JPS6336780A - 新規なプルラン分解酵素およびその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は新規なプルラナーゼ並びにその製造法に関する
。更に詳しくは、新規なサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属
に属する好熱性微生物を培養して得られる新規な耐熱性
プルラナーゼおよびその製造法に関する。

従来の技術 プルラナーゼは、ペングー（Ｂｅｎｄｅｒ）らにより、
プルラリャ・プルランの生産する多糖類プルランを加水
分解する酵素として、微生物：エーロバクク−−ｘ−ロ
ゲネス（八ｅｒｏｂａｃｔｅｒ、　ａｅｒｏｇｅｎｅｓ
）　ｌこおいてはじめて見出されたものである〔バイオ
シミ力　エ　バイオフィジヵ　アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ
、　　Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ａｃｔａ）、　３６．３０９　（１９５９）、特公昭４
６−７５５９などを参照のこと〕。その後、この酵素は
、アミロペクチンのα−１，６−グルコシド結合を加水
分解し、β−アミラーゼとの併用により、デンプンから
マルトースを収量よく生産することから注目され、現在
では同種の酵素が種々の微生物により生産されることが
知られている。

この種の酵素はプルラナーゼ、イソアミラーゼなど種々
の名称で呼ばれているが、総称してα−１，６−グルコ
シダーゼと言われている。例えば、エシェリヒア・イン
ターメディアのイソアミラーゼ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ　１ｎｔｅｒ＋ｎｅｄｉａ　；アプライド　マイクロ
バイオロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、
）、　　１５．４９２（１９６７））　、ストレプトコ
ッカス・ミテイスのプルラナーゼ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏ
ｃｃｕｓ　ｍ１ｔｉｓ　　；　）４イオケミカル　ジャ
ーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、）、皿３３．　（１９
６８）　：ｌ、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓ　−ｓｐ、　）　　Ｎｏ、２８のイソアミラ
ーゼ〔ジャーナル　オブ　ザ　ファーメンテ−ジョン　
テクノロジー（Ｊ、Ｆｅｒｍｅｎｔ。

Ｔｅｃｈ、）、　４９．５５２　（１９７１）］　、バ
チルス属のプルラナーゼ　〔アグリカルチュラル＆バイ
オロジカルケミス）　’Ｊ　−（Ａｇｒｉｃ、Ｂｉａｌ
、　Ｃｈｅ＋＋＋、）、４０．　１５１５（１９７６）
　；スターチ（Ｓｔａｒｃｈ）、３４．３４０　（１９
ｇ２）等〕などが報告されている。

最近、プルラナーゼやイソアミラーゼなどのα−１，６
−グルコシダーゼは、デンプンからグルコニスを製造し
たり、またデンプンからマルトース、マルトトリオース
、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘ
キサオースなどのマルトオリゴ糖を生産する際に、これ
ら糖の堆収に有効であることが認められている。

しかるに、従来知られているプルラナーゼやイソアミラ
ーゼなどのα−１，６−グルコシダーゼは、熱安定性に
劣り、また多くはその最適温度が４５〜５０℃程度でし
かなかった。

発明が解決しようとする問題点 一般に、澱粉糖の生産は、５０℃以上の高温で、かつｐ
Ｈ４，５〜６．０の弱酸性条件下で行われているが、６
０℃以下の反応温度では反応槽中の微生物汚染による反
応ｐＨの低下を防止することは出来ず、また汚染による
ｐ’Ｈ低下を補償するために多量の水酸化ナトリウムや
水酸化カルシウムなどのアルカリ試薬をｐＨ調整の目的
で添加しなければならなかった。このため、生産物の脱
塩・精製のために後処理が必要となるばかりか、多大の
費用が必要となる。従って、このような微生物汚染を防
止するためには６０℃以上、好ましくは６５〜７５℃に
酵素反応の最適温度を有し、同時にｐＨ低下を調整する
ためのアルカリ剤の添加量を低減するために反応の至適
ｐＨを中性〜弱アルカリ性に有する酵素が求められてい
る。

