CS203974B2 - Method for the contemporary production of beta-amylase and alpha-glucosidase at micro-organisms

Info

Description

Claims

CS203974B2

Publication number: CS203974B2
Application number: CS75225A
Authority: CS
Inventors: Yoshiyuki Takasaki; Yoshimasa Takahara
Original assignee: Agency Ind Science Techn
Priority date: 1974-01-11
Filing date: 1975-01-13
Publication date: 1981-03-31
Also published as: JPS536232B2; SU611596A3; FR2257683B1; IT1026306B; BE828972A; BR7500131A; NL180021B; DD120468A5; SE7500274L; DD116853A5; HU173275B; US3992261A; JPS50100287A; YU323780A; GB1466009A; FR2257683A1; NL180021C; NL7500283A; PL96758B1; DE2500597C2

Vynález se týká způsobu současné výroby /3-amylázy a a-l,6-gluko-sidázy z mikroorganismů.

Až dosud .byla /--amyláza (a-l,4-glukanmaltohydroláza) zjišťována převážně v sójových bobech a ve sladu. Tyto dvě suroviny jsou dnes zdroji pro průmyslovou výrobu tohoto enzymu. Mimoto bylo známo, že mikroorganismy rodu Bacillus jsou schopny produkovat podobný enzym. Například Kneen a další zjistili, že Bacillus polymyxa produkuje β-amylázu. [Archives of Biochemistry, sv. 10, str. 41 (1946).] V roce 1948 byla podána podrobnější zpráva o enzymatických vlastnostech /J-amylázy produkovaných kmenem mikroorganismu Rose [Archives of Biochemistry, sv. 16, str. 349 (1948).]

Později bylo uvedeno, že i Bacilus megaterium produkuje ^-amylázu [ (Higaschihara a další, Japan Agricultural Chemical Society, Abstracts of Lectures at the 1971 Annual Meeting, str. 212 a Amylase Symposium, sv. 6, str. 39 (1971).] Bylo uvedeno, že tento enzym je totožný s /S-amylázou produkovanou Bacillus polymyxa (Japan Agricultural Chemical Society, Abstracts of Lectures at the 1972 Annual Meeting, str. 86.)

Co se týká a-l,6-glukosidázy škrobu, byla zařazována dosti často· jako izoamyiáza nebo pullulanáza. Izoamyláza byla poprvé objeve2 na v kvasnicích [ (Maruo, Kobayashi a další Bunji Maruo and Tsuneo Kobayashi, Journal of Japan Agricultural Chemical Society, sv. 23, str. 115 a 120 (1949)).]

Od té doby bylo zjištěno, že se tento enzym vyskytuje ve vyšších roslinách, a v tomto' ' případě se uvádí jako R-enzym a také ' v mikroorganismech rodu Pseudomonas . [ (Japanese Patent Publication č. 16788/1970).] V - poslední době byla podána zpráva o· tom, že termofilní Bacillus stearothermophilas produkuje termofilní izomylázu, jejíž optimální pracovní teplota je 65 až 67,5 °C [Japan Agricultural Chemical Society, Abstracts of Lectures at the 1972 Annual Meeting, str. 88 and Japanese Patent Dlsclosure č. 91272'/ /19713).]

Pullulanáza byla zjištěna Benderem v roce 1959 v Aerobacter aerogenes jako enzym schopný hydrolyzovat polysacharid pullulan, produkovaný Pullularia pullulan. Hydrolyzuje -a-l,6-glukosidickou vazbu pullulanu za vzniku maltotriózy [Biochem. Biophys. Acta, sv. 36, str. 309 (1959) a Japanese Patent Publication č. 7559/1971], Enzym také hydrolyzuje a-l,6-glykosidickou vazbu, například v amylopektinu a glykogenu. Bylo také uváděno, že enzymy tohoto typu jsou produkovány mikroorganismy, například Escherichia intermedia [Ueda a další, Applied Microbio203974 logy, sv. 15, str. 492 (1967)] a Streptomyces mites [Ueda a další, Journal of Fermentation Technology, sv. 49, str. 552 (1971)].

Jak již bylo uvedeno, byla potvrzena nezávislá produkce α-amylázy a a-l,6-glykosidázy pro řadu mikroorganismů a rostlin. Dosud však nebyl popsán mikroorganismus, který by současně produkoval oba tyto enzymy.

Při výrobě těchto dvou enzymů bylo tedy až dosud nutno odděleně pěstovat dva různé mikroorganismy. Nehledě к rozdílům v reakci pH a teploty na oba enzymy, bylo velmi obtížné uvést oba tyto enzymy ve styk se škrobem současně. Z tohoto důvodu byla výroba maltózy až dosud prováděna ve dvou stupních, přičemž v prvním stupni se uváděl škrob ve styk s a-l,6-glukosidázou za vzniku sloučeniny s přímým řetězcem, podobné amylóze, ve druhém stupni se tato látka uváděla ve styk s β-amylázou za vzniku maltózy.

Předmětem vynálezu je způsob výroby β-amylázy a a-l,6-glukosidázy z mikroorganismů, vyznačující se tím, že se pěstuje při teplotě 20 až 40 ^aC a při hodnotě pH 5 až 10 mikroorganismus rodu Bacillus se schopností produkovat β-amylázu a 1,6-glukosidázu současně v živném prostředí s obsahem zdroje uhlíku, například maltózy, glukózy, škrobu nebo dextrinu, zdroje dusíku, například peptonu, kaseinu, extraktu z masa, extraktu z kvasnic, kukuřičného výluhu, sójové mouky nebo sójových pokrutin, a anorganických solí, například fosfátů, hořečnatých solí, barnatých nebo vápenatých solí nebo solí manganu.

V případě, že se škrob nebo derivát škrobu smísí současně s oběma uvedenými enzymy, působí β-amyláza štěpení maltózových jednotek z amylopektinu, který je přítomen ve škrobu, a to v neredukujících koncových skupinách řetězce, tím dochází ke zpřístupnění dalších rozvětvených vazeb a «-1,6-glukosldáza může štěpit «-1,6-glukosldázové vazby postranních řetězců, čímž se opět umožní funkce /?-amylázy. To znamená, že oba tyto enzymy střídavě hydrolyzují maltózovou jednotku amylopektinu z neredukujících zakončení řetězce, takže je přímo produkována maltóza ze škrobu jednostupňovým postupem ve vyšších výtěžcích, než jakých je možno dosáhnout známými způsoby.

Účinek obou těchto enzymů na škrob je znázorněn v přiložených grafech.

Na obr. 1 je znázorněn vztah mezi hodnotou pH a účinností /З-amylázy a a-l,6-glukosidázy, které byly produkovány Bacillus cereus var. mycoides. Na ose pořadnic je znázorněna relativní účinnost v procentech, na ose úseček je znázorněno pH, které se udržuje v rozmezí 4 až 6 acetátovým pufrem a v rozmezí 6 až 10 fosfátovým pufrem. Čára, přerušovaná prázdnými kroužky značí účinnost ι/3-amylázy, křivka přerušovaná plnými kroužky znázorňuje účinnost a-l,6-glykosidázy.

