JP2929023B2 - セルラーゼ及びこれを産生する微生物及びセルラーゼの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はバチルス（Bacillus）属細菌が生産するセル
ラーゼであり、特に、弱酸性側pH領域に於いて作用し、
中性以上のpH領域に於いては殆ど作用しないセルラー
ゼ、当該セルラーゼを生産する微生物及び当該セルラー
ゼの製造法に関する。

〔従来の技術〕

従来、セルラーゼはセルロースをグルコース又はセロ
ビオース或いはセロオリゴ糖まで分解する酵素反応を触
媒する複雑な酵素群として理解されており、その作用機
構により、C₁酵素、C_X酵素とβ−グルコシダーゼ、或い
はエキソ−β−グルカナーゼ、エンド−β−グルカナー
ゼ、セロビアーゼなどの名称で呼ばれる酵素を含有する
と言われる。過去数十年のセルラーゼの研究の歴史は、
バイオマス資源の有効利用、醸造業に於ける麦芽の糖化
などの観点から、例えばトリコデルマ属、アスペルギル
ス属、アクレモニウム属、フミコーラ属、イルペックス
属などの糸状菌類、或いはクロストリジウム属、シュー
ドモナス属、ルミノコッカス属、セルロモナス属等の細
菌類などにその供給源を求めてきた（村尾沢夫ら「セル
ラーゼ」、講談社（1987））。また最近、セルラーゼの
新規産業的用途として、衣料用洗浄剤組成物に関するも
のがあり、バチルス属、セルロモナス属及びストレプト
マイセス属細菌に生産するアルカリセルラーゼが注目さ
れている（特公昭50−28515号公報、特開昭58−224686
号公報、Horikoshiら、J.Gen．Microbiol.,131巻,3339
頁，（1985）、特開昭61−280276号公報、特開昭63−10
9771号公報、特開昭63−240785号公報など）。

しかしながら、一般に、上記の微生物起源のセルラー
ゼは、その構成酵素群が多様であり、また大半の微生物
に於いては、酵素の生産量が少ないこともあって、酵素
の精製が困難であった。即ち、培養液から精製酵素を取
得し、酵素特性を明らかにした例としては、トリコデル
マ ビリデ（Trichoderma viride）のエンドグルカナー
ゼ、エキソグルカナーゼ及びβ−グルコシダーゼ（Beld
manら、Eur．Ｊ.Biochem.,146巻,301頁，（1985）
等）、アスペルギルス アクレアツス（Aspergillus a
culeatus）のセルラーゼ（アビラーゼ）（Araiら、Agri
c．Biol．Chem.,51巻,627頁，（1987））、イルペック
ス ラクテウス（Irpex lacteus）のエンド型及びエキ
ソ型セルラーゼ（Kandaら、Ｊ．Biochem.,87巻,1625
頁，（1980））、シュードモナス フルオレッセンス
（Pseudomonas fluorescens）の３種類のセルラーゼ
（Yamaneら、Ｊ．Biochem.,67巻,19頁，（1970））、ク
ロストリジウム サーモセラム（Clostridium thermoc
ellum）のエンド−β−グルカナーゼの精製（Petreら、
Biochimie,63巻,629頁，（1981））、枯草菌（Bacillus
subtilis）のエンド−β−グルカナーゼ（Kit−sing
ら、Ｊ．Generl．Microbiol.,113巻,2155頁，（198
7）），好アルカリ性バチルス属細菌の２種類のアルカ
リセルラーゼ（CMCアーゼ）（特開昭63−109777号公報
及び特開昭63−109778号公報）、バチルス属細菌の２種
類のアルカリセルラーゼ（特開昭64−37287号公報及び
特開昭64−37288号公報）等が知られているのみであっ
た。

［発明が解決しようとする課題］ しかしながら、上記のセルラーゼの場合に於いても、
構成酵素の多様性等の為に、酵素精製に複雑な多くの操
作を必要とし、それ故に、精製酵素の回収率も低く、或
いはその純度等が十分でない等の問題があった。

〔課題を解決しようとする手段〕

本発明者は、セルラーゼを生産する微生物を自然界に
求め、鋭意捜索を続けてきた結果、今般、栃木県真岡市
の土壌から分離した新規バチルス属細菌を培養すること
によって、弱酸性領域に於いて良く作用し、中性以上の
pH領域で殆ど作用しない新規なセルラーゼを大量に生産
できることを見出し、また培養液から、容易且つ高収率
で精製セルラーゼを取得し得ることを見出し、本発明を
完成した。

すなわち、本発明は新規なセルラーゼKC−Ｉ及びKC−
II、これら産出する微生物（バチルス エスピーKSM−3
30）並びに該セルラーゼの製造法を提供するものであ
る。

