NO180642B - Alkalipullulanase og renisolert kultur av Bacillus sp. mikroorganisme som produserer denne - Google Patents
Alkalipullulanase og renisolert kultur av Bacillus sp. mikroorganisme som produserer denne Download PDFInfo
- Publication number
- NO180642B NO180642B NO903801A NO903801A NO180642B NO 180642 B NO180642 B NO 180642B NO 903801 A NO903801 A NO 903801A NO 903801 A NO903801 A NO 903801A NO 180642 B NO180642 B NO 180642B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- range
- medium
- alkaline
- optimum
- pullulanase
- Prior art date
Links
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims description 21
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 title claims description 12
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 claims description 63
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 58
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 19
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 239000004373 Pullulan Substances 0.000 claims description 14
- 229920001218 Pullulan Polymers 0.000 claims description 14
- 235000019423 pullulan Nutrition 0.000 claims description 14
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 claims description 12
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 12
- 239000008107 starch Substances 0.000 claims description 12
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 claims description 12
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 10
- IDQFMTPFABLANH-UHFFFAOYSA-L disodium 2-aminoacetic acid chloride hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+].[Na+].[Cl-].NCC(O)=O IDQFMTPFABLANH-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 9
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims description 8
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 claims description 7
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 7
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 7
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 claims description 7
- 229920000945 Amylopectin Polymers 0.000 claims description 6
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 claims description 6
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 claims description 6
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims description 6
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 6
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 6
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 5
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 claims description 5
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 5
- 108091005658 Basic proteases Proteins 0.000 claims description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229910021536 Zeolite Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 4
- HNPSIPDUKPIQMN-UHFFFAOYSA-N dioxosilane;oxo(oxoalumanyloxy)alumane Chemical compound O=[Si]=O.O=[Al]O[Al]=O HNPSIPDUKPIQMN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000000344 soap Substances 0.000 claims description 4
- 239000010457 zeolite Substances 0.000 claims description 4
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 claims description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 claims description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 73
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 39
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 39
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 39
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 20
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 18
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 16
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 16
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 14
- -1 polyoxyethylene Polymers 0.000 description 13
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 10
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 10
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 description 10
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Inorganic materials [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 8
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 8
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 7
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 7
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 7
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 6
- 229910021653 sulphate ion Inorganic materials 0.000 description 6
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 5
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 5
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 5
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 5
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 108010023063 Bacto-peptone Proteins 0.000 description 4
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 4
- JXLHNMVSKXFWAO-UHFFFAOYSA-N azane;7-fluoro-2,1,3-benzoxadiazole-4-sulfonic acid Chemical compound N.OS(=O)(=O)C1=CC=C(F)C2=NON=C12 JXLHNMVSKXFWAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 4
- 238000004851 dishwashing Methods 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 4
- VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N sodium nitrate Chemical compound [Na+].[O-][N+]([O-])=O VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 4
- LWFUFLREGJMOIZ-UHFFFAOYSA-N 3,5-dinitrosalicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC([N+]([O-])=O)=CC([N+]([O-])=O)=C1O LWFUFLREGJMOIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DBTMGCOVALSLOR-UHFFFAOYSA-N 32-alpha-galactosyl-3-alpha-galactosyl-galactose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(OC2C(C(CO)OC(O)C2O)O)OC(CO)C1O DBTMGCOVALSLOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 3
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 3
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 3
- RXVWSYJTUUKTEA-UHFFFAOYSA-N D-maltotriose Natural products OC1C(O)C(OC(C(O)CO)C(O)C(O)C=O)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 RXVWSYJTUUKTEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 3
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 3
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 3
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N aldehydo-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 3
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 3
- 150000004996 alkyl benzenes Chemical class 0.000 description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 3
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 3
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 3
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 3
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 3
- FYGDTMLNYKFZSV-UHFFFAOYSA-N mannotriose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(CO)OC(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)C(O)C1O FYGDTMLNYKFZSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 3
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 3
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 3
- 239000004711 α-olefin Substances 0.000 description 3
- FYGDTMLNYKFZSV-BYLHFPJWSA-N β-1,4-galactotrioside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@H](CO)O[C@@H](O[C@@H]2[C@@H](O[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O FYGDTMLNYKFZSV-BYLHFPJWSA-N 0.000 description 3
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N (+)-Galactose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N 0.000 description 2
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-SOOFDHNKSA-N D-ribopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 2
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N Indole Chemical compound C1=CC=C2NC=CC2=C1 SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 description 2
- 108010056079 Subtilisins Proteins 0.000 description 2
- 102000005158 Subtilisins Human genes 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 2
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 2
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 238000004042 decolorization Methods 0.000 description 2
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 2
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 2
- 108010003855 mesentericopeptidase Proteins 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 231100000989 no adverse effect Toxicity 0.000 description 2
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 2
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004317 sodium nitrate Substances 0.000 description 2
- 235000010344 sodium nitrate Nutrition 0.000 description 2
- LPXPTNMVRIOKMN-UHFFFAOYSA-M sodium nitrite Chemical compound [Na+].[O-]N=O LPXPTNMVRIOKMN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 229960002920 sorbitol Drugs 0.000 description 2
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZPLCXHWYPWVJDL-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-hydroxyphenyl)methyl]-1,3-oxazolidin-2-one Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1CC1NC(=O)OC1 ZPLCXHWYPWVJDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001134780 Bacillus acidopullulyticus Species 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 241000207199 Citrus Species 0.000 description 1
- 102000000634 Cytochrome c oxidase subunit IV Human genes 0.000 description 1