一方、バチルス　ステアロサーモフィルス（Ｂ。

Ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）やクロストリ
ジウム　サーモハイドロサルｎｘリカム（ＣＩ、　ｔｈ
ｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌ−ｆｕｒｉｃｕｍ）のα−１
，６−グルコシダーゼは６５〜６７．５℃および８５℃
に至適温度を有しており、工業的意味において優れた特
性を有していると考えられるが、酵素の生産性や培養の
困難さのために実用的とは言えなかった。

このような情況の下で、高い（７０℃前後の）酵素反応
の至適作用温度を有し、しかも弱酸性〜弱アルカリ性領
域に安定ｐＨ範囲を有するα−１，６−グルコシダーゼ
の開発が強く要求されている。

また、このような酵素を開発することによって、デンプ
ンからのグルコース、マルトースあるいはマルトオリゴ
糖の製造を安価かつ高い生産性で実施することが可能と
なる。

従って、本発明の第１の目的は上記要件を満足する新規
なプルラナーゼを提供することにある。

本発明のもう一つの目的は、上記新規プルラナーゼを簡
単かつ高収率で製造することを可能とする、新規な微生
物を用いた方法を提供することにある。

問題点を解決するための手段 そこで、本発明者らは培養が容易であり、酵素反応の至
適温度が７０℃前後であり、かつ弱酸性側に至適ｐｉ（
を有する、温度安定性に優れたα−１゜６−グルコシダ
ーゼを生産する微生物を得るべく鋭意検索した結果、温
泉の高温土壌中から採取された好熱性細菌であるサーマ
ス（Ｔｈｅｒｎｕｓ）属に属する新規微生物が上記目的
を達成する上で極めて有用であり、これを好気的に培養
することにより、培養物中に上記要件を満足する新規プ
ルラナーゼが高収率で生成蓄積されることを見出し、本
発明を完成したものである。

すなわち、本発明はまず新規耐熱性プルラナーゼを提供
するものであり、これは以下のような理化学的緒特性を
有している。

（イ）作用 アミロペクチン、グリコーゲン、デンプンおよびそれら
の部分加水分解物中のα−１，６−グルコピラノシド結
合からなる枝分れ構造を特異的に加水分解し、α−１，
４−グルコピラノシド結合からなる直鎖状オリゴ糖を生
成し、また、プルラン中のα−１，６−グルコピラノシ
ド結合を加水分解してマルトトリオースを生成する。

（ロ）基質的異性 α−１，６−グルコピラノシド結合で分枝した枝分れ糖
のうち、マルトース以上の重合度を有する枝分れ構造を
加水分解する。

（ハ）至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲 至適ｐＨは５．５〜６．０であり、５０℃、３０分間の
加熱条件下ではｐＨ５〜９の範囲内で安定である。

（ニ）温度に対する安定性 ｐＨ６，０，３０分間の処理では６０℃まで安定である
。

（ホ）作用適温の範囲 ７０℃近傍に至適作用温度を有する。

（へ）失活条件 ５０℃、３０分間の処理条件ではｐＨ４および１１で完
全に失活し、また、ｐＨ６．０．３０分間の処理では８
０℃で完全に失活する。

（ト）阻害および活性化 銅、水銀、亜鉛およびＥＤＴＡ　（エチレンジアミンテ
トラアセテート）で阻害され、カルシウムで安定化され
る。

（チ）ゲル濾過法による分子量 １２８、０００±５．０００゜ また、本発明は上記の新規耐熱性プルラナーゼの製法に
も係り、該プルラナーゼはサーマス属に属する微生物を
好気的に培養することにより、該酵素を培養液中に細胞
吸着型および菌体外分泌型酵素として生成蓄積せしめ、
これを分離・精製することを特徴とする方法によって得
ることができる。

本発明の方法において使用する新規耐熱性プルラナーゼ
生産菌株はいずれも本発明者等により新たに自然界から
検索・単離されたものである。これらの菌株をバージニ
ーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリ
オロジ−（Ｂｅｒｇｅｙ’　ｓＭａｎｎｕａｌ　ｏｆ、
　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏ、１ｏｇｙ
）　、第１巻に従って同定すると、いずれも好気性無胞
子桿菌であり、運動性がなく、ダラム染色陰性であり３
６℃以下および７５℃以上では生育できず、生育の最適
温度が６５℃前後であることからサーマス（Ｔｈｅｒｍ
ｕｓ）属に属すると考えられた。