Na obr. 2 je znázorněn vztah mezi teplotou a účinností uvedených dvou enzymů. Na ose úseček je znázorněna teplota ve stupních Celsia, na ose pořadnic je stanovena relativní účinnost v procentech, reakční doba byla 30 minut. Jednotlivé křivky jsou označeny stejně jako na obr. 1.

Na obr. 3 je uveden graf, který znázorňuje stálost obou svrchu uvedených enzymů při různých hodnotách pH. Na ose úseček je uvedeno pH. Na ose pořadnic je znázorněna relativní účinnost v procentech. Pokus byl prováděn při teplotě 30 °C po dobu 3 hodin. Křivky jsou označeny stejně jako na obr. 1.

Na obr. 4 je znázorněna stálost obou enzymů při různých teplotách. Na ose úseček je znázorněna teplota ve stupních Celsia. Na ose pořadnic je znázorněna relativní účinnost v procentech. Pokus trval 10 minut. Křivky jsou označeny stejně jako na obr. 1.

Na obr. 5 je znázorněn vztah mezi reakční dobou a stupněm hydrolýzy, který je uváděn jako množství maltózy. Stanovení bylo prováděno tak, že živné prostředí, v němž byl mikroorganismus pěstován, bylo uvedeno v reakci s amylázou, amylopektinem, bramborovým škrobem, glykogenem a dextrinem. Na ose úseček je znázorněna reakční doba v hodinách, na ose pořadnic je znázorněn stupeň hydrolýzy v procentech. Shora dolů jsou na grafu uvedeny křivky pro amylázu, dextrin, amylopektin, škrob a glykogen.

Protože (S-amyláza a «-1,6-glukosidáza jsou produkovány současně, je možno je také oddělit ve formě složitějšího enzymatického přípravku, který je pak možno velmi výhodně užít pro výrobu maltózy. Bylo proto vyzkoušeno velké množství mikroorganismů, aby bylo možno zjistit druh, který je nejschopnější produkovat oba uvedené enzymy současně. Byly objeveny tři kmeny, které tuto schopnost mají.

Všechny tři zjištěné kmeny jsou bakterie náležející do rodu Bacillus. Tyto mikroorganismy byly pojmenovány Bacillus cereus var. mycoides, Bacillus sp. YT 1002 a Bacillus sp. YT 1003.

Na základě tohoto zjištění bylo možno navrhnout způsob výroby maltózy přímo ze škrobu a jeho derivátů tak, že se pěstují bakterie rodu Bacillus schopné produkovat současně uvedené enzymy, živné prostředí se pak uvádí po izolaci nebo bez izolace enzymů ve styk se škrobem a jeho deriváty. Až dosud nebyl popsán žádný jiný mikroorganismus, který by byl schopen současné produkce 0-amyIázy a a-l,6-glukosidázy.

Bacyllus cereus var. mycoides byl uložen v Fermentation Research Institute of Chiba-shi, Japonsko, pod FERM č. 2391 20. prosince 1973 a Bacillus sp. YT 1002 a Bacillus sp. YT 1003 byly uloženy ve stejném ústavě 12. prosince 1974 pod FERM č. 2837 a FERM č. 2838.

Mykologické vlastnosti těchto mikroorganismů budou dále popsány.

Bacillus cereus var. mycoides (Ferm č.2391)

Tyčinka o velikosti 1,1 až 1,4 X 4,2 až 7,0 mikrometrů, obvykle v krátkých nebo delších řetězcích jako plíseň nebo Actinomyces, nepohyblivá, gram-pozitivní, sporangia nejsou zjevně nabobtnalá.

Živný bujón: dobrý růst, sediment.

Šikmý živný agar: bohatý růst, vlákna, sporangia, krémově bílá barva.

Agar s glukózou a asuaraginem: špatný růst, vlákna.

Agar s glukózou a dusičnanem: kultura neroste nebo roste velmi špatně.

Šikmý agar s tyrosinem: dobrý růst, vlákna, světle hnědé zbarvení.

Využití citrónanu: pozitivní.

Mléko: peptonizace.

Brambor: dobrý růst, krémové až hnědavé zbarvení.

Želatina: dochází ke zkapalnění.

Tvorba amoniaku: pozitivní.

Tvorba acetylmethylkarbinolu: pozitivní. Redukce dusičnanů na dusitany: pozitivní.

Kataláza: pozitivní.

Produkce indolu: negativní.

Hydrolýza škrobu: pozitivní.

Bujón s chloridem sodným: ve 4 % roztoku chloridu sodného nedochází к růstu.

Bacillus sp. YT 1002 (FERM č. 2837)

Tyčinka o rozměrech 1 až 1,2 X 5 až 6 mikrometrů, nepohyblivá, gram-pozitivní, obvykle tvoří krátké i delší řetězce.

Živný bujón: sediment.

Šikmý živný agar: dobrý růst a dobré rozšíření kultury.

Agar s glukózou a asparaginem: středně dobrý růst.

Šikmý agar s glukózou a dusičnanem: středně dobrý růst.

Mléko: pomalá peptonizace.

Brambor: dobrý růst, rozšíření kultury po ploše, krémově bílá barva.

Želatina: zkapalnění.

Produkce amoniaku pozitivní,

Redukce dusičnanu na dusitan: pozitivní.

Kataláza: pozitivní.

Acetylmethylkarbinol: produkce.

Agar s citrónanem: středně dobrý růst.

Organické zdroje dusíku: důležité pro růst. Uhlohydráty: při použití glukózy, fruktózy, galakiózy, mannózy, laktózy, maltózy, trehalózy, sorbitu, glycerinu, škrobu, glykogenu se vytváří kyselina, nikoli plyn.

Teplota při růstu: kultura roste až do teploty 50 °C. Optimální teplota je 30 až 35 °C.

Zdroj kultury: izolace z půdy.

Bacillus sp. YT 1003 (FERM č. 2838)

Tyčinka o rozměrech 1 až 1,6 X 2 až 7 mikrometrů, obvykle tvoří kratší nebo delší řetězce, není pohyblivá, je gram-pozitivní.

Živný bujón: dobrý růst, sediment.

Šikmý živný agar: dobrý růst, rozšíření kultury po ploše, krémově bílá barva.

Agar s glukózou a asparaginem středně dobrý růst.

Mléko: peptonizace bez koagulace.

Želatina: pomalé zkapalnění.

Produkce amoniaku: pozitivní.

Kataláza: pozitivní.

Redukce dusičnanu na dusitan: pozitivní. Acetylmethylkarbinol: produkce.

Citrónan: využití jako zdroje uhlíku.

Uhlohydráty: využití bez tvorby plynu u glukózy, fruktózy, glaktózy, mannózy, L-arabinózy, D-xylózy, sacharózy, laktózy, maltózy, trehalózy, raffinózy, mannitu, sorbitu, glycerinu, inulinu.

Teplota při růstu: optimální teplota je 30 až 35 °C, maximální teplota je 45 °C.

Zdroj mikroorganismu: izolace z půdy.

Všechny druhy bakterií podle vynálezu produkují jak β-amylázu a a-l,6-glukosidázu při pěstování v prostředí se zdrojem uhlíku a dusíku tak, jak je to běžné při pěstování, mikroorganismů. Příkladem uhlíkových zdrojů mohou být maltóza, škrob, částečně hydrolyzovaný škrob, jako je dextrin a jiné formy škrobu. Příkladem zdrojů dusíku mohou být pepton, kasein, extrakt z masa, extrakt z kvasnic, kukuřičný výluh, sója a sójové pokrutiny.

