CS203974B2 - Method for the contemporary production of beta-amylase and alpha-glucosidase at micro-organisms - Google Patents
Method for the contemporary production of beta-amylase and alpha-glucosidase at micro-organisms Download PDFInfo
- Publication number
- CS203974B2 CS203974B2 CS75225A CS22575A CS203974B2 CS 203974 B2 CS203974 B2 CS 203974B2 CS 75225 A CS75225 A CS 75225A CS 22575 A CS22575 A CS 22575A CS 203974 B2 CS203974 B2 CS 203974B2
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- amylase
- glucosidase
- enzyme
- starch
- enzymes
- Prior art date
Links
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims abstract description 28
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 108010019077 beta-Amylase Proteins 0.000 title claims description 62
- 102100024295 Maltase-glucoamylase Human genes 0.000 title 1
- 108010028144 alpha-Glucosidases Proteins 0.000 title 1
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 claims abstract description 12
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims abstract description 9
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 claims description 51
- 239000008107 starch Substances 0.000 claims description 51
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 claims description 51
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 40
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 claims description 40
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 29
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 claims description 15
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 claims description 15
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 claims description 15
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 15
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 14
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 10
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims description 6
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 claims description 6
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 5
- 150000002696 manganese Chemical class 0.000 claims description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 5
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 claims description 4
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 4
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 4
- 239000005018 casein Substances 0.000 claims description 4
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 claims description 4
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 claims description 4
- 229910052788 barium Inorganic materials 0.000 claims description 3
- DSAJWYNOEDNPEQ-UHFFFAOYSA-N barium atom Chemical compound [Ba] DSAJWYNOEDNPEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 claims description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 3
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 claims description 3
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 3
- 241000193755 Bacillus cereus Species 0.000 claims description 2
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000001727 glucose Nutrition 0.000 claims description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims 1
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 abstract description 27
- 241000194106 Bacillus mycoides Species 0.000 abstract description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 abstract 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 120
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 119
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 119
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 25
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 24
- 229920000945 Amylopectin Polymers 0.000 description 17
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 14
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 12
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 12
- 230000008569 process Effects 0.000 description 11
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 11
- 108010028688 Isoamylase Proteins 0.000 description 10
- 239000004373 Pullulan Substances 0.000 description 10
- 229920001218 Pullulan Polymers 0.000 description 10
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 10
- 235000019423 pullulan Nutrition 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 9
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 9
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 9
- DBTMGCOVALSLOR-UHFFFAOYSA-N 32-alpha-galactosyl-3-alpha-galactosyl-galactose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(OC2C(C(CO)OC(O)C2O)O)OC(CO)C1O DBTMGCOVALSLOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- RXVWSYJTUUKTEA-UHFFFAOYSA-N D-maltotriose Natural products OC1C(O)C(OC(C(O)CO)C(O)C(O)C=O)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 RXVWSYJTUUKTEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 8
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 8
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 8
- FYGDTMLNYKFZSV-UHFFFAOYSA-N mannotriose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(CO)OC(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)C(O)C1O FYGDTMLNYKFZSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 8
- FYGDTMLNYKFZSV-BYLHFPJWSA-N β-1,4-galactotrioside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@H](CO)O[C@@H](O[C@@H]2[C@@H](O[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O FYGDTMLNYKFZSV-BYLHFPJWSA-N 0.000 description 8
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 7
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 7
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 7
- -1 for example Chemical class 0.000 description 7
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical class [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- ROWKJAVDOGWPAT-UHFFFAOYSA-N Acetoin Chemical compound CC(O)C(C)=O ROWKJAVDOGWPAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 6
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 6
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 6
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 6
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 5
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 5
- 229920000856 Amylose Polymers 0.000 description 5
- 239000003905 agrochemical Substances 0.000 description 5
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 5
- 239000004927 clay Substances 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 5
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 4
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 4
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 4
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 4
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 4
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 4
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 4
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 229920001592 potato starch Polymers 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000001433 sodium tartrate Substances 0.000 description 4
- 229960002167 sodium tartrate Drugs 0.000 description 4
- 235000011004 sodium tartrates Nutrition 0.000 description 4
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 4
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 3
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 3
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 3
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 3
- 235000019484 Rapeseed oil Nutrition 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 239000000440 bentonite Substances 0.000 description 3
- 229910000278 bentonite Inorganic materials 0.000 description 3
- SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N bentoquatam Chemical compound O.O=[Si]=O.O=[Al]O[Al]=O SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 125000003071 maltose group Chemical group 0.000 description 3
- 229910001437 manganese ion Inorganic materials 0.000 description 3
- 229910000357 manganese(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 3
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 3
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 3
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 3
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 3
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 239000010451 perlite Substances 0.000 description 3
- 235000019362 perlite Nutrition 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 3
- HELHAJAZNSDZJO-OLXYHTOASA-L sodium L-tartrate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O HELHAJAZNSDZJO-OLXYHTOASA-L 0.000 description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 3
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 3
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000012222 talc Nutrition 0.000 description 3
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 2
- 241001660259 Cereus <cactus> Species 0.000 description 2
- 235000005979 Citrus limon Nutrition 0.000 description 2
- 244000131522 Citrus pyriformis Species 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 2
- 229920002245 Dextrose equivalent Polymers 0.000 description 2
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 2
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 2
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 2
- 108010073178 Glucan 1,4-alpha-Glucosidase Proteins 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N Indole Chemical compound C1=CC=C2NC=CC2=C1 SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005909 Kieselgur Substances 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M Nitrite anion Chemical compound [O-]N=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000194105 Paenibacillus polymyxa Species 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 2
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 2
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003028 enzyme activity measurement method Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 2
- JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N iodoacetic acid Chemical compound OC(=O)CI JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N kaolin Chemical compound O.O.O=[Al]O[Si](=O)O[Si](=O)O[Al]=O NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L magnesium sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[O-]S([O-])(=O)=O WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229940099596 manganese sulfate Drugs 0.000 description 2
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 238000004816 paper chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 2
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 2
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 1
- 241000186046 Actinomyces Species 0.000 description 1
- 239000005995 Aluminium silicate Substances 0.000 description 1
- 241000223678 Aureobasidium pullulans Species 0.000 description 1
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 description 1
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920000298 Cellophane Polymers 0.000 description 1
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000936506 Citrobacter intermedius Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 1
- CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N Fe2+ Chemical compound [Fe+2] CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010056771 Glucosidases Proteins 0.000 description 1
- 102000004366 Glucosidases Human genes 0.000 description 1
- 229920001202 Inulin Polymers 0.000 description 1
- AYRXSINWFIIFAE-SCLMCMATSA-N Isomaltose Natural products OC[C@H]1O[C@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O AYRXSINWFIIFAE-SCLMCMATSA-N 0.000 description 1
- 241000588915 Klebsiella aerogenes Species 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 229920000881 Modified starch Polymers 0.000 description 1
- GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N N-[2-(1H-indol-3-yl)ethyl]-N-methylprop-2-en-1-amine Chemical compound CN(CCC1=CNC2=C1C=CC=C2)CC=C GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010026867 Oligo-1,6-Glucosidase Proteins 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 description 1
- 241000220317 Rosa Species 0.000 description 1
- KGAOCABQVUEVGB-UHFFFAOYSA-J S(=O)(=O)([O-])[O-].[Mn+4].S(=O)(=O)([O-])[O-] Chemical compound S(=O)(=O)([O-])[O-].[Mn+4].S(=O)(=O)([O-])[O-] KGAOCABQVUEVGB-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 102100027918 Sucrase-isomaltase, intestinal Human genes 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LUEWUZLMQUOBSB-UHFFFAOYSA-N UNPD55895 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(CO)OC(OC2C(OC(OC3C(OC(O)C(O)C3O)CO)C(O)C2O)CO)C(O)C1O LUEWUZLMQUOBSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001242 acetic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000012211 aluminium silicate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 150000003841 chloride salts Chemical class 0.000 description 1
- 229910052570 clay Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 229910001448 ferrous ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000004992 fission Effects 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- DBTMGCOVALSLOR-AXAHEAMVSA-N galactotriose Natural products OC[C@@H]1O[C@@H](O[C@@H]2[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H](O[C@H]3[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H](CO)[C@@H]3O)[C@@H]2O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O DBTMGCOVALSLOR-AXAHEAMVSA-N 0.000 description 1
- 230000009229 glucose formation Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N indole Natural products CC1=CC=CC2=C1C=CN2 PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N indolenine Natural products C1=CC=C2CC=NC2=C1 RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- JYJIGFIDKWBXDU-MNNPPOADSA-N inulin Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)OC[C@]1(OC[C@]2(OC[C@]3(OC[C@]4(OC[C@]5(OC[C@]6(OC[C@]7(OC[C@]8(OC[C@]9(OC[C@]%10(OC[C@]%11(OC[C@]%12(OC[C@]%13(OC[C@]%14(OC[C@]%15(OC[C@]%16(OC[C@]%17(OC[C@]%18(OC[C@]%19(OC[C@]%20(OC[C@]%21(OC[C@]%22(OC[C@]%23(OC[C@]%24(OC[C@]%25(OC[C@]%26(OC[C@]%27(OC[C@]%28(OC[C@]%29(OC[C@]%30(OC[C@]%31(OC[C@]%32(OC[C@]%33(OC[C@]%34(OC[C@]%35(OC[C@]%36(O[C@@H]%37[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O%37)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%36)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%35)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%34)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%33)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%32)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%31)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%30)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%29)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%28)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%27)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%26)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%25)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%24)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%23)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%22)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%21)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%20)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%19)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%18)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%17)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%16)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%15)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%14)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%13)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%12)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%11)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%10)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O9)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O8)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O7)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O6)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 JYJIGFIDKWBXDU-MNNPPOADSA-N 0.000 description 1
- 229940029339 inulin Drugs 0.000 description 1
- DLRVVLDZNNYCBX-RTPHMHGBSA-N isomaltose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O1 DLRVVLDZNNYCBX-RTPHMHGBSA-N 0.000 description 1
- FBJQEBRMDXPWNX-FYHZSNTMSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H]2[C@H]([C@H](O)[C@@H](O)C(O)O2)O)O1 FBJQEBRMDXPWNX-FYHZSNTMSA-N 0.000 description 1
- 229910052622 kaolinite Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- UYQJCPNSAVWAFU-UHFFFAOYSA-N malto-tetraose Natural products OC1C(O)C(OC(C(O)CO)C(O)C(O)C=O)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)C(CO)O1 UYQJCPNSAVWAFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LUEWUZLMQUOBSB-OUBHKODOSA-N maltotetraose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@H](CO)O[C@@H](O[C@@H]2[C@@H](O[C@@H](O[C@@H]3[C@@H](O[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]3O)CO)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O LUEWUZLMQUOBSB-OUBHKODOSA-N 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 235000019426 modified starch Nutrition 0.000 description 1
- 150000002823 nitrates Chemical class 0.000 description 1
- 150000002826 nitrites Chemical class 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 229940095064 tartrate Drugs 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C13—SUGAR INDUSTRY
- C13K—SACCHARIDES OBTAINED FROM NATURAL SOURCES OR BY HYDROLYSIS OF NATURALLY OCCURRING DISACCHARIDES, OLIGOSACCHARIDES OR POLYSACCHARIDES
- C13K7/00—Maltose
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2411—Amylases
- C12N9/2425—Beta-amylase (3.2.1.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2451—Glucanases acting on alpha-1,6-glucosidic bonds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01002—Beta-amylase (3.2.1.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01033—Amylo-alpha-1,6-glucosidase (3.2.1.33)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/832—Bacillus
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/832—Bacillus
- Y10S435/834—Bacillus cereus
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Vynález se týká způsobu současné výroby /3-amylázy a a-l,6-gluko-sidázy z mikroorganismů.