本発明の微生物としては、バチルス属に属する細菌で
あり、菌体外にセルラーゼを著量生産する微生物、例え
ばバチルス エスピーKSM−330株が挙げられる。この菌
株は、本発明者が栃木県真岡市の土壌より分離したもの
で、以下に示す菌学的諸性質を示すものであり、微工研
菌寄第11223号として工業技術院微生物工業技術研究所
に寄託されている。尚、菌株の分類に用いた培地は次の
培地Ａ〜Ｌの12種類である。

1.使用した培地の組成（表示は重量％） 培地A:バクトニュートリエント アガー，指示量 培地B:バクトニュートリエント ブロース，指示量 培地C:バクトニュートリエント ブロース，指示量；食
塩7.0 培地D:ポリペプトン,1.0;肉エキス,0.3;KNO₃,0.1 培地E:ポリペプトン,0.7;グルコース,0.5;食塩,0.5 培地F:ポリペプトン,1.5;肉エキス,0.4;乳糖,1.0;蔗糖,
1.0;グルコース,1.0;食塩,0.5;チオ硫酸ナトリウム,0.0
08;亜硫酸ナトリウム,0.04;硫酸第一鉄,0.02;フェノー
ル・レッド,0.002バクト寒天,1.5 培地G:ポリペプトン,1.5;酵母エキス,0.5;可溶性澱粉,
2.0;K₂HPO₄,0.1;バクト寒天,1.5;MgSO₄・7H₂O,0.02（別
滅菌） 培地H:食塩,0.5;MgSO₄・7H₂O,0.02;（NH₄）₂HPO₄,0.1;K
₂HPO₄,0.1;クエン酸ナトリウム,0.2 培地I:肉エキス,1.0;ポリペプトン,1.0食塩,0.5菌接種
後、流動パラフィン−ワセリン1:1を上部約5cm重層、固
化 培地J:トリプトン（ディフコ社製）,0.2;食塩,0.5;K₂HP
O₄,0.03;ブロモチモールブルー,0.008;糖類,1.0（濾過
滅菌） 培地K:酵母エキス,0.5;グルコース,1.0（別滅菌）;K₂HP
O₄,0.1;MgSO₄・7H₂O,0.02（別滅菌）；バクト寒天,1.5
脱脂粉乳,10.0（別滅菌） 培地L:下層：肉汁寒天培地（栄研），指示量 上層：肉汁培地（栄研），指示量；ゼラチン,2
5と肉汁寒天培地，指示量の1:10混合物 （菌学的観察結果） （ａ）顕微鏡的観察結果 菌体の大きさは、0.9〜1.0μｍ×2.5〜3.0μｍの桿菌
であり、菌体内に中立乃至準端立胞子（1.0〜1.3μｍ×
1.5〜2.0μｍ）を形成する。又、周鞭毛を有して運動性
があり、グラム染色では陽性を示した。

（ｂ） 各種培地における生育状態 肉汁寒天培地（培地Ａ） 集落の形状は円形であり、集落の表面は偏平状であ
る。又、集落の色調は白色乃至淡黄色の不透明であり、
光沢がない。

肉汁液体培地（培地Ｂ） 生育し、混濁する。

７％食塩肉汁液体培地（培地Ｃ） 生育し、混濁する。

（ｃ） 生理学的性質 硝酸塩の還元（培地Ｄ） 硝酸還元する。

MRテスト（培地Ｅ） 陽性。

VPテスト（培地Ｅ） 陽性。

インドールの生成（培地Ｄ） 蓚酸紙を用いる試験により、陰性。

硫化水素の生成（培地F,培地Ｄ） 培地Ｆを黒変せず、また酢酸鉛試験紙により、陰性。

澱粉の加水分解（培地Ｇ） ヨウ素反応による検出法により、陰性。

クエン酸の利用（培地Ｈ） クエン酸を利用し、生育する。

カタラーゼ 陽性。

生育温度範囲（培地Ｂ） 10℃から50℃の範囲で生育する。

嫌気条件下での生育（培地Ｉ） 生育せず。

グルコースからガスの生成（培地Ｊ） 陰性。

糖類からの酸の生成（培地Ｊ） グルコース；陽性 アラビノース；陰性 キシロース；陰性 マンニトール；陰性 カゼインの加水分解（培地Ｋ） 平板培地上に生育し、集落周辺にカゼインの加水分解
による透明帯を形成。