V případě, že je to nutné, přidávají -se anorganické soli, jako fosforečnany, horečnaté soli, soli barnaté a vápenaté nebo anorganický zdroj dusíku; v případě, že základní surovinou pro výrobu živného prostředí je kukuřičný výluh, je výhodné upravit jeho pH v rozmezí 6 až 9, takže je možno před použitím odstranit sraženinu, v níž může být přítomna látka inhibující produkci /7amylázy. Z tabulky 1 jasně vyplývá, že v případě, kdy se odstranění této sraženiny provede, je množství vyrobené /З-amylázy více než 10 X vyšší než v opačném případě, přičemž odstranění sraženiny téměř neovlivňuje produkci a-l,6-glukosidázy.

a-l,6-glukosidáza (jednotky/ml prostředí) /3-amyláza (jednotky/ml prostředí)

Tabulka 1 pH při přípravě kukuřičného výluhu bez úpravy

5.1+ 0,1

6.0 + 0,1

7.1+ 0,1

8.1+ 0,1

9,1 + 0,1

10,0 + 0,1

Ve snaze vyrobit oba enzymy ve vysokém výtěžku byla provedena řada pokusů pro zjištění nejvýhodnějších podmínek pěstování. Bylo potvrzeno, že členěním iontů manganu do prostředí je možno zvýšit podstatným způsobem produkci a-l,6-glukosidázy. Přítomnost těchto iontů však má inhibiční efekt na výrobu /З-amylázy. Příslušným výběrem doby a množství při přidávání iontů manganu к živnému prostředí je však možno provést pěstování tak, že se získají oba enzymy v žádané koncentraci.

Ze solí manganu je možno užít různé sloučeniny, například sírany, chloridy, fosforečnany a octany manganu. Tyto soli se obvykle к prostředí přidávají v množství 1 X 10⁼⁸až IX10“² molu, s výhodou IX10“⁶ až IX X10⁴ molu. V případě, že prostředí obsahuje síran manganu v množství 1 X 10⁵ molu, je produkce a-l,6-glukosidázy 3 až 6X vyšší než bez tohoto přídavku. Pokud jde o produkci obou enzymů, zvýší se množství obou v případě, že se pěstování mikroorganismu provádí v prostředí s obsahem citrónanu a/ /nebo vínanu.

Tyto látky se obvykle přidávají к prostředí v množství 0,01 až 1 °/o, s výhodou 0,05 až 0,2 %, vztaženo na hmotnost prostředí. V případě, že se pěstování provádí v živném prostředí s obsahem citrónanu nebo vínanu sodného v množství 0,1 %, je množství β-amylázy 1,5 až 2X vyšší a množství a-1,6-glykosldázy je 1,3 až 1,5 X vyšší než bez přidání těchto solí.

Dále bylo zjištěno, že v případě, že se pěstování provádí v živném prostředí s obsahem řepkového semene, pokrutin z řepkového semene nebo z traktu získaného z řepkového semene zahříváním s vodou nebo s kapalinou o pH 9 až 10, dochází к vysokému zvýšení množství a-l,6-glukosidázy, například při obsahu 4 % pokrutin z řepkové4035,4

12140,6

42039,1

51641,3

52535,9

46035,1

35225,0 ho semene je obsah tohoto enzymu 2 až 3 X vyšší než bez tohoto přídavku.

Kultura se pěstuje za provzdušňování při teplotě 20 až 40 °C po dobu 24 až 72 hodin. V průběhu pěstování se pH prostředí mění v rozmezí 5,5 až 9,5. Je žádoucí udržovat hodnotu pH prostředí na hodnotách 6 až 8 v průběhu celé fermentace.

Oba uvedené enzymy se produkují extracelulárně. Je tedy možno vyrobené enzymy izolovat tak, že se živné prostředí zfiltruje za účelem odstranění buněk, filtrát se zahustí a pak se enzymy dále koncentrují přidáním organického rozpustidla, jako acetonu, ethanolu, methanolu nebo isopropanolu, к vysrážení nebo je možno provést srážení také síranem amonným. V případě, že se srážení enzymu provádí vysolením pomocí síranu amonného, je možno získat 60 až 100 % β-amylázy a a-l,6-glukosidázy ve formě sraženiny při 70 až 75 % vysycení síranem amonným.

Protože každý z těchto enzymů je možno absorbovat na škrob, aktivované uhlí, různé druhy infusoriové hlinky, jako Celit, Hyfro-Supercel nebo Perlit, různé druhy jílů, jako bentonit, kyselý jíl, fulernarde, kaolin nebo mastek nebo fosforečnan vápenatý, po absorpci je možno tyto enzymy opět uvolnit nebo v případě absorpce na škrob přímo dochází к rozložení škrobu. Například /ϊ-amylázu je možno velmi účinně absorbovat na škrob, zejména v případě, že byl předem zahřát na 40 až 65 °C.

V případě přidání kukuřičného škrobu dochází к absorpci 3000 až 8000 jednotek \β-amylázy na 1 kg škrobu, je-li kukuřičný škrob předehřát na teploty v rozmezí 40 až 65 °C, jak je zřejmé z tabulky 2. Rovněž gelatinizovaný škrob zajišťuje velmi dokonalou absorpci enzymu.

Tabulka 2

Teplota při předběžném zpracování škrobu (°C)	Doba (min)	Účinnost absorbované /?-amylázy (jednotky/g škrobu)
40	10	3 010
50	10	5 930
55	10	6 890
60	10	7 650
65	10	8130
80	10 (gelatinizování)	7 890
nezpracováno		1020

Adsorbovaná β-amyláza může být úplně vymyta roztokem z obsahem 1 až 10 %, s výhodou 5 až 10 % maltózy nebo rozpustného škrobu, popřípadě dextrinu s maltózou. β-Amyláza i a-l,6-glukosidáza se dobře adsorbují na aktivované uhlí. Výsledné adsorbované enzymy mají vysokou enzymatickou účinnost a je možno je v této formě užít jako imobilizované enzymy. Napříkled β-amyláza se adsorbuje v množství 8 000 až 12 000 jednotek a a-l,6-gluku^!sidáza v množství 500 až 1 000 jednotek na g aktivního uhlí. Výsledný adsorbovaný enzym si uchovává v případě /ϊ-amylázy enzymatickou účinnost, která je rovna 90 % původní účinnosti, a-l,6-glukosidáza si uchovává svou účinnost na 100 %.

Mimoto je možno a-l,6-glukosidázu adsorbovat v množství 500 až 800 jednotek na g na infusoriové hlinky, například na Celit, Perlit apod.; jde o křemičité materiály nebo o jílovité produkty, jako bentonit, kyselý jíl nebo kaolinit, který sestává převážně z kysličníku křemičitého a hlinitého, z těchto přípravků je možno adsorbovaný enzym úplně vymýt 5 až 10% vodným roztokem chloridu sodného. I v adsorbovaném stavu si enzymy uchovávají účinnost, která odpovídají 50 až 70 procentům původní účinnosti.