- 108050008072 Cytochrome c oxidase subunit IV Proteins 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-VRPWFDPXSA-N D-Fructose Natural products OC[C@H]1OC(O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-VRPWFDPXSA-N 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen sulfide Chemical compound S RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- 241000193385 Geobacillus stearothermophilus Species 0.000 description 1
- 108010068370 Glutens Proteins 0.000 description 1
- 238000003794 Gram staining Methods 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- 241000588915 Klebsiella aerogenes Species 0.000 description 1
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M Nitrite anion Chemical compound [O-]N=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NGFMICBWJRZIBI-JZRPKSSGSA-N Salicin Natural products O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1)c1c(CO)cccc1 NGFMICBWJRZIBI-JZRPKSSGSA-N 0.000 description 1
- 241001134658 Streptococcus mitis Species 0.000 description 1
- FTNIPWXXIGNQQF-UHFFFAOYSA-N UNPD130147 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(CO)OC(OC2C(OC(OC3C(OC(OC4C(OC(O)C(O)C4O)CO)C(O)C3O)CO)C(O)C2O)CO)C(O)C1O FTNIPWXXIGNQQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LUEWUZLMQUOBSB-UHFFFAOYSA-N UNPD55895 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(CO)OC(OC2C(OC(OC3C(OC(O)C(O)C3O)CO)C(O)C2O)CO)C(O)C1O LUEWUZLMQUOBSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 1
- OCIBBXPLUVYKCH-QXVNYKTNSA-N alpha-maltohexaose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@H](O[C@@H]3[C@H](O[C@H](O[C@@H]4[C@H](O[C@H](O[C@@H]5[C@H](O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]5O)CO)[C@H](O)[C@H]4O)CO)[C@H](O)[C@H]3O)CO)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O OCIBBXPLUVYKCH-QXVNYKTNSA-N 0.000 description 1
- NGFMICBWJRZIBI-UHFFFAOYSA-N alpha-salicin Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1=CC=CC=C1CO NGFMICBWJRZIBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 235000012501 ammonium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 235000020971 citrus fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 1
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 1
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 210000003495 flagella Anatomy 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 235000021312 gluten Nutrition 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N heavy water Substances [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 1
- PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N indole Natural products CC1=CC=CC2=C1C=CN2 PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N indolenine Natural products C1=CC=C2CC=NC2=C1 RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009655 industrial fermentation Methods 0.000 description 1
- 229910001410 inorganic ion Inorganic materials 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 1
- 238000010412 laundry washing Methods 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- DJMVHSOAUQHPSN-UHFFFAOYSA-N malto-hexaose Natural products OC1C(O)C(OC(C(O)CO)C(O)C(O)C=O)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC2C(C(O)C(OC3C(C(O)C(OC4C(C(O)C(O)C(CO)O4)O)C(CO)O3)O)C(CO)O2)O)C(CO)O1 DJMVHSOAUQHPSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FJCUPROCOFFUSR-UHFFFAOYSA-N malto-pentaose Natural products OC1C(O)C(OC(C(O)CO)C(O)C(O)C=O)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC2C(C(O)C(OC3C(C(O)C(O)C(CO)O3)O)C(CO)O2)O)C(CO)O1 FJCUPROCOFFUSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UYQJCPNSAVWAFU-UHFFFAOYSA-N malto-tetraose Natural products OC1C(O)C(OC(C(O)CO)C(O)C(O)C=O)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)C(CO)O1 UYQJCPNSAVWAFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FJCUPROCOFFUSR-GMMZZHHDSA-N maltopentaose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O[C@H]([C@H](O)CO)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O[C@@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](CO)O1 FJCUPROCOFFUSR-GMMZZHHDSA-N 0.000 description 1
- LUEWUZLMQUOBSB-OUBHKODOSA-N maltotetraose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@H](CO)O[C@@H](O[C@@H]2[C@@H](O[C@@H](O[C@@H]3[C@@H](O[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]3O)CO)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O LUEWUZLMQUOBSB-OUBHKODOSA-N 0.000 description 1
- WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L manganese(2+);methyl n-[[2-(methoxycarbonylcarbamothioylamino)phenyl]carbamothioyl]carbamate;n-[2-(sulfidocarbothioylamino)ethyl]carbamodithioate Chemical compound [Mn+2].[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S.COC(=O)NC(=S)NC1=CC=CC=C1NC(=S)NC(=O)OC WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 239000011785 micronutrient Substances 0.000 description 1
- 235000013369 micronutrients Nutrition 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- NGFMICBWJRZIBI-UJPOAAIJSA-N salicin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC=CC=C1CO NGFMICBWJRZIBI-UJPOAAIJSA-N 0.000 description 1
- 229940120668 salicin Drugs 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000010288 sodium nitrite Nutrition 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- DAJSVUQLFFJUSX-UHFFFAOYSA-M sodium;dodecane-1-sulfonate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCS([O-])(=O)=O DAJSVUQLFFJUSX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000004753 textile Substances 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2451—Glucanases acting on alpha-1,6-glucosidic bonds
- C12N9/2457—Pullulanase (3.2.1.41)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01041—Pullulanase (3.2.1.41)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/832—Bacillus
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
Description
Denne oppfinnelse vedrører en ny alkalisk pullulanase og en renisolert kultur av Bacillus sp. mikroorganisme for å produsere den alkaliske pullulanasen.
Beskrivelse av bakgrunnskunnskapen:
Pullulanase er et enzym som hydrolyserer bare a-l,6-glykosid-binding i pullulan og tilslutt produserer maltotriose. Pullulanase ble først oppdaget fra en stamme som tilhører Aerobacter aerogenes av Bender og Wallenfels i 1961 [Biochem. Z., 334, 79, (1961)].
Nylig er forskjellige mikroorganismer som er i stand til å produsere pullulanase, blitt rapportert. Disse mikroorganismer er f.eks. Bacillus sp. [J. Jpn. Soc. Starch Sei., 30, 200, (1983)]; Bacillus acidopullulyticus [Agric. Biol. Cheirt. , 52, 2293, (1984)]; Bacillus stearothermophiluss [Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol., 17, 24, (1983)]; Streptococcus mitis [Biochem.J., 108, 33, (1968)]; og Lactobacillus [Denpun Kagaku, 28, 72, (1981)].
Det er kjent at pullulanaser ikke bare har den ovenfor nevnte aktivitet mot pullulan, men også hydrolyseaktiviteter mot a-l,6-glykosidbinding i stivelse, glykogen, amylopektin såvel som mot forgrenete oligosakkarider idet den produserer delvis dekomponering av disse forbindelser. På grunn av denne egenskap blir pullulanase kalt et "deforgreningsenzym".
Videre er det blitt funnet at pullulanase i kombinasjon med både endo-type amylase og ekso-type amylase kan gi glykose eller maltooligo-sakkarider slik som maltose, maltotriose, malto-tetraose, maltopentaose eller maltoheksaose fra stivelse i høyt utbytte. Denne egenskap har i den senere tid tiltrukket seg betraktlig oppmerksomhet.
Det er en rapport om at pullulanase som har disse egenskaper, ble anvendt i kombinasjon med amylase som tilsetningsstoff til oppvaskmidler eller klesvaskmidler, og derved merkbart forbedrer vaskemiddelets renseevne mot stivelsesjordarter (Japansk patent-søknad nr. 285424/1988). Videre anvendelse av pullulanase er forventet på disse områder.
Imidlertid er nesten alle naturlig forekommende pullulanaser klassifisert i de nøytrale eller sure pullulanaser som viser maksimal og stabil enzymatisk aktivitet under nøytrale eller sure betingelser. Det er få alkaliske eller alkali-resistente pullulanaser som har bedre stabilitet og viser den maksimale aktivitet i et alkalisk pH område hvorved klesvask eller oppvask utføres. En alkalisk pullulanase betegner her en pullulanase som har sin optimale pH i et alkalisk område. En alkaliresistent pullulanase betegner en pullulanase som har sin optimale pH i et nøytralt til surt område, men har en tilstrekkelig grad av aktiviteter i et alkalisk område da den har sin optimale pH mens den bevarer god stabilitet. Ordet "nøytral" betegner her et pH-område på 6-8, og ordet "alkalisk" betegner et pH område på ikke mindre enn 8.
Ingen fremgangsmåte for å produsere alkaliske pullulanaser eller alkali-resistente pullulanaser er kjent til nå, med unntak av en rapport fra Horikoshi et al., som beskriver en fremgangsmåte for produksjon av alkalisk pullulanase ved å dyrke en alkalofil mikroorganisme som tilhører slekten Bacillus [Biochem. Biophys. Acta, 397, 188, (1975), og Japansk patent-publikasjon nr. 27796/1978)].
Pullulanasen til Horikoshi et al. er et enzym som har sin optimale pH i et alkalisk område og har en videre substratspesifisitet enn konvensjonelt kjente pullulanaser. Imidlertid, siden dens optimale pH er i et svakt alkalisk område på 8-9, kan den ikke anvendes i vaskemiddel-blandinger. I tillegg har fremgangsmåten til Horikoshi et al. den ulempe at den har lav produk-tivitet av enzym. Denne type fremgangsmåte er derfor uegnet til industriell fermenteringsproduksjon. Av disse grunner har utviklingen av pullulanaser med en optimal pH i høyere alkalisk område vært ønsket.