Až dosud .byla /--amyláza (a-l,4-glukanmaltohydroláza) zjišťována převážně v sójových bobech a ve sladu. Tyto dvě suroviny jsou dnes zdroji pro průmyslovou výrobu tohoto enzymu. Mimoto bylo známo, že mikroorganismy rodu Bacillus jsou schopny produkovat podobný enzym. Například Kneen a další zjistili, že Bacillus polymyxa produkuje β-amylázu. [Archives of Biochemistry, sv. 10, str. 41 (1946).] V roce 1948 byla podána podrobnější zpráva o enzymatických vlastnostech /J-amylázy produkovaných kmenem mikroorganismu Rose [Archives of Biochemistry, sv. 16, str. 349 (1948).]
Později bylo uvedeno, že i Bacilus megaterium produkuje ^-amylázu [ (Higaschihara a další, Japan Agricultural Chemical Society, Abstracts of Lectures at the 1971 Annual Meeting, str. 212 a Amylase Symposium, sv. 6, str. 39 (1971).] Bylo uvedeno, že tento enzym je totožný s /S-amylázou produkovanou Bacillus polymyxa (Japan Agricultural Chemical Society, Abstracts of Lectures at the 1972 Annual Meeting, str. 86.)
Co se týká a-l,6-glukosidázy škrobu, byla zařazována dosti často· jako izoamyiáza nebo pullulanáza. Izoamyláza byla poprvé objeve2 na v kvasnicích [ (Maruo, Kobayashi a další Bunji Maruo and Tsuneo Kobayashi, Journal of Japan Agricultural Chemical Society, sv. 23, str. 115 a 120 (1949)).]
Od té doby bylo zjištěno, že se tento enzym vyskytuje ve vyšších roslinách, a v tomto' ' případě se uvádí jako R-enzym a také ' v mikroorganismech rodu Pseudomonas . [ (Japanese Patent Publication č. 16788/1970).] V - poslední době byla podána zpráva o· tom, že termofilní Bacillus stearothermophilas produkuje termofilní izomylázu, jejíž optimální pracovní teplota je 65 až 67,5 °C [Japan Agricultural Chemical Society, Abstracts of Lectures at the 1972 Annual Meeting, str. 88 and Japanese Patent Dlsclosure č. 91272'/ /19713).]
Pullulanáza byla zjištěna Benderem v roce 1959 v Aerobacter aerogenes jako enzym schopný hydrolyzovat polysacharid pullulan, produkovaný Pullularia pullulan. Hydrolyzuje -a-l,6-glukosidickou vazbu pullulanu za vzniku maltotriózy [Biochem. Biophys. Acta, sv. 36, str. 309 (1959) a Japanese Patent Publication č. 7559/1971], Enzym také hydrolyzuje a-l,6-glykosidickou vazbu, například v amylopektinu a glykogenu. Bylo také uváděno, že enzymy tohoto typu jsou produkovány mikroorganismy, například Escherichia intermedia [Ueda a další, Applied Microbio203974 logy, sv. 15, str. 492 (1967)] a Streptomyces mites [Ueda a další, Journal of Fermentation Technology, sv. 49, str. 552 (1971)].
Jak již bylo uvedeno, byla potvrzena nezávislá produkce α-amylázy a a-l,6-glykosidázy pro řadu mikroorganismů a rostlin. Dosud však nebyl popsán mikroorganismus, který by současně produkoval oba tyto enzymy.
Při výrobě těchto dvou enzymů bylo tedy až dosud nutno odděleně pěstovat dva různé mikroorganismy. Nehledě к rozdílům v reakci pH a teploty na oba enzymy, bylo velmi obtížné uvést oba tyto enzymy ve styk se škrobem současně. Z tohoto důvodu byla výroba maltózy až dosud prováděna ve dvou stupních, přičemž v prvním stupni se uváděl škrob ve styk s a-l,6-glukosidázou za vzniku sloučeniny s přímým řetězcem, podobné amylóze, ve druhém stupni se tato látka uváděla ve styk s β-amylázou za vzniku maltózy.
Předmětem vynálezu je způsob výroby β-amylázy a a-l,6-glukosidázy z mikroorganismů, vyznačující se tím, že se pěstuje při teplotě 20 až 40 aC a při hodnotě pH 5 až 10 mikroorganismus rodu Bacillus se schopností produkovat β-amylázu a 1,6-glukosidázu současně v živném prostředí s obsahem zdroje uhlíku, například maltózy, glukózy, škrobu nebo dextrinu, zdroje dusíku, například peptonu, kaseinu, extraktu z masa, extraktu z kvasnic, kukuřičného výluhu, sójové mouky nebo sójových pokrutin, a anorganických solí, například fosfátů, hořečnatých solí, barnatých nebo vápenatých solí nebo solí manganu.
V případě, že se škrob nebo derivát škrobu smísí současně s oběma uvedenými enzymy, působí β-amyláza štěpení maltózových jednotek z amylopektinu, který je přítomen ve škrobu, a to v neredukujících koncových skupinách řetězce, tím dochází ke zpřístupnění dalších rozvětvených vazeb a «-1,6-glukosldáza může štěpit «-1,6-glukosldázové vazby postranních řetězců, čímž se opět umožní funkce /?-amylázy. To znamená, že oba tyto enzymy střídavě hydrolyzují maltózovou jednotku amylopektinu z neredukujících zakončení řetězce, takže je přímo produkována maltóza ze škrobu jednostupňovým postupem ve vyšších výtěžcích, než jakých je možno dosáhnout známými způsoby.
Účinek obou těchto enzymů na škrob je znázorněn v přiložených grafech.
Na obr. 1 je znázorněn vztah mezi hodnotou pH a účinností /З-amylázy a a-l,6-glukosidázy, které byly produkovány Bacillus cereus var. mycoides. Na ose pořadnic je znázorněna relativní účinnost v procentech, na ose úseček je znázorněno pH, které se udržuje v rozmezí 4 až 6 acetátovým pufrem a v rozmezí 6 až 10 fosfátovým pufrem. Čára, přerušovaná prázdnými kroužky značí účinnost ι/3-amylázy, křivka přerušovaná plnými kroužky znázorňuje účinnost a-l,6-glykosidázy.
Na obr. 2 je znázorněn vztah mezi teplotou a účinností uvedených dvou enzymů. Na ose úseček je znázorněna teplota ve stupních Celsia, na ose pořadnic je stanovena relativní účinnost v procentech, reakční doba byla 30 minut. Jednotlivé křivky jsou označeny stejně jako na obr. 1.
Na obr. 3 je uveden graf, který znázorňuje stálost obou svrchu uvedených enzymů při různých hodnotách pH. Na ose úseček je uvedeno pH. Na ose pořadnic je znázorněna relativní účinnost v procentech. Pokus byl prováděn při teplotě 30 °C po dobu 3 hodin. Křivky jsou označeny stejně jako na obr. 1.
Na obr. 4 je znázorněna stálost obou enzymů při různých teplotách. Na ose úseček je znázorněna teplota ve stupních Celsia. Na ose pořadnic je znázorněna relativní účinnost v procentech. Pokus trval 10 minut. Křivky jsou označeny stejně jako na obr. 1.
Na obr. 5 je znázorněn vztah mezi reakční dobou a stupněm hydrolýzy, který je uváděn jako množství maltózy. Stanovení bylo prováděno tak, že živné prostředí, v němž byl mikroorganismus pěstován, bylo uvedeno v reakci s amylázou, amylopektinem, bramborovým škrobem, glykogenem a dextrinem. Na ose úseček je znázorněna reakční doba v hodinách, na ose pořadnic je znázorněn stupeň hydrolýzy v procentech. Shora dolů jsou na grafu uvedeny křivky pro amylázu, dextrin, amylopektin, škrob a glykogen.