Enzymatické vlastnosti /З-amylázy a a-1,6-glukosidázy, které jsou produkovány bakteriálními kmeny podle vynálezu budou dále uvedeny.

/?-Amyláza:

1) Účinnost: Enzym štěpí maltózu ze škrobu, ajmylózy, amylopektinu, glykogenu, dextrinu apod.

2} Specificita substrátu: stupeň hydrolýzy pro maltózu a amylózu je téměř 100 % a pro škrob téměř 60 %. Enzym nehydrolyzuje a-1,6-glukosidázovou vazbu amylopektinu, glykogenu, dextrinu, pullulanu apod.

3) pH vhodné pro účinnost enzymu je pH 3 až 10 (obr. 1].

4) Optimální pH: pH 7 (obr. 1).

5) Teplota pro účinnost enzymu je až do 65 °C (obr. 2).

6) Optimální teplota: v blízkosti 50 °C (obr. 2).

7) Inaktivace: přibližně 20 % účinnosti se ztrácí po 10 minutách stání při 55 °C; v podstatě veškerá účinnost je ztracena po 10 minutách stání při 70 °C (obr. 4).

8) Stabilita při různém pH: Enzym je nestálý v kyselém pH pod hodnotou pH 5 a je stálý na alkalické straně při pH 6 až 10 (obr. 3).

9) Inhibice: enzym je inhibován p-chlorortuťnatým benzoátem a částečně inhibován monojodoacetátem; po inhibici první z uvedených sloučenin je možno účinnost obnovit přidáním cysteinu; enzym je silně inhibován ionty Cu⁺⁺, Hg⁺⁺ a Ag⁺; dále je inhibován Fe^{+ +} .

10) Čištění: enzym se frakcionuje vysrážením po 30 až 50% nasycení síranem amonným ze živného prostředí a pak je možno jej čistit sloupcovou chromatografií při použití přípravku Sephadex G-100.

11) Měření enzymatické účinnosti: Vhodné množství enzymatického roztoku se přidá ke 2 ml fosforečnanového pufru o koncetraci 0,1 M o pH 7,0 s obsahem 2 % rozpustného škrobu a směs se doplní destilovanou vodou na 4 ml., načež se inkubuje při 40 °C. Množství enzymu, které vede po 1 hodině ke vzniku 1 mg maltózy ze svrchu uvedených podmínek, je definováno jako jedna jednotka.

a-l,6-Glukosidáza

1) Působení: Enzym hydrolyzuje a-l,.6-glukosidickou vazbu amylopektinu, který byl částečně hydrolyzován působením ^-amylázy.

2) Specifičnost substrátu: Enzym produkuje maltotriózu hydrolýzou a-l,6-glukosidické vazby pullulanu. V případě, že se uvede v reakci s amylopektinem, nedochází ke zvýšení barvitosti jodem. To znamená, že enzym projevuje svou účinnost pouze na amylopektinu, částečně hydrolyzovatelném β-amylázou, takže postranní řetěz je zkrácen. Enzym nepůsobí na isomaltózu a pannózu.

3) pH při působení enzymu: 5 až 10 (obr. 1).

4) Optimální pH: 6 až 6,5 (obr. 1).

5) Teplota pří působení: Do 65 °C (obr. 2).

6) Optimální teplota: Přibližně 50 °C (obr. 2).

7) Inaktivace: Přibližně 50 % účinnosti je ztraceno po 10 minutách stání při 50 °C. V podstatě veškerá účinnost se ztrácí po 10 minutách stání při 65 °C (obr. 4). Ionty Ca^{+ +}nebo Sr⁺⁺ však mají silnou ochrannou účinnost. V nepřítomnosti vápenatých iontů se ztrácí 90 °/o účinnosti po 30 minutách stání při 50 °C, za přítomnosti 5 Х1СГ³ M chloridu vápenatého je ztěží možno rozeznat pokles účinnosti.

8) Stálost při různém pH: Enzym je stálý v oblasti pH 6 až 9. Enzym je nestálý na kyselé straně a poměrně stálý na alkalické straně (obr. 3).

9) Inhibice: Enzym je částečně inhibován p-chlorobenzylátem rtuťnatým a nepatrně monojodoacetátem. Enzym je silně inhibován ionty rtuťnatými, stříbrnými a železnatýml.

10) Čištění: Enzym je možno čistit srážením 60 až 70 % síranu amonného ze živného prostředí, čistit enzym je možno sloupcovou chromatografií na přípravku Sephadex G-100.

11) Měření enzymatické účinnosti: Účinnost enzymu se měří při použití pullulanu jako substrátu, enzym z tohoto materiálu uvolňuje maltotriózu. Zkouška se provádí tak, že se vhodné množství enzymu přidá к 0,5 mililitru 0,1 M fosforečnanového pufru o pH 7,0 s obsahem 1 % pullulanu. Výsledná směs se doplní na 1,0 ml destilovanou vodou a inkubuje se při teplotě 40 ^aC 1 hodinu. Množství enzymu, které vyvolá tvorbu 1 mg maltotričzy za svrchu uvedených podmínek, se pokládá za jednotku účinnosti.

Z fyzikálních a chemických vlastností, zejména podle specifičnosti substrátu, je enzym novou a-l,6-glukosidázou, produkovanou bakteriemi rodu Bacillus, který není možno zařadit mezi dříve známé enzymy, isoamylázu a pullulanázu. Byl označen jako dextrin-a-l,6-glukosidáza. «-1,6-Glukosidázy, a to isoamyláza a pullulanáza, produkované dříve známými mikroorganismy, hydrolyzují a-1,6-glukosidázovou vazbu v postranním řetězci amylopeiktinu za vzniku sloučeniny podobné amylóze, která se modře barví při reakci s jodem. [(Biochemische Zeltšchrift, sv. 334, str. 79 — 95 (1961), Biochemische J. sv. 108, str. 33 — 40 (1968), Biochemica et Biophyslca Acta, sv. 212, str. 458 — 469 (1970), J. Fermentation of Technology, sv. 49, str. 552 — 559 (1971)]. Obvykle se proto provádí zkouška na účinnost měřením vzrůstu těchto zbarvení jodem po reakci enzymu se škrobem nebo amylopektinem.

a-l,6-Glukosidáza podle vynálezu nezpůsobuje zvýšení intenzity zbarvení jodem při uvedené reakci. Tato skutečnost prokazuje, že tyto enzymy reagují pouze se škrobem nebo amylopektinem, v němž postranní řetězec byl částečně hydrolyzován působením /3-amylázy a glukózový zbytek v postranním řetězci byl tedy zkrácen. Tato specifičnost substrátu odlišuje enzym od dříve známých β-1,6-glukosidáz.