Oppvask eller klesvask blir vanligvis utført i et vidt pH-område fra nøytralt til sterkt alkalisk område. Det er derfor verdt å oppdage og oppnå naturlige mikroorganismer som produserer pullulanaser med en optimal pH i et sterkt alkalisk område og som er egnet til oppvask- og klesvaskmidler.
I lys av denne situasjon har de foreliggende oppfinnere utført utstrakte studier for å oppnå naturlige mikroorganismer som er i stand til å produsere alkalisk pullulanase og som et resultat funnet at en ny alkalisk pullulanase som har en optimal pH i et sterkt alkalisk område på fra 9,5 til 11, kan oppnås ved å dyrke en spesifikk mikroorganisme som tilhører slekten Bacillus. Dette funn har ført til fullførelsen av den foreliggende oppfinnelse.
Sammendra<g> av oppfinnelsen
Et mål for den foreliggende oppfinnelse er å gi en ny renset alkalisk pullulanase Z-l som har følgende enzymologiske egenskaper:
(1) Virkning
Hydrolyserer a-l,6-binding i pullulan og gir maltotreose, og hydrolyserer a-l,6-glykosidisk binding i stivelse, amylopektin, glykogen eller deres partielle spaltningsprodukter;
(2) Substratspesifisitet
har hydrolyseaktivitet mot a-l,6-glykosidbinding av sukkere med en høyere polymeriseringsgrad enn maltoses; (3) Virknings-pH- og optimum pH-område
har et aktivt pH-område på 5 - 11 med et optimum pH-område på 9,5 - 11; (4) pH-stabilitet
er stabil i et pH-område på 8 - 10 og beholder relativ aktivitet på 50 % eller mer av aktiviteten ved et optimale pH-område selv i et pH-område på 7 - 10,5 ved behandling ved 4 5°C i 10 minutter; (5) Virketemperatur og optimum-temperatur
er aktiv i et bredt temperaturområde på fra 10 - 60°C med en optimumstemperatur på rundt 50°C; (6) Termisk stabilitet
er meget stabil ved 40°C ved behandling i 10 mM glycin-NaCl-_ NaOH buffer (pH 9,5) i 30 minutter; (7) Molekylvekt
ca. 12 0.000 ± 5.000 målt ved hjelp av elektroforese ved bruk av natriumdodecylsulfat; (8) Virkninger av metallioner
blir negativt påvirket av Hg<2+>, Cd<2+>, Mn<2+>, og Pb<2+->ioner. (9) Virkning av vaskemidler
knapt påvirket av overflateaktive midler så som lineær alkyl-benzensulfonat (LAS), natriumalkylsulfat (AS), natriumpoly-oksyetylenalkylsulfat (ES), natrium-a-olefinsulfonat (AOS), natrium a-sulfonert fettsyreester (a-SFE), natriumalkyl-sulfonat (SAS), natriumdodecylsulfat (SDS), såper og softanol; (10) Virkninger av chelateringsmidler
knapt påvirket av EDTA, EGTA, sitronsyre, og zeolitt; (11) Resistens mot protease
viser sterk bestandighet mot alkaliske proteaser.
Et annet mål for den foreliggende oppfinnelse er å gi en renisolert kultur av Bacillus sp. mikroorganisme som er i stand til å produsere den alkaliske pulllulanase med de ovenfor nevnte egenskaper.
Andre mål, særtrekk og fordeler ved oppfinnelsen vil heretter lettere åpenbart fra den følgende beskrivelse.
Kort beskrivelse av tegningene
Fig. 1 er en tegning som viser forholdet mellom relativ aktivitet og reaksjons-pH i den alkaliske pullulanase i henhold til denne oppfinnelse. Fig. 2 er en tegning som viser forholdet mellom pH og rest-aktivitet i den alkaliske pullulanase i henhold til denne oppfinnelse. Fig. 3 er en tegning som viser forholdet mellom reaksjons-temperatur (pH 9,5) og relativ aktivitet i den alkaliske pullulanase i henhold til den foreliggende oppfinnelse. Fig. 4 er en tegning som viser forholdet mellom reaksjons-temperatur (pH 9,5) og restaktivitet i den alkaliske pullulanase i henhold til den foreliggende oppfinnelse. Fig. 5 er en tegning som viser forholdet mellom relativ aktivitet og reaksjons-pH i den alkaliske pullulanase Z-l i henhold til denne oppfinnelsen. Fig. 6 er en tegning som viser forholdet mellom pH og rest-aktivitet i den alkaliske pullulanase Z-l i henhold til denne oppfinnelsen. Fig. 7 er en tegning som viser forholdet mellom reaksjons-temperatur (pH 9,5) og relativ aktivitet i den alkaliske pullulanase Z-l i henhold til den foreliggende oppfinnelse. Fig. 8 er en tegning som viser forholdet mellom reaksjons-temperatur (pH 9,5) og restaktivitet i den alkaliske pullulanase Z-l i henhold til den foreliggende oppfinnelse. Fig. 9 er en tegning som viser resultatene fra elektroforese av den alkaliske pullulanase Z-l i henhold til den foreliggende oppfinnelse. Fig. 10 er en tegning som viser resultatene fra SDS elektroforese av den alkaliske pullulanase Z-l i henhold til den foreliggende oppfinnelse.
Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen
og foretrukne utførelsesformer
Mikroorganismer i den foreliggende oppfinnelse tilhører slekten Bacillus og er i stand til å produsere pullulanase med en optimal pH på 9,5 - 11, typisk er en alkalofil mikroorganisme, Bacillus sp. KSM-AP187 6, som ble oppdaget av oppfinnerne i jord-artene i Yokohama-shi, Kanagawa-gen, Japan.
Mykologiske egenskaper ved Bacillus sp. KSM-AP1876, som er mikroorganismen i henhold til denne oppfinnelse, blir nå diskutert. De følgende dyrkingsmedier av 21 sorter (medium 1 til 21) er anvendt til klassifiseringen av stamme. De inneholder alle 0,5 vekt% sterilisert natriumkarbonat (Na2C03) .