Protože (S-amyláza a «-1,6-glukosidáza jsou produkovány současně, je možno je také oddělit ve formě složitějšího enzymatického přípravku, který je pak možno velmi výhodně užít pro výrobu maltózy. Bylo proto vyzkoušeno velké množství mikroorganismů, aby bylo možno zjistit druh, který je nejschopnější produkovat oba uvedené enzymy současně. Byly objeveny tři kmeny, které tuto schopnost mají.
Všechny tři zjištěné kmeny jsou bakterie náležející do rodu Bacillus. Tyto mikroorganismy byly pojmenovány Bacillus cereus var. mycoides, Bacillus sp. YT 1002 a Bacillus sp. YT 1003.
Na základě tohoto zjištění bylo možno navrhnout způsob výroby maltózy přímo ze škrobu a jeho derivátů tak, že se pěstují bakterie rodu Bacillus schopné produkovat současně uvedené enzymy, živné prostředí se pak uvádí po izolaci nebo bez izolace enzymů ve styk se škrobem a jeho deriváty. Až dosud nebyl popsán žádný jiný mikroorganismus, který by byl schopen současné produkce 0-amyIázy a a-l,6-glukosidázy.
Bacyllus cereus var. mycoides byl uložen v Fermentation Research Institute of Chiba-shi, Japonsko, pod FERM č. 2391 20. prosince 1973 a Bacillus sp. YT 1002 a Bacillus sp. YT 1003 byly uloženy ve stejném ústavě 12. prosince 1974 pod FERM č. 2837 a FERM č. 2838.
Mykologické vlastnosti těchto mikroorganismů budou dále popsány.
Bacillus cereus var. mycoides (Ferm č.2391)
Tyčinka o velikosti 1,1 až 1,4 X 4,2 až 7,0 mikrometrů, obvykle v krátkých nebo delších řetězcích jako plíseň nebo Actinomyces, nepohyblivá, gram-pozitivní, sporangia nejsou zjevně nabobtnalá.
Živný bujón: dobrý růst, sediment.
Šikmý živný agar: bohatý růst, vlákna, sporangia, krémově bílá barva.
Agar s glukózou a asuaraginem: špatný růst, vlákna.
Agar s glukózou a dusičnanem: kultura neroste nebo roste velmi špatně.
Šikmý agar s tyrosinem: dobrý růst, vlákna, světle hnědé zbarvení.
Využití citrónanu: pozitivní.
Mléko: peptonizace.
Brambor: dobrý růst, krémové až hnědavé zbarvení.
Želatina: dochází ke zkapalnění.
Tvorba amoniaku: pozitivní.
Tvorba acetylmethylkarbinolu: pozitivní. Redukce dusičnanů na dusitany: pozitivní.
Kataláza: pozitivní.
Produkce indolu: negativní.
Hydrolýza škrobu: pozitivní.
Bujón s chloridem sodným: ve 4 % roztoku chloridu sodného nedochází к růstu.
Bacillus sp. YT 1002 (FERM č. 2837)
Tyčinka o rozměrech 1 až 1,2 X 5 až 6 mikrometrů, nepohyblivá, gram-pozitivní, obvykle tvoří krátké i delší řetězce.
Živný bujón: sediment.
Šikmý živný agar: dobrý růst a dobré rozšíření kultury.
Agar s glukózou a asparaginem: středně dobrý růst.
Šikmý agar s glukózou a dusičnanem: středně dobrý růst.
Mléko: pomalá peptonizace.
Brambor: dobrý růst, rozšíření kultury po ploše, krémově bílá barva.
Želatina: zkapalnění.
Produkce amoniaku pozitivní,
Redukce dusičnanu na dusitan: pozitivní.
Kataláza: pozitivní.
Acetylmethylkarbinol: produkce.
Agar s citrónanem: středně dobrý růst.
Organické zdroje dusíku: důležité pro růst. Uhlohydráty: při použití glukózy, fruktózy, galakiózy, mannózy, laktózy, maltózy, trehalózy, sorbitu, glycerinu, škrobu, glykogenu se vytváří kyselina, nikoli plyn.
Teplota při růstu: kultura roste až do teploty 50 °C. Optimální teplota je 30 až 35 °C.
Zdroj kultury: izolace z půdy.
Bacillus sp. YT 1003 (FERM č. 2838)
Tyčinka o rozměrech 1 až 1,6 X 2 až 7 mikrometrů, obvykle tvoří kratší nebo delší řetězce, není pohyblivá, je gram-pozitivní.
Živný bujón: dobrý růst, sediment.
Šikmý živný agar: dobrý růst, rozšíření kultury po ploše, krémově bílá barva.
Agar s glukózou a asparaginem středně dobrý růst.
Mléko: peptonizace bez koagulace.
Želatina: pomalé zkapalnění.
Produkce amoniaku: pozitivní.
Kataláza: pozitivní.
Redukce dusičnanu na dusitan: pozitivní. Acetylmethylkarbinol: produkce.
Citrónan: využití jako zdroje uhlíku.
Uhlohydráty: využití bez tvorby plynu u glukózy, fruktózy, glaktózy, mannózy, L-arabinózy, D-xylózy, sacharózy, laktózy, maltózy, trehalózy, raffinózy, mannitu, sorbitu, glycerinu, inulinu.
Teplota při růstu: optimální teplota je 30 až 35 °C, maximální teplota je 45 °C.
Zdroj mikroorganismu: izolace z půdy.
Všechny druhy bakterií podle vynálezu produkují jak β-amylázu a a-l,6-glukosidázu při pěstování v prostředí se zdrojem uhlíku a dusíku tak, jak je to běžné při pěstování, mikroorganismů. Příkladem uhlíkových zdrojů mohou být maltóza, škrob, částečně hydrolyzovaný škrob, jako je dextrin a jiné formy škrobu. Příkladem zdrojů dusíku mohou být pepton, kasein, extrakt z masa, extrakt z kvasnic, kukuřičný výluh, sója a sójové pokrutiny.
V případě, že je to nutné, přidávají -se anorganické soli, jako fosforečnany, horečnaté soli, soli barnaté a vápenaté nebo anorganický zdroj dusíku; v případě, že základní surovinou pro výrobu živného prostředí je kukuřičný výluh, je výhodné upravit jeho pH v rozmezí 6 až 9, takže je možno před použitím odstranit sraženinu, v níž může být přítomna látka inhibující produkci /7amylázy. Z tabulky 1 jasně vyplývá, že v případě, kdy se odstranění této sraženiny provede, je množství vyrobené /З-amylázy více než 10 X vyšší než v opačném případě, přičemž odstranění sraženiny téměř neovlivňuje produkci a-l,6-glukosidázy.
a-l,6-glukosidáza (jednotky/ml prostředí) /3-amyláza (jednotky/ml prostředí)
Tabulka 1 pH při přípravě kukuřičného výluhu bez úpravy
5.1+ 0,1
6.0 + 0,1
7.1+ 0,1
8.1+ 0,1
9,1 + 0,1
10,0 + 0,1
Ve snaze vyrobit oba enzymy ve vysokém výtěžku byla provedena řada pokusů pro zjištění nejvýhodnějších podmínek pěstování. Bylo potvrzeno, že členěním iontů manganu do prostředí je možno zvýšit podstatným způsobem produkci a-l,6-glukosidázy. Přítomnost těchto iontů však má inhibiční efekt na výrobu /З-amylázy. Příslušným výběrem doby a množství při přidávání iontů manganu к živnému prostředí je však možno provést pěstování tak, že se získají oba enzymy v žádané koncentraci.
Ze solí manganu je možno užít různé sloučeniny, například sírany, chloridy, fosforečnany a octany manganu. Tyto soli se obvykle к prostředí přidávají v množství 1 X 10=8 až IX10“2 molu, s výhodou IX10“6 až IX X104 molu. V případě, že prostředí obsahuje síran manganu v množství 1 X 105 molu, je produkce a-l,6-glukosidázy 3 až 6X vyšší než bez tohoto přídavku. Pokud jde o produkci obou enzymů, zvýší se množství obou v případě, že se pěstování mikroorganismu provádí v prostředí s obsahem citrónanu a/ /nebo vínanu.
Tyto látky se obvykle přidávají к prostředí v množství 0,01 až 1 °/o, s výhodou 0,05 až 0,2 %, vztaženo na hmotnost prostředí. V případě, že se pěstování provádí v živném prostředí s obsahem citrónanu nebo vínanu sodného v množství 0,1 %, je množství β-amylázy 1,5 až 2X vyšší a množství a-1,6-glykosldázy je 1,3 až 1,5 X vyšší než bez přidání těchto solí.
Dále bylo zjištěno, že v případě, že se pěstování provádí v živném prostředí s obsahem řepkového semene, pokrutin z řepkového semene nebo z traktu získaného z řepkového semene zahříváním s vodou nebo s kapalinou o pH 9 až 10, dochází к vysokému zvýšení množství a-l,6-glukosidázy, například při obsahu 4 % pokrutin z řepkové4035,4
12140,6
42039,1
51641,3
52535,9
46035,1
35225,0 ho semene je obsah tohoto enzymu 2 až 3 X vyšší než bez tohoto přídavku.
Kultura se pěstuje za provzdušňování při teplotě 20 až 40 °C po dobu 24 až 72 hodin. V průběhu pěstování se pH prostředí mění v rozmezí 5,5 až 9,5. Je žádoucí udržovat hodnotu pH prostředí na hodnotách 6 až 8 v průběhu celé fermentace.
Oba uvedené enzymy se produkují extracelulárně. Je tedy možno vyrobené enzymy izolovat tak, že se živné prostředí zfiltruje za účelem odstranění buněk, filtrát se zahustí a pak se enzymy dále koncentrují přidáním organického rozpustidla, jako acetonu, ethanolu, methanolu nebo isopropanolu, к vysrážení nebo je možno provést srážení také síranem amonným. V případě, že se srážení enzymu provádí vysolením pomocí síranu amonného, je možno získat 60 až 100 % β-amylázy a a-l,6-glukosidázy ve formě sraženiny při 70 až 75 % vysycení síranem amonným.