«-1,6-Glukosidáza podle vynálezu má velmi výhodné enzymatické vlastnosti zejména proto, že je produkována současně s 0-amylázou, takže je možno přímo hydrolyzovat škrob na maltózu. Jak je zřejmé z obr. 1 až 4, tyto dva enzymy si jsou podobné, pokud jde o optimální pH a optimální teplotu. Jsou si také podobné, pokud jde o stálost při různé teplotě. Pokud jde o způsob hydrolýzy škrobu uvedenými enzymy, probíhá tento postup tak, že β-amyláza odštěpuje maltózové jednotky z neredukujícího konce řetězce, čímž dojde ke zpřístupnění místa, v němž dochází к rozvětvení, takže a-l,6-glukosidáza může rozštěpit a-l,6-glukosidickou vazbu. Tímto způsobem oba enzymy střídavě hydrolyzují amylopektin z neredukujícího konce. Jak je možno očekávat z mechanismu reakce, použití enzymu podle vynálezu ve spojení s /З-amylázou má za následek vyšší výtěžky maltózy než při použití kterýchkoli dříve známých a-l,6-glukosidáz, výtěžky se blíží teoretickému výtěžku na 90 až 96 %.

V případě, že se užívá známého enzymu, jako pullulanázy nebo izoamylázy, odštěpuje tento enzym z amylopektinu různé části tak, že vzniká škrob a pak amylóze podobná látka s přímým řetězcem a pak teprve dochází působením β-amylázy к tvorbě maltózy. Jde tedy o dvoustupňový proces, kterým je možno získat maltózu s dosti dobrými výsledky. V případě, že se užívají enzymy podle vynálezu, dochází ke střídavé reakci enzymatické směsi, takže je možno získat maltózu v podstatě vyšším výtěžku.

Na rozdíl od izoamyláz, které mají svůj původ v kvasnicích a mikroorganismech rodu Pseudomonas, hydrolyzují enzymy podle vynálezu a-l,6-glukosidickou vazbu pullulanu a popřípadě hydrolyzují pullulan úplně na maltotriézu. Lze jich tedy také užít к výrobě maltotriózy z pullulanu. V tomoto případě nejsou výslednými produkty glukóza, maltóza nebo oligosacharidy. Způsob hydrolýzy v tomto případě je pravděpodobně jiný, a to z toho důvodu, že к tvorbě maltotriózy pochází již v počátečním stupni reakce. Reakce způsobované enzymy podle vynálezu není reverzibilní.

Při hydrolýze pullulanu pullulanázou z mikroorganismů rodů Aerobacter a Streptococus dochází současně ke tvorbě glukózy, maltózy, maltotetraózy a oligosacharidů, současně však dochází к tvorbě maltotriázy.

[Biochemische Zeitschrift, sv. 334, str. 79 — — 95 (1961)]. Byly pozorovány i další reakce, jejichž výsledkem byly štěpné produkty různého typu [Nátuře, sv. 210, str. 200 (1966), Archives of Biochemistry and Biophysics, sv. 137, str. 483 — 493 (1970), Biochemical J., sv. 108, str. 33 — 40 (1968J], což znamená, že nedochází k úplné hydrolýze pullulanu na maltotriózu.

Jak již bylo uvedeno, mají 'i enzymy podle vynálezu vysokou afinitu k hydrolýze krátkého postranního řetězce glukózového zbytku a nejsou schopné hydrolyzovat a-l,6-glukosidickou vazbu isomaltózy, pannózy a isomaltotriózy. Tato' pozorování prokazují, že se enzymy liší od zvířecí oligo-l,6-glukosidázy. [J. Biol. Chem., sv. 215, str. 723—736 (1955)].

a-l,6-Glukosidáza podle vynálezu se význačně Uší od dosud známých isoamyláz a pullulanázy také specifičností substrátu, která je jednou z nejdůležitějších vlastností každého enzymu. Reakce způsobená tímto enzymem také není reverzibilní, což tento enzym dále odlišuje od enzymů známých. Mimoto je tento enzym chráněn proti inaktivaci teplem působením vápenatých iontů, což rovněž není možno pozorovat u pullulanázy nebo isoamylázy. Mimoto však také · různé vlastnosti známých enzymů, které jsou produkovány rody Aerobacter a Streptococcus, není možno pozorovat u enzymů podle vynálezu. Enzym podle vynálezu je tedy řadou svých vlastností od známých enzymů zcela odlišný.

Optimální pH enzymu podle vynálezu je v blízkosti neutrality, jak je zřejmé z obr. 1, a optimální teplota je přibližně 50 °C, jak je zřejmé z obr. 2. Podle chování při různém pH a různé teplotě se enzym podle vynálezu liší od pullulanázy produkované kmenem Aerobacter [optimální pH 5,0, optimální teplota 47,5 °C, Biochemische Zeitscchrift, sv. 334, str. 79 — 95 (1961)] a od pullulanázy produkované rodem Streptococcus [optimální pH 5,4 až 5,8 optimální teplota 30 °C, Bochemical J., sv. 108, str. 33 — 40 (1968)] a liší se také od isoamylázy z kvasnic [optimální pH 6,0 až 6,2, optimální teplota 20 °C, Journal of Agricultural Chemical Society, sv. 23, str. 115 a 120 (1949)] a od isoamylázy produkované rodem Pseudomonas [optimální pH 3 až 4, optimální teplota 52 °C, Biochemica a Biophysica Acta, sv. 212, str. 458 — — 469 (1970)].

Filtrát živného prostředí, koncentrát filtrátu, sraženina získaná působením organického rozpustidla a sraženina získaná síranem amonným obsahují /3-amylázu a a-1,6-glukosidázu a lze jich proto užít jako smíšeného enzymatického přípravku pro výrobu maltózy ze škrobu a dalších výchozích látek.

Z enzymatického preparátu získaného tímto způsobem je možno získat /3amylázu a a-1,6-glukosidázu nezávisle frakcionováním tím způsobem, že se živné prostředí nebo jeho filtrát nasytí na 30 až 50 % síranem amonným k vysrážení β-amylázy, pak se prostředí nasytí do 60 až 70 % toutéž látkou, čímž se vysráží druhý enzym. Oba enzymy je pak možno dále čistit sloupcovou chromatografií.

Způsob výroby maltózy ze škrobu použitím , enzymatického komplexu podle vynálezu je tedy možno shrnout následujícím způsobem.

Při pěstování svrchu uvedených bal^^t-ei^iálních kmenů se ' hromadí v živném prostředí (Samyláza a a-l,6-glukosidáza. Živné prostředí se zfiltruje nebo odstředí k odstranění buněk mikroorganismu, načež se přidá k roztoku škrobu. Pro vysoké výtěžky maltózy je žádoucí užít škrob nebo rozpustný škrob s nízkým dextrózovým ekvivalentem' (D. E.) redukující cukry, vyjádřené __jako glukóza_________ _{χ 1QQ} , sušina

V případě, že .má být hydrolyzován vysoce koncentrovaný škrob, je výhodné jej nejprve zkapalnit působením α-amylázy a takto zkapalněný škrob pak použít. Stejným způsobem lze užít dextrin a podobné látky. Koncentrace -substrátu se má pohybovat v rozmezí 5 až 60 °/o, obvykle 10 až 40 °/o. V případě potřeby se přidají vápenaté ionty. Směs se udržuje na pH 5 až 8, s výhodou 6 až 7 a na teplotě 20 až 60 °C, s výhodou 40 až ‘55 °C, načež se přidá živné prostředí s - obsahem obou enzymů β-amylázy i a-l,6-glukosidázy. Sraženina obsahující oba tyto· enzymy nebo aktivované uhlí s oběma adsorbovanými enzymy je možno přidat k reakční směsi místo živného prostředí. Je také možno oddělit oba enzymy nezávisle ze živného prostředí adsorpcí nebo extrakcí a pak přidat oba tyto enzymy k reakčnímu . roztoku. Potřebné množství β-amylázy je obvykle 200 až 400 jednotek mno^žství a-^-gmkosM^y 1° ^{až 50}jednotek na 1 g sušiny škrobu. Za těchto podmínek . se hydrolyzuje škrob na maltózu ve výtěžku 80 až 90 % po 48 až 72 hodinách. Reakční doba je kratší při větším množství enzymu při nižší koncentraci substrátu.

