Przedmiotem wynalazku jest sposób równoczesnego wytwarzania (3-amylazy i a-l,6-glikozydazy z mikro¬ organizmu.Jak wiadomo, (3-amylaza (a-l,4-glukanomaltohydro- laza) wystepuje glównie w slodzie i w soli, które uwazane sa w chwili obecnej, za zródla tego enzymu. Wiadomo ponadto, ze zdolnosc wytwarzania podobnego enzymu posiada drobnoustrój rodzaju Bacillus.Kneen i inni odkryli w 1946 r., ze Bacillus polymyxa wytwarza P-amylaze (Archives of Biochemistry, vol. 10, str. 41 (1946), a Rose w 1946 r. szczególowo opisal enzy¬ matyczne wlasnosci p-amylazy wytwarzanej przez rase powyzszego drobrnoustroju (Archives of Biochemistry, vol. 10, str. 341 (1948). Nastepnie, Higashihaya i inni stwierdzili, ze P-amylaze wytwarza Bacillus megaterium (Japan Agricultural Chemical Society, Abstracts of Lectu- res at the 1971 Annual Meeting, str. 212 i Amylase Sympo- sium, vol. 6, str. 39 (1971). W kolejnym artykule (Japan Agricultural Chemical Society, Abstracts of Lectures at 1972 Annual Moeting str. 86) znajduje sie informacja, ze enzym ten jest identyczny z p-amylaza, wytwarzana przez Bacillus polymyxa. Z drugiej strony, wiele artykulów, do¬ tyczacych uzyskiwanej ze skrobi a-l,6-glikozydazy, traktuje ten enzym jako izomylaze lub pullulanaze. Marno, Koba- yashi i inni (Bunji Marno and Teuneo Kobayaschi, Journal of Japan Agricultural Chemical Society, vol. 23, str. 115 i 120 (1949) odkryli izomylaze w drozdzach.Jak stwierdzono, enzym ten wystepuje w wyzszych roslinach (enzym, pochodzacy z takiego zródla, nazywany jest R-enzymem) i w drobnoustrojach rodzaju Pseudomo- nas (Japanese Patent Publication nr 16788/1970).W pózniejszych pracach zauwazono, ze termofilowy Bacillus stearotermofil wytwarza termofilowa izoamylaze o optymalnej temperaturze pracy 65—67, 5°C (Japan Agricultiural Chemical Society, Abstracts of Lectures at the 1972 Annual Meeting, str. 88 i Japanese Patent Disclosure nr 91272/1973).W 1959 r. Bender odkryl pullulanaze, wystepujaca io w bakteriach tlenowych jako enzym zdolny do hydrolizy polisacharydu, wytwarzanego przez Pullularia pullulan.Enzym ten hydrólizuje wiazanie a-l,6-glikozydowe pullanu, powodujac zwiekszenie maltotriozy (Biochem. Biophys.Acta, vol. 36, str. 309 (1959) i Japanese Patent Publi- cation nr 7559/1971), oraz wiazanie a-l,6-glikozydowe amylopektyny i glikogenu. Stwierdzono równiez, ze en¬ zymy takie wytwarzane sa przez drobnoustroje Esche- richia intermedia (Ueda i inn. Applied Microbiology, vol. 15, str. 492 (1967) i Streptomyces mites (Ueda i inn. Journal of Fermentation Technology, vol. 49, str. 552 (1971)).Jak wynika z powyzszego, w wielu artykulach opisano niezalezne wytwarzanie P-amylazy i a-l,6-glikozydazy, jednakze zaden z artykulów nie wymien1'! drobnoustroju, wytwarzajacego jednoczesnie P-amylaze i a-l,6-glikozydaze.A zatem, aby wytworzyc oba enzymy nalezalo hodowac dwa rózne drobnoustroje oddzielnie. Ponadto, z uwagi na rózne dla obu enzymów temperatury reakcji i pH srodowiska reakcji, trudno bylo poddawac oba enzymy reakcji ze skrobia w tym samym czasie. Tak wiec wytwarzanie mal- 96 758 \96 758 3 "' tozy prowadzone bylo w dwóch etapach, z których pierwszy polegal zwykle na reakcji a-l,6-glikozydazy ze skrobia w celu wytworzenia substancji typu amylazy o prostym lancuchu, a nastepnie reakcji wytworzonej substancji z P-amylaza w celu uzyskania maltozy.Celem wynalazku jest opracowanie sposobu równoczes¬ nego wytwarzania p-amylazy i a-l,6-glikozydazy z mikro¬ organizmu.Przedmiotem wynalazku jest sposób równoczesnego wytwarzania P-amylazy i a-l,6-glikozydazy z mikroorga¬ nizmu, polegajacy na hodowli mikroorganizmu, nalezacego do rodzaju Bacillus, zdolnego do równoczesnego wytwarza¬ nia P-amylazy i ct-l,6-glikozydazy w srodowisku hodowla¬ nym i wydzieleniu z brzeczki pofermentacyjnej P-amylazy i a-l,6-glikozydazy. Zarówno P-amylaze, jak i a-l,6-gliko- zydaze mozna równoczesnie otrzymac z pojedynczego mikroorganizmu. W przypadku, gdy 2arówno p-amylaza, jak i a-l,6-glikozydaza sa dodawane do skrobi lub jej po¬ chodnej, dzialanie P-amylazy polega na oderwaniu od niezredukowynych konców lancucha fragmentów malto- zowych amylopektyny, obecnych w skrobi i udostepnienie rozgalezionego wiazania dzialaniu a-l,6-glikozydazy, które polega na rozerwaniu wiazania a-l,6-glikozydowego, po czym nastepuje ponowne dzialanie P-amylazy. Z uwagi na to, iz te dwa enzymy, tj. P-amylaza i a-l,6-glikozydaza, hydrolizuja na przemian fragmenty maltozowe amylo¬ pektyny, znajdujace sie na niezredukowanych koncach lancucha, maltoza wytwarzana jest ze skrobi w procesie jednostopniowym i z wydajnoscia wyzsza niz uzyskiwana dotychczasowymi sposobami.Przedmiot wynalazku wyjasniono ponizej w nawiazaniu do rysunków, na których fig. 1 pr2edstawia zaleznosc pomiedzy pH a aktywnoscia p-amylazy i a-l,6-glikozydazy wytwarzanych przez Bacillus cereus var. myccides; fig. 2 przedstawia zaleznosc pomiedzy temperatura a aktywnoscia obu wymienionych enzymów; fig. 3 przedstawia odpornosc obu enzymów na zmiane wartoscipH; fig. 4 przedstawia odpornosc obu enzymów na zmiane temperatury; fig. 5 przedstawia zaleznosc pomiedzy czasem reakcji a stopniem zhydrolizowania (do maltozy)^ oznaczonym na podstawie reakcji bulionu z hodowli wspomnianego drobno¬ ustroju z amyloza, amylopektyna, skrobia ziemniaczana, glikogenem i dekstryna.Rozwazajac poglad, ze lesli P-amylaza i a-l,6-glikozydaza wytwarzane sa równoczesnie, to moga byc wydzielane w postaci preparatu, bedacego zwiazkiem obu enzymów i stosowane jako wielce korzystny enzym do wytwarzania maltozy, przebadano liczne drobnoustroje w celu znale¬ zienia gatunku, zdolnego do równoczesnego wytwarzania P-amylazy i a-l,6-glikozydazy i znaleziono drobnoustrój o pozadanych wlasciwosciach, a mianowicie Bacillus cereus var. mycoides.Stwierdzenia te byly podstawa niniejszego wynalazku Sposób wedlug wynalazku wykorzystuje sie do wytwarzania maltozy bezposrednio ze skrobi i jej pochodnych i polega na hodowaniu bakterii Bacillus cereus var. mycoides, posiadajacej zdolnosc równoczesnego wytwarzania p~amy- lazy i a-l,6-glikozydazy, nastepnie wydzielaniu obu wytwo¬ rzonych enzymów z hodowli i wprowadzanie ich w reakcje ze skrobia i jej pochodnymi. Do tej pory nie jest znany inny drobnoustrój poza bakteriami, wymienionymi w ni¬ niejszym wynalazku, zdolny do równoczesnego wytwarzania p-amylazy i a-l,6-glikozydazy. 