Protože každý z těchto enzymů je možno absorbovat na škrob, aktivované uhlí, různé druhy infusoriové hlinky, jako Celit, Hyfro-Supercel nebo Perlit, různé druhy jílů, jako bentonit, kyselý jíl, fulernarde, kaolin nebo mastek nebo fosforečnan vápenatý, po absorpci je možno tyto enzymy opět uvolnit nebo v případě absorpce na škrob přímo dochází к rozložení škrobu. Například /ϊ-amylázu je možno velmi účinně absorbovat na škrob, zejména v případě, že byl předem zahřát na 40 až 65 °C.
V případě přidání kukuřičného škrobu dochází к absorpci 3000 až 8000 jednotek \β-amylázy na 1 kg škrobu, je-li kukuřičný škrob předehřát na teploty v rozmezí 40 až 65 °C, jak je zřejmé z tabulky 2. Rovněž gelatinizovaný škrob zajišťuje velmi dokonalou absorpci enzymu.
Tabulka 2
| Teplota při předběžném zpracování škrobu (°C) | Doba (min) | Účinnost absorbované /?-amylázy (jednotky/g škrobu) |
| 40 | 10 | 3 010 |
| 50 | 10 | 5 930 |
| 55 | 10 | 6 890 |
| 60 | 10 | 7 650 |
| 65 | 10 | 8130 |
| 80 | 10 (gelatinizování) | 7 890 |
| nezpracováno | 1020 |
Adsorbovaná β-amyláza může být úplně vymyta roztokem z obsahem 1 až 10 %, s výhodou 5 až 10 % maltózy nebo rozpustného škrobu, popřípadě dextrinu s maltózou. β-Amyláza i a-l,6-glukosidáza se dobře adsorbují na aktivované uhlí. Výsledné adsorbované enzymy mají vysokou enzymatickou účinnost a je možno je v této formě užít jako imobilizované enzymy. Napříkled β-amyláza se adsorbuje v množství 8 000 až 12 000 jednotek a a-l,6-gluku!sidáza v množství 500 až 1 000 jednotek na g aktivního uhlí. Výsledný adsorbovaný enzym si uchovává v případě /ϊ-amylázy enzymatickou účinnost, která je rovna 90 % původní účinnosti, a-l,6-glukosidáza si uchovává svou účinnost na 100 %.
Mimoto je možno a-l,6-glukosidázu adsorbovat v množství 500 až 800 jednotek na g na infusoriové hlinky, například na Celit, Perlit apod.; jde o křemičité materiály nebo o jílovité produkty, jako bentonit, kyselý jíl nebo kaolinit, který sestává převážně z kysličníku křemičitého a hlinitého, z těchto přípravků je možno adsorbovaný enzym úplně vymýt 5 až 10% vodným roztokem chloridu sodného. I v adsorbovaném stavu si enzymy uchovávají účinnost, která odpovídají 50 až 70 procentům původní účinnosti.
Enzymatické vlastnosti /З-amylázy a a-1,6-glukosidázy, které jsou produkovány bakteriálními kmeny podle vynálezu budou dále uvedeny.
/?-Amyláza:
1) Účinnost: Enzym štěpí maltózu ze škrobu, ajmylózy, amylopektinu, glykogenu, dextrinu apod.
2} Specificita substrátu: stupeň hydrolýzy pro maltózu a amylózu je téměř 100 % a pro škrob téměř 60 %. Enzym nehydrolyzuje a-1,6-glukosidázovou vazbu amylopektinu, glykogenu, dextrinu, pullulanu apod.
3) pH vhodné pro účinnost enzymu je pH 3 až 10 (obr. 1].
4) Optimální pH: pH 7 (obr. 1).
5) Teplota pro účinnost enzymu je až do 65 °C (obr. 2).
6) Optimální teplota: v blízkosti 50 °C (obr. 2).
7) Inaktivace: přibližně 20 % účinnosti se ztrácí po 10 minutách stání při 55 °C; v podstatě veškerá účinnost je ztracena po 10 minutách stání při 70 °C (obr. 4).
8) Stabilita při různém pH: Enzym je nestálý v kyselém pH pod hodnotou pH 5 a je stálý na alkalické straně při pH 6 až 10 (obr. 3).
9) Inhibice: enzym je inhibován p-chlorortuťnatým benzoátem a částečně inhibován monojodoacetátem; po inhibici první z uvedených sloučenin je možno účinnost obnovit přidáním cysteinu; enzym je silně inhibován ionty Cu++, Hg++ a Ag+; dále je inhibován Fe+ + .
10) Čištění: enzym se frakcionuje vysrážením po 30 až 50% nasycení síranem amonným ze živného prostředí a pak je možno jej čistit sloupcovou chromatografií při použití přípravku Sephadex G-100.
11) Měření enzymatické účinnosti: Vhodné množství enzymatického roztoku se přidá ke 2 ml fosforečnanového pufru o koncetraci 0,1 M o pH 7,0 s obsahem 2 % rozpustného škrobu a směs se doplní destilovanou vodou na 4 ml., načež se inkubuje při 40 °C. Množství enzymu, které vede po 1 hodině ke vzniku 1 mg maltózy ze svrchu uvedených podmínek, je definováno jako jedna jednotka.
a-l,6-Glukosidáza
1) Působení: Enzym hydrolyzuje a-l,.6-glukosidickou vazbu amylopektinu, který byl částečně hydrolyzován působením ^-amylázy.
2) Specifičnost substrátu: Enzym produkuje maltotriózu hydrolýzou a-l,6-glukosidické vazby pullulanu. V případě, že se uvede v reakci s amylopektinem, nedochází ke zvýšení barvitosti jodem. To znamená, že enzym projevuje svou účinnost pouze na amylopektinu, částečně hydrolyzovatelném β-amylázou, takže postranní řetěz je zkrácen. Enzym nepůsobí na isomaltózu a pannózu.
3) pH při působení enzymu: 5 až 10 (obr. 1).
4) Optimální pH: 6 až 6,5 (obr. 1).
5) Teplota pří působení: Do 65 °C (obr. 2).
6) Optimální teplota: Přibližně 50 °C (obr. 2).
7) Inaktivace: Přibližně 50 % účinnosti je ztraceno po 10 minutách stání při 50 °C. V podstatě veškerá účinnost se ztrácí po 10 minutách stání při 65 °C (obr. 4). Ionty Ca+ + nebo Sr++ však mají silnou ochrannou účinnost. V nepřítomnosti vápenatých iontů se ztrácí 90 °/o účinnosti po 30 minutách stání při 50 °C, za přítomnosti 5 Х1СГ3 M chloridu vápenatého je ztěží možno rozeznat pokles účinnosti.
8) Stálost při různém pH: Enzym je stálý v oblasti pH 6 až 9. Enzym je nestálý na kyselé straně a poměrně stálý na alkalické straně (obr. 3).
9) Inhibice: Enzym je částečně inhibován p-chlorobenzylátem rtuťnatým a nepatrně monojodoacetátem. Enzym je silně inhibován ionty rtuťnatými, stříbrnými a železnatýml.
10) Čištění: Enzym je možno čistit srážením 60 až 70 % síranu amonného ze živného prostředí, čistit enzym je možno sloupcovou chromatografií na přípravku Sephadex G-100.
11) Měření enzymatické účinnosti: Účinnost enzymu se měří při použití pullulanu jako substrátu, enzym z tohoto materiálu uvolňuje maltotriózu. Zkouška se provádí tak, že se vhodné množství enzymu přidá к 0,5 mililitru 0,1 M fosforečnanového pufru o pH 7,0 s obsahem 1 % pullulanu. Výsledná směs se doplní na 1,0 ml destilovanou vodou a inkubuje se při teplotě 40 aC 1 hodinu. Množství enzymu, které vyvolá tvorbu 1 mg maltotričzy za svrchu uvedených podmínek, se pokládá za jednotku účinnosti.
Z fyzikálních a chemických vlastností, zejména podle specifičnosti substrátu, je enzym novou a-l,6-glukosidázou, produkovanou bakteriemi rodu Bacillus, který není možno zařadit mezi dříve známé enzymy, isoamylázu a pullulanázu. Byl označen jako dextrin-a-l,6-glukosidáza. «-1,6-Glukosidázy, a to isoamyláza a pullulanáza, produkované dříve známými mikroorganismy, hydrolyzují a-1,6-glukosidázovou vazbu v postranním řetězci amylopeiktinu za vzniku sloučeniny podobné amylóze, která se modře barví při reakci s jodem. [(Biochemische Zeltšchrift, sv. 334, str. 79 — 95 (1961), Biochemische J. sv. 108, str. 33 — 40 (1968), Biochemica et Biophyslca Acta, sv. 212, str. 458 — 469 (1970), J. Fermentation of Technology, sv. 49, str. 552 — 559 (1971)]. Obvykle se proto provádí zkouška na účinnost měřením vzrůstu těchto zbarvení jodem po reakci enzymu se škrobem nebo amylopektinem.
a-l,6-Glukosidáza podle vynálezu nezpůsobuje zvýšení intenzity zbarvení jodem při uvedené reakci. Tato skutečnost prokazuje, že tyto enzymy reagují pouze se škrobem nebo amylopektinem, v němž postranní řetězec byl částečně hydrolyzován působením /3-amylázy a glukózový zbytek v postranním řetězci byl tedy zkrácen. Tato specifičnost substrátu odlišuje enzym od dříve známých β-1,6-glukosidáz.