しかしながら、これまでにこのサーマス属に属する微生
物の中でプルラナゼを菌体外生産するものは知られてい
ないので、本発明の耐熱性プルナラーゼ生産菌株は新規
なものであると考えた。

以下の第１表に単離した三種の耐熱性プルラナーゼ生産
菌の菌学的諸性質を示す。

なお、上記菌は工業技術院微生物工業技術研究所に夫々
、ＦＩＥＲＭ　Ｐ−８８８１（ＡＭＤ−６）　、ＦＥＲ
Ｍ　Ｐ−８８８２（八Ｍ　Ｏ−２２）　およびＦＥＲＭ
　Ｐ−８８８３（ＡＭＤ−２８）として寄託している。

本発明の新規な耐熱性プルラナーゼの製造法につきさら
に詳しく説明する。

上記のような耐熱性プルラナーゼ生産菌を適当な培地に
接種し、その生育温度の観点から３７〜７４℃、好まし
くは５５〜６５℃にて４８〜９６時間、好気的に培養す
ることにより培養液中に細胞吸着型および菌体外分泌型
酵素として該プルラナーゼが生成蓄積される。

本発明に用いられる培地は安価に入手し得る公知の各種
材料を使用することができる。例えば、窒素源としては
、コーン・ステイープ・リカー、ポリペプトン、大豆粕
、フスマ、肉エキス、酵母エキス、硫酸アンモニウム、
酢酸アンモニウム、尿素、アミノ酸液、などであり、炭
素源としては水飴、マルトース、各種デンプン、可溶性
デンプン、デンプン液化液、デキストリン、プルランな
どである。

また、これらの炭素源や窒素源の他に各種の塩、例えば
マグネシウム塩、カリウム塩、リン酸塩、鉄塩等の無機
塩や各種ビタミン類を必要により添加する。

本発明の上記方法において使用するのに適した培地は、
例えば１％プルラン、１％大豆粕、０．１％に、ＨＰＯ
，，０，０４％Ｍｇ５Ｏ＜・７Ｈ２０を含有する液体培
地である。

また、本発明の方法で使用する微生物の生育ｐＨは弱酸
から弱塩基性の範囲内であるので、適当なｐＨ調整剤を
用いて培地のｐＨを調整する必要がある。

そのために種々の緩衝液を用いることができるが、０．
２〜１％程度の炭酸カルシウムを用いることが特に便利
である。

既に述べたように、本発明において有用な新規微生物は
細胞吸着型の酵素および菌体外分泌型の酵素を産生ずる
。これらは夫々以下のような操作に従って分離・精製す
ることができる。

即ち、上記のような組成の培地中で、上記条件下で培養
した後、培養液から菌体外分泌型酵素を、また菌体から
細胞吸着型酵素を夫々回収する。培養土浦中に蓄積され
る菌体外分泌型酵素は、遠心分離により菌体を除去した
後に得られる粗酵素液の形で、また、細胞吸着型酵素は
遠心分離により得た菌体自体を用いることが経済的に有
利であるが、これをさらに精製して使用することもでき
る。

そのために、例えば硫安等による塩析、エタノーノペア
セトン、イソプロパツール等による溶媒沈殿法、限外濾
過法、ゲル濾過法、イオン交換樹脂等による一般的な酵
素精製法により精製することができる。