ゼラチンを液化（培地Ｌ） 平板培地上に生育し、集落周辺のゼラチンを液化す
る。

以上の菌学的性質についてバージーズ・マニュアル・
オブ・ディタミネイテイブ・バクテリオロジー（Berge
y's Mannual of Determinative Bacteriology）第８版
及びザ・ジーナス・バチルス（“The Genus Bacillua"R
uth,E.Gordon Agriculture Hand−book No.427,Agricul
tural Research Service,U.S.Department of Agricultu
re Washington D.C.,（1973））を参照した結果、本菌
は有胞子桿草であるバチルス（Bacillus）属の一種であ
ると認められた。更に、当該菌株を他のバチルス属の菌
株と比較すると、最も類縁と菌種として、バチルス プ
ミルス（Bacillus pumilus）或いは枯草菌（Bacillus
subtilis）が挙げられる。しかしながら、いずれの菌
株との比較に於いても、アラビノース、キシロース及び
マンニトールから酸の生成の有無の点で、また、バチル
ス プミルスとは硝酸塩の還元能の有無、更に枯草菌と
は澱粉の加水分解の有無の点で、それぞれ異なった性質
を有していることから、本菌株は新菌株であると判断さ
れる。

本発明のバチルス エスピーKSM−330（FERM P−1122
3）を使用したセルラーゼの製造は、当該微生物を適当
な培地に接種し、培養することにより実施される。

セルラーゼの発酵生産にあたっては、適当な培地を加
熱等により殺菌後、バチルス エスピー KSM−330（FE
RM P−11223）を接種し、20℃〜40℃、好ましくは25℃
〜35℃で、１〜４日振盪又は通気撹拌培養すれば良い。
pHは中性付近に調整すると良い結果が得られる。セルラ
ーゼの生産培地としては、資化し得る窒素源と炭素源を
適宜組み合わせて含有させれば良く、特に両栄養源を限
定するものではない。例えば、窒素源としては、硝酸塩
類、或いはカザミノ酸、酵母エキス、肉エキス、ペプト
ンなどが挙げられる。又、炭素源としては、資化し得る
糖類或いは有機酸、例えば、グルコース、フラクトー
ス、麦芽糖、ショ糖、セロビオース、クエン酸などが挙
げられる。その他、リン酸、Mg²⁺,Ca²⁺,Mn²⁺,Zn²⁺,C
o²⁺,Na⁺,K⁺などの無機塩や、必要であれば、無機、有機
微量栄養源を含有する培地を適宜選択して使用される。

斯くして得られた培養物中から目的物資であるセルラ
ーゼの採取及び精製は、例えば、後記実施例に示す如
く、一般の酵素の採取及び精製の手段に準じて行うこと
ができる。

すなわち、培養物を遠心分離、又は濾過法によって菌
体を分離して、その菌体及び培養濾液から通常の分離手
段、例えば、塩析法、等電点沈澱法、溶媒沈澱法によっ
て蛋白を沈殿させたり、又、限外濾過（例えばホローフ
ァイバーH1P3−20、アミコン社製）により濃縮させてセ
ルラーゼの粗酵素を得ることができる。斯くして得られ
た粗酵素をそのまま使用することも可能であるが、粗酵
素標品中には同時に生産された他の酵素類、多糖類等が
混在している。

更に、酵素を精製する場合には例えば、CM−バイオゲ
ル（バイオ・ラド社製）等の陽イオン交換樹脂、或いは
陽イオン交換セルロースを用いたイオン交換クロマトグ
ラフィーを行うことによって、電気泳動的に均一な精製
セルラーゼを得ることが可能である。陽イオン交換樹
脂、或いは陽イオン交換セルロースからの酵素の溶出の
際に、溶出液に含まれる塩の直線濃度勾配（例えばNaCl
0Mから0.2Mまで）を用いた場合、セルラーゼは主成分KC
−Ｉ（0.1〜0.17M NaCl）と副成分KC−II（0.08〜0.15M
NaCl）の二つのピークとして、互いに極めて近い位置
に溶出されるが、両成分はドデシル硫酸ナトリウム−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動に於ける移動度やゲル濾
過に於ける溶出位置に差異が認められず、その構造が極
めて似通っている。

斯くして、得られるセルラーゼの酵素的性質を以下に
述べる。尚、セルラーゼの酵素活性は以下の様にして測
定した。

（１） CMCアーゼ活性 2.5％CMC（山陽国策パルプ社製 サンローズAO1MC）
0.4ml、0.5Mクエン酸緩衝液（pH5.2）0.2ml、及び脱イ
オン水0.3mlからなる基質溶液に酵素液0.1mlを加え、40
℃、20分間反応した。反応後、3,5−ジニトロ−サリチ
ル酸（3,5−dinitro−salicylic acid（DNS））法にて
還元糖の定量を行った。すなわち、反応液1.0mlにDNS試
薬1mlを加え、５分間100℃で加熱発色させ、冷却後、4.
0mlの脱イオン水を加えて希釈した。これを波長535nmで
比色定量した。酵素力価は、上記の条件下で１分間に１
μmolのグルコースに相当する還元糖を生成する酵素量
を１単位とした。