Je tedy zřejmé, že při -použití obou těchto enzymů, produkovaných tímtéž bakteriálním kmenem, je možno vyrobit přímo maltózu ze škrobu. To znamená, že způsob podle vynálezu není jen jednodušší, avšak přináší také vyšší výtěžky ve srovnání s běžnými postupy nebo s metodou, při níž ' se k substrátu přidávají odděleně dva enzymy, vyprodukované dvěma rozdílnými bakteriálními kmeny.

Množství, v němž je nutno přidat oba enzymy, je možno snadno odhadnout. Tvorbu enzymů v živném prostředí je možno řídit přidáním manganových iontů, je také možno zvýšit účinnost obou enzymů různými způsoby. Mimoto je možno tyto enzymy snadno izolovat a čistit současně nebo odděleně. Způsob podle vynálezu je tedy vhodný pro různé průmyslové použití.

Vynález bude osvětlen následujícími příklady.

Příklad 1

Do Erlenmeyerovy baňky o obsahu 200 ml se vloží 50 ml prostředí s obsahem 1 % peptonu, 0,3 % KžHPO4, 0,1 % MgSOá: 7№O s 1 % maltózy. Prostředí se sterilizuje běžným způsobem (121 °C, 15 minut] a očkuje se Bacillus cereus var. mycoides FERM č. 2391, načež se kultura pěstuje při teplotě 30 °C 2 dny. Po skončeném pěstování se živné prostředí odstředí к odstranění buněčného materiálu a získaný supernatant se analyzuje na množství získaného enzymu. Za uvedenou tfobu bylo získáno 628 jednotek /3-amylázy a 18 jednotek a-l,6-glukosidázy v 1 ml živného prostředí. Živné prostředí se uloží do celofánové trubice a dialyzuje proti destilované vodě к odstranění zbytku cukru.

Část dlalyzovaného enzymu s obsahem 204 jednotek β-amylázy a 3,6 jednotek a-l,6-glukosidázy se uvede v reakci s amylózou z brambor, amylopektinem, bramborovým škrobem, glykogenem a dextrinem. Všechny tyto látky jsou užity v koncentraci 0,4 % při pH 7 a teplotě 40 °C. Celkový reakční objem je 4,3 ml.

V předem určených intervalech se reakční roztok analyzuje a stanoví se redukční cykly způsobem podle Somogyiho a Nelsona. Složení cukrů v reakční směsi se stanoví papírovou chromatografií, při níž se jako soustavy rozpustidel užije směs 4 díly pyridinu, 6 dílů butanolu a 3 díly vody. Bylo zjištěno, že vytvořeným cukrem byla z 90 až 96 % maltóza v případě, že substrátem byla amylóza, amylopektin nebo bramborový škrob, přičemž bylo zjištěno velmi malé množství maltotriózy, přibližně 4 až 8 %. Při zkouškách přístrojem Glukostat bylo zjištěno, že tvorba glukózy byla nižší než 0,1 °/o. Získané výsledky jsou uvedeny na obr. 5. Z obr. 5 je zřejmé, že došlo к úplné hydrolýze amylózy z brambor, amylopektinu, dextrinu a bramborového škrobu na maltózu po 8 hodinách reakce. Glykogen byl rovněž hydrolyzován alespoň na 90 % na maltózu po 23 hodinách reakce.

Příklad 2

Prostředí stejného složení jako v příkladu 1 bylo očkováno Bacillus sp. YT Č. 1002 (FERM č. 2837). Třepací kultura byla pěstována při 30 °C. Po 48 hodinách bylo živné prostředí analyzováno na množství enzymů. Bylo zjištěno 121 jednotek Д-amylázy a 10,5 jednotek a-l,6-glukosidázy v 1 ml živného prostředí.

Příklad 3

Prostředí stejného složení jako v příkladu 1 se očkuje Bacillus sp. YT č. 1003 (FERM č. 2838). Třepací kultura se pěstuje při teplotě 30 °C. Po 48 hodinách pěstování se živné prostředí analyzuje na množství vytvořených enzymů. Tímto způsobem se získá 152 jednotek β-amylázy a 5,3 jednotek «-1,6-glukosidázy v 1 ml živného prostředí.

Příklad 4

Do baňky s obsahem 1 litr se vloží 250 ml živného prostředí s obsahem 1 '% polypeptonu, 0,3 % K2HPO4, 0,1 % MgSO4.7H2O a 1 % dextrinu a obsah baňky se sterilizuje běžným způsobem. Pak se obsah očkuje Baclllus cereus var. mycoides a třepací kultura se pěstuje při 30 ^aC. Po 48 hodinách pěstování se kultura odstředí к odstranění buněk a získaný supernatant se analyzuje na enzymatickou účinnost.

Tímto způsobem bylo získáno 420 jednotek /З-amylázy a 7,8 jednotek a-l,6-glukosidázy v 1 ml živného prostředí. 200 ml tohoto prostředí se pak sytí na 75 °/o síranem amonným, sraženina se oddělí odstředěním a rozpustí v malém množství vody a roztok se analyzuje na enzymatickou účinnost. Bylo zjištěno, 83 000 jednotek /3-amylázy a 952 jednotek a-l,6-glukosidázy.

Příklad 5

Část roztoku z příkladu 1 s obsahem 10 000 jednotek /З-amylázy a 275 jednotek a-1,6-glukosidázy se uvede v reakci s 1 g amylopektinu o koncentraci 1 % za přítomnosti 5 X 10~⁵ M chloridu vápenatého. Reakce probíhá při teplotě 40 °C a při pH 7. Redukční cukr v reakční směsí se stanoví svrchu uvedeným způsobem. Vytvoří se 972 mg maltózy. Současně se vytvoří 3,7 mg glukózy. Papírovou chromatografií se zjistí skvrna pro maltózu a skvrna pro velmi malé množství maltotriózy.

Příklad 6

Způsob výroby maltózy byl prováděn při použití vysoce koncentrovaného substrátu, ve snaze zjistit optimální teplotu a optimální pH za těchto podmínek.

Reakční roztok obsahoval různé složky, jejíchž množství je uvedeno v tabulce 3.

Tabulka 3

Rozpustný škrob (D. E. 1,5) 1 g fosforečnanový pufr o pH 6,5 až 7 nebo acetátový pufr o pH 5 až 6

CaCl? /3-amyláza a-l,6-glukosidáza celkový objem

0,05 M

0,01 M

1016 jednotek

13,1 jednotky ml

Ke stanovení vlivu pH byla reakce prováděna při 50 °C při pH 5,0, 5,5, 6,Q, 6,5 a 7,0. Výsledky jsou, uvedeny v tabulce 4.