以下に、本発明のプルラナーゼの好ましい精製法の１例
につき更に詳しく説明する。

好熱性細菌サーマス属に属する例えばＡＭＤ−２８菌株
を１％プルラン、１％大豆粕、０．１％に２８Ｐ○１．
０．０４％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０，０，２５％炭酸カル
シウムを含む培地に植菌し、６０℃にて７２時間、通気
歯ＩＶ、Ｖ１ｍ、２５Ｏｒ、ｐ、ｍ、で好気的に培養し
て得られる培養液を１０．００Ｏｒ、　ｐ、　ｍ、、４
℃にて連続遠心して菌体を除き、約５１！の上澄液を得
る。次いで、該上澄液に固形硫酸アンモニウムを添加し
、８０％飽和とし、４℃で一夜放置する。生じた沈澱を
濾過により集め、１０ｍＭ　！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ７，
０）に溶解させた後、同緩衝液に対して一夜４℃で透析
する。透析、により生じる沈澱は遠心分離により除き、
得られる上澄液を１０ｍＭ　！Ｊン酸緩衝液（ｐ）ＩＴ
、０）で平衡化したＤＥＡＥ−セルロースカラムに吸着
させ、０〜０．８ＭのＮａＣ１を含む上記と同様な緩衝
液の濃度勾配法によって酵素を溶出させる。溶出した活
性画分を集め平均分画分子量３０．０００の限外濾過膜
を用いて濃縮した後、０．’１Ｍ食塩を含む上記同様の
リン酸緩衝液を用いて一夜透析する。次いで、該透析酵
素を同様に０．１Ｍ食塩を含む上記リン酸緩衝液で平衡
化したセファクリルＳ−２００カラムに充填し、０．１
Ｍ食塩を含む同緩衝液で溶出する。

活性画分を集め限外濾過膜を用いて濃縮した後、ショデ
ックス（Ｓｈｏｄｅｘ）　ＷＳ−２００３カラムを用い
る高速液体クロマトグラフ法にて再度クロマトグラフィ
ーに付して活性画分を集める。かくして得られるｌ’＋
Ｗ　ｙ酵素はポリアクリルアミドゲルディスク電気泳動
くゲル濃度７．５％）的に単一であり、活性収率は約２
１％であった。なお、本発明の方法において有用なへＭ
Ｏ−６菌株およびＡＭＤ−２２菌株のプルラナーゼにつ
いても同様な方法で精製可能である。

さらに、細胞吸着型酵素は、例えばトライトン（Ｔｒ　
ｉ　ｔｏｎ）　Ｘ−１００あるいはドデシル硫酸ナトリ
ウム（ＳＯ３＞などの界面活性剤で菌体を洗浄すること
により容易に溶離するので遠心分離により集菌した菌体
を０，０５〜０，５（％）程度の該界面活性剤で処理し
た後、遠心分離して得られる上清から上記と同様な方法
により精製できる。

勿論、培養液の遠心分離処理前に、培養液中に上記のよ
うな界面活性剤を添加して、予め細胞吸着型酵素を培養
液中に溶離させ、次いで上記の精製・分離操作を行って
、これら両者を同時に回収することも可能である。

なお、上記方法により得られる細胞吸着型酵素と菌体外
分泌型酵素の理化学的性質は、はぼ同一である。

更に、プルラナーゼの活性測定法並びに活性表示法は以
下の通りである。

即ち、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）に溶解さ
せた３％（Ｗ／Ｖ）のプルラン溶液Ｑ、３ｍｌに酵素液
０．０５ｍ１を混合し、６０℃で３０分間反応させた後
、ＤＮＳ試液〔ジエイ、アール、サマー、ジー、イー、
ソマーズ、″ラボラトリ−イクスベリメンツ　インバイ
オロジカル　ケミストリー”、アカデミツクプレス、ニ
ューヨーク（Ｊ、Ｒ，Ｓｕｍｍｅｒ、　　Ｇ、　　ε、
Ｓｏｍｅｒｓ、”Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　　εｘｐｅｒ
ｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ、”Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　　Ｎ
ｅｗ　Ｙｏｒｋ）、３４３５頁、　　１９４４年〕１ｍ
ｌを加えて反応を止める。ついで、沸騰水溶中で５分間
加熱した後急冷し、３ｍｌの水を加えて十分に攪拌する
。同様に処理した０、　３５ｍ１の０．５ｍｇ　／ｍｌ
グルコース溶液を標準とし、その着色度をクレトーサマ
ーソ７　（Ｋｌｅｔｔ−３％ｍｍｅｒｓｏｎ）型光電比
色計フィルターＮｏ、５２を用いて測定する。酵素活性
の単位は前述の条件下で１分間に１μｍｏｌｅのマルト
トリオース生成に相当する還元力を有する酵素量を１単
位とした。