«-1,6-Glukosidáza podle vynálezu má velmi výhodné enzymatické vlastnosti zejména proto, že je produkována současně s 0-amylázou, takže je možno přímo hydrolyzovat škrob na maltózu. Jak je zřejmé z obr. 1 až 4, tyto dva enzymy si jsou podobné, pokud jde o optimální pH a optimální teplotu. Jsou si také podobné, pokud jde o stálost při různé teplotě. Pokud jde o způsob hydrolýzy škrobu uvedenými enzymy, probíhá tento postup tak, že β-amyláza odštěpuje maltózové jednotky z neredukujícího konce řetězce, čímž dojde ke zpřístupnění místa, v němž dochází к rozvětvení, takže a-l,6-glukosidáza může rozštěpit a-l,6-glukosidickou vazbu. Tímto způsobem oba enzymy střídavě hydrolyzují amylopektin z neredukujícího konce. Jak je možno očekávat z mechanismu reakce, použití enzymu podle vynálezu ve spojení s /З-amylázou má za následek vyšší výtěžky maltózy než při použití kterýchkoli dříve známých a-l,6-glukosidáz, výtěžky se blíží teoretickému výtěžku na 90 až 96 %.
V případě, že se užívá známého enzymu, jako pullulanázy nebo izoamylázy, odštěpuje tento enzym z amylopektinu různé části tak, že vzniká škrob a pak amylóze podobná látka s přímým řetězcem a pak teprve dochází působením β-amylázy к tvorbě maltózy. Jde tedy o dvoustupňový proces, kterým je možno získat maltózu s dosti dobrými výsledky. V případě, že se užívají enzymy podle vynálezu, dochází ke střídavé reakci enzymatické směsi, takže je možno získat maltózu v podstatě vyšším výtěžku.
Na rozdíl od izoamyláz, které mají svůj původ v kvasnicích a mikroorganismech rodu Pseudomonas, hydrolyzují enzymy podle vynálezu a-l,6-glukosidickou vazbu pullulanu a popřípadě hydrolyzují pullulan úplně na maltotriézu. Lze jich tedy také užít к výrobě maltotriózy z pullulanu. V tomoto případě nejsou výslednými produkty glukóza, maltóza nebo oligosacharidy. Způsob hydrolýzy v tomto případě je pravděpodobně jiný, a to z toho důvodu, že к tvorbě maltotriózy pochází již v počátečním stupni reakce. Reakce způsobované enzymy podle vynálezu není reverzibilní.
Při hydrolýze pullulanu pullulanázou z mikroorganismů rodů Aerobacter a Streptococus dochází současně ke tvorbě glukózy, maltózy, maltotetraózy a oligosacharidů, současně však dochází к tvorbě maltotriázy.
[Biochemische Zeitschrift, sv. 334, str. 79 — — 95 (1961)]. Byly pozorovány i další reakce, jejichž výsledkem byly štěpné produkty různého typu [Nátuře, sv. 210, str. 200 (1966), Archives of Biochemistry and Biophysics, sv. 137, str. 483 — 493 (1970), Biochemical J., sv. 108, str. 33 — 40 (1968J], což znamená, že nedochází k úplné hydrolýze pullulanu na maltotriózu.
Jak již bylo uvedeno, mají 'i enzymy podle vynálezu vysokou afinitu k hydrolýze krátkého postranního řetězce glukózového zbytku a nejsou schopné hydrolyzovat a-l,6-glukosidickou vazbu isomaltózy, pannózy a isomaltotriózy. Tato' pozorování prokazují, že se enzymy liší od zvířecí oligo-l,6-glukosidázy. [J. Biol. Chem., sv. 215, str. 723—736 (1955)].
a-l,6-Glukosidáza podle vynálezu se význačně Uší od dosud známých isoamyláz a pullulanázy také specifičností substrátu, která je jednou z nejdůležitějších vlastností každého enzymu. Reakce způsobená tímto enzymem také není reverzibilní, což tento enzym dále odlišuje od enzymů známých. Mimoto je tento enzym chráněn proti inaktivaci teplem působením vápenatých iontů, což rovněž není možno pozorovat u pullulanázy nebo isoamylázy. Mimoto však také · různé vlastnosti známých enzymů, které jsou produkovány rody Aerobacter a Streptococcus, není možno pozorovat u enzymů podle vynálezu. Enzym podle vynálezu je tedy řadou svých vlastností od známých enzymů zcela odlišný.
Optimální pH enzymu podle vynálezu je v blízkosti neutrality, jak je zřejmé z obr. 1, a optimální teplota je přibližně 50 °C, jak je zřejmé z obr. 2. Podle chování při různém pH a různé teplotě se enzym podle vynálezu liší od pullulanázy produkované kmenem Aerobacter [optimální pH 5,0, optimální teplota 47,5 °C, Biochemische Zeitscchrift, sv. 334, str. 79 — 95 (1961)] a od pullulanázy produkované rodem Streptococcus [optimální pH 5,4 až 5,8 optimální teplota 30 °C, Bochemical J., sv. 108, str. 33 — 40 (1968)] a liší se také od isoamylázy z kvasnic [optimální pH 6,0 až 6,2, optimální teplota 20 °C, Journal of Agricultural Chemical Society, sv. 23, str. 115 a 120 (1949)] a od isoamylázy produkované rodem Pseudomonas [optimální pH 3 až 4, optimální teplota 52 °C, Biochemica a Biophysica Acta, sv. 212, str. 458 — — 469 (1970)].
Filtrát živného prostředí, koncentrát filtrátu, sraženina získaná působením organického rozpustidla a sraženina získaná síranem amonným obsahují /3-amylázu a a-1,6-glukosidázu a lze jich proto užít jako smíšeného enzymatického přípravku pro výrobu maltózy ze škrobu a dalších výchozích látek.
Z enzymatického preparátu získaného tímto způsobem je možno získat /3amylázu a a-1,6-glukosidázu nezávisle frakcionováním tím způsobem, že se živné prostředí nebo jeho filtrát nasytí na 30 až 50 % síranem amonným k vysrážení β-amylázy, pak se prostředí nasytí do 60 až 70 % toutéž látkou, čímž se vysráží druhý enzym. Oba enzymy je pak možno dále čistit sloupcovou chromatografií.
Způsob výroby maltózy ze škrobu použitím , enzymatického komplexu podle vynálezu je tedy možno shrnout následujícím způsobem.
Při pěstování svrchu uvedených bal^^t-ei^iálních kmenů se ' hromadí v živném prostředí (Samyláza a a-l,6-glukosidáza. Živné prostředí se zfiltruje nebo odstředí k odstranění buněk mikroorganismu, načež se přidá k roztoku škrobu. Pro vysoké výtěžky maltózy je žádoucí užít škrob nebo rozpustný škrob s nízkým dextrózovým ekvivalentem' (D. E.) redukující cukry, vyjádřené __jako glukóza_________ χ 1QQ , sušina
V případě, že .má být hydrolyzován vysoce koncentrovaný škrob, je výhodné jej nejprve zkapalnit působením α-amylázy a takto zkapalněný škrob pak použít. Stejným způsobem lze užít dextrin a podobné látky. Koncentrace -substrátu se má pohybovat v rozmezí 5 až 60 °/o, obvykle 10 až 40 °/o. V případě potřeby se přidají vápenaté ionty. Směs se udržuje na pH 5 až 8, s výhodou 6 až 7 a na teplotě 20 až 60 °C, s výhodou 40 až ‘55 °C, načež se přidá živné prostředí s - obsahem obou enzymů β-amylázy i a-l,6-glukosidázy. Sraženina obsahující oba tyto· enzymy nebo aktivované uhlí s oběma adsorbovanými enzymy je možno přidat k reakční směsi místo živného prostředí. Je také možno oddělit oba enzymy nezávisle ze živného prostředí adsorpcí nebo extrakcí a pak přidat oba tyto enzymy k reakčnímu . roztoku. Potřebné množství β-amylázy je obvykle 200 až 400 jednotek množství a-^-gmkosM^y 1° až 50 jednotek na 1 g sušiny škrobu. Za těchto podmínek . se hydrolyzuje škrob na maltózu ve výtěžku 80 až 90 % po 48 až 72 hodinách. Reakční doba je kratší při větším množství enzymu při nižší koncentraci substrátu.
Je tedy zřejmé, že při -použití obou těchto enzymů, produkovaných tímtéž bakteriálním kmenem, je možno vyrobit přímo maltózu ze škrobu. To znamená, že způsob podle vynálezu není jen jednodušší, avšak přináší také vyšší výtěžky ve srovnání s běžnými postupy nebo s metodou, při níž ' se k substrátu přidávají odděleně dva enzymy, vyprodukované dvěma rozdílnými bakteriálními kmeny.
Množství, v němž je nutno přidat oba enzymy, je možno snadno odhadnout. Tvorbu enzymů v živném prostředí je možno řídit přidáním manganových iontů, je také možno zvýšit účinnost obou enzymů různými způsoby. Mimoto je možno tyto enzymy snadno izolovat a čistit současně nebo odděleně. Způsob podle vynálezu je tedy vhodný pro různé průmyslové použití.
Vynález bude osvětlen následujícími příklady.
Příklad 1
Do Erlenmeyerovy baňky o obsahu 200 ml se vloží 50 ml prostředí s obsahem 1 % peptonu, 0,3 % KžHPO4, 0,1 % MgSOá: 7№O s 1 % maltózy. Prostředí se sterilizuje běžným způsobem (121 °C, 15 minut] a očkuje se Bacillus cereus var. mycoides FERM č. 2391, načež se kultura pěstuje při teplotě 30 °C 2 dny. Po skončeném pěstování se živné prostředí odstředí к odstranění buněčného materiálu a získaný supernatant se analyzuje na množství získaného enzymu. Za uvedenou tfobu bylo získáno 628 jednotek /3-amylázy a 18 jednotek a-l,6-glukosidázy v 1 ml živného prostředí. Živné prostředí se uloží do celofánové trubice a dialyzuje proti destilované vodě к odstranění zbytku cukru.