Tabulka 4 redukující cukry (jako maltóza) sušina

Maltózový ekvivalent =

X 100

Ke zjištění vlivu teploty byla reakce prováděna při pH 6 až 6,5, teplota byla měněna na hodnoty 40, 50, 55 a 60 °C. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 5.

Tabulka 5

Příklad?

Bylo připraveno živné prostředí s obsahem 1 °/o polypeptonu, 1 % dextrinu, 0,3 °/o K2HPO4 a 0,1 % MgSO4. 7НгО a toto prostředí bylo měněno přidáváním různých množství (1 X 10^-7 až 1 X 10-3 molu) síranu manga natého jak je zřejmé z tabulky 6. Získaná prostředí byla uložena do Erlenmeyerových baněk o obsahu 200 ml a byla sterilizována běžným způsobem. Pak bylo živné prostředí očkováno gaeijlug pigfpug yar, myp$4§§ Д kultivace byla prováděna při 30 °C 42 hodip.

|Po sjčowento PňgtPvÁní bylo Živné prostředí odstředěno a supernatant byl analyzován na redukci /ϊ-amylázy a a-l,6-glukosidázy. Získané výsledky jsou uvedeny v tabulce 6.

)ak je z tabulky zřejmé, přidání síranu manganatého zvýší množství produkované a-1,6-^glnkpsidázy až třikrát.

Tabulka 6

Množství přidaného Optická hustota síranu manganatého mycelia (660 nm) (moly)

Účinnost a-l,6-glukosidázy (jednotky/ml)

Účinnost /?-amylázy (jednotky/ml)

O (bez přídavku) 1 x 10-⁷	0,7 6,5	11,3 14,2	699 678
1 X 10-⁶	5,8	18,2	155
5 X 10-6	5,6	284	155
1 x 10-⁵	5,0	25,0	132
1 X 10-⁴	5,9	28,3	152
1 X 10-3	5,8	25,2	153

Příklad 8

Do Erlenmeyerových baněk s obsahem 200 mililitrů bylo vloženo vždy 50 ml prostředí s obsahem 1 % polypeptonu, 1 % dextrinu, 0,3 % K2HPO4 a 0,1 % MgSO4.7HžO a prostředí bylo sterilizováno běžným způsobem, napřed bylo očkováno Bacillus cereus var. mycoides a třepací kultura byla pěstována při 30 °C 24 hodin, za tuto dobu bylo množství /?-amylážy 237 jednotek v ml prostředí, pak byl přidán síran manganatý sterilním způsobem tak, aby živné prostředí obsahovalo 1 X 10⁴ molu této sloučeniny.

Pak byla kultura pěstována ještě 42 hodin, napřed bylo živné prostředí odstředěno к odstranění buněk a supernatant byl analyzován na účinnost /J-amylázy a a-l,6-glukosidázy. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 7.

Jak je z tabulky zřejmé, přídavek manganaté soli v polovině doby pěstování zvýší množství «-1,6-glukosidázy 1,7 X a současně umožňují i tvorbu /í-amylázy.

Tabulka 7

MnS04	Doba pěstování	Optická hustota Účinnost	Účinnost
	(hod)	mycelia (600 nm) β-amylázy	a-l,6-glukosidázy
		(jednotky/ml)	(jednotky/ml)

0	42	6,7	377,6	13,0
1 x 10-⁴ M	24	6,5	236,8	12,5
MnS04 přidáno
po 24 hod.	42	6,6	244,5	22,2
1 Χ 10-⁴ M	42	5,9	28,8	25,0

MnSO4 přidáno od začátku

V případě, že se živné prostředí od začátku doplní manganatou solí, zvýší se sice také množství a-l,6-glukosldázy 2X, množství /J-amylázy je však sníženo až 28,8 jednotek/ /ml.

Příklad 9

Bylo připraveno živné prostředí s obsahem 2 % polypeptonu, 0,3 % K2HPO4, 0,1 % MgSO4.7HžO a 5 X 10^-4 molu CaCh a další prostředí, s různým množstvím citrónanu sodného, v koncentracích 0,5 % a 1 %, a prostředí s obsahem vínanu sodného v koncentraci 0,25 % a 0,5 %. Tato prostředí byla uložena do Erlenmeyerových baněk s obsahem 200 ml po podílech o velikosti 50 ml, načež byly baňky sterilizovány běžným způsobem a živné prostředí pak bylo očkováno Bacillus cereus var. mycoides a třepací kultura byla pěstována při teplotě 30 °C 42 hodin.

Po skončeném pěstování bylo živné prostředí odstředěno a supernatant byl analyzován na účinnost /З-amylázy a a-l,6-glukosidázy. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 8.

Z tabulky je zřejmé, že přídavek organické kyseliny zřetelně zvyšuje množství β-amylázy i a-l,6-glukosidázy.

Tabulka 8

Přidaná organická kyselina	Množství kyseliny v % prostředí	Optická hustota mycelia (660 nm)	Účinnost jí-amylázy (jednotky/ /ml)	Účinnost a-l,6-glukosidázy (jednotky/ /ml) ,
Citrónón sodný	0,5	4,9	1035,0	20,7
citrónón sodný	1,0	4,8	1080,0	17,1
vínan sodný	0,25	4,7	1119,0	18,4
vínan sodný	0,5	4,9	1063,0	16,2
kontrola (bez přídavku)		4,9	588,0	13,0

Příklad 10

Do dvou fermentorů o obsahu 10 litrů bylo uloženo prostředí s obsahem 4 % mléčného kaseinu, 0,3 % K2HPO4, 0,1% MgSO4. .7НгО, 5X10^-4 M СаС1з a 0,5% rozpustného škrobu, každé z těchto prostředí mělo objem 5 litrů. Do jednoho z obou fermentorů byla přidána 4 % pokrutin z řepkového semene, pak byla obě prostředí sterilizována minut při teplotě 121 °C. Pak byla obě prostředí očkována 100 ml Bacillus cereus var. mycoides a kultura byla za stálého provzdušňování pěstována při teplotě 30 °C, přičemž vzduch byl dodáván rychlostí 5 1/min a prostředí bylo stále mícháno při 250 otáčkách za minutu. Po 24 hodinách pěstování bylo živné prostředí odstředěno a supernatant byl analyzován na enzymatickou účinnost. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 9.

Účinnost β-amylázy (jednotky/ml)

2470,0

2600,0

Účinnost a-l,6-glukosidázy (jednotky/ml)

106,0

44,4

Tabulka 9

Pokrutlny z řepkového semene (% prostředí) _________ kontrola (bez přídavku)

Jak je z tabulky zřejmé, bylo množství a-1,6-glukosidázy, vyrobené z prostředí s obsahem pokrutin z řepkového semene 2,4 X vyšší než množství v živném prostředí, к němuž pokrutiny přidány nebyly.

Živné prostředí bylo odstředěno к odstranění buněk, 2 litry supernatantu byly smíšeny se 4 litry chladného ethanolu к vysrážení enzymu a vzniklá sraženina byla oddělena filtrací a usušena. Tímto způsobem byl získán práškovitý enzymatický přípravek, který obsahoval 115 800 jednotek /З-amylázy v 1 g, to znamená, že /?-amyláza byla izolována ze 75 % a a-l,6-glukosidáza ze 70 °/o.