本発明の方法によって得られる耐熱性プルラナーゼの理
化学的、酵素化学的諸性質と従来公知の微生物由来のα
−１，６−グルコシダーゼとの比較を第２表に示す。

作用 プルラナーゼはアミロペクチンのα−１，６−グルコシ
ド結合を加水分解し、またβ−アミラーゼと併用した場
合にはデンプンからマルトースを高収率で生産できる。

このマルトースは澱粉糖の一種で麦芽糖とも呼ばれ、一
般に甘味剤、栄養剤などとして有用なものである。

この澱粉糖の生成反応は、低温かつ弱酸性条件下で実施
された場合、既に述べたような微生物汚染に起因する様
々な悪影響を受けることが知られている。そこで、この
澱粉の酵素加水分解反応をできるだけ高温条件下で行い
、また中性〜弱酸性側のｐＨ条件下で実施することが望
ましいとされている。

しかしながら、これまでに単離されたα−１゜６−グル
コシダーゼは熱安定性に劣り、殆どが４５〜５０℃程度
の至適温度を示すにすぎなかった。更に、一部高温領域
に至適温度を有するものも知られているが、酵素の生産
性が悪い、該酵素産生微生物の培養が困難である等の欠
点を有しており、高価であり、大規模使用ができないな
ど工業的観点から十分満足できるものではなかった。

しかしながら、このような澱粉の酵素分解反応に係る諸
問題点は、本発明によるプルラナーゼ並びにその製法に
よちてほぼ解決される。即ち、まず本発明のプルラナー
ゼは約７０℃に酵素反応の至適温度を有しており、また
至適ｐＨも弱酸性〜中性領域にある。従って、澱粉の酵
素分解反応を高温でしかも中性領域近傍で実施すること
が可能となる。この事実は、微生物汚染を確実に防止す
ることを保証し、また汚染に基＜ｐＨ低下を補償する目
的でアルカリ試薬を添加する必要もなくなり、コストパ
ーフォーマンスにおける大巾な改善が期待できる。更に
、高温での反応が可能なことから反応速度の改善が期待
でき、これは分解生成物の量産性を保証する。

一方、該プルラナーゼの製法の観点からしても、本発明
で使用する新規微生物においては、菌体（細胞吸着型酵
素）および培養液中（菌体外分泌型酵素）の両者から有
用なα−１，６−ゲリコシダーゼを単離することができ
る。従って、収率が高く、培養操作も簡単であり、特に
菌体外分泌型酵素の場合には精製・分離操作が簡単であ
り、酵素の製法としては極めて有利である。尚、細胞吸
着型酵素においても、界面活性剤の使用により菌体から
容易に溶離でき、その後は菌体外分泌型酵素と同様に精
製・分離できる。

かくして、本発明の方法によれば澱粉の酵素分解のため
に有用なプルラナーゼを安価かつ大量に供給でき、また
かくして得られる酵素により工業的に大規模な澱粉糖の
生成を有利に実施できる。

実施例 以下、実施例に従って本発明の新規耐熱性プルラナーゼ
並びにその製造方法につき更に具体的に説明する。

しかしながら、本発明の範囲は以下の実施例によって何
等制限されるものではない。

実施例１ 好熱性細菌サーマスＮｏ、　ＡＭＤ−６（Ｔｈｅｒｍｕ
ｓ　ＳＩＮ、　　Ｎ。

ＡＭＤ−６：　ＦεＲＭ　Ｐ−８８８１）菌株を５００
ｍ１容の三角フラスコ中のプルラン１％、大豆粕１％、
Ｋ２　ＨＰ　０４０．１％、ＭｇＳＯ４・７　Ｈ２Ｏ０
，０４％およびＣａＣＯ３０，２５％を含む培地（ｐＨ
７，０）　１００ｍ１に植菌し、７０℃で３０時間２０
Ｏｒ、　ｐ、　ｍ、で回転振とう培養した後、トリドア
　（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００を０．４％添加し、３７
℃で２０時間、２０Ｏｒ、　ｐ、　ｍ、で回転振とうし
て細胞吸着型酵素を細胞表層から溶離抽出した。ついで
１２．０００　ｇ　。