Část dlalyzovaného enzymu s obsahem 204 jednotek β-amylázy a 3,6 jednotek a-l,6-glukosidázy se uvede v reakci s amylózou z brambor, amylopektinem, bramborovým škrobem, glykogenem a dextrinem. Všechny tyto látky jsou užity v koncentraci 0,4 % při pH 7 a teplotě 40 °C. Celkový reakční objem je 4,3 ml.
V předem určených intervalech se reakční roztok analyzuje a stanoví se redukční cykly způsobem podle Somogyiho a Nelsona. Složení cukrů v reakční směsi se stanoví papírovou chromatografií, při níž se jako soustavy rozpustidel užije směs 4 díly pyridinu, 6 dílů butanolu a 3 díly vody. Bylo zjištěno, že vytvořeným cukrem byla z 90 až 96 % maltóza v případě, že substrátem byla amylóza, amylopektin nebo bramborový škrob, přičemž bylo zjištěno velmi malé množství maltotriózy, přibližně 4 až 8 %. Při zkouškách přístrojem Glukostat bylo zjištěno, že tvorba glukózy byla nižší než 0,1 °/o. Získané výsledky jsou uvedeny na obr. 5. Z obr. 5 je zřejmé, že došlo к úplné hydrolýze amylózy z brambor, amylopektinu, dextrinu a bramborového škrobu na maltózu po 8 hodinách reakce. Glykogen byl rovněž hydrolyzován alespoň na 90 % na maltózu po 23 hodinách reakce.
Příklad 2
Prostředí stejného složení jako v příkladu 1 bylo očkováno Bacillus sp. YT Č. 1002 (FERM č. 2837). Třepací kultura byla pěstována při 30 °C. Po 48 hodinách bylo živné prostředí analyzováno na množství enzymů. Bylo zjištěno 121 jednotek Д-amylázy a 10,5 jednotek a-l,6-glukosidázy v 1 ml živného prostředí.
Příklad 3
Prostředí stejného složení jako v příkladu 1 se očkuje Bacillus sp. YT č. 1003 (FERM č. 2838). Třepací kultura se pěstuje při teplotě 30 °C. Po 48 hodinách pěstování se živné prostředí analyzuje na množství vytvořených enzymů. Tímto způsobem se získá 152 jednotek β-amylázy a 5,3 jednotek «-1,6-glukosidázy v 1 ml živného prostředí.
Příklad 4
Do baňky s obsahem 1 litr se vloží 250 ml živného prostředí s obsahem 1 '% polypeptonu, 0,3 % K2HPO4, 0,1 % MgSO4.7H2O a 1 % dextrinu a obsah baňky se sterilizuje běžným způsobem. Pak se obsah očkuje Baclllus cereus var. mycoides a třepací kultura se pěstuje při 30 aC. Po 48 hodinách pěstování se kultura odstředí к odstranění buněk a získaný supernatant se analyzuje na enzymatickou účinnost.
Tímto způsobem bylo získáno 420 jednotek /З-amylázy a 7,8 jednotek a-l,6-glukosidázy v 1 ml živného prostředí. 200 ml tohoto prostředí se pak sytí na 75 °/o síranem amonným, sraženina se oddělí odstředěním a rozpustí v malém množství vody a roztok se analyzuje na enzymatickou účinnost. Bylo zjištěno, 83 000 jednotek /3-amylázy a 952 jednotek a-l,6-glukosidázy.
Příklad 5
Část roztoku z příkladu 1 s obsahem 10 000 jednotek /З-amylázy a 275 jednotek a-1,6-glukosidázy se uvede v reakci s 1 g amylopektinu o koncentraci 1 % za přítomnosti 5 X 10~5 M chloridu vápenatého. Reakce probíhá při teplotě 40 °C a při pH 7. Redukční cukr v reakční směsí se stanoví svrchu uvedeným způsobem. Vytvoří se 972 mg maltózy. Současně se vytvoří 3,7 mg glukózy. Papírovou chromatografií se zjistí skvrna pro maltózu a skvrna pro velmi malé množství maltotriózy.
Příklad 6
Způsob výroby maltózy byl prováděn při použití vysoce koncentrovaného substrátu, ve snaze zjistit optimální teplotu a optimální pH za těchto podmínek.
Reakční roztok obsahoval různé složky, jejíchž množství je uvedeno v tabulce 3.
Tabulka 3
Rozpustný škrob (D. E. 1,5) 1 g fosforečnanový pufr o pH 6,5 až 7 nebo acetátový pufr o pH 5 až 6
CaCl? /3-amyláza a-l,6-glukosidáza celkový objem
0,05 M
0,01 M
1016 jednotek
13,1 jednotky ml
Ke stanovení vlivu pH byla reakce prováděna při 50 °C při pH 5,0, 5,5, 6,Q, 6,5 a 7,0. Výsledky jsou, uvedeny v tabulce 4.
Tabulka 4 redukující cukry (jako maltóza) sušina
Maltózový ekvivalent =
X 100
| Reakční doba (hod) | 2 | 8 | 24 | 36 | 48 | 72 |
| pH 5,0 + 0,1 | 49 | 70 | 73 | 74 | 77 | 76 |
| 5,5 + 0,1 | 55 | 77 | 82 | 82 | 83 | 84 |
| 6,0 + 0,1 | 63 | 83 | 92 | 94 | 97 | 100 |
| 6,5 + 0,1 | 63 | 79 | 91 | 94 | 96 | 100 |
| 7,0 + 0,1 | 59 | 78 | 89 | 91 | 92 | 96 |
Ke zjištění vlivu teploty byla reakce prováděna při pH 6 až 6,5, teplota byla měněna na hodnoty 40, 50, 55 a 60 °C. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 5.
Tabulka 5
| Reakční doba (hod) | 2 | 8 | Maltózový ekvivalent 20 30 | 48 | 68 | |
| teplota (°C) | ||||||
| 40 | 64 | 79 | 82 | 87 | 94 | 100 |
| 50 | 66 | 78 | 85 | 92 | 97 | 100 |
| 55 | 70 | 78 | 82 | 83 | .87 | 89 |
| 60 | 68 | 70 | 71 | 72 | 73 | 74 |
Příklad?
Bylo připraveno živné prostředí s obsahem 1 °/o polypeptonu, 1 % dextrinu, 0,3 °/o K2HPO4 a 0,1 % MgSO4. 7НгО a toto prostředí bylo měněno přidáváním různých množství (1 X 10-7 až 1 X 10-3 molu) síranu manga natého jak je zřejmé z tabulky 6. Získaná prostředí byla uložena do Erlenmeyerových baněk o obsahu 200 ml a byla sterilizována běžným způsobem. Pak bylo živné prostředí očkováno gaeijlug pigfpug yar, myp$4§§ Д kultivace byla prováděna při 30 °C 42 hodip.
|Po sjčowento PňgtPvÁní bylo Živné prostředí odstředěno a supernatant byl analyzován na redukci /ϊ-amylázy a a-l,6-glukosidázy. Získané výsledky jsou uvedeny v tabulce 6.
)ak je z tabulky zřejmé, přidání síranu manganatého zvýší množství produkované a-1,6-^glnkpsidázy až třikrát.
Tabulka 6
Množství přidaného Optická hustota síranu manganatého mycelia (660 nm) (moly)
Účinnost a-l,6-glukosidázy (jednotky/ml)
Účinnost /?-amylázy (jednotky/ml)
| O (bez přídavku) 1 x 10-7 | 0,7 6,5 | 11,3 14,2 | 699 678 |
| 1 X 10-6 | 5,8 | 18,2 | 155 |
| 5 X 10-6 | 5,6 | 284 | 155 |
| 1 x 10-5 | 5,0 | 25,0 | 132 |
| 1 X 10-4 | 5,9 | 28,3 | 152 |
| 1 X 10-3 | 5,8 | 25,2 | 153 |
Příklad 8
Do Erlenmeyerových baněk s obsahem 200 mililitrů bylo vloženo vždy 50 ml prostředí s obsahem 1 % polypeptonu, 1 % dextrinu, 0,3 % K2HPO4 a 0,1 % MgSO4.7HžO a prostředí bylo sterilizováno běžným způsobem, napřed bylo očkováno Bacillus cereus var. mycoides a třepací kultura byla pěstována při 30 °C 24 hodin, za tuto dobu bylo množství /?-amylážy 237 jednotek v ml prostředí, pak byl přidán síran manganatý sterilním způsobem tak, aby živné prostředí obsahovalo 1 X 104 molu této sloučeniny.
Pak byla kultura pěstována ještě 42 hodin, napřed bylo živné prostředí odstředěno к odstranění buněk a supernatant byl analyzován na účinnost /J-amylázy a a-l,6-glukosidázy. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 7.
Jak je z tabulky zřejmé, přídavek manganaté soli v polovině doby pěstování zvýší množství «-1,6-glukosidázy 1,7 X a současně umožňují i tvorbu /í-amylázy.
Tabulka 7
| MnS04 | Doba pěstování | Optická hustota Účinnost | Účinnost |
| (hod) | mycelia (600 nm) β-amylázy | a-l,6-glukosidázy | |
| (jednotky/ml) | (jednotky/ml) |
| 0 | 42 | 6,7 | 377,6 | 13,0 |
| 1 x 10-4 M | 24 | 6,5 | 236,8 | 12,5 |
| MnS04 přidáno | ||||
| po 24 hod. | 42 | 6,6 | 244,5 | 22,2 |
| 1 Χ 10-4 M | 42 | 5,9 | 28,8 | 25,0 |
MnSO4 přidáno od začátku
V případě, že se živné prostředí od začátku doplní manganatou solí, zvýší se sice také množství a-l,6-glukosldázy 2X, množství /J-amylázy je však sníženo až 28,8 jednotek/ /ml.
