осаждаетс второй знзим. Полученные энзимы очищают на колонке , зар женной Sephadex. Пример Ь В эрленмейеровскую колбу емкостью 200 мл помещают 50 мл среды, содержащей 1% пептона, 0,3 КгНГОА, 0.1 MgSb47H2O и 1 мальтозы. Стерилизуют обычным способом, в среду внос т микоиды разновидности Bacillus nerpiis fFERM № 239П и культивируют при 30°С
в течение двух дней. После культивировани из культурального бульона центрифугированием удал ют клетки. Затем всплывающий слой исследуют дл определени количества полученных энзимов . В результате было получено 628 единиц /J-амилазы и 18 единиц о-1,6-гликозидазы, счита на 1 мл среды.
Культуральный бульон помещают в целлофановую трубку и диализируют по отношению к дистиллированной воде дл того, чтобы удалить остаточный сахар.
Часть указанных диализированных знзимов (в которых содержалось 204 единицы j3-амилазы и 5,6 единиц а-1,6-глюкозкдазы) привод т во взаимодействие с картофельной амилазой, амилопектином картофельным крахмалом, гликогеном и декстрином , каждый из которых был вз т в концентрации 4% при рН 7 и 40° С (обадай реакционный объем составл л 4,3 мл).
Через посто нные промежутки времени отбирают пробы реакционного раствора, каждую из которых , берут в посто нном количестве, и в них определ ют количество редуцирующего сахара по методу Somogyi Nelson. Состав сахара в реакционной смеси определ ют с помощью метода хроматографии на бумаге (4 ч. пиридина, 6 ч. бутанола и 3 ч. воды). В результате установлено, что образовавшийс сахар почти полностью представл ет собой мальтозу (90-96%), в том случае когда амилоза, амш1опектин, картофельный крахмал использовались в качестве субстрата и в конечном реакционном растворе наблюдали очень небольшое количеств сахара, имеющего Rf, соответствующий мальтотриозе (4-8%), В результате испытани с помощью Hucostat (производимого Vorthington Biochemical Corporation U.S.A ) было установлено, что образование глюкозы происходит в чрезвычайно небольшом процентном количестве (менее 0,1%). Картофельна амилаза, амилопектин, декстрин и картофельный крахмал, испытанные таким образом, практически нацело гидролизуютс в мальтозу через 8 час реакции. Гликоген также гидролизуетс не менее 4eiyi на 90% в мальтозу через 23 час реакции .
Пример 2. В среду, имеющую такой жесостав, что использовалс в примере 1, инокулируют Baci 11 us; sp. УТ 1002 (PERM N 2837) и подвергают культивированию со встр хиванием при 30° С. Через 48 час культивировани в культуральном бульоне определ ли количество образовавщихс энзимов. Было получено 121 единица /3-амилазы и 10,5 единиц а-1,6-глюкозидазы на 1 мл бульона.
Пример 3. В среду того же, что и в примере .1, состава инокулируют Bacillus зр.УТЮО ( PERM N 2838) и подвергают культивированию со встр хиванием при 30° С. Через 48 час культивировани в культуральном бульоне определили количество образовавшихс энзимов. В результате получено 152 ч, /З-амилазы и 5,3 ч. а-1,6-глюкозидазы
J Пример 4. В колбу емкостью 1 л помещают 250 мл среды, содержащей (%) 1 полипептона , 0,3 К2НР04, ОД Мд8047НгЪ и 1 декстрина , и подвергают ее стерилизации по обычной методике. Затем среду инокулируют микоидами разновидности Bacillus cereus и провод т культивирование ее встр хиванием при 30° С. Через 48 час культивации культуральный бульон центрифугируют дл удалени клеток и полученный всплывший слой испытьшают на знзиматическую активность .
Было получено 420 единиц /S-амилазы и 7,8 единиц а-1,6-глюкозидазы на 1 мл бульона. В 200 мл (часть указанного культурального бульона ) внос т ю 75% сульфата аммони и полученную в результате осажденную фракцию центрифугируют и раствор ют в небольшом количестве воды, а полученный в результате раствор испытывают на энзиматическую активность. В результате получено 83000 единиц /З-амилазы и 952 единицы а-1,6-глюкозидазы.