Blandinger av de anvendte dyrkingsmedier (vekt%)
Medium 1: Næringsstoffbuljong, 0,8; agarpulver
(fremstilt av Wako Pure Chemical Co.), 1,5
Medium 2: Næringsstoffbuljong, 0,8
Medium 3: Næringsstoffbuljong, 0,8; gelatin 20,0; agarpulver
(fremstilt av Wako Pure Chemical), 1,5
Medium 4: Bacto lakmus melk, 10,5
Medium 5: Næringsstoffbuljong, 0,8; KN03, 0,1
Medium 6: Bacto pepton, 0,7; NaCl, 0,5; glykose, 0,5
Medium 7: SIM agar medium (fremstilt av Eiken Kagaku),
en mengde angitt
Medium 8: TSI agar (fremstilt av Eiken Kagaku),
en mengde angitt
Medium 9: gjær-ekstrakt, 0,5; Bacto pepton, 1,5; K2HP04, 0,1;
MgS04'7H20, 0,02; løselig stivelse, 2,0; agarpulver (fremstilt av Wako Pure Chemical), 1,5
Medium 10: Koser's medium (fremstilt av Eiken Kagaku)
en mengde angitt
Medium 11: Christensen<1>s medium (fremstilt av Eiken Kagaku)
en mengde angitt
Medium 12: Mediet som inkluderer de følgende blandinger (1) og (2) hvor til det er tilsatt nitrogenkilder som
består av natriumnitrat, natriumnitritt, ammonium-klorid og ammoniumfosfat i en mengde på hhv. 0,25%, 0,2025 %, 0,158 % og 0,195 % av vekt i mediet. (1) gjær-ekstrakt, 0,05; Na2S04, 0,1;
KH2P04, 0,1; glukose, 1,0
(2) gjærekstrakt, 0,5; Na2S04, 0,1;
KH2PH4, 0,1; glukose, 1,0;
CaCl2<->2H20, 0,05; NmS04"4-6H20, 0,01;
FeS04<->7H20, 0,001; MgS04"7H20, 0,02
Medium 13: King A medium "Eiken" (fremstilt av Eiken Kagaku),
en mengde angitt
Medium 14: King B medium "Eiken" (fremstilt av Eiken Kagaku),
en mengde angitt
Medium 15: Urea medium "Eiken" (fremstilt av Eiken Kagaku)
en mengde angitt
Medium 16: Cytokrom-oksidase testfilterpapir (fremstilt av
Nissiu Pharmaceutical Co., Ltd.)
Medium 17: 3 % vandig hydrogenperoksyd
Medium 18: Bacto pepton, 0,5; gjær-ekstrakt, 0,5;
K2HP04, 0,1; glukose, 1,0; MgS04-7H2<0,> 0,02 Medium 19: Bacto pepton, 2,7; NaCl, 5,5; K2HP04, 0,3;
glukose, 0,5; bromthymol blått, 0,06; agarpulver (fremstilt av Wako Pure Chemical), 1,5
Medium 20: (NH4)2HP04, 0,1; KC1, 0,02;
MgS04'7H2O, 0,02, gjær-ekstrakt, 0,05; sukker, 1,0 Medium 21: Kasein, 0,5; gjær-ekstrakt, 0,5; glukose, 1,0;
K2HP04, 0,1; MgS04'7H20, 0,02; agarpulver (fremstilt av Wake Pure Chemical), 1,5
Mykologiske egenskaper
(1) Observasjon under mikroskop
Celler er staver med en størrelse på 1,0 - 2,2 jum x 2,2 - 4,4 jxm roed en elliptisk endospore (0,8 - 1,0 jim x 1,0 - 1,8 /im) som dannes i subterminalene. De har flageller og er bevegelige, Gram-farging er positiv. Syrefasthet: negativ
(2) Vekst i forskjellige kulturmedier
(a) Næringsstoffbuljong-agarplate (medium 1)
Vekst av celler er god. Kolonien har sirkulær form, og overflaten er glatt, og dens perifere ende er glatt eller bølgete. Fargen på kolonien er melkeaktig, semi-transparent og glinsende.
(b) Næringsstoffbuljong-agar skråkultur (medium 1)
Celler kan vokse. Kolonien har form som et tekstildekke, og fargen på kolonien er glinsende melkeaktig og semi-transparent.
(c) Væske næringsstoffbuljong (medium 2)
Celler kan vokse
(d) Stikk-dyrking i næringsstoffbuljong-gelatin
(Medium 3).
Vekst av celler er god. Væskedannelse av gelatin er observert.
(e) Lakmus melkemedium (medium 4)
Melkekoagulering og peptonisering er ikke observert. Litmus avfarging er ubestemmelig fordi medium er et alkalisk medium.
(3) Fysiologiske egenskaper
(a) Nitratreduksjon og denitrifisering (medium 5)
Nitratreduksjon: positiv
Denitrifisering: negativ
(b) MR test (medium 6)
Ubestemmelig fordi mediet er et alkalisk medium.
(c) V-P test (medium 6
negativ
(d) Produksjon av indole (medium 7)
negativ
(e) Produksjon av hydrogensulfid (medium 8)
negativ
(f) Hydrolyse av stivelse (medium 9)
positiv
(g) Anvendelse av sitronsyre (medium 10, medium 11)
negativ i Koser's medium (medium 10) og ubestemmelig i Christensen<1>s medium (medium 11)
(h) Anvendelse av uorganiske nitrogenkilder
(medium 12)
nitrat, nitritt og ammoniumsalter blir alle anvendt.
(i) Avfarging (medium 13, medium 14)
negativ
(j) Urease (medium 15)
negativ
(k) Oksidase (medium 16)
ubestemmelig
(1) Katalase (medium 17)
positiv
(m) Vekstområde (medium 18)
Veksttemperatur: 20 - 40°C,
Optimal veksttemperatur: 30 - 35°C
Vekst pH-område: 7 - 10,5
Optimal pH: 10
(n) Oppførsel på oksygen
aerob
(o) O-F test (medium 19)
ubestemmelig fordi mediet er et alkalisk medium.
Celler kan vokse bare under aerobe betingelser.
(p) Sukker-anvendelse (medium 20)
De følgende sukkere anvendes: L-arabinose, D-xylose, D-glukose, D-mannose, D-fruktose, D-galaktose, maltose, sukrose, laktose, trehalose, D-sorbitol, D-mannitol, glycerol, stivelse, salicin, D-ribose og dekstrin.
(g) Vekst i et medium som inneholder natriumsalt
(modifisering av medium 1)
Celler kan vokse i nærvær av 5 % natriumklorid men kan ikke vokse i nærvær av 7 % natriumklorid.
(r) Hydrolyse av kasein (medium 21)
positiv.
Basert på de ovenfor nevnte mykologiske egenskaper ble stammene i henhold til den foreliggende oppfinnelse undersøkt idet de refererer til Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, Vol. 8 og "The Genus Bacillus" Ruth E. Gordon, Agriculture Handbook nr. 427, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Washington D.C., (1973), og bestemt som en mikroorganisme som tilhører slekten Bacillus, ascospore staver. Stammen vokser ikke i et nøytralt område, men kan for det meste vokse i et sterkt alkalisk område. Fra dette faktum blir stammen i henhold til den foreliggende oppfinnelse klassifisert som en alkalofil mikroorganisme som det ble demonstrert av Horikoshi og Akiba, "Alkalophilic Microorganism", Japan Scientific Society Press (Tokyo) 1982. Stammen i henhold til den foreliggende oppfinnelse er adskilt fra en gruppe mikroorganismer som tilhører slekten Bacillus som vokser i et nøytralt område.
Stammen i henhold til den foreliggende oppfinnelse, har forskjellig fra de ovenfor nevnte egenskaper, mykologisk forskjellig egenskaper fra enhver vanlig kjent alkalofil Bacillus. Følgelig ble stammen i henhold til den foreliggende oppfinnelse bestemt som en ny stamme og kalt Bacillus sp. KSM-AP1876, som ble deponert med Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology som FERM P-10887.