Příklad 9
Bylo připraveno živné prostředí s obsahem 2 % polypeptonu, 0,3 % K2HPO4, 0,1 % MgSO4.7HžO a 5 X 10-4 molu CaCh a další prostředí, s různým množstvím citrónanu sodného, v koncentracích 0,5 % a 1 %, a prostředí s obsahem vínanu sodného v koncentraci 0,25 % a 0,5 %. Tato prostředí byla uložena do Erlenmeyerových baněk s obsahem 200 ml po podílech o velikosti 50 ml, načež byly baňky sterilizovány běžným způsobem a živné prostředí pak bylo očkováno Bacillus cereus var. mycoides a třepací kultura byla pěstována při teplotě 30 °C 42 hodin.
Po skončeném pěstování bylo živné prostředí odstředěno a supernatant byl analyzován na účinnost /З-amylázy a a-l,6-glukosidázy. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 8.
Z tabulky je zřejmé, že přídavek organické kyseliny zřetelně zvyšuje množství β-amylázy i a-l,6-glukosidázy.
Tabulka 8
| Přidaná organická kyselina | Množství kyseliny v % prostředí | Optická hustota mycelia (660 nm) | Účinnost jí-amylázy (jednotky/ /ml) | Účinnost a-l,6-glukosidázy (jednotky/ /ml) , |
| Citrónón sodný | 0,5 | 4,9 | 1035,0 | 20,7 |
| citrónón sodný | 1,0 | 4,8 | 1080,0 | 17,1 |
| vínan sodný | 0,25 | 4,7 | 1119,0 | 18,4 |
| vínan sodný | 0,5 | 4,9 | 1063,0 | 16,2 |
| kontrola (bez přídavku) | 4,9 | 588,0 | 13,0 |
Příklad 10
Do dvou fermentorů o obsahu 10 litrů bylo uloženo prostředí s obsahem 4 % mléčného kaseinu, 0,3 % K2HPO4, 0,1% MgSO4. .7НгО, 5X10-4 M СаС1з a 0,5% rozpustného škrobu, každé z těchto prostředí mělo objem 5 litrů. Do jednoho z obou fermentorů byla přidána 4 % pokrutin z řepkového semene, pak byla obě prostředí sterilizována minut při teplotě 121 °C. Pak byla obě prostředí očkována 100 ml Bacillus cereus var. mycoides a kultura byla za stálého provzdušňování pěstována při teplotě 30 °C, přičemž vzduch byl dodáván rychlostí 5 1/min a prostředí bylo stále mícháno při 250 otáčkách za minutu. Po 24 hodinách pěstování bylo živné prostředí odstředěno a supernatant byl analyzován na enzymatickou účinnost. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 9.
Účinnost β-amylázy (jednotky/ml)
2470,0
2600,0
Účinnost a-l,6-glukosidázy (jednotky/ml)
106,0
44,4
Tabulka 9
Pokrutlny z řepkového semene (% prostředí) _________ kontrola (bez přídavku)
Jak je z tabulky zřejmé, bylo množství a-1,6-glukosidázy, vyrobené z prostředí s obsahem pokrutin z řepkového semene 2,4 X vyšší než množství v živném prostředí, к němuž pokrutiny přidány nebyly.
Živné prostředí bylo odstředěno к odstranění buněk, 2 litry supernatantu byly smíšeny se 4 litry chladného ethanolu к vysrážení enzymu a vzniklá sraženina byla oddělena filtrací a usušena. Tímto způsobem byl získán práškovitý enzymatický přípravek, který obsahoval 115 800 jednotek /З-amylázy v 1 g, to znamená, že /?-amyláza byla izolována ze 75 % a a-l,6-glukosidáza ze 70 °/o.
Příklad 11 % kukuřičný výluh s obsahem 4 % suši ny byl upraven uhličitanem sodným na pH
7,5. Výsledná směs byla odstředěna к odstranění sraženiny, která obsahuje látku inhibující produkci /J-amylázy a kterou je možno vysrážet úpravou pH. Do Erlenmeyerových baněk o obsahu 200 ml bylo uloženo vždy 50 ml supernatantu s přídavkem 0,5 % škrobu a baňky byly sterilizovány běžným způsobem. Pak byl obsah baněk očkován Bacillus cereus var. mycoides a kultury byly pěstovány za aerobních podmínek při teplotě 30 °C 42 hodin. Po skončeném pěstování bylo živné prostředí odstředěno к odstranění buněčného materiálu a supernatant byl analyzován na β-amylázu a a-l,6-glukosidázu. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 10.
Tabulka 10
Účinnost (J-amylázy Účinnost a-l,6-glukosidázy (jednotky/ml) (jednotky/ml) kontrola 52,1 35,3 po odstranění látky, inhibující produkci /3-amylázy 592,7 41,1
Jak je z tabulky zřejmé, je možno zvýšit množství /З-amylázy podstatným způsobem úpravou pH kukuřičného výluhu, spojenou s odstraněním inhibičního faktoru.
Příklad 12
Směs 10 g rozpustného škrobu s 1 litrem enzymatického roztoku, který byl získán kultivací Bacillus cereus var. mycoides a obsahoval 572 jednotek /ϊ-amylázy a 43,5 jednotek a-l,6-glukosidázy, byla smísena se 40 g aktivovaného uhlí s názvem Nořit, směs byTabulka 11 β-amyláza (jednotky) la míchána к dosažení adsorpce enzymů na aktivované uhlí. Enzymy pak byly izolovány filtrací.
Byla enalyzována enzymatická účinnost filtrátu a aktivovaného uhlí s adsorbovanými enzymy. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 11.
Z tabulky je zřejmé, že β-amyláza byla izolována ve výtěžku 90,1 % a a-l,6-glukosidáza ve výtěžku téměř 100 %, oba enzymy v imobilizované formě. V případě, že nebyl přidán škrob byl výtěžek jS-amylázy v imobilizované formě pouze 12,4 %.
a-l,6-glukosidáza (jednotky)
| A) přidané množství | 572 000 | 43 500 |
| В) neadsorbované množství | 197 000 | 9 700 |
| C) účinnost imobilizovaného | ||
| enzymu | 338 000 | 33 800 |
Výtěžek imobilizovaného enzymu (C/A-BX100) 90,1%
100 %
293974
Část imobilizovaného enzymu, a to 3000 jednotek ^-amylázy a 310 a-l,6-glukosidázy, byla přidána к 10 g rozpustného škrobu a směs byla doplněna vodou na 100 ml. Roztok byl pak udržován na 55 °C při pH 6 až
6,5. Po skončení reakce byl roztok analyzován na obsah cukru, bylo zjištěno 90,5 °/o maltózy, 7,5 % maltotriózy a 2,0 % oligosacharidu.
P г í к 1 a d 1 3
Do 100 ml vody bylo přidáno 50 g kuku řičného škrobu a 10 g přípravku Celit, roztok byl promíchán a pak byl zahřát na 60 °C wa 30 minut. К výslednému roztoku bylo přidán© 30Θ ml filtrátu kultury Bacillus oereus var. mycoides (pH 7,1, 403 jednotek β-amylázy/ml a 28,0 jednotek a-l,6-glukosidázy/ml) -a směs byla míchána к zajištění adsorpce obou enzymů.
Pak byla celá směs zfiltrována к oddělení enzymu, jehož účinnost byla stanovena. Získané výsledky jsou uvedeny v tabulce 12.
Tabulka 12
| jS-amyláza (jednotky) | a-l ,6-ghřkosidáza (Jednotky) |
| A ] původní účinnost 121 000 B) zbýva jící účinnost 111ΟΘ0 C) účinnost fixovaného enzymu 95 300 Výitěžek fixovaného enzymu (C/A-BX100) 86,7 % | 9400 1860 6220 95,1% |
Směs škrobu a přípravku Celíte s adsorbovanými enzymy pak byla přidána к 10% vodnému roztoku dextrinu s obsahem 10 % chloridu sodného za účelem vymytí enzymu z adsorpčního činidla. β-Amyláza byla vymyta na 100 %, a-l,6-glukosidáza na 85 %.
Příklad 14
Vždy 100 ml filtrátu s obsahem živného prostředí po odstranění Bacillus cereus var. mycoides o koncentraci 758 jednotek /3-amy lázy a 37,1 jednotek a-l,6-glukosidázy v 1 ml bylo smíseno s 5 g kyselého jílu, bentonitu, mastku nebo přípravku Celíte a Perlíte к adsorpci a-l,6-glukosidáz.
Adsorbovaný enzym byl oddělen filtrací nebo 'Odstředěním, byl důkladně promyt vodou a byla stanovena jeho účinnost. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 13, z níž je zřejmé, že a-l,6-glukosidáza se dobře adsorbuje na všechna užitá činidla v množství 400 až 700 jednotek na 1 g.
Tabulka 1'3
Účinnost adsorbované α-1,6-gluk'OSidázy (jednotky/g)
Účinnost adsorbované
0-amylázy (jednotky/g)
| kyselý jíl | 612 |
| bantonii | 648 |
| mastek | 416 |
| .Celíte | 492 |
| •Perlíte | 532 |
Příklad 15
Ke 100 g sušiny zkapalněného škrobu s
D. E. 1,5 % se přidá 30 000 jednotek β-amylázy, 3 000 jednotek α-Ι,Ό-glukosidázy a 0,73 procent chloridu vápenatého s 2 molekulami krystalické vody. Směs se zředí na celkový objem 500 ml, zahřeje se na teplotu 50 °C a
790
694
200 .0 .0 na této teplotě se udržuje při pH 6 až 6,5, čímž dojde к průběhu enzymatické reakce. Po 100 hodinách této reakce se stanoví složení cukrů v reakční směsi papírovou chro. matografií. Podle tohoto stanovení obsahuje výsledná směs 90,6 % maltózy, 7,1 % maltotričzy, 0,0 % glukózy a .2,3 % jiných sacharidů.