П р и м е р 5. Часть раствора энзима, полученного в примере 1 и состо щего из 10000 еданиц /3-амилазы и 275 едашиц а-1,6-глюкозидазы, привод т во взаимодействие с 1 г амилопектина при концентрации 1% в присутствии СаСЦ Реакци протекает при 40° С, рН среды при этом поддерживают на уровне 7. Редуцирующий сахар в реакционной смеси определ ют по методике Somogyi Nelson. Получено 972 мг мальтозы. Количество полученной глюкозы составило 3,7 мг. Путем бумажной хроматографии обнаружено п тно мальтозы и п тно, соответствующее очень небольшому количеству мальтотриозы.
П р и м е |j 6. ПРИГОТОВЛЯЮТ среду, содержащую (%) 1 полипептона, 1 декстрина, 0,3 К2НРО4 и 0,1 MgS047H2O, а также среду, полученную в результате добавлени к указанной среде различных количеств (1x10 -1x10 моли) сульфата марганца, как показано в табл. 1. Эти среды помещают (каждую объемом 50 мл) в эрленмейеровскую колбу объемом 200 мл и стерилизуют по обычной методике. После этого среды инокулируют микоидами равновидности Bacillus cereus и подвергают культивированию в услови х аэрации при 30 С в течение 42 час.
После культивировани культуральный бупьс центрифугируют и верхний слой подвергают испытанию на содержание образовавшихс 0-амилазы и а-1,6-глюкозидазы. Результаты представлены в табл. 1.
Как следует из табл. 1, добавление сульфата магни повьццает количество полученной а-1,6-глн козидазы приблизительно в 3 раза.
Пример 7. В эрленмейеровские колбы емкостью 200 мл помеп т 50 мл среды, содержащей (%) 1 полипептона, 0,3 К2НГО4 и 0,1 MgS0 хТНаО, и стерилизуют. Затем среду инокулируют микоидами разновидности BacHlus cereus и подotnnn n/ Tn rvT7n itrUJ L« mtu
30° С. На 24-м часу культавировашш, когда количество -амилазы составило 237 единиц на 1 мл среды , в среду стерильно добавл ют сульфат марганца в количестве 1x10, счита на количество среды, и цродолжают культивацию.
На 42-м часу культивирование прекращают. Культуральный бульон центрифугируют дл удалени из него клеток и полученный в результате всплывший слой испытывают на (З-амилазную и а-1 ,6-гл козидазную активности. Результаты зтого испытани представлены в табл. 2.
Соль марганца, добавленна в среду в середин культивировани , повышает количество полученной ,6-глюкозидазы приблизительно в 1,7 раза и благопри тствует образованию |3-амилазы. Когда культивирование осушествл ют в среде, содержащей марганцевую соль с самого начала, количество полученной а-1,6-глюкозидазы повышаетс приблизительно в 2 раза по сравнению с количеством, которое может быть получено без добавлени соли марганца, а количество полученной амилазы понижено , всего лишь 28,8 единиц на 1 мл.
Пример 8. Готов т среду, содержащую (%) 2 полипептона, 0,3 Кг НЮ,, 0,1 MgSO47HjO и CaCl2, а также среды, полученные в результате добавлени к указанной среде цитрата натри в количествах, соответствующих концентрации 0,5 и 1%, и среды, полученные в результате добавлени тартрата натри к указанной среде в количествах, отвечающих концентрации пор дка 0,25 и 0,5%. В эрленмейеровские колбы емкостью 200 мл помещают среды (в количестве 50 мл) и стерилизуют по обычной методике. В среды ннокулируют микоиды разновидности Bacillus cereus и подвергают их культивированию при 30° С в течение 42 час.
Затем культивируют, жидкость из каждой колбы центрифугируют и полученный в результате всплывший слой подвергают пробе на определение |3-амилазной и а-1,6-глюкозидазной активности Полученные в результате данные представлены в табл. 3.
В том случае, когда культивирование осуществл ют в среде, содержащей рапсовый жмых, количество полученной а-1,6-глюкозидазы приблизительно в 2,4 раза превышает то количество, которое получаетс в среде, не содержащей рапсового жмыха.