Produksjonen av alkalisk pullulanase kan gjøres ved å inokulere mikroorganismene i henhold til den foreliggende oppfinnelse og dyrke mikroorganismene i henhold til konvensjonelle dyrkingsmetoder. Inkludering av en egnet mengde karbon- og nitrogenkilder som mikroorganismen kan anvende i mediet, er ønskelig. Det er ingen spesifikke begrens-ninger når det gjelder karbon- og nitrogenkilder. Satt opp som nitrogenkilder er organiske nitrogenkilder slik som mais gluten-mel, soyabønnemel, maisstøp-væske, kasaminosyre, gjær-ekstrakt, farmamedia, kjøtt-ekstrakt, trypton, soyton, hypro, ajipulver, soyabønnemel, bomullfrømel, kultivator, ajipron, sitrusskall og lignende; og uorganiske nitrogenkilder slik som ammoniumsulfat, ammoniumnitrat, ammoniumfosfat, ammoniumkarbonat, natriumnitrat, ammoniumacetat, og lignende. Gitt som eksempler på karbonkilder er løselig stivelse, uløselig stivelse, amylopektin, glykogen, pullulan og forgrenede oligomerer produsert ved delvis dekomponering av disse, og anvendbare karbonkilder er slike som glukose, maltose, arabinose, xylose, ribose, mannose, fruktose, galaktose, sukrose, laktose, trehalose, mannitol, sorbitol, glycerol, og anvendbare organiske syrer er slik som eddiksyre og lignende. I tillegg til disse karbon- og nitrogenkilder kan uorganiske ioner slik som fosfater, magnesium, kalsium, mangan, sink, kobolt, natrium, kalium og lignende, som påkrevet, andre organiske eller uorganiske mikronæringsstoffer, tilsettes til dyrkingsmediet.
Alkalisk pullulanase kan fremstilles fra dyrkingsbuljongen ved hjelp av konvensjonelle oppsamlings- og rensingsmetoder til-passet til generelle enzymer. Spesifikt blir celler separert fra dyrkingsbuljongen ved hjelp av konvensjonelle faststoff-væske-separasjons-metoder, slik som sentrifugering, filtrering eller lignende, for å oppnå en råenzymvæske. Selvom det er mulig å anvende den således oppnådde råenzymvæske som sådan, kan de også tjene som et renset enzym, som påkrevet, etter separering ved hjelp av separasjonsmetoder, f.eks. utsalting, presipitering, ultra-filtrering o.l., for å oppnå råenzym, og rensing og krystal-liser ing av råenzymet ved hjelp av konvensjonelle metoder. Egnede rensingsmetoder er f.eks. DEAE cellulose (fremstilt av Whatman Co.) adsorpsjon, DEAE cellulose kromatografering, Sephacryl
(fremstilt av Pharmasia Co.) kromatografering, DEAE Toyopeal (fremstilt av Tosoh) kromatografering, og butyl Toyopeal kromatografering.
Enzymologiske egenskaper til det nye enzym, alkalisk pullulanase blir nå diskutert. Enzymatiske aktiviteter ble målt ved å anvende de følgende bufferløsninger (50 mM hver) i henhold til fremgangsmåten forklart nedenfor.
Bufferløsningene:
pH 4 - 6: acetatbuffer
pH 6 - 8: fosfatbuffer
pH 8 - 11: glycin-NaCl-NaOH buffer
pH 11 - 12: KCl-NaOH buffer
Måling av enzymatisk aktivitet:
0,1 ml enzymløsning ble tilsatt til 0,9 ml av hver substrat-løsning fremstilt fra hver bufferløsning som inneholdt pullulan (sluttkonsentrasjon i reaksjonssystemet: 0,2 5 % v/v) og blandingen ble reagert ved 40°C i 30 minutter. Etter reaksjonen ble reduserende sukkere kvantitativt bestemt ved hjelp av 3,5-dinitro-salicylsyre (DNS) prosedyren.
Spesifikt ble 1,0 ml DNS reagens tilsatt til en 1,0 ml reaksjonsblanding, og blandingen ble oppvarmet ved 100°C for å utvikle en farge. Etter avkjøling ble 4,0 ml deionisert vann tilsatt til blandingen. Dette ble underkastet kolorimetrisk kvantitativ analyse ved en bølgelengde på 535 nm. En enhet (1 U) enzymaktivitet ble definert som mengden av enzym som frigjorde 1 jumol reduserende sukker som glukose pr. minutt under standard målebetingelser.
Enzymolo<g>iske egenskaper ved den rå alkaliske pullulanase
(1) Virkning
Hydrolyserer a-l,6-binding i pullulan så det produseres maltotriose, og som vist i tabell 1, hydrolyserer a-l,6-glykosid-binding i stivelse, amylopektin, glykogen eller deres delvise dekomponeringsprodukter.
(2) Virknings-pH og optimum-pH-område
Har et aktivt pH-område på 4 - 14 med et optimum pH-område på 9,5 - 11 og bevarer relativ aktivitet på 50 % eller mer av aktiviteten i det optimale pH-området til og med i et pH område på 8,5 - 11,5.
Pullanase aktiviteter ved forskjellig pH ble målt ved å anvende hvert reaksjonssystem som besto av 0,25 % (v/v) pullulan og en bufferløsning av 10 mM acetat (pH 4-6), fosfat (pH 7-8), glycin-NaCl-NaOH (pH 8,5-10,5), eller KCl-NaOH (pH 11-12). Hver reaksjon ble utført ved 40°C i 30 minutter. Resultatene er vist i fig. 1.
(3) pH-stabilitet
Er stabil i et pH-område på 7 - 10 og bevarer relativ aktivitet på 50 % eller mer av aktiviteten i det optimale pH-området til og med i et pH-område på 6 - 11,5.
Pullulanase aktiviteter ved forskjellige pH ble målt ved å anvende hvert reaksjonssystem som besto av 0,25 % (v/v) pullulan og en bufferløsning av 10 mM acetat (pH 4-6), fosfat (pH 7.8), glycin-NaCl-NaOH (pH 8,5-10,5) eller KCl-NaOH (pH 11-12). Hver reaksjon ble utført ved 45°C i 10 minutter. Resultatene er vist i fig. 2.
(4) Virke-temperatur og optimum-temperatur
Virker i et vidt temperaturområdé på 10 - 60°C med en optimum temperatur på 55°C (se fig. 3).
(5) Termisk stabilitet
Rest-aktiviteter av enzymet, når varmebehandlet ved forskjellige temperaturer i 3 0 minutter i glycin-NaCl-NaOH buffer (pH 9,5), ble målt. Enzymet mistet knapt sin aktivitet ved 45°C, og har rest-aktivitet på omtrent 50 % til og med ved 52°C (se fig. 4).
(6) Molekylvekt
Molekylvekten av enzymet i henhold til den foreliggende oppfinnelse ble målt ved hjelp av en gel-filtreringsmetode ved å anvende Bio-gel A 0,5m. Enzymet har en molekylvekt på omtrent 110.000 ± 10.000.
(7) Virkning av metallioner
Tilsetning av Hg<2+>, Pb<2+>, og Cd<2+> ioner (1 mM hver) gir en negativ virkning og tilsetning av Mn<2+> ion (1 mM) gir en svakt negativ virkning. (8) Virkning av vaskemidler 0,05 vekt% av overflateaktive midler slik som lineær alkyl-benzensulfonat (LAS), natriumalkylsulfat (AS), natrium-polyoksyetylenalkylsulfat (ES), natrium a-olefinsulfonat (AOS), natrium a-sulfonert fettsyreester (a-SFE), natrium-alkylsulfonat (SAS), natriumdodekylsulfonat (SDS), såper og softanol ble testet ved 4 0°C i 15 minutter for å bekrefte at det ikke var noen negativ virkning på enzymatiske aktiviteter.