4 Bacillus cereus var. mycoides zostal zdeponowany w Fermentation Research Institute of Chiba-shi, Japonia grudnia 1973 r. pod numerem FERM nr 2391. Równo¬ czesnie stwierdzono, ze Bacillus sp. YT 1002 i Bacillus sp.YT 1003, zdeponowane w tym samym Instytucie 12 grudnia 1974 r. pod numerami FERM nr 2837 i FERM nr 2838 posiadaja takie same wlasciwosci, jak mikroorganizm, stosowany w sposobie wedlug wynalazku.Ponizej podana jest mikologiczna charakterystyka po¬ lo wyzszych drobnoustrojów.Bacillus cereus var. mycoides (wariant grzybo- waty) FERM nr 2391.Precik o wymiarach: 1,1 do 1,4 — 4,2 do 7,8 u. zwykle wystepuje w postaci krótszego lub dluzszego lancucha, podobnego do lancucha plesni lub drobnoustrojów Actino- myces. Gram-dodatni. Nieruchliwy. Zarodnia nieznacznie obrzmiala; Pozywka bulionowa: wzrost dobry, osad; Powierzchnia pozywki agarowej: wzrost obfity, osad wlóknisty, rozciagniety, kremowo bialy; Glukoza — asparagina na agarze: wzrost slaby, wlóknisty; Glukoza — azotan na agarze: brak wzrostu lub wzrost niewielki; Powierzchnia tyrozynowo-agarowa: wzrost dobry, wlók- nisty, lekko brazowy; Wykorzystanie cytrynianu: pozytywne; Mleko: peptonizacja; Ziemniak: wzrost dobry, kremowo-bialy lub lekko brazowy; Zelatyna: rozpuszczanie; Wytwarzanie amoniaku: pozytywne; Wytwarzanie acetylometylokarbinolu: pozytywne; Redukcja azotanu do azotynu: pozytywne,; Kataliza: pozytywna; Wytwarzanie indolu: negatywne; Hydroliza skrobi: pozytywna; Bulion NaCl: brak wzrostu w bulionie, zawierajacym 4% NaCl.Bacillus sp. YTM002 (FERM nr 2837). 40 Pret: 1—1,2x5—6 u, nieruchliwy, Gram-dodatni, zwykle wystepuje w postaci krótszego lub dluzszego lan¬ cucha; Pozywka bulionowa: osad; Powierzchnia pozywki agarowej: wzrost dobry, rozcia- 45 gniety; Glukoza — asparagina na agarze: niewielki wzrost; Powierzchnia glukozowo-azotanowa na agarze: niewielki wzrost; Mleko: wolna peptonizacja; 50 Ziemniak: wzrost dobry, rozciagniety, kremowo bialy; Zelatyna: rozpuszczanie; Wytwarzanieamoniaku: pozytywne; Redukcja azotanu doazotynu: pozytywna; Kataliza: pozytywna; 55 Acetylometylokarbinol: wytwarzany; Cytrynian — agar: niewielki wzrost; Substancja organiczna, bedaca zródlem azotu: niezbedna dla wzrostu; Weglowodan: kwas, lecz bez gazu, z glukozy, fruktozy, 80 galaktozy, mannozy, laktozy, maltozy, trechalozy, sorbitu, gliceryny 3 skrobi, glikogenu; Wplyw temparatury na wzrost: rosnie do temperatury okolo 50 °C, temperatura optymalna 30—35 °C; Pochodzenie: wydzielony z gleby. 65 Bacillus sp. YT 1003 (FERM nr 2838).5 Precik o wymiarach: 1—1,6x2—7 u. zwykle w postaci krótszego lub dluzszego lancucha, nieruchliwy, Gram-do- datni; Pozywka bulionowa: wzrost dobry, osad; Nachylona powierzchnia pozywki agarowej: wzrost dobry, rozciagniety; kremowo bialy; Glukoza — asparagina na agarze: niewielki wzrost; .Mleko: peptonizacja bezkoagulacji; Zelatyna: powolne rozpuszczanie; Wytwarzanie amoniaku: pozytywne; Redukowanie azotanu do azotynu: pozytywne; Kataliza: pozytywna; Acetylometylokarbinol: wytwarzany; Cytrynian: wykorzystywany jako zródlo wegla; Weglowodan: wykorzystywany bez tworzenia gazu, glu¬ koza, fruktoza, galaktoza, mannoza, L-arabinoza, D-ksy- loza, sacharoza, laktoza, maltoza, trehaloza, rafinoza, ma¬ nnit, sorbit, gliceryna, inulina; Wplyw temperatury na wzrost: temperatura optymalna dla wzrostu 30—36°C, temperatura maksymalna 45°C; Pochodzenie: wydzielony z ziemi.Bakterie, stosowane w sposobie wedlug wynalazku, hoduje sie w srodowisku stosowanym zwykle do hodowli drobnoustrojów i zawierajacym substancje, bedace zró¬ dlem wegla i azotu, wytwarzaja niezmiennie p-amylaze i a-l,6-glukozydaze.Jako przyklady substancji, bedacych zródlem wegla, mozna wymienic: maltoze, skrobie, skrobie czesciowo zhydrolizowana, taka jak dekstryna oraz inne rodzaje skrobi.. Jako przyklady substancji, bedacych zródlem azotu, moga sluzyc: pepton, kazeina, ekstrakt z miesa, ekstrakt z drozdzy, roztwór zmacerowanej kukurydzy, soja i placek soiowy. W razie potrzeby zródla azotu mozna uzupelnic solami nieorganicznymi, takimi jak fosforan magnezu, fosforan baru i fosforan wapnia, i wlaczyc wraz z substan¬ cjami, bedacymi nieorganicznymi zródlami azotu, do sro¬ dowiska.W przypadku uzycia roztworu zmacerowanej kukurydzy, jako surowca dla srodowiska, korzystnie jest najpierw doprowadzic pH roztworu do wartosci od 6 do 9, tj. do wartosci przy której nastepuje wytracenie osadu, zawieraja¬ cego substancje inhibitujaca wytwarzanie p-amylazy, a nastepnie, jeszcze przed uzyciem roztworu jako srodowiska, usunac wytracony osad.Z tabeli l wynika jasno, ze ilosc wytworzonej P-amylazy jest 10-krotnje wieksza w przypadku, gdy przeprowadzono operacje usuwania osadu, niz w przypadku, gdy jej nie przeprowadzono. Widac-równiez, ze wplyw operacji usu- Tabela 1 1 Wartosc pH, do której doprowadza sie roztwór zmacerowanej kukurydzy Bez zmian ' 5,1 ±0,1 6,0±0,1 7,1 ±0,1 8,1 ±0,1 . 