４℃で３０分間遠心分離して菌体を除き、９．２単位／
ｍｌの粗酵素液８９ｍ１を得た。尚、酵素の活性単位は
上記方法によって測定した（以下同様）。

実施例２ 好熱性細菌サーマスＮｏ、　ＡＭＤ−２２（Ｔｈｅｒｍ
ｕｓ　ｓｐ、Ｎｏ。

ＡＭＤ−２２：　ＦＯＲＭ　Ｐ−８８８２）菌株を５０
０ｍ１容の三角フラスコ中の可溶性デンプン１％、コー
ンステイープリカー４％、酵母エキス０．２％、Ｋ２Ｈ
Ｐ０゜０．１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，０２％を含
む培地（ｐＨ６）　１００　ｍｌに植菌し、５０℃で７
２時間、２０Ｏｒ、　ｐ、　ｍ。

で回転振とう培養した。培養液を１２．０００　ｇ、４
℃で３０分間遠心分離して得られる培養上清９３ｍ１中
には３．５単位／ｍｌの菌体外分泌型プルラナーゼが含
まれていた。さらに遠心分離により得られる菌体を、０
．１％（Ｗ／Ｖ）のＳＤＳを含む２５ｍ１の５０ｍＭ燐
酸緩衝液　（ｐＨ７，０）に懸濁させ、３０℃で１８時
間、２００ｒ、　ｐ、　ｍ、で回転振とう抽出した後、
１２．０００ｇ、　４℃で３０分間遠心分離した。得ら
れる上清２２ｍ１中には３１．２単位／ｍｌの細胞吸着
型プルラナーゼが含まれていた。

実施例３ 好熱性細菌サーマスＮＯ，へＭＯ−２８（Ｔｈｅｒｍｕ
ｓ　ｓｐ、　ＡＭＤ−２８二Ｆ踵Ｍ　　Ｆ？−８８８３
）菌株を１０１容のジャーファーメンタ−中のプルラン
１％、ゼラチン１．５％、大豆粕０．５％、Ｋ２　ＨＰ
　０４０．１％、Ｍｇ５Ｏ＜・７８２００．０３％、Ｃ
ａＣ１ｚ　０．００５％、Ｆｅ５０＜・７Ｈ２００゜０
０３％を含む培地（ｐＨ７）６βに、予め、実施例１で
述べた培地を用いてＮｏ、　ＡＭＤ−２８菌株を６０℃
で１８時間前培養して得られる種菌液１８０ｍ１を添加
し、６０℃で２５０ｒ、ｐ、ｍ、　　、通気量Ｉ　Ｖ、
　Ｖ、　ｍ。

で７２時間通気攪拌培養した。培養終了後、温度を３７
℃に下げ、５ＤＳＯ，，１％（Ｗ／Ｖ）を添加して、更
に１８時間攪拌した。ついで、１０．０００ｒ、　ｐｏ
ｍｌ、４℃で連続遠心して菌体を除いた後、平均分画分
子量３０、０００の限外濾過膜を用いて約１０倍に濃縮
した。

ついで、該濃縮液に固型硫酸アンモニウムを８０％飽和
まで添加し、４℃で一夜放置した。本操作により生じた
沈殿を濾過により集め、減圧下、室温で乾燥して３．５
ｇの１６２．０００単位／ｇのプルラン分解活性をもつ
粗酵素粉末を得た。

発明の効果 以上詳しく述べたように、本発明によれば高温度域（７
０℃前後）に酵素反応の至適温度を有し、しかも弱酸性
〜弱塩基性領域に安定ｐＨ範囲を有するα−１，６−グ
ルコシダーゼが提供され、このものはその前記諸特性に
基き、澱粉の酵素分解反応の収率、効率を大巾に改善す
ることを可能とする。しかも、余分な試薬の必要性を排
除し、脱塩などの後処理をも不要とするので工程の経済
性も著しく向上する。

更に、本発明の方法によれば、使用する新規微生物が菌
体並びに培養液両者に上記の優れた諸特性を有するα−
１，６−グルコシダーゼを簡単な工程で、しかも高収率
で得ることを可能とすることから酵素自体のコストを著
しく低減する。