(9) Virkning av chelateringsmidler
Chelateringsmidler slik som EDTA (10 mM), EGTA (10 mM), sitronsyre (0,05 vekt%) og zeolitt (0,05 vekt%) gir ingen negativ virkning på enzymatiske aktiviteter.
(10) Resistens mot protease
I nærvær av alkalisk protease, f.eks. API-21 (Showa Denko), Maxatase (IBIS) og Sabinase, Alkalase og Esperase (Novo) i en mengde på 0,2 AU/1, ble aktivitetene målt for å bekrefte at enzymene hadde sterk bestandighet mot alle proteaser.
Enzymolo<g>iske egenskaper for renset alkalisk pullulanase Z- l (1) Virkning
Hydrolyserer a-l,6-binding av pullulan så det produseres malto-treose, og hydrolyserer a-l,6-glykosidbinding i stivelse, amylopektin, glykogen, eller deres delvise dekomponeringsprodukter.
(2) Substratspesifisitet
Har hydrolyseaktivitet mot a-l,6-glykosidbinding i sukkere som har en høyere polymeriseringsgrad enn maltoses som vist i tabell 2.
(3) Virknings-pH og optimum-pH-område
Har et aktivt pH-område på 5 - 11 med et optimalt pH-område på 9,5 - 11.
Pullulanase aktiviteter ved forskjellig pH ble målt ved å anvende hvert reaksjonssystem som besto av 0,25 % (v/v) pullulan og en bufferløsning av 10 mM acetat (pH 4-6), fosfat (pH 6-8,5), glycin-NaCl-NaOH (pH 8,5-11), eller KCl-NaOH (pH 11-12). Hver reaksjon ble utført ved 40°C i 30 minutter. Resultatene er vist i fig. 5.
(4) pH-stabilitet
Er stabil i et pH område på 8 - 10 og bevarer relativ aktivitet på 50 % eller mer av aktiviteten i det optimale pH-området til og med i et pH-område på 7 - 10,5.
Pullulanase aktiviteter ved forskjellig pH ble målt ved å anvende hvert reaksjonssystem som besto av 0,25 % (v/v) pullulan og en bufferløsning av 10 mM acetat (pH 4-6), fosfat (pH 6-8,5), glycin-NaCl-NaOH (pH 8,5-11), eller KCl-NaOH (pH 11-12). Hver reaksjon ble utført ved 45°C i 10 minutter. Resultatene er vist i fig. 6.
(5) Virke-temperatur og optimum-temperatur
Er aktiv i et vidt temperaturområde på fra 10 - 60°C med en optimal temperatur på 50°C (se fig. 7).
(6) Termisk stabilitet
Restaktiviteter av enzymet, når varmebehandlet ved forskjellige temperaturer i 30 minutter i glycin-NaCl-NaOH buffer (pH 9,5), ble målt. Enzymet i henhold til denne oppfinnelse mister knapt sin aktivitet ved 40°C, og har en restaktivitet på omtrent 50 % til og med ved 50°C (se fig. 8.).
(7) Molekylvekt
Molekylvekten av enzymet i henhold til den foreliggende oppfinnelse ble målt ved hjelp av SDS-polyakrylamid gel elektroforese (7,5 % gel). Enzymet i henhold til denne oppfinnelse har en molekylvekt på omtrent 12 0.000 ± 5.000.
(8) Virkning av metallioner
Tilsetning av Hg<2+>, Cd<2+>, og Mn<2+> ioner (1 mM hver) gir en negativ virkning og tilsetning av Pb<2+> ion (1 mM) gir en svakt negativ virkning. (9) Virkning av vaskemidler 0,05 vekt% av overflateaktive midler slik som lineær alkyl-benzensulfonat (LAS), natriumalkylsulfat (AS), natriumpoly-oksyetylenalkylsulfat (ES), natrium a-olefinsulfonat (AOS), natrium a-sulfonert fettsyreester (a-SFE), natriumalkyl-sulfonat (SAS), natriumdodekylsulfat (SDS), såper og softanol ble testet ved 40°C i 15 minutter for å bekrefte at det ikke var noen negativ virkning på enzymatiske aktiviteter.
(10) Virkning av chelateringsmidler
Chelateringsmidler slik som EDTA (10 mM), EGTA (10 mM), sitronsyre (0,05 vekt%) og zeolitt (0,05 vekt%) gir ingen negativ virkning på enzymatiske aktiviteter.
(11) Bestandighet mot protease
I nærvær av alkalisk protease, f.eks. API-21 (Showa Denko), Maxatase (IBIS), Sabinase, Alkalase og Esperase (Novo) i en mengde på 0,2 AU/1, ble aktivitetene målt for å bekrefte at enzymet i henhold til denne oppfinnelse hadde sterk resistens mot alle proteaser.
Alkalisk pullulanase i henhold til den foreliggende oppfinnelse har et høyere optimalt pH område (pH 9,5 - 11) enn de konvensjonelle alkaliske pullulanaser og viser utmerket stabilitet i et videre pH område. Den har en optimal temperatur høyere enn 50°C og er termisk stabil opp til 4 0°C. Videre har alkalisk pullulanase i henhold til den foreliggende oppfinnelse sterk resistens mot nesten alle vaskemiddelkomponenter slik som overflateaktive midler, chelateringsmidler, protease for vaskemidler og lignende. Følgelig kan enzymet i henhold til den foreliggende oppfinnelse på fordelaktig måte anvendes som vaskemiddelkomponent. I tillegg kan enzymet i henhold til den foreliggende oppfinnelse anvendes til å produsere mange slags oligosakkarider og også sammen med a-amylase for å produsere forskjellige monosakkarider. Enzymet i henhold til foreliggende oppfinnelse har således en enestående signifikans på industrielle områder.
Andre særtrekk ved oppfinnelsen vil fremkomme i løpet av den følgende beskrivelse av eksemplene på utførelsesformer som er gitt for å illustrere oppfinnelsen.
EKSEMPLER
Eksempel 1
En spiseskje jord (ca. 0,5 g) av Yokohama-shi, Kanagawa-ken, Japan ble suspendert i sterilisert saltvann, og blandingen ble varmebehandlet ved 80°C i 15 minutter.
En supernatant av den varmebehandlede blanding ble passende fortynnet, påført på et isolerende agar medium (medium A), og dyrket ved 3 0°C i 3 dager for å la kolonier vokse. Koloniene som dannet transparente soner i periferiene på grunn av pullulan oppløsning, ble oppsamlet for å oppnå pullulanase-produserende stammer. Disse stammer ble inokulert i væskemedium B og ryste-" dyrket ved 3 0°C i 3 dager. Etter dyrkinger ble den dyrkede buljong sentrifugert for å separere en supernatant. Pullulanase-aktiviteten i supernatanten ble målt ved pH 10 for å selektere alkalisk pullulanase-produserende stammer. Bacillus sp. KSM-AP1876 (FERM P 10887) ble således oppnådd.