9,1 ±0,1 . ,0±0,1 Ilosc wytwarzanej P-amylazy (jednostki) ml bulionu 40 121 420 516 525 460 352 Ilosc wytwarzanej a-l,6-gli- kozydazy (jednostki) ml bulionu ,4 40,6 39,1 41,3 ,9 ,1 ,0 758 6 wania osadu na ilosc Wytwarzanej a-1,6-glikozydazy jest bardzo niewielki.W celu uzyskania jak najwyzszych wydajnosci w procesie wytwarzania dwóch enzymów — przeprowadzono szcze- gólowe badania warunków prowadzenia hodowli i stwier¬ dzono, ze dodanie do srodowiska jonów manganowych wyraznie zwieksza ilosc wytworzonej a-1,6-glikozydazy.Z drugiej strony, obecnosc jonów manganowych wywiera dzialanie raczej inhibitujace wytwarzanie p-amylazy. Jed- io nakze przez odpowiednie dobranie momentu dodawania i ilosci dodawanych do srodowiska jonów manganowych mozna hodowle poprowadzic w taki sposób, by uzyskac pozadane stezenie zarówno^ P-amylazy, jak i a-l,6~gliko- zydazy., Jako sole manganowe mozna stosowac rózne zwiazki manganu, takie jak siarczan manganu, chlorek manganu, fosforan manganu i octan manganu. Sole te dodaje sie zwykle do srodowiska w ilosci od 1 x 10-8 do lx 10-2 mola, korzystnie w ilosci od 1 x 10"6 do 1 x 10"4 mola.W przypadku, gdy hodowle prowadzi sie w srodowisku, zawierajacym siarczan manganu w ilosci, na przyklad lxl0-5 mola, ilosc wytworzonej a-1,6-glikozydazy bedzie 3—6 razy wieksza, niz w przypadku hodowli w srodowisku bez siarczanu manganu. W przypadku wytwarzania dwóch enzymów w hodowli, prowadzonej w srodowisku, zawiera¬ jacym cytrynian i/lub winian, uzyskuje sie wieksze ilosci zarówno P-amylazy, jak i a-l,6-glikozydazy. Cytrynian lub winian dodaje sie zwykle do srodowiska w ilosci od 0,01 do 1%, a korzystnie od 0,05 do 0,2%, w stosunku do srodowiska W przypadku, gdy hodowle prowadzi sie w srodowisku, zawierajacym cytrynian sodu lub winian sodu w ilosci np. 0,1%, liczac w stosunku do srodowiska, iloscwytworzo¬ nej P-amylazy jest 1,5—2 razy wieksza, a a-1,6-glikozydazy okolo 1,3—1,5 razy Wieksza, niz w przypadku hodowli w srodowisku bez dodatku powyzszych substancji.Jak stwierdzono, ilosc wytworzonej a-l,6-glikozydazy wzrasta znacznie w przypadku, gdy hodowle prowadzi sie w srodowisku, zawierajacym nasienie rzepaku, placek 40 z nasienia rzepaku lub ekstrakt (tj. substancje wyekstra¬ howana z nasienia rzepaku na drodze ogrzewania w wodzie lub w cieczy alkalicznej o wartosci pH = 9—10). W przy¬ padku, gdy srodowisko zawiera np. 4% placka z nasienia rzepaku, ilosc wytworzonej a-1,6-glikozydazy jest 2—3 45 krotnie wieksza od ilosci, uzyskanej w przypadku hodowli w srodowisku bez takiego placka.Hodowle bakrterii prowadzi sie w warunkach napowiet¬ rzania w temperaturze 20—40°C i w ciagu 24^-72 godzin.W czasie hodowli wartosc pH srodowiska zmienia sie w za- 50 kresie od 5,5 do 9,5. Pozadane jest jednak utrzymywanie w ciagu calej hodowli wartosci pH w zakresie 6—8.Zarówno P-amylaza, jak i a-l,6-glikozydaza wytwa¬ rzane sa poza komórkami. Tak wytworzone enzymy tnozna wydzielac ze srodowiska poprzez odsaczenie bulionu w celu 55 usuniecia komórek drobnoustroju, nastepnie zatezenie przesaczu — i ponowne zatezenie — przez dodanie, np. rozpuszczalnika organicznego, takiego jak aceton, etanol, metanol lub izopropanol, lub czynnika stracajacego, ta¬ kiego jak siarczan amonu, w celu wytracenia osadu. W przy- 60 padku, ^y osad enzymu straca sie przy uzyciu siarczanu amonu; mozna przy okolo 70—75% nasyceniu siarczanem amonu uzyskac, od 60 do 100% P-amylazy i a-l,6-glikozy- dazy, zmieszanych w postaci osadu.Poniewaz jeden lub oba enzymy adsorbowane sa sku- 65 tecznie przez skrobie, wegiel aktywny, rózne rodzaje ziemi96 75* 7 okrzemkowej, takie jak celit, Hydro-Supereel lub perlit, rózne rodzaje gliny, takie jak bentonit, glina kwasna Cacid clay), ziemia fulerska (Fullernarde), kaolin, talk lub fosfo¬ ran wapnia, mozna je odzyskiwac przy uzyciu takiego adsorbenta. I tak P-amylaza adsorbowana jest skutecznie na skrobi, zwlaszcza na skrobi, poddanej wczesniej obróbce w temperaturze 40—-65 °C. Na skrobi kukurydzanej pod¬ danej wczesniej obróbce w temperaturze 40—60 °C i do¬ danej do bulionu z hodowli adsorbuje sie od 3000 do 8000 jednostek P-amylazy na l g skrobi, jak podano w tabeli 2.Skuteczna adsorpcja enzymu umozliwia równiez skrobia zelatynizowana.Tabela 2 Temperatura obróbki skrobi (°C) 40 50 55 60 55 80 skrobia nieobro¬ biona Czas (min) !0 skrobia zelatyni¬ zowana Aktywnosc zaadsorbowanej P-amylazy (jednostki/g skrobi) 3010 5930 6890 7650 , 8130 7890 1020 Zaadsorbowana P-amylaze mozna wymyc roztworem, zawierajacym od 1 do 10%, korzystnie od 5 do 10%, malto¬ zy lub roztworu, zawierajacego rozpuszczalna skrobie, dekstryne lub maltoze, Na weglu aktywnym adsorbuje sie wystarczajaco dobrze oba enzymy: P-amylaza i a-l,6rgliko- zydaza. Zaadsorbowane enzymy wykazuja silne dzialanie enzymatyczne, moga wiec byc uzywane w tej postaci (zaadsorbowyne na weglu). 3-amylaza adsorbowana jest na weglu aktywnym w ilosci 8000—12000 jednostek/l g wegla aktywnego, a a-l ,6-glikozydaza w ilosci 500—1000 jednostek/l g wegla aktywnego. Zaadsorbowana p-amylaza zachowuje 90% swojej zwyklej aktywnosci, a a-l,6^gliko- zydaza 100% (posiada taka sama aktywnosc, jak w stanie niezwiazanym).Ponadto, a-l,6-glikozydaza adsorbowana jest dostatecz¬ nie dobrze (500 do 800 jednostek na 1 g) na ziemi okrzemko¬ wej, takiej jak celit, perlit itp., tzn. na substancji krzemowej lub na glinie, takiej jak bentonit, glina kwasna (acid clay), lub kaolinit, tzn. skladajacej sie glównie z dwutlenku krzemie i tlenku glinowego. Zaadsorbowany enzym mozna calkowicie wymyc 5—10% wodnym roztworem chlorku sodowego. Nawet w stanie zaadsorbowanym enzym ten posiada aktywnosc enzymatyczna, stanowiaca okolo 50— 70% jego aktywnosci w stanie wolnym.Ponizej podane sa wlasnosci enzymatyczne p-amylazy i a-l,6~glukozydazy, wytworzonej przez bakterie sposobem wedlugwynalazku. • p-amylaza, r— dzialanie: enzym wytwarza maltoze ze skrobi, amylozy, amylopektyny, glikogenu, dekstryny itp.; :—. wlasnosci, wykazywane w stosunku do substratu: sfppjen zhydrolizowania do maltozy wynosi dla amylozy 8 okolo 100%, a dla skrobi prawie 60%. Enzym nie hydroli- zuje wiazania a-l,6-glikoZydowego, znajdujacego sie w amylopektynie, glikogenie, dekstranie, pullulanie itp.; — wartosc pH dzialania enzymu: 3 do 10 (patrz fig/l); —optymalna wartosc pH okolo 7 (patrz fig. 1); — temperatura dzialania enzymu i do okolo 65 °C (patrz fig. 2.); — temperatura optymalna: okolo 50 °C (patrzfig. 