Příklad 11 % kukuřičný výluh s obsahem 4 % suši ny byl upraven uhličitanem sodným na pH

7,5. Výsledná směs byla odstředěna к odstranění sraženiny, která obsahuje látku inhibující produkci /J-amylázy a kterou je možno vysrážet úpravou pH. Do Erlenmeyerových baněk o obsahu 200 ml bylo uloženo vždy 50 ml supernatantu s přídavkem 0,5 % škrobu a baňky byly sterilizovány běžným způsobem. Pak byl obsah baněk očkován Bacillus cereus var. mycoides a kultury byly pěstovány za aerobních podmínek při teplotě 30 °C 42 hodin. Po skončeném pěstování bylo živné prostředí odstředěno к odstranění buněčného materiálu a supernatant byl analyzován na β-amylázu a a-l,6-glukosidázu. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 10.

Tabulka 10

Účinnost (J-amylázy Účinnost a-l,6-glukosidázy (jednotky/ml) (jednotky/ml) kontrola 52,1 35,3 po odstranění látky, inhibující produkci /3-amylázy 592,7 41,1

Jak je z tabulky zřejmé, je možno zvýšit množství /З-amylázy podstatným způsobem úpravou pH kukuřičného výluhu, spojenou s odstraněním inhibičního faktoru.

Příklad 12

Směs 10 g rozpustného škrobu s 1 litrem enzymatického roztoku, který byl získán kultivací Bacillus cereus var. mycoides a obsahoval 572 jednotek /ϊ-amylázy a 43,5 jednotek a-l,6-glukosidázy, byla smísena se 40 g aktivovaného uhlí s názvem Nořit, směs byTabulka 11 β-amyláza (jednotky) la míchána к dosažení adsorpce enzymů na aktivované uhlí. Enzymy pak byly izolovány filtrací.

Byla enalyzována enzymatická účinnost filtrátu a aktivovaného uhlí s adsorbovanými enzymy. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 11.

Z tabulky je zřejmé, že β-amyláza byla izolována ve výtěžku 90,1 % a a-l,6-glukosidáza ve výtěžku téměř 100 %, oba enzymy v imobilizované formě. V případě, že nebyl přidán škrob byl výtěžek jS-amylázy v imobilizované formě pouze 12,4 %.

a-l,6-glukosidáza (jednotky)

A) přidané množství	572 000	43 500
В) neadsorbované množství	197 000	9 700
C) účinnost imobilizovaného
enzymu	338 000	33 800

Výtěžek imobilizovaného enzymu (C/A-BX100) 90,1%

100 %

293974

Část imobilizovaného enzymu, a to 3000 jednotek ^-amylázy a 310 a-l,6-glukosidázy, byla přidána к 10 g rozpustného škrobu a směs byla doplněna vodou na 100 ml. Roztok byl pak udržován na 55 °C při pH 6 až

6,5. Po skončení reakce byl roztok analyzován na obsah cukru, bylo zjištěno 90,5 °/o maltózy, 7,5 % maltotriózy a 2,0 % oligosacharidu.

P г í к 1 a d 1 3

Do 100 ml vody bylo přidáno 50 g kuku řičného škrobu a 10 g přípravku Celit, roztok byl promíchán a pak byl zahřát na 60 °C wa 30 minut. К výslednému roztoku bylo přidán© 30Θ ml filtrátu kultury Bacillus oereus var. mycoides (pH 7,1, 403 jednotek β-amylázy/ml a 28,0 jednotek a-l,6-glukosidázy/ml) -a směs byla míchána к zajištění adsorpce obou enzymů.

Pak byla celá směs zfiltrována к oddělení enzymu, jehož účinnost byla stanovena. Získané výsledky jsou uvedeny v tabulce 12.

Tabulka 12

jS-amyláza (jednotky)	a-l ,6-ghřkosidáza (Jednotky)
A ] původní účinnost 121 000 B) zbýva jící účinnost 111ΟΘ0 C) účinnost fixovaného enzymu 95 300 Výitěžek fixovaného enzymu (C/A-BX100) 86,7 %	9400 1860 6220 95,1%

Směs škrobu a přípravku Celíte s adsorbovanými enzymy pak byla přidána к 10% vodnému roztoku dextrinu s obsahem 10 % chloridu sodného za účelem vymytí enzymu z adsorpčního činidla. β-Amyláza byla vymyta na 100 %, a-l,6-glukosidáza na 85 %.

Příklad 14

Vždy 100 ml filtrátu s obsahem živného prostředí po odstranění Bacillus cereus var. mycoides o koncentraci 758 jednotek /3-amy lázy a 37,1 jednotek a-l,6-glukosidázy v 1 ml bylo smíseno s 5 g kyselého jílu, bentonitu, mastku nebo přípravku Celíte a Perlíte к adsorpci a-l,6-glukosidáz.

Adsorbovaný enzym byl oddělen filtrací nebo 'Odstředěním, byl důkladně promyt vodou a byla stanovena jeho účinnost. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 13, z níž je zřejmé, že a-l,6-glukosidáza se dobře adsorbuje na všechna užitá činidla v množství 400 až 700 jednotek na 1 g.

Tabulka 1'3

Účinnost adsorbované α-1,6-gluk'OSidázy (jednotky/g)

Účinnost adsorbované

0-amylázy (jednotky/g)

kyselý jíl	612
bantonii	648
mastek	416
.Celíte	492
•Perlíte	532

Příklad 15

Ke 100 g sušiny zkapalněného škrobu s

D. E. 1,5 % se přidá 30 000 jednotek β-amylázy, 3 000 jednotek α-Ι,Ό-glukosidázy a 0,73 procent chloridu vápenatého s 2 molekulami krystalické vody. Směs se zředí na celkový objem 500 ml, zahřeje se na teplotu 50 °C a

790

694

200 .0 .0 na této teplotě se udržuje při pH 6 až 6,5, čímž dojde к průběhu enzymatické reakce. Po 100 hodinách této reakce se stanoví složení cukrů v reakční směsi papírovou chro. matografií. Podle tohoto stanovení obsahuje výsledná směs 90,6 % maltózy, 7,1 % maltotričzy, 0,0 % glukózy a .2,3 % jiných sacharidů.

2S

Reakční doba (hod)

pH 5,0 + 0,1

1. Způsob současné výroby /J-amylázy a a-l,6-glukosidázy z mikroorganismů, vyznačující se tím, že se pěstuje při teplotě 20 až 40 °C a při hodnotě pH 5 až 10 mikroorganismus rodu Bacillus se schopností produkovat β-amylázu a 1,6-glukosidázu současně v živném prostředí s obsahem zdroje uhlíku, například maltózy, glukózy, škrobu nebo dextrinu, zdroje dusíku, například peptonu, kaseinu, extraktu z masa, extraktu z kvasnic,

VYNÁLEZU kuřičného výluhu, sójové mouky nebo sójových pokrutin, a anorganických solí, například fosfátů, hořečnatých solí, barnatých nebo vápenatých solí nebo solí manganu.

2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že mikroorganismem je Bacillus cereus var. mycoidex — FERM č. 2391, Bacillus sp. YT 1002 — FERM č. 2837 nebo Bacillus sp. YT 1003 — FERM č. 2838.