かくして、本発明は安価かつ大規模での澱粉糖の製造を
可能とするので工業的に極めて大きな意義を有するもの
である。

特許出願人　　　新技術開発事業団 中村　信之 掘越　弘毅

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）以下の理化学的性質を有する新規なプルラナーゼ
   。 （イ）作用 アミロペクチン、グリコーゲン、デンプンおよびそれら
   の部分加水分解物中のα−１，６−グルコピラノシド結
   合からなる枝分れ構造を特異的に加水分解し、α−１，
   ４−グルコピラノシド結合からなる直鎖状オリゴ糖を生
   成し、また、プルラン中のα−１，６−グルコピラノシ
   ド結合を加水分解してマルトトリオースを生成する。 （ロ）基質特異性 α−１，６−グルコピラノシド結合で分枝した枝分れ糖
   のうち、マルトース以上の重合度を有する枝分れ構造を
   加水分解する。 （ハ）至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲 至適ｐＨは５．５〜６．０であり、５０℃、３０分間の
   加熱条件下ではｐＨ５〜９の範囲内で安定である。 （ニ）温度に対する安定性 ｐＨ６．０、３０分間の処理では６０℃まで安定である
   。 （ホ）作用適温の範囲 ７０℃近傍に至適作用温度を有する。 （ヘ）失活条件 ５０℃、３０分間の処理条件ではｐＨ４および１１で完
   全に失活し、また、ｐＨ６．０、３０分間の処理では８
   ０℃で完全に失活する。 （ト）阻害および活性化 銅、水銀、亜鉛およびエチレンジアミンテトラアセテー
   トで阻害され、カルシウムで安定化される。 （チ）ゲルろ過法による分子量 １２８，０００±５，０００
2. （２）上記プルラナーゼが細胞吸着型酵素である特許請
   求の範囲第１項記載のプルラナーゼ。
3. （３）上記プルラナーゼが菌体外分泌型酵素である特許
   請求の範囲第１項記載のプルラナーゼ。
4. （４）上記プルラナーゼが細胞吸着型酵素と菌体外分泌
   型酵素との混合物である特許請求の範囲第１項記載のプ
   ルラナーゼ。
5. （５）サーマス属に属し、以下に示す理化学的諸特性： （イ）作用 アミロペクチン、グリコーゲン、デンプンおよびそれら
   の部分加水分解物中のα−１，６−グルコピラノシド結
   合からなる枝分れ構造を特異的に加水分解し、α−１，
   ４−グルコピラノシド結合からなる直鎖状オリゴ糖を生
   成し、また、プルラン中のα−１，６−グルコピラノシ
   ド結合を加水分解してマルトトリオースを生成する；（
   ロ）基質特異性 α−１，６−グルコピラノシド結合で分枝した枝分れ糖
   のうち、マルトース以上の重合度を有する枝分れ構造を
   加水分解する； （ハ）至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲 至適ｐＨは５．５〜６．０であり、５０℃、３０分間の
   加熱条件下ではｐＨ５〜９の範囲内で安定である；（ニ
   ）温度に対する安定性 ｐＨ６．０、３０分間の処理では６０℃まで安定である
   ；（ホ）作用適温の範囲 ７０℃近傍に至適作用温度を有する； （ヘ）失活条件 ５０℃、３０分間の処理条件ではｐＨ４および１１で完
   全に失活し、また、ｐＨ６．０、３０分間の処理では８
   ０℃で完全に失活する； （ト）阻害および活性化 銅、水銀、亜鉛およびエチレンジアミンテトラアセテー
   トで阻害され、カルシウムで安定化される； （チ）ゲル濾過法による分子量 １２８，０００±５，０００ を有する新規プルラナーゼ生産能を有する微生物を培養
   し、培養物から該プルラン分解酵素を採取することを特
   徴とする上記新規プルラナーゼの製造方法。
6. （６）上記培養を３７〜７４℃の範囲内の温度下で好気
   的に行うことを特徴とする特許請求の範囲第５項記載の
   プルラナーゼの製造方法。
7. （７）上記培養液のｐＨが５．０〜８．５の範囲内にあ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第５項または第６項
   記載のプルラナーゼの製造方法。
8. （８）上記培養液に界面活性剤を添加し、細胞吸着型酵
   素と菌体外分泌型酵素とを同時に採取することを特徴と
   する特許請求の範囲第５〜７項のいずれか１項に記載の
   プルラナーゼの製造方法。