2); — dezaktywacja: aktywnosc enzymu spada o okolo 20% podczas przebywania w ciagu 10 minut w temperaturze 55 °C. Calkowita utrata aktywnosci nastepuje po 10 minu¬ tach przebywania enzymu w temperaturze 70 °C (patrz fig. 4); — odpornosc na zmiane wartosci pH: enzym jest nieodporny na spadek wartosci pH ponizej 5, a odporny w granicach od pH 6 do 10 (patrz fig. 3); — inhibitowanie: inhibitorem enzymu jest benzoesan p- chlororteciowy oraz, w niewielkim stopniu, jednojodo- octan. Aktywnosc enzymu, inhibitowana przez benzoesan p-chlororteciowy, odzyskuje sie po dodaniu cysteiny.Ponadto enzym jest silnie inhibitowany przez jony Cu++, Hg+ + i Ag+, oraz przez jon Fe++; — sposób oczyszczania: enzym oczyszcza sie przez stracanie, przy 30—50% nasyceniu siarczanem amonu, z bulionu z hodowli, a nastepnie dalsze oczyszczane metoda chromatograficzna przy uzyciu kolumny wypelnionej Sephade^em G-100; — pomiar aktywnosci enzymu: odpowiednia ilosc roztworu enzymu dodaje sie do 2 ml 0,1 m roztworu buforu fosforanowego o wartosci pH = 7,0, zawierajacego 2% rozpuszczalnej skrobi, calosc dopelnia woda destylo-- wana do objetosci 4 ml i umieszcza w cieplarce w tempera¬ turze 40°C. Ilosc enzymu;, która po jednej godzinie reakcji w opisanych wyzej warunkach wytwarza 1 g maltozy, nazywa sie „1 jednostka". a-1,6-glikozydaza. —dzialanie: enzym hydrolizuje wiazanie a-l,6-gliko- zydowe amylopektyny, zhydrolizowane do pewnego stopnia dzialaniem P-amylazy; 40 —wlasnosci, wykazywane w stosunku do substratu: enzym wytwarza maltotrioze na drodze hydrolizy a-1,6- glikozydowego wiazania pullulanu. Poddany reakcji z amy- lopektyna nie wykazuje zadnego wzrostu intensywnosci zabarwienia w próbie jodowej (iodine staining power). 45 Mozna stad wywnioskowac, ze enzym ten wykazuje swoja aktywnosc wobec amylopektyny, zhydrolizowanej uprzednio przez P-amylaze w takim stopniu, ze nastapHo skrócenie bocznego lancucha. Jednakze, enzym ten nie wykazuje dzialania wobec izomaltozy i pannozy; 50 — pH dzialania enzymu: od 5 do 10 (patrz fig. 1); — optymalna wartosc pH: od 6 do 6,5 (patrz fig. 1); — temperatura dzialania enzymu: do okolo 65°C (patrz fig, 2); — optymalna temperatura: okolo 50°C (patrz fig. 2); 55 — dezaktywacja: aktywnosc enzymu spada o okolo 50% podczas przebywania w ciagu 10 minut w temperaturze 50°C. Calkowita utrata aktywnosci nastepuje po 10 minu¬ tach przebywania w temperaturze 65°C (patrz fig. 4).Jednakze, silne dzialania ochronne wykazuja jony Ca+H~ 60 i Sr++. W obecnosci jonu Ca++ utrata 90% aktywnosci enzymu nastepuje dopiero po 30 minutach przebywania w temperaturze 50°C. W obecnosci 5 x 10"3 mola CaCl2 trudno zauwazyc zmniejszanie sie aktywnosci; — odpornoscia zmiane pH: enzym wykazuje odpornosc 65 na zmiane pH w granicach od 6 do 9. Brak odpornosci96 758 9 pojawia sie przy nizszych wartosciach pH (przy wyzszych) powyzej 9 (enzym jest stosunkowo trwaly); — inhibitowanie: dzialanie enzymu inhibitowane jest lekko przez benzoesan p-chlororteciowy, a slabo przez jecjnojodooctan. Silne dzialanie inhibitujace wykazuja jony Hg++, Ag++oraz Fe++ ; — sposób oczyszczania: enzym oczyszcza sie przez stracenie, wywolane 60—70% nasyceniem siarczanem amonu, z bulionu z hodowli, a nastepnie dalsze oczysz¬ czanie metoda chromatograficzna przy uzyciu kolumny, wypelnionej Sephadex*em G-100; — pomiar aktywnosci enzymatycznej: aktywnosc enzymu mierzy sie w reakcji z pullulanem jako substratem, prowa¬ dzonej w podanych nizej warunkach. Enzym ten wytwarza z pullulanu maltotrioze.Odpowiednia ilosc enzymu dodaje sie do 0,5 ml 0,1 m roztworu buforu fosforanowego o wartosci pH = 7,9, zawierajacego 1% pullulanu. Uzyskana mieszanine do¬ pelnia sie woda destylowana do objetosci 1,0 ml i przecho¬ wuje w ciagu 1 godziny w temperaturze 40°C. Ilosc enzymu która po jednej godzinie reakcji w opisanych wyzej warun¬ kach wytwarza 1 mg maltotriozy definiuje sie jako „1 jed¬ nostke".Z podanych wyzej wlasnosci fizycznych i chemicznych, a zwlaszcza z wlasnosci, wykazywanych wobec substratu, wynika, ze enzym ten mozna za nowa a-l,6-glikozydaze, wytworzona przez rodzaj Baccillus, i ze nie moze byc on uirieszczany pod którymkolwiek ze znanych wczesniej enzymów: izoamylaza i pullulanaza. Moze on byc ozna¬ czany jako a-l,6-glikozydaza dekstryny.Znane dotychczas w biochemii a-l,6-glikozydazy (izo¬ amylaza i pullulanaza), wytwarzane przez drobnoustroje, hydrolizuja wiazanie a-l,6-glikozydowe w lancuchu bocz¬ nym amylopektyny, tworzac podobna do amylazy substan¬ cje, która w próbie jodowej daje niebieskie zabarwienie (Biochemische Zeitschrift, vol. 334, str. 79-95 (1961); Biochem. J. vol. 108, str. 33-40 (1?68), Biochimica et Biophisica Acta, vol. 212, str. 458—469 (1970), J. Ferman- tation of Technology, vol. 49, str. 552—559 (1971) itd.).Tak wiec, enzymy tego typu poddaje/sie oznaczeniu, polegajacemu na pomiarze wzrostu intensywnosci zabar¬ wienia w próbie jodowej enzymu, dzialajacego na skrobie lub amylopektyne. a-l,6-glikozydaza, wytwarzana przez bakterie sposobem wedlug wynalazku, z trudem pozwala zauwazyc wzrost intensywnosci zabarwienia w próbie jodowej w przypadku poddawania enzymu reakcji ze skrobia lub amylopektyna.Fakt ten wskazuje, ze omawiany enzym dziala wylacznie na skrobie lub amylopektync3 w których boczny