Eksempel 2
Alkalisk pullulanase-produserende stammer Bacillus sp. KSM-AP187 6 ble inokulert i væskemedium B i eks. 1 og ryste-dyrket ved 3 0°C i 3 dager. Etter dyrking ble celler fjernet ved hjelp av sentrifugering for å oppnå fremstilling av rå pullulanase. Råenzymet ble fremstilt i henhold til en konvensjonell metode for å fremstille etanol-tørt pulver. Som et resultat ble produksjonen av enzymet pullulanase bekreftet som vist i tabell 3. Den enzymatiske aktivitet ble målt ved pH 9.
Eksempel 3
Alkalisk pullulanase-produserende stamme Bacillus sp. KSM-AP1876 ble inokulert i et medium som hadde samme sammensetning som væskemedium B i eks. 1 med unntak av at 1 % maltose var tilsatt i stedet for pullulan og rystedyrket ved 30°C i 2 - 3 dager. Pullulanase-aktiviteten i en supernatant etter sentrifugering ble målt og funnet å være 211 U pr. en omgang kulturbuljong.
Eksempel 4
Til råenzymet fremstilt i eks. 2 ble det tilsatt DEAE cellulosepulver, og pullulanase i råenzymet ble fullstendig adsorbert til DEAE cellulose. Etter at 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8) var blitt anvendt til å vaske en harpiks, ble enzymet eluert ved å anvende 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8) som inneholdt 0,6 M natriumklorid. 10 mM Tris-HCl bufferen hvori enzymet var eluert, ble underkastet dialyse for å konsentrere bufferen. Så ble enzymet adsorbert til DEAE-cellulose DE52 ekvilibrert med bufferen og gradient eluert med 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8) som inneholdt natriumklorid som hadde en konsentrasjon på 0 - 1 M for å oppsamle aktive fraksjoner. De aktive fraksjoner ble konsentrert ved å anvende en ultrafiltreringsmembran (10-kDa avskjæring) og dialysert over natten mot 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8) som inneholdt 0,1 M natriumklorid. Etter å ha blitt konsentrert og dialysert ble eluatet underkastet adsorpsjon ved å anvende en Sephacryl S-2 00 kolonne ekvilibrert med 10 mM Tris-HCl buffer
(pH 8) som inneholdt 0,1 M natriumklorid. Enzymet ble eluert med 0,1 M natriumklorid i 10 mM Tris-HCl buffer for å oppsamle aktive fraksjoner, som ble underkastet adsorpsjonsprosess ved å anvende DEAE Toyopeal 650S kolonne. Det adsorberte enzym ble gradient eluert ved å anvende 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8) som inneholdt natriumklorid som hadde en konsentrasjon 0 - 1 M for å oppsamle aktive fraksjoner. Etter konsentrasjon på en ultrafiltreringsmembran ble de aktive fraksjoner underkastet adsorpsjonsprosess ved å anvende en Butyl-Toyopeal 650S kolonne ekvilibrert med 10 mM Tris-HCl buffer som inneholdt 2 M ammoniumsulfat. Kolonnen ble gradient-eluert med 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8) som inneholdt
ammoniumsulfat som hadde en konsentrasjon på 2 - 0 M for å oppsamle aktive fraksjoner. De aktive fraksjoner ble konsentrert på en ultrafiltreringsmembran og dialysert over natten mot 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8) for å oppnå et renset enzym av alkalisk pullulanase Z-l. Det rensede enzym ble underkastet polyakryl-amidgel-elektroforese (gel-konsentrasjon: 15%), i henhold til fremgangsmåten til Davis [Davis D. J., Ann. N. Y. Acad. Sei., 121, 404 (1964)], og farget med Coomassie Brilliant blått for å bekrefte at den ga et enkeltbånd (se fig. 9). Utbyttet av det aktive enzym var omtrent 4 %.
Eksempel 5
Den alkaliske pullulanase Z-l oppnådd i eks. 4 ble underkastet SDS elektroforese i henhold til en vanlig fremgangsmåte for å bekrefte at enzymet hadde en molekylvekt på 12 0.000 5.000.
Åpenbart er tallrike modifikasjoner og variasjoner av den foreliggende oppfinnelse mulige i lys av beskrivelsene ovenfor. Det må derfor forstås at innen rekkevidden av de vedlagte krav kan oppfinnelsen praktiseres på annen måte enn som spesifikt beskrevet her.
Claims (2)
1. Renset, alkalisk pullulanase Z-l, karakterisert ved de følgende enzymologiske karakteristika:
(1) Virkning
Hydrolyserer a-l,6-binding i pullulan og gir maltotreose, og hydrolyserer a-l,6-glykosidisk binding i stivelse, amylopektin, glykogen eller deres partielle spaltningsprodukter;
(2) Substratspesifisitet
har hydrolyseaktivitet mot a-l,6-glykosidisk binding i sukkere med en høyere polymeriseringsgrad enn maltosens;
(3) Virknings-pH og optimum-pH-område
har et aktivt pH-område på 5-11 med et optimum pH-område som er 9,5-11;
(4) pH-stabilitet
er stabil i et pH-område på 8-10 og beholder relativ aktivitet på 50% eller mer av aktiviteten ved det optimale pH-område selv i et pH-område 7-10,5 ved behandling ved 45°C i 10 minutter;
(5) Virketemperatur og optimum-temperatur
er aktiv i et bredt temperaturområde fra 10-60"C med en optimumstemperatur som er rundt 50°C;
(6) Termisk stabilitet
er meget stabil ved 40°C ved behandling i 10 mmol er glycin-NaCl-NaOH buffer (pH 9,5) i 30 minutter;
(7) Molekylvekt
ca. 12 0.000 ±5.000 målt ved hjelp av elektroforese ved bruk av natriumdodecylsulfat;
(8) Virkning av metallioner
blir negativt påvirket av Hg<2+>, Cd<2+>, Mn<2+> og Pb<2+->ioner;
(9) Virkning av vaskemidler
knapt påvirket av overflateaktive midler såsom LAS, AS, ES, AOS, a-SFE, SAS, SDS, såper og softanol;
(10) Virkning av chelateringsmidler
knapt påvirket av EDTA, EGTA, sitronsyre og zeolitt;
(11) Bestandighet mot protease
viser sterk bestandighet mot alkaliske proteaser.