Культуральный бульон, полученный в результате культивации в среде, содержащей рапсовый жмых, центрифугируют дл удалени клеток. 2 л полученного всплывшего сло объедин ют с 4 л холодного этанола. Полученный осадок отдел ют фильтрацией, а затем сушат. В результате получен порошкообразный знзим, состо щий из 115800 единиц |3-амилазы и 4640 единиц а-1,б-глюкозидазы на 1 г, что указывает степень регенерации р-амилазы 75%, а степень регенерации а-1 6-глюкозидазы -Добавление солей органических кислот заметно повышает количества полученных -амилазы и а-1,6-глюкозидазы.
Пример 9. В два баночных феркюнтатора емкостью 10 л помещают среду, содержащую (%) 4 молочного казеина, 0,3 К2НЮ4 и 0,lMgSO4 7Н2О и 5-10 М CaClj, а также 0,5 растворимого крахмала, причем в каждый ферментатор загружают по 0,5 л. В один из двух ферментаторов добавл ют рапсовый жмых в количестве, соответствующем 4%, счита на вес среды. Затем среды двух ферментаторов стерилизуют 30 мин при 12lC. После этого среды инокулируют микоидами разновидности Bacillus cereus (100 мл) и осуществл ют культивирование в услови х аэрации при 30° С при подаче воздуха с объемной скоростью пор дка 5 мин при перемешивании со скоростью пор дка 250 об/мин. Через 24 час культивации культуральный бульон центрифугируют и полученный в результате всплывший слой подвергают испытанию на энзиматическую активность. Полученные ре- . зультаты представлены в табл. 4.
Нагревают до 60° С 30 мин. К полученному раствору добавл ют 300 мл фильтрата культуры микоидов разновидности BaciHus cereus. Фильтрат имеет рН7, 1403 единицы /3-амилазы на 1 мл и 28,0 единиц а-1,6-глюкозидазы на 1 мл. Смесь перемешивают дл адсорбировани двух энзимов.
Затем смесь отфильтровывают дл регенерации энзимов и испытьшают ца активность. Полученные результаты представлены в табл. 5.
Затем смесь крахмала и целита, на котором бьши адсорбированы оба энзима, добавили к 109feному водному раствору декстрина, содержащему 10% хлористого натри . Это делают, чтобы осуществить элюирование энзимов с адсорбентов. В результате /3-амилазу и а-1,6-глюкозидазу регенерировали с выходами 100 и 85% соответственно.
Пример 13. Фильтрат (каждый объемом 100 мл) культуры микоидов разновидности Bacillus cereus, содержащей 758 единиц амилазы и 37,1 единицы а-1,6-глюкозидазы на 1 мл, смешивают с 5 г каждого из следующих веществ: кислой глины, бентонита, талька, целита и перлита с целью адсорбщш а-1,6-глюкозидазы.
Адсорбированный знзим регенерируют фильтрацией или центрифугированием, тщательно промывают водой и затем определ ют его активность Полученные результаты представлены в таблице БКак видно из приведенных данных, а-1,6-глюкозидаза удовлетворительно адсорбируетс всеми адсорбентами, количество адсорбированного энзима 400-700 единиц на 1 г.
Пример 14. К 100 г (вес сухого вещества ) сжиженного крахмала с декстрозным эквивалентом 1,5% добавл ют 30000 единиц р- амилазы, 3000 единиць1а-1,6-глюкозидазы и 0,73 CaClj. Смесь разбавл ют до общего объема
ттг пс1п1 -а son Ап uarrv nQwiT пг SO С И VPTawawnnвают рН в интервале 6-6,5. В этих услови х осуществл ют реакцию. Через 100 час в реакционной смеси определ ют состав сахара методом буДобавлено к концу 24-го часа культивировани .
-ХЧДобавлено в начале культивировани .
мажной хроматографии. Сахар содержал (%) 90,6 мальтозы, 7,1 мальтотриозы, 0,0 глюкозы и 2,3 других сахаридов.