lancuch zostal w pewnym zakresie zhydrolizowany dzialaniem np. (3-amylazy tak, iz pozostaly w bocznym lancuchu fragment glikozy stal sie wskutek tego krótszy.I wlasnie ta, wykazy¬ wana wobec substratu wlasnosc enzymu, stanowi jedna z glównych cech charakterystycznych, odrózniajacych omawiany enzym od a-l,6-glikozydazy, wytwarzanej przez typowe, znane drobnoustroje. a-l,6-glikozydaza, wytwarzana sposobem wedlug wyna¬ lazku przez gatunek, nalezacy do rodzaju Bacillus, posiada bardzo korzystne wlasnosci enzymatyczne, dzieki którym wspólpracuje z równolegle wytwarzana p-amylaza w kie¬ runku bezposredniego zhydrolizowania skrobi do maltozy.Zgodnie z zaleznosciami pokazanymi na fig. 1—4, oba te enzymy sa bardzo do siebie podobne nie tylko z uwagi na podobne pH dzialania i optymalna wartosc pH dzialania, lecz równiez ze wzgleduna temperature dzialania i opty- malna temperature dzialania. Ponadto* wykazuja one znaczne podobienstwo pod wzgledem odpornosci na zmiany pH i temperatury.Odnosnie hydrolizy, prowadzonej przez oba enzymy, 3-amylaza dziala w ten sposób) ze rozrywa znajdujaca sie w skrobi na niezredukowanych koncach lancucha amylopektyne aa fragmenty maltozpwe, po czym, w mo¬ mencie kiedy rozerwanie zostalo dokonane (w ceju udo¬ stepnienia wiazania, znajdujacego sie w miejscu odgalc- io zienia), a-l,6-glikozydaza, wytworzona sposobem wedlug wynalazku, rozpoczyna dzialanie w kierunku rozerwania wiazania a-1,6-glikozydazowego, znajdujacego sie w miej¬ scu odgalezienia. Tak wiec, oba enzymy, P-amylaza i a-1,6- glikozydaza,kolejno hydrolizuja amylopektyne do maltozy z kolejnych, niezredukowanych konców lancucha.Jak mozna oczekiwac na podstawie powyzszego mechaniz¬ mu dzialania, uzycie enzymu, wytworzonego sposobem wedlugwynalazku w powiazaniu z p-amylaza, daje w wyniku wyzsza wydajnosc maltozy (równa w przyblizeniu wydajnosc ci teoretycznej (90^96%), niz przy uzyciu jakiejkolwiek innej, znanej dotychczas a-l*6-glikozydazy.W przypadku uzycia znanego juz enzymu, takiego jak pullulanaza lub izoamylaza, uzyty enzym dziala na skro¬ bie w kierunku oderwania amylopektyny od skrobi i utwo- rzenia podobnej do amylazy substancji o prostym lancuchu, natomiast 3-amylaza dziala w kierunku utworzenia maltozy.Jak stwierdzono, taki dwustopniowy proces pozwala na wytwarzaniae maltozy z dobrymi wydajnosciami.W przypadku zastosowania w powyzszym procesie enzy- mów, wytwarzanych sposobem wedlug wynalazku, istnieja powazne trudnosci z uzyskaniem wyzszych wydajnosci maltozy, takich jak osiagane sposobem wedlug wynalazku.Jak juz stwierdzono, 0-amylaza i a-l,6-glikozydaza dzialaja na przemian w kierunku uzyskania maltozy, co pozwala na wytwarzanie maltozy ze znacznie wiekszymi wydajnos- ciami. f W przeciwienstwie do izoamylaz, uzyskiwanych z droz¬ dzy przy pomocy drobnoustroju rodzaju Pseudomonas, enzymy, wytwarzane sposobem wedlug wynalazku, hydro- 40 lizuja a-l,6-glikózydazowe wiazanie w pullulanie i osta¬ tecznie calkowicie hydrolizuja pullulan do maltotriozy.Mozna je wiec oczywiscie stosowac do wytwarzania malto¬ triozy z pullulanu. W produkcie koncowym n;e stwierdza sie obecnosci glukozy, maltozy lub oligosacharydu. Powyzszy 45 sposób hydrolizowania uwaza sie za reakcje typu okso, co wynika z obserwacji, ze tworzenie maltotriozy nastepuje juz w poczatkowym etapie reakcji. Nie stwierdza sie, by reakcja, wywolana przez enzymy, wytwarzane sposobem wedlug wynalazku, byla reakcja odwracalna. 50 W przeciwienstwie do tego, w reakcji hydrolizy pullu- ~ lanu, prowadzonej przez pullulanaze, wytworzona przez drobnoustroje rodzaju Aerobacter i rodzaju. Streptococcus, obserwuje sie tworzenie zarówno maltotriozy, jak i glukozy, maltozy, mahotetrozy oraz wyzszych oligosacharydów 65 (Biochemische Zeitschrift, vol. 334, str. 79^95 (1961)), a ponadto, obserwuje sie reakcje odwrotna, dajaca w wyniku zwiazek G6, utworzony z maltotriozy i zwiazek G4, utwo¬ rzony z maltozy (Nature, vol. 210, str. 200 (1966), Archi- ves of Biochemistry and Biophys, vol. 137, str. 483^493 60 (1970), Biochemical J., vol. 108, str. 33—40 (1968) itp.), co wskazuje, ze nie dochodzi do calkowitej hydrolizy pullulanu do maltotriozy.Jak juz wspomniano, enzymy, wytwarzane sposobem wedlug wynalazku, wykazuja silne dzialanie w kierunku 6fi hydrolizowania krótkiego, bocznego lancucha pozostalosci96 758 11 glikozy oraz nie sa zdolne do hydrolizowania wiazania a-l,6-glikozydazowego w izomaltozie, pannozie i izomalto- triozie. Obserwacje te dowodza, ze enzymy te rózniasie od óligo-l,6-glukozydazy pochodzenia zwierzecego (J. Biol.. Oran. vol. 215, str. 723—736 (1955)). a-l,6-glikozydaza, wytwarzana sposobem wedlug wyna¬ lazku, rózni sie znacznie od opisywanych dotad izomylazy i pullulanazy wlasnosciami, wykazywanymi wobec substratu, które sa jedna z najwazniejszych .wlasnosci kazdego enzy¬ mu; Udowodniono, ze a-l,6-glikozydaza, wytwarzana sposobem wedlug wynalazku, nie pozwala na odwracalnosc reakcji, czym rózni sie znacznie od pullulanazy i izomylazy.Ponadto, omawiany enzym moze byc zabezpieczany przed dezaktywacja pod wplywem temperatury przez dodanie jonów Ca++, co nie ma miejsca w przypadku pullanazy lub izomylazy. Z drugiej strony, fenomen odwracalnej dezaktywacji pod wplywem temperatury, która jest obser¬ wowana w przypadku pullulanazy, wytwarzanej przez rodzaj Aerobacter rodzaj Streptococcus, nie wystepuje w przypadku enzymu, wytwarzanego sposobem wedlug wynalazku. Fenomen ten wskazuje, ze enzym ten rózni sie od pullulanazy, wytwarzanej przez rodzaj Aerobacter i rodzaj Streptococcus, pod wzgledem wlasnosci bialkowych.Optymalna wartosc dzialania pH enzymu, wytwarzanego sposobem wedlug wynalazku, znajduje sie w poblizu wartosci pH '= 7 (jak pokazano na fig. 1)., a optymalna temperatura