2. Renisolert kultur av Bacillus sp. mikroorganisme som produserer en alkalisk pullulanase ifølge krav 1, karakterisert ved at mikroorganismen kalles "Bacillus sp. KSM-AP1876" og er deponert som FERM P-10887 hos Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1226210A JPH0387176A (ja) | 1989-08-31 | 1989-08-31 | アルカリプルラナーゼ、これを産生する微生物及びアルカリプルラナーゼの製造法 |
| JP1226211A JPH0659215B2 (ja) | 1989-08-31 | 1989-08-31 | アルカリプルラナーゼｚ―１、これを生産する微生物及びアルカリプルラナーゼｚ―１の製造法 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO903801D0 NO903801D0 (no) | 1990-08-30 |
| NO903801L NO903801L (no) | 1991-03-01 |
| NO180642B true NO180642B (no) | 1997-02-10 |
| NO180642C NO180642C (no) | 1997-05-21 |
Family
ID=26527056
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO903801A NO180642C (no) | 1989-08-31 | 1990-08-30 | Alkalipullulanase og renisolert kultur av Bacillus sp. mikroorganisme som produserer denne |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5147795A (no) |
| EP (1) | EP0415397B1 (no) |
| CA (1) | CA2024194C (no) |
| DE (1) | DE69013446T2 (no) |
| DK (1) | DK0415397T3 (no) |
| ES (1) | ES2065449T3 (no) |
| FI (1) | FI95481C (no) |
| HK (1) | HK154695A (no) |
| NO (1) | NO180642C (no) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69133154T2 (de) * | 1990-04-05 | 2003-07-24 | Kao Corp | Detergentzusammensetzung |
| JPH05236958A (ja) * | 1992-02-28 | 1993-09-17 | Amano Pharmaceut Co Ltd | 新規イソアミラーゼ及びその製造法 |
| WO1994019468A1 (en) * | 1993-02-25 | 1994-09-01 | Kao Corporation | Dna fragment containing gene for alkaline pullulanase |
| CA2316191A1 (en) * | 1997-12-22 | 1999-07-01 | The Procter & Gamble Company | Cleaning compositions containing a neopullulanase |
| US20090123987A1 (en) * | 2005-08-26 | 2009-05-14 | Michael Patane | Extracting and purifying limit dextrinases |
| CN101974543B (zh) * | 2010-08-18 | 2012-05-23 | 江南大学 | 一种来源于芽孢杆菌的胞外普鲁兰酶编码基因及其应用 |
| WO2012095746A2 (en) | 2011-01-11 | 2012-07-19 | Capsugel Belgium Nv | New hard capsules |
| CA3059529A1 (en) | 2017-04-14 | 2018-10-18 | Capsugel Belgium Nv | Process for making pullulan |
| CN110678170A (zh) | 2017-04-14 | 2020-01-10 | 比利时胶囊公司 | 普鲁兰多糖胶囊 |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE1517752C3 (de) * | 1966-02-05 | 1974-10-24 | Farbwerke Hoechst Ag, Vormals Meister Lucius & Bruening, 6000 Frankfurt | Verfahren zur Herstellung von Pullulanase |
| US3806419A (en) * | 1968-11-13 | 1974-04-23 | Cpc International Inc | Preparing pullulanase enzyme |
| US3963575A (en) * | 1974-02-25 | 1976-06-15 | A. E. Staley Manufacturing Company | Producing pullulanase with organisms having a superior capacity to elaborate pullulanase |
| US4318989A (en) * | 1979-06-07 | 1982-03-09 | Lifeline Products, Inc. | Starch-degrading enzymes from Cladosporium resinae |
| US4734364A (en) * | 1983-05-20 | 1988-03-29 | Miller Brewing Company | Production of dextrose and maltose syrups using an enzyme derived from rice |
| JPS60186282A (ja) * | 1984-03-07 | 1985-09-21 | Agency Of Ind Science & Technol | 新規な耐熱性プルラナ−ゼ |
| US4628031A (en) * | 1984-09-18 | 1986-12-09 | Michigan Biotechnology Institute | Thermostable starch converting enzymes |
| US4628028A (en) * | 1985-05-23 | 1986-12-09 | Cpc International Inc. | Novel thermostable pullulanase enzyme and method for its production |
| US4612287A (en) * | 1985-05-23 | 1986-09-16 | Cpc International Inc. | Plasmids containing a gene coding for a thermostable pullulanase and pullulanase-producing strains of Escherichia coli and Bacillus subtilis containing the plasmids |
| JPS6336780A (ja) * | 1986-07-31 | 1988-02-17 | Res Dev Corp Of Japan | 新規なプルラン分解酵素およびその製法 |
| JPH062071B2 (ja) * | 1986-08-08 | 1994-01-12 | 新技術事業団 | 糖類の製造法 |
| FI81112C (fi) * | 1986-08-27 | 1990-09-10 | Alko Ab Oy | Amylas av ny typ. |
-
1990
- 1990-08-29 DK DK90116597.7T patent/DK0415397T3/da active
- 1990-08-29 DE DE69013446T patent/DE69013446T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-08-29 ES ES90116597T patent/ES2065449T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-08-29 CA CA002024194A patent/CA2024194C/en not_active Expired - Fee Related
- 1990-08-29 EP EP90116597A patent/EP0415397B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-08-30 US US07/575,434 patent/US5147795A/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-08-30 NO NO903801A patent/NO180642C/no unknown
- 1990-08-30 FI FI904277A patent/FI95481C/fi not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-09-28 HK HK154695A patent/HK154695A/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO903801D0 (no) | 1990-08-30 |
| HK154695A (en) | 1995-10-06 |
| EP0415397B1 (en) | 1994-10-19 |
| DK0415397T3 (da) | 1995-04-03 |
| NO180642C (no) | 1997-05-21 |
| FI95481C (fi) | 1996-02-12 |
| ES2065449T3 (es) | 1995-02-16 |
| CA2024194A1 (en) | 1991-03-01 |
| NO903801L (no) | 1991-03-01 |
| DE69013446D1 (de) | 1994-11-24 |
| US5147795A (en) | 1992-09-15 |
| EP0415397A1 (en) | 1991-03-06 |
| FI95481B (fi) | 1995-10-31 |
| FI904277A0 (fi) | 1990-08-30 |
| DE69013446T2 (de) | 1995-05-24 |
| CA2024194C (en) | 1999-05-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2652871B2 (ja) | アルカリセルラーゼおよびその製造法 | |
| US5635468A (en) | Liquefying alkaline α-amylase, process for producing the same, and detergent composition containing the same | |
| US5258297A (en) | Proteinase-resistant cellulase, microorganism producing the same and process for producing the same | |
| EP0269977B1 (en) | Alkaline cellulases and microorganisms capable of producing same | |
| US5316691A (en) | Detergent composition containing an alkaline pullulanase from bacillus ferm BP-3048 | |
| US5147796A (en) | Alkaline pullulanase Y having α-amylase activity | |
| US5147795A (en) | Alkaline pullulanase from bacillus sp. ferm p-10887 | |
| CA2024952C (en) | Novel alkaline pullulanase y having .alpha.-amylase activity, microorganism producing the same, and process for producing the same | |
| JPH0630578B2 (ja) | アルカリセルラ−ゼｋ | |
| JP3729910B2 (ja) | アルカリα−アミラーゼ、これを生産する微生物及び当該アルカリα−アミラーゼの製造法 | |
| JP2866460B2 (ja) | 多糖類の糖化方法 | |
| JP3000310B2 (ja) | カルボキシメチルセルラーゼ及びこれを生産する微生物 | |
| JPH0371878B2 (no) | ||
| JPH0632606B2 (ja) | 新規微生物 | |
| JPH0655139B2 (ja) | Ｃｍｃア−ゼ▲ｉｉ▼ | |
| JPH0632612B2 (ja) | アルカリセルラ−ゼ製造法 | |
| JPH0614775A (ja) | アルカリイソアミラーゼ及びそれを生産する微生物並びに該アルカリイソアミラーゼの製造方法 | |
| JPH0387177A (ja) | アルカリプルラナーゼｚ―ｉ、これを生産する微生物及びアルカリプルラナーゼｚ―ｉの製造法 | |
| JPH0655138B2 (ja) | Ｃｍｃア−ゼ▲ｉ▼ | |
| JPH0375152B2 (no) | ||
| JPH0387176A (ja) | アルカリプルラナーゼ、これを産生する微生物及びアルカリプルラナーゼの製造法 |