Таблица 1
4.0
Активность фиксированного энзима (С)
Выход фиксированного энзима (С/А-Вх100).%
Таблица 3
Таблица 4
106,0
24700
6220
95300
95.1
Кисла глига
Бентонит
Тальк
Целит
Перлит
Claims (1)
1. Патент Великобритании № 1281093, кл. С 3 Н, 1972.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP646574A JPS536232B2 (ru) | 1974-01-11 | 1974-01-11 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
SU611596A3 true SU611596A3 (ru) | 1978-06-15 |
Family
ID=11639184
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU752101415A SU611596A3 (ru) | 1974-01-11 | 1975-01-10 | Способ получени фермента -1,6 глюкозидазы |
Country Status (16)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US3992261A (ru) |
JP (1) | JPS536232B2 (ru) |
BE (1) | BE828972A (ru) |
BR (1) | BR7500131A (ru) |
CS (1) | CS203974B2 (ru) |
DD (2) | DD116853A5 (ru) |
DE (1) | DE2500597C2 (ru) |
FR (1) | FR2257683B1 (ru) |
GB (1) | GB1466009A (ru) |
HU (1) | HU173275B (ru) |
IT (1) | IT1026306B (ru) |
NL (1) | NL180021C (ru) |
PL (1) | PL96758B1 (ru) |
SE (1) | SE7500274L (ru) |
SU (1) | SU611596A3 (ru) |
YU (1) | YU323780A (ru) |
Families Citing this family (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU520395B2 (en) * | 1978-01-12 | 1982-01-28 | Cpc International Inc. | Obtaining crystals of maltose froma starch hydrolyzate |
JPS57174089A (en) * | 1981-04-20 | 1982-10-26 | Novo Industri As | Chain dividing enzyme product |
US4734364A (en) * | 1983-05-20 | 1988-03-29 | Miller Brewing Company | Production of dextrose and maltose syrups using an enzyme derived from rice |
JPS60186283A (ja) * | 1984-03-07 | 1985-09-21 | Agency Of Ind Science & Technol | 微生物による新規な耐熱性プルラナ−ゼaの製造法 |
US4814267A (en) * | 1984-09-18 | 1989-03-21 | Michigan Biotechnology Institute | Method for preparing high conversion syrups and other sweeteners |
US4628028A (en) * | 1985-05-23 | 1986-12-09 | Cpc International Inc. | Novel thermostable pullulanase enzyme and method for its production |
DE68914401T2 (de) * | 1988-10-07 | 1994-08-25 | Matsutani Kagaku Kogyo Kk | Verfahren zur Herstellung von Dextrin enthaltenden faserigen Nahrungsprodukten. |
JP3173849B2 (ja) * | 1992-02-26 | 2001-06-04 | 天野エンザイム株式会社 | 新規な枝切り酵素及びその製造法 |
DK3473710T3 (da) * | 2016-06-17 | 2023-10-23 | Nissan Chemical Corp | Forsukringsreaktionsopløsning, forsukringsenzymsammensætning, fremgangsmåde til fremstilling af sukker og fremgangsmåde til fremstilling af ethanol |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US2494514A (en) * | 1946-05-10 | 1950-01-10 | Staley Mfg Co A E | Production of the amylase of bacillus macerans |
US3827940A (en) * | 1968-04-01 | 1974-08-06 | Hayashibara Co | Preparation of alpha-1,6-glucosidase |
JPS543937B1 (ru) * | 1968-11-18 | 1979-02-28 | ||
JPS505271B1 (ru) * | 1970-04-24 | 1975-03-01 | ||
US3804718A (en) * | 1971-04-01 | 1974-04-16 | Hayashibara Co | Method of producing beta-amylase by bacterial fermentation |
US3769168A (en) * | 1971-06-11 | 1973-10-30 | Hayashibara Co | Process for the purification of amylases |
-
1974
- 1974-01-11 JP JP646574A patent/JPS536232B2/ja not_active Expired
-
1975
- 1975-01-03 GB GB31675A patent/GB1466009A/en not_active Expired
- 1975-01-06 US US05/538,918 patent/US3992261A/en not_active Expired - Lifetime
- 1975-01-09 DE DE2500597A patent/DE2500597C2/de not_active Expired
- 1975-01-09 BR BR131/75A patent/BR7500131A/pt unknown
- 1975-01-10 IT IT47625/75A patent/IT1026306B/it active