dzialania wynosi okolo 50 °C (jak pokazano na fig. 2). Z punktu widzenia warunków pH i temperatury enzym ten rózni sie od pullulanazy, wytwarzanej przez rodzaj Aerobacter (optymalna wartosc pH dzialania 5,0., optymalna temperatura dzialania 47,5 °C; Biochemische Zeitschrift, vol. 334, str. 79—95 (1961) i od pullulanazy, wytwarzanej przez rodzaj Streptococcus (optymalna warr tosc pH dzialania 5,4—5,8, optymalna temperatura dziala¬ nia 30°C; Biochemical J., vol. 108, str. 33—40 (1968)), a takze od izomylazy, uzyskanej z drozdzy (optymalna wartosc pH dzialania 6,0—6,2, optymalna temperatura dzialania 20 °G, Journal of Agricultural Chemical Society, vol. 23, str. 115 i 120 (1949)) i od izomylazy, wytwarzanej przez Pseudomonas (optymalna wartosc pH dzialania 3—4, optymalna temperatura dzialania 52 °C; Biochimica et Biophysica Acta, vol. 212, str. 458—469 (1970)).Przesacz, uzyskany z bulionu z hodowli bakterii sposobem wedlug wynalazku, koncentrat przesaczu, osad odzyskany z rozpuszczalnika organicznego oraz osad odzyskany z siar¬ czanu amonu — wszystkie te frakcje zawieraja p-amylaze i a-l,6-glikozydazei moga byc uzyte jako preparaty enzymu do wytwarzania maltozy ze skrobi itp.Z preparatu takiego mozna wydzielic niezaleznie P-amy¬ laze i a-l,6-glikozydaze przez nasycenie roztworu siarcza¬ nem amonu do stezenia 30—50%, w celu wytracenia P-amylazy, a nastepnie nasycenie roztworu tym samym zwiazkiem do stezenia 60—70%, w celu wytracenia dru¬ giego enzymu. Rozdzielone enzymy: P-amylaze i a7l,6-gli- kozydaze mozna dokladnie oczyscic metoda chromatografi¬ czna w kolumnie, wypelnionej Sephadex'em.Jak wynika ? powyzszego opisu, oba enzymy: P-amylaza i hodowli jednego szczepu i moga byc stosowane, w przypad¬ ku reakcji ze skrobia lub jej pochodnymi, do bezposredniego wytwarzania maltozy. Tak wiec, sposób wedlug wynalazku wprowadza nie tylko uproszczenie calej oper.acjs lecz rów¬ niez zwiekszenie wydajnosci w porównaniu z dotychcza¬ sowymi sposobarai lub ze sposobem, polegajacym na jedno¬ czesnym dodawaniu do mieszaniny reakcyjnej dwóch en- 12 zymów, Wytworzonych oddzielnie przez dwa rózne szczepy.Ponadto, wzajemny stosunek ilosciowy obu wytwarza¬ nych w hodowli enzymów moze byc latwo doprowadzany do odpowiedniej wartosci przez dodanie jonów mangano- wych. Mozliwe jest równiez zwiekszenie aktywnosci obu enzymów przez uzycie róznego rodzaju dodatków.Ponadto, obydwa wytwarzane w hodowli enzymy moga byc latwo wydzielane z bulionu i wspólnie oczyszczane lub moga byc latwo od siebie oddzielane. ...';.Jak wynika z powyzszego, sposób wedlug wynalazku ma szerokie zastosowanie przemyslowe.Ponizej opisano korzystne wykonanie sposobu wedlug wynalazku. Nizej podane przyklady nie ograniczaja za¬ kresu wynalazku.Przyklad I. W kolbie Erlenmeyera o pojemnosci 200 ml umieszcza sie 80 ml pozywki, zawierajacej 1% peptonu, 0,3% K2HP04,0,1% MgS04 7H20 i l % maltozy.Pozywke te sterylizuje sie w zwykly sposób w ciagu 15 minut w temperaturze 121 QC_ po czym zaszczepia na niej Bacillus cereus var. mycoides (FERM No 2391) i hoduje je w ciagu dwóch dni w temperaturze 30 °C. Po rozwinieciu sie kultury bulion odwirowuje sie w celu usuniecia komórek. Nastepnie w uzyskanej warstwie wierzchniej oznacza sieilosc wytworzo¬ nych enzymów. W przeliczeniu na 1 ml srodowiska uzys- kuje sie 628 jednostek p-amylazy i 18 jednostek a-l,6-gli- kozydazy.Bulion z hodowli umieszcza sie w tubie celofanowej i poddaje dializie wobec wody destylowanej w celu usuniecia resztek cukru.Czesci wspomnianych zdializowanych enzymów (zawie¬ rajacej 204 jednosteki P-amylazy i 3,6 jednostki a-l,6-gli- kozydazy) pozwala sie dzialac na 0,4% roztworze amy- lazy, pochodzacej z ziemniaków, amylopektyny, skrobi ziemniaczanej, glikogenu oraz dekstryny przy wartosci pH = 7 i w temperaturze 40°C (calkowita objetosc srodo¬ wiska reakcjiwynosi4,3 ml).Co pewien czas z roztworu reakcyjnego pobiera sie próbki o okreslonej objetosci i oznacza metoda Somogyi i Nelsona cukier. Sklad cukru z mieszaniny reakcyjnej 40 bada sie metoda chromatografii bibulowej (4 czesci pi¬ rydyny, 6 czesci butanolu i 3 czesci wody). W ten sposób mozna stwierdzic, ze w przypadku gdy jako substancje wyjsciowa stosuje sie amyloze, amylopektyne lub skrobie ziemniaczana, to wytworzonym cukrem jest prawie wylacz- 45 nie maltoza (90—96%), a w roztworze poreakcyjnym stwierdza sie obecnosc cukru o wspólczynniku refrakcji, odpowiadajacym . maltotriozie, wystepujacej w ilosciach 4—8%. Analiza glukostatowa wykonana przez Worthing- ton Biochemical Corporation* USA, wykazala, ze glukoza 50 powstaje w niezwykle malej ilosci (mniejszej niz 0,1%).• Otrzymane wyniki przedstawione sa na fig. 5. Z tego wy¬ kresu wynika, ze po 8 godzinach reakcji amyloza ziemnia¬ czana, amylopektyna, dekstryna i skrobia ziemniaczana, badane w opisany sposób, ulegaja calkowitej hydrolizie 5S do maltozy. Równiez glikogen ulega po 23 godzinach re¬ akcji hydrolizie do maltozy sw canajmniej 90%.Przykladu. W kolbie o pojemnosci 1 1 umieszcza sie 250 ml pozywki, zawierajacej 1% polipeptonu, Q,3% K2HP04, 0,1% MgS04 ¦ 7H20 oraz 1% dekstryny i calosc 6Q poddaje sterylizacji w zwykly sposób. Nastepnie zaszczepia sie pozywke drobnoustrojem Bacillus cereus var. mycoides i kulture poddaje wstrzasaniu w temperaturze 30 °C. Po 48 godzinach hodowania bulion z hodowli odwirowuje sie w celu usuniecia komórek i w oddzielonej warstwie wierzT 65 chniej bada aktywnosc enzymatyczna. Przeprowadzona96 758 13 - 14 Jak wynika z tabeli, dodatek siarczanu magnezu powoduje okolo trzykrotny wzrost ilosci otrzymanej a-l,6-glikozydazy.Przyklad IV. W kolbach Erlenmeyera o pojemnosci 200 ml umieszcza sie po 50 ml srodowiska, zawierajacego 1 % polipeptonu, 1% dekstryny, 0,3% K2HP03 i 