2S
Claims (2)
1. Způsob současné výroby /J-amylázy a a-l,6-glukosidázy z mikroorganismů, vyznačující se tím, že se pěstuje při teplotě 20 až 40 °C a při hodnotě pH 5 až 10 mikroorganismus rodu Bacillus se schopností produkovat β-amylázu a 1,6-glukosidázu současně v živném prostředí s obsahem zdroje uhlíku, například maltózy, glukózy, škrobu nebo dextrinu, zdroje dusíku, například peptonu, kaseinu, extraktu z masa, extraktu z kvasnic,
VYNÁLEZU kuřičného výluhu, sójové mouky nebo sójových pokrutin, a anorganických solí, například fosfátů, hořečnatých solí, barnatých nebo vápenatých solí nebo solí manganu.
2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že mikroorganismem je Bacillus cereus var. mycoidex — FERM č. 2391, Bacillus sp. YT 1002 — FERM č. 2837 nebo Bacillus sp. YT 1003 — FERM č. 2838.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP646574A JPS536232B2 (cs) | 1974-01-11 | 1974-01-11 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS203974B2 true CS203974B2 (en) | 1981-03-31 |
Family
ID=11639184
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS75225A CS203974B2 (en) | 1974-01-11 | 1975-01-13 | Method for the contemporary production of beta-amylase and alpha-glucosidase at micro-organisms |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US3992261A (cs) |
| JP (1) | JPS536232B2 (cs) |
| BE (1) | BE828972A (cs) |
| BR (1) | BR7500131A (cs) |
| CS (1) | CS203974B2 (cs) |
| DD (2) | DD116853A5 (cs) |
| DE (1) | DE2500597C2 (cs) |
| FR (1) | FR2257683B1 (cs) |
| GB (1) | GB1466009A (cs) |
| HU (1) | HU173275B (cs) |
| IT (1) | IT1026306B (cs) |
| NL (1) | NL180021C (cs) |
| PL (1) | PL96758B1 (cs) |
| SE (1) | SE7500274L (cs) |
| SU (1) | SU611596A3 (cs) |
| YU (1) | YU323780A (cs) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU520395B2 (en) * | 1978-01-12 | 1982-01-28 | Cpc International Inc. | Obtaining crystals of maltose froma starch hydrolyzate |
| JPS57174089A (en) * | 1981-04-20 | 1982-10-26 | Novo Industri As | Chain dividing enzyme product |
| US4734364A (en) * | 1983-05-20 | 1988-03-29 | Miller Brewing Company | Production of dextrose and maltose syrups using an enzyme derived from rice |
| JPS60186283A (ja) * | 1984-03-07 | 1985-09-21 | Agency Of Ind Science & Technol | 微生物による新規な耐熱性プルラナ−ゼａの製造法 |
| US4814267A (en) * | 1984-09-18 | 1989-03-21 | Michigan Biotechnology Institute | Method for preparing high conversion syrups and other sweeteners |
| US4628028A (en) * | 1985-05-23 | 1986-12-09 | Cpc International Inc. | Novel thermostable pullulanase enzyme and method for its production |
| KR0135075B1 (ko) * | 1988-10-07 | 1998-04-20 | 마쓰따니 히데지로 | 식이섬유를 함유한 덱스트린의 제조방법 |
| JP3173849B2 (ja) * | 1992-02-26 | 2001-06-04 | 天野エンザイム株式会社 | 新規な枝切り酵素及びその製造法 |
| JP7001053B2 (ja) * | 2016-06-17 | 2022-01-19 | 日産化学株式会社 | 糖化反応液、糖化酵素組成物、糖の製造方法及びエタノールの製造方法 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US2494514A (en) * | 1946-05-10 | 1950-01-10 | Staley Mfg Co A E | Production of the amylase of bacillus macerans |
| US3827940A (en) * | 1968-04-01 | 1974-08-06 | Hayashibara Co | Preparation of alpha-1,6-glucosidase |
| JPS543937B1 (cs) * | 1968-11-18 | 1979-02-28 | ||
| JPS505271B1 (cs) * | 1970-04-24 | 1975-03-01 | ||
| US3804718A (en) * | 1971-04-01 | 1974-04-16 | Hayashibara Co | Method of producing beta-amylase by bacterial fermentation |
| US3769168A (en) * | 1971-06-11 | 1973-10-30 | Hayashibara Co | Process for the purification of amylases |
-
1974
- 1974-01-11 JP JP646574A patent/JPS536232B2/ja not_active Expired
-
1975
- 1975-01-03 GB GB31675A patent/GB1466009A/en not_active Expired
- 1975-01-06 US US05/538,918 patent/US3992261A/en not_active Expired - Lifetime
- 1975-01-09 DE DE2500597A patent/DE2500597C2/de not_active Expired
- 1975-01-09 BR BR131/75A patent/BR7500131A/pt unknown
- 1975-01-10 SU SU752101415A patent/SU611596A3/ru active
- 1975-01-10 DD DD183592A patent/DD116853A5/xx unknown
- 1975-01-10 DD DD188481A patent/DD120468A5/xx unknown
- 1975-01-10 SE SE7500274A patent/SE7500274L/xx unknown
- 1975-01-10 FR FR7500753A patent/FR2257683B1/fr not_active Expired
- 1975-01-10 NL NLAANVRAGE7500283,A patent/NL180021C/xx not_active IP Right Cessation
- 1975-01-10 HU HU75SI1447A patent/HU173275B/hu unknown
- 1975-01-10 IT IT47625/75A patent/IT1026306B/it active
- 1975-01-10 PL PL1975177264A patent/PL96758B1/pl unknown
- 1975-01-13 CS CS75225A patent/CS203974B2/cs unknown
- 1975-05-12 BE BE156269A patent/BE828972A/xx not_active IP Right Cessation
-
1980
- 1980-12-22 YU YU03237/80A patent/YU323780A/xx unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS50100287A (cs) | 1975-08-08 |
| PL96758B1 (pl) | 1978-01-31 |
| NL180021B (nl) | 1986-07-16 |
| JPS536232B2 (cs) | 1978-03-06 |
| BE828972A (fr) | 1975-09-01 |
| IT1026306B (it) | 1978-09-20 |
| NL180021C (nl) | 1986-12-16 |
| BR7500131A (pt) | 1975-11-04 |
| GB1466009A (en) | 1977-03-02 |
| NL7500283A (nl) | 1975-07-15 |
| FR2257683B1 (cs) | 1978-04-21 |
| YU323780A (en) | 1983-12-31 |
| DE2500597C2 (de) | 1984-07-12 |
| DD120468A5 (cs) | 1976-06-12 |
| SE7500274L (cs) | 1975-07-14 |
| DD116853A5 (cs) | 1975-12-12 |
| FR2257683A1 (cs) | 1975-08-08 |
| SU611596A3 (ru) | 1978-06-15 |
| US3992261A (en) | 1976-11-16 |
| DE2500597A1 (de) | 1975-07-17 |
| HU173275B (hu) | 1979-03-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Harada et al. | Formation of isoamylase by Pseudomonas | |
| US4317881A (en) | Process for producing cyclodextrins | |
| US4628028A (en) | Novel thermostable pullulanase enzyme and method for its production | |
| CS203974B2 (en) | Method for the contemporary production of beta-amylase and alpha-glucosidase at micro-organisms | |
| EP0184019B1 (en) | Thermostable alpha-amylase-producing, thermophilic anaerobic bacteria, thermostable alpha-amylase and process for producing the same | |
| US5147796A (en) | Alkaline pullulanase Y having α-amylase activity | |
| US4657865A (en) | Pullulanase-like enzyme, method for preparation thereof, and method for saccharification of starch therewith | |
| US5147795A (en) | Alkaline pullulanase from bacillus sp. ferm p-10887 | |
| CA1081633A (en) | Heat and acid-stable alpha-amylase enzymes and processes for producing the same | |
| US5316924A (en) | Pullulanase, methods of producing pullulanase and methods of saccharification of starch using pullulanase | |
| KR100261359B1 (ko) | 절지효소 및 이의 제조방법 | |
| RU2244742C2 (ru) | Способ выделения и селекции бактерий-продуцентов циклодекстринглюканотрансферазы, штамм бактерий bacillus circulans b-65 ncaim (p) 001277 (b-65) - продуцент внеклеточной циклодекстринтрансферазы, циклодекстринглюканотрансфераза, полученная из него, и его применение для получения циклодекстрина | |
| JP2987685B2 (ja) | 新規なグルコシル（α１→６）分岐水解酵素、該酵素の製造方法および利用方法 | |
| US5110734A (en) | Purified cyclodextrinase | |
| US5238825A (en) | Preparation and use of a cyclodextrinase for preparing maltooligosaccharides | |
| DK164600B (da) | Termostabil pullulanase og fremgangsmaade til fremstilling deraf samt anvendelse deraf i en fremgangsmaade til forsukring af stivelse eller i en fremgangsmaade til fremstilling af maltose med hoej renhed | |
| JP2866460B2 (ja) | 多糖類の糖化方法 | |
| JPH0378990B2 (cs) | ||
| Abdel‐Aziz | Production and some properties of two chitosanases from Bacillus alvei | |
| RU2213773C2 (ru) | Продуцент комплекса хитинолитических ферментов и ламинариназы | |
| KR0129471B1 (ko) | 말토테트라오즈 생산 아밀라제의 제조방법 | |
| JPH0134037B2 (cs) | ||
| JPH0351398B2 (cs) | ||
| JPH0662882A (ja) | 澱粉の糖化によるグルコースの製造方法 | |
| JPS5844356B2 (ja) | バシルス属アミラ−ゼｇ６の製造法 |