- 1975-01-10 SU SU752101415A patent/SU611596A3/ru active
- 1975-01-10 NL NLAANVRAGE7500283,A patent/NL180021C/xx not_active IP Right Cessation
- 1975-01-10 PL PL1975177264A patent/PL96758B1/pl unknown
- 1975-01-10 FR FR7500753A patent/FR2257683B1/fr not_active Expired
- 1975-01-10 HU HU75SI1447A patent/HU173275B/hu unknown
- 1975-01-10 DD DD183592A patent/DD116853A5/xx unknown
- 1975-01-10 SE SE7500274A patent/SE7500274L/xx unknown
- 1975-01-10 DD DD188481A patent/DD120468A5/xx unknown
- 1975-01-13 CS CS75225A patent/CS203974B2/cs unknown
- 1975-05-12 BE BE156269A patent/BE828972A/xx not_active IP Right Cessation
-
1980
- 1980-12-22 YU YU03237/80A patent/YU323780A/xx unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
HU173275B (hu) | 1979-03-28 |
FR2257683A1 (ru) | 1975-08-08 |
NL180021B (nl) | 1986-07-16 |
SE7500274L (ru) | 1975-07-14 |
YU323780A (en) | 1983-12-31 |
FR2257683B1 (ru) | 1978-04-21 |
JPS50100287A (ru) | 1975-08-08 |
DD120468A5 (ru) | 1976-06-12 |
CS203974B2 (en) | 1981-03-31 |
NL180021C (nl) | 1986-12-16 |
NL7500283A (nl) | 1975-07-15 |
DD116853A5 (ru) | 1975-12-12 |
GB1466009A (en) | 1977-03-02 |
IT1026306B (it) | 1978-09-20 |
BE828972A (fr) | 1975-09-01 |
JPS536232B2 (ru) | 1978-03-06 |
BR7500131A (pt) | 1975-11-04 |
DE2500597C2 (de) | 1984-07-12 |
DE2500597A1 (de) | 1975-07-17 |
PL96758B1 (pl) | 1978-01-31 |
US3992261A (en) | 1976-11-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CA1247032A (en) | Method for direct saccharification of raw starch using enzyme produced by a basidiomycete belonging to the genus corticium | |
US4604355A (en) | Maltogenic amylase enzyme, preparation and use thereof | |
CA1128885A (en) | Thermostable glucoamylase from talaromyces duponti | |
EP0024182B1 (en) | Thermo-stable micro-organism and proteolytic enzyme prepared therefrom, and processes for the preparation of the micro-organism and the proteolytic enzyme | |
SU611596A3 (ru) | Способ получени фермента -1,6 глюкозидазы | |
CA1304030C (en) | .beta.-AMYLASE ENZYME PRODUCT, PREPARATION AND USE THEREOF | |
US4657865A (en) | Pullulanase-like enzyme, method for preparation thereof, and method for saccharification of starch therewith | |
Haasum et al. | Growth and glucoamylase production by the thermophilic fungus Thermomyces lanuginosus in a synthetic medium | |
US4844911A (en) | Quality improvement of alcoholic liquors | |
CA1329161C (en) | Process for the preparation of difructose dianhydride iii | |
US3697378A (en) | Dextrinization of starch with alph-amylase from bacillus coaculans | |
US3806421A (en) | Amylase inhibitor and method of producing the same | |
JP3691875B2 (ja) | 耐熱性マルトースホスホリラーゼ、その製造方法、その製造に使用する菌、および該酵素の使用方法 | |
CA1081633A (en) | Heat and acid-stable alpha-amylase enzymes and processes for producing the same | |
JP3761236B2 (ja) | 新規なβ−グルコシダーゼ、その製造法および用途 | |
WO1996025489A1 (en) | Psychrophilic protease and psychrophilic bacteria | |
CA1106225A (en) | Production of fructose and fructose-base syrups and means for carrying out such production | |
US5593869A (en) | Method of manufacturing sugars by trehalase | |
JPH0789920B2 (ja) | 微生物による−α−N−アセチルガラクトサミニダーゼの製造法 | |
KR830002800B1 (ko) | 열에 안정한 글루코아밀라제의 제법 | |
CA1131142A (en) | Glucoamylase from stachybotrys subsimplex | |
US3906113A (en) | New amylase and its preparation by fermentation of a penicillium | |
JP2677837B2 (ja) | キトサナーゼ及びその製造方法 | |
JPS6155947B2 (ru) | ||
KR960007741B1 (ko) | 신규 α-1, 6-글루코시다제 및 그의 제조방법 |