0,1% MgSO; • • 7H20 i sterylizuje w zwykly sposób. Nastepnie zaszcze¬ pia sie je Bacillus cereus var. mycoides i wytrzasa kulture w temperaturze 30 °C. W 24-ej godzinie prowadzenia ho¬ dowli, kiedy wytworzona p-amylaza wystepuje w ilosci 237 jednostek na 1 ml., dodaje sie do mieszaniny sterylnej siarczanu manganu w ilosci 1 • 10"4 mola.Proces hodowania zatrzymuje sie po 42 godzinach.Bulion odwirowuje sie w celu oddzielenia komórek, a w otrzymanej warstwie wierzchniej oznacza sie aktywnosc p-amylazy i a-l,6-glikozydazy. Wyniki oznaczen podane sa wtabeli 4.Jak widac z tej tablicy, sól manganowa, dodana do srodo¬ wiska po uplywie polowy czasu prowadzenia hodowli, powoduje okolo 1,7 krotny wzrost ilosci wytworzonej a-l,6-glikozydazy i nie przeszkadza w równoczesnym powstawaniu P-amylazy. Jesli kulture hoduje sie na po¬ zywce, zawierajacej od poczatku sól manganu, wtedy ilosc otrzomanej a-l,6-glikozydazy wzrasta prawie dwukrotnie w porównaniu z iloscia, otrzymana pod nieobecnosc soli manganu, a ilosc wytworzonej P-amylazy spada do zaledwie 28,8 jedn/ml.Przyklad V. Przygotowuje sie pozywke, zawiera¬ jaca 2% polipeptonu, 0,3% K2HP04, 0,1% MgS04 • 7H20 i 5 • 10 ~4M CaCl2 oraz pozywki o tym skladzie, lecz z do¬ datkiem cytrynianu sodu w ilosci odpowiedniej do uzys¬ kania stezenia 0,5% i 1%, oraz z dodatkiem winianu sodo¬ wego w ilosci odpowiedniej do uzyskania stezenia 0,25% i 0,5%. Pozywki te umieszcza sie w ilosciach po 50 ml w kol¬ bach Erlenmeyera o pojemnosci 200 ml i sterylizuje w zwy¬ kly sposób. Nastepnie zaszczepia sie Bacillus cereus var mycoides i kulture poddaje wytrzasaniu w temperaturze °C w ciagu 42 godzin. Po zakonczeniu procesu hodo_ wania bulion kultury odwirowuje sie. W warstwie wierzch _ Tabela 4 MnS04 0 1 • 10-4 MnS04 dodane w 24 godz. prowadzenia hodowli 1 • 10"4 MnS04 dodane na poczatku prowadzenia hodowli Czas prowadzenia hodowli (godz) 42 24 42 42 Gestosc optyczna spowodowana przez micelle (600 m) 6,7 6,5 6,6 ,9 Aktywnosc wytworzonej P-amylazy jedn/ml bulionu 377,6 236,8 244,5 28,8 Aktywnosc I wytworzonej a-l,6-glikozy- dazy jedn/ml bulionu 13,0 12,5 22,2 ,0 Tabela 5 Rodzaj dodanego kwasu organicznego 1 cytrynian sodu cytrynian sodu winian sodu winian sodu kontrola (bez dodatku kwasu) Ilosc dodanego kwasu (% pozywki) 0,5 1,0 0,25 0,5 Gestosc optyczna spowodowana przez micelle (660 m) 4,9 4,8 4,7 4,9 4,9 Aktywnosc wytworzonej P-amylazy jedn/ml bulionu 1035,0 1080,0 1119,0 1063,0 588,0 Aktywnosc wytworzonej i a-l,6-gliko- zydazy jedn/ml bulionu • 20,7 17,1 . . 18,4 16,2 13,0 | próba wykazala, ze w przeliczeniu na 1 ml bulionu powstalo 420 jednostek P-amylazy i 7,8 jednostek a-l,6-glikozydazy.Porcje 200 ml wspomnianego bulionu wysyca sie siarczanem amonu do stezenia 75% i odwirowuje wytracony osad, który po rozpuszczeniu w niewielkiej ilosci wody poddaje 5 sie próbie na aktywnosc enzymatyczna. W ten sposób stwierdza sie obecnosc 83 000 jednostek P-amylazy i 952 jednostek a-l,6-glikozydazy.Przyklad III. Przygotowuje sie srodowisko, zawie¬ rajace 1% polipeptonu, 1% dekstryny, 0,3% K2HP04 10 i 0,1% MgS04 • 7H20 oraz srodowiska, otrzymane przez dodanie do opisanego wyzej srodowiska róznych ilosci (od 1.10"7 do 1.10-3 mola — jak podano w tabeli 3) siar¬ czanu magnezu. Srodowiska te umieszcza sie w ilosci po 50 ml w kolbach Erlenmeyera o pojemnosci 200 ml i steryli- 15 zuje w zwykly sposób. Nastepnie, zaszczepia sie je Bacillus cereus var. mycoides i hoduje na powietrzu w tempera¬ turze 30°C w ciagu 42 godzin.Po wyhodowaniu kulture odwirowuje sie i w wydzielonej warstwie wierzchniej oznacza utworzona P-amylaze i a-l,6- 20 glikozydaze. Otrzymaneta droga wynikipodane sa w tabeli 3.Tabela 3 Ilosc dodanego siarczanu magnezu (mole) 0 (nie do¬ dano) 1 • 10-7 1 • 10-6 • 10-6 1 • 10"5 ' 1- • 10-4 1 • lO"3 | Gestosc optyczna spowodo¬ wana przez micelle {660 m) 6,7 6,5 ,8 ,6 ,9 4,9 ,8 | Aktywnosc wytworzonej a-l,6-gli- kozydazy jedn/ml bulionu 11,3 14,2 18,6 23,4 ,0 28,3 ,2 Aktywnosc wytworzonej *P-amylazy jedn/ml bulionu 699 678 166 155 132 152 153 |96 758 niej przesaczu oznacza sie aktywnosci p-amylazy i a-l,6- glikozydazy. Otrzymane tym sposobem wyniki podane sa w tabeli 5.Z tabeli wyraznie wynika, ze dodanie kwasu organicz¬ nego powoduje znaczny wzrost ilosci wytworzonej p-amyla- zy i to-l,6-glikozydazy.Przyklad VI. W dwóch kadziach fermentacyjnych, zaopatrzonych w mieszadlo, o pojemnosci 10 1 umieszcza sie po 5 1 pozywki, zawierajacej 4% kazeiny z mleka, 0,3% K2HP04, 0,1% MgS04.-7H20, 5 • 10"4M Cad2 i 0,5% rozpuszczalnej skrobi * Do jednej z kadzi dodaje sie placków z nasion rzepaku w ilosci potrzebnej do otrzymania 4% stezenia w stosunku do pozywki. Nastepnie pozywki w obu naczyniach sterylizuje sie w ciagu 30 minut w tempe¬ raturze 121 °C, zaszczepia sie je Bacillus cereus var. myco- ides (100 ml) i przeprowadza hodowle z przewietrzaniem w temperaturze 30 °C przy przeplywie powietrza z szyb¬ koscia 5 l/min i mieszaniu z predkoscia 250 obr/min. Po 24 godzinach hodowania kultury, bulion odwirowuje sie, a w otrzymanej warstwie wierzchniej oznacza aktywnosc enzymatyczna. Otrzymane ta droga wyniki podane sa w tabeli 6.Tabela 6 % pozywki 4,0 Odnosnik (bez dodat¬ ku) -i Aktywnosc wytworzonej P-amylazy jedn/ml bulionu 2 470,0 2 600,0 Aktywnosc wytworzonej a-1,6-glikozydazy jedn/ml bulionu 106,0 44,4 Jak wynika z tabeli, w kulturze hodowanej na pozywce, zawierajacej placki z nasion rzepaku, ilosc wytworzonej a-l,6-glikozydazy jest okolo 2,4 raza wieksza niz w kulturze, wyhodowanej na pozywce pozbawionej placków z nasion rzepaku.Bulion, otrzymany na pozywce, zawierajacej placki rze¬ pakowe, odwirowuje sie celem oddzielenia komórek. W celu wytracenia enzymów miesza sie 2 litry otrzymanej warstwy wierzchniej z 4 litrami zimnego etanolu. Otrzymany osad odsacza sie i suszy. Uzyskuje sie enzym w postaci proszku, zawierajacego w 1 gramie 115 900 jednostek p-amylazy i 4 640 jednostek a-l,6-glikozydazy; stopien regeneracji P-amylazy wynosi 75%, a a-l,6-glikozydazy 70%.Przyklad VII. Wyciag namokowy kukurydzy (za¬ wierajacy okolo 4% substancji stalych) z soda kaustyczna doprowadza sie do wartosci pH równego 7,5. Otrzymana mieszanine odwirowuje sie celem oddzielenia osadu (la¬ cznie z substancja spowalniajaca proces powstawania p-amylazy), wytraconego w wyniku zmiany wartosci pH.Warstwe wierzchnia po dodaniu do niej 0,5% skrobi u- mieszcza sie, w kolbach Erlenmeyera o pojemnosci 200 ml w ilosci po 50 ml w kazdej i sterylizuje w zwykly sposób.Nastepnie zaszczepia sie ja kultura Bacillus cereus var. mycoides i hoduje w atmosferze tlenu w ciagu 42 godzin w temperaturze 30 °C. Po zakonczeniu procesu hodowania bulion odwirowuje sie celem usuniecia komórek, a w war¬ stwie wierzchniej oznacza wytworzona P-amylaze i a-l,6- glikozydaze. Uzyskane wyniki podane sa w tabeli 7.Jak wynika z zamieszczonej tabeli, ilosc p-amylazy, wytworzonej w kulturze, wyhodowanej na wyciagu namo- 16 Tabela 7 Kontrola # Po usunieciu sub¬ stancji spowalniaja¬ cej proces powstawania | p-amylazy Aktywnosc wytworzonej p-amylazy jedn/ml bulion 52,1 592,7 Aktywnosc wytworzonej a-l,6-glikozy- dazy jedn/ml bulion ,3 41,1 | kowym kukurydzy, pozbawionym osadu, powstalego w wyniku nastawiania pH, wzrosla w sposób znaczny.Przyklad VIII. Mieszanine 10 g rozpuszczalnej skrobi z 1 1 roztworu enzymowego, uzyskanego z hodowli Bacillus cereus var. mycoides i "zawierajacego 572 jednostki P-amylazy i 43,5 jednostek a-l,6-glikozydazy, miesza sie z 40 g wegla aktywnego (Norit sprzedawany przez Wako Pure Chemicals) i wstrzasa w celu zaadsorbowania enzymów na weglu aktywnym. Nastepnie zaadsorbowane enzymy odzyskuje sie na drodze filtracji.Oznacza sie aktywnosci enzymów, znajdujacych sie w przesaczu i aktywnosc enzymów, zaadsorbowanych na weglu aktywnym. Uzyskane wyniki podane sa w tabeli 8. 1 (A) Ilosci dodanych enzymów^ (B) Ilosci enzymów niezaadsorbo- wanych (C) Aktywnosc za¬ adsorbowanego enzymu Wydajnosc zaad- sorbowanego enzy¬ mu (C) A-B • 100) | p-amylaza 572 000 jedno¬ stek 197 000 jednos¬ tek 338 000 jednos¬ tek 90,1% | a-1,6- glikozydaza 43 500 jedno¬ stek 99 700 jednos¬ tek 33 800 jednos¬ tek 100% | 50 Jak widac z powyzszej tabeli, P-amylaze odzyskuje sie z wydajnoscia 90,1 %j a a-l,6-glikozydaze z wydajnoscia zblizona do 100%, oba te enzymy w postaci enzymu, zaadsorbowanego na weglu. Jednakze, w przypadku gdy do roztworu dodaje sie skrobie wydajnosc P-amylazy jako 55 zaadsorbowanego enzymu wynosi okolo 12,4%.Czesc zaadsorbowanych enzymów (3 000 jednostek P-amylazy i 310 jednostek a-l,6-glikozydazy) dodaje sie do 10 g rozpuszczalnej skrobi i uzyskana mieszanine do¬ pelnia woda do objetosci 100 ml. Nastepnie pH roztworu 60 doprowadza sie do wartosci 6—6,5, a temperature do 50°C i utrzymuje w tej temperaturze dla przeprowadzenia reakcji. Pozakonczeniu reakcji roztwór bada sie na zawartosc poszczególnych cukrów. W wyniku analizy stwierdza sie, ze w znajdujacych sie w roztworze cukrach maltoza stanowi 65 90,5%, maltotrioza — 7,5%, a oligosacharoza — 2,0%.96 758 17 Przyklad IX. Do 100 ml wody dodaje sie 50 g skrobi kukurydzianej i 10 g celitu, i calosc wstrzasa sie i ogrzewa w ciagu 30 minut w temperaturze 60°C. Do uzys¬ kanego roztworu dodaje sie 300 ml przesaczu z hodowli Bacillus cereus var. mycoides (pH = 7,1, 403 jednostek P-amylazy/ml i . 28,0 jednostek a-l,6-glikozydazy/ml) i calosc wstrzasa w celu zaadsorbowania enzymów. Naste¬ pnie zaadsorbowane enzymy odsacza sie i bada ich aktyw¬ nosc. Uzyskane wyniki podane sa w tabeli 9. Nastepnie mieszanine skrobi i celitu z zaadsorbowanymi na nich enzymami miesza sie z 10% wodnym roztworem dekstryny, zawierajacym 10% chlorku sodu, w celu wymycia enzymów z adsorbentów. W wyniku odzyskuje sie P-amylaze z wydaj¬ noscia 100%, a a-l,6-glikozydaze z wydajnoscia 85%.Tabela 9 (A) Aktywnosc poczatkowa 1 (B) Aktywnosc koncowa 1 (C) Aktywnosc enzymu zwiazanego Wydajnosc enzymu, zwiazanego | (C/A-B100) p-amylaza 121 000 jednostek Ul 000 jednostek 95 300 jednostek 86,2% a-1,6- glikozydaza 8 400 jednostek 1860 jednostek 6 220 jednostek 95,1% Przyklad X. Porcje po 100 ml przesaczu z ho¬ dowli Bacillus cereus var. mycoides, zawierajace w 1 ml 758 jednostek P-amylazy i 37,1 jednostek a-l,6-glikozydazy, miesza sie z 5-gramowymi porcjami kwasnej gliny (acid clay), bentonitu, talku, celitu i perlitu w celu zaadsorbo¬ wania a-l,6-glikozydazy.Zaadsorbowany enzym odsacza sie lub odwirowuje, przemywa dokladnie woda, po czym bada jego aktywnosc.Uzyskane wyniki przedstawione sa w tabeli 10.Tabela 10 Kwasna glina (acid clay) Bentonit Talk Celit Perlit Ilosc zaadsorbowanej a-1,6-glikozydazy jednostki/gram 612 648 416 492 532 Ilosc zaadsorbowanej p-amylazy jednostki/gram 790 694 200 0 0. 18 Jak wynika z powyzszych danych, a-l,6-glikozydaza adsorbowana jest w sposób zadowalajacy przez wszystkie badane adsorbenty, a ilosc zaadsorbowanego enzymu miesci sie w zakresie od 400 do 700 jednostek/gram.Do 100 g (masa suchej substancji) rozpuszczalnej skrobi, zawierajacej 1,5% DE dodaje sie 30 000 jednostek P-amylazy, 3 000 jednostek a-l,6-glikozydazy i 0,73% CaCl2 • 2H20 i mieszanine rozciencza do objetosci 500 ml.Nastepnie, pH mieszaniny doprowadza sie do wartosci io 6—6,5, ogrzewa do temperatury 50 °C i utrzymuje w tej temperaturze w ciagu 100 godzin w celu przeprowadzenia reakcji. Po zakonczeniu reakcji oznacza sie w mieszaninie sklad cukrów metoda chromatografii bibulowej. Wynik oznaczenia: 90,6% maltozy, 7,1% maltotriozy, 0,0% glikozy i 2,3% innych sacharydów. PL