（２） ｐ−ニトロフェニルグルコシド及びｐ−ニトロ
フェニルセロビオシド分解活性 0.8μmolp−ニトロフェニルセロビオシド（シグマ社
製）又はｐ−ニトロフェニルグルコシド（シグマ社製）
と50μmolリン酸緩衝液（pH7.0）又は100mMグリシン緩
衝液（pH9）とを含有する反応液1.0ml中に適当量の酵素
液を30℃で作用させた後、1M Na₂CO₃を0.4ml加え、遊離
するｐ−ニトロフェノールを410nmで比色定量した。酵
素力価は、１分間に１μmolのＰ−ニトロフェノールを
遊離させる酵素量を１単位とした。

（３） アビセル、セルロース粉末、リン酸膨潤セルロ
ース、アルカリ膨潤セルロース及び濾紙分解活性 10mgアビセル（メルク社製）及び100mMグリシン緩衝
液（pH9）を含有する反応液1.0ml中に適当量の酵素を加
え、30℃で280rpmで振盪しながら反応させた。反応後、
DNS法にて還元糖の定量を行った。酵素力価は、１分間
に１μmolのグルコースに相当する還元糖を生成する酵
素量を１単位とした。

その他の活性も、上記の方法に準じて行った。基質と
しては、東洋濾紙社製のセルロース粉末、及び、富田等
の方法（Tomita,Y.ら;J.Fermet.Technol.，52巻,235
頁，（1974））に従って処理したリン酸膨潤セルロース
を使用した。

（酵素学的性質） 1. 作用 セルロース類に作用し、これらを加水分解してセロビ
オース等の還元糖を生成する（KC−Ｉ及びKC−II）。

2. 基質特異性 KC−ＩはCMCに対する活性を主活性として有する他
に、リン酸膨潤セルロース（CMCに対する活性の約７
％）、アビセル（同約５％）、セルロース粉末（同約１
％）、に対する活性を有している。一方、ｐ−ニトロフ
ェニルセロビオシド（PNPC）、及びｐ−ニトロフェニル
グルコシド（PNPG）に対しては殆ど作用しない（第１
表）。

3. 作用pH及び至適作用pH KC−Ｉ、KC−II共に作用pHは4.5〜6.5、最適作用pHは
5.0〜5.5に認められる（第１表）。

4. 安定pH領域 pHの異なる緩衝液の下、５℃で24時間放置した時の安
定pH領域はKC−Ｉ、KC−IIいずれもpH3.0〜11.0の範囲
である（第２図）。

5. 作用温度範囲及び作用至適温度 KC−Ｉ及びKC−IIは10℃から60℃の広い範囲で作用す
るが、作用至適温度は45℃に認められる（第３図）。

6. 熱安定性 KC−Ｉ、KC−IIいずれも、クエン酸緩衝液（pH5）の
下で、各温度で10分間加熱処理した場合、50℃以下で失
活せず、55℃で約50％の残存活性を有するが、60℃では
ほぼ完全に失活する（第４図）。

7. 分子量 バイオゲルＰ−100（バイオ・ラド社製）を用いたゲ
ル濾過法により約39000±3000、ドデシル硫酸ナトリウ
ム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（SDS−PAGE）
により約42000±3000と推定される（KC−Ｉ及びKC−I
I）。

8. UV吸収スペクトル KC−ＩとKC−IIのUV吸収スペクトルはいずれも約280n
mに最大吸収を示し、また、約290nmに肩吸収の存在が認
められる（第５図）。

9. 金属による影響（KC−Ｉ） 酸素反応液中に各種の金属イオンを共存させた場合、
水銀イオン（1mM）による酵素活性の阻害が認められる
（第２表）。一方、酵素活性はコバルトイオン（1mM）
によって若干活性化される。第２表に示した他の金属イ
オンは1mM（ナトリウム、カリウムは50mM）の濃度で酵
素活性に殆ど影響しない。

10. 各種薬剤の影響 ３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（MOPS）
−水酸化ナトリウム緩衝液（pH7.2）中でＮ−ブロモコ
ハク酸イミド（1mM）による処理（30℃、20分間）を行
った場合、酵素の失活が認められる（第３表）。第３表
に示した他の薬剤（1mM）は同条件下で活性に殆ど影響
がしない。

11. 陽イオン交換クロマトグラフィー CM−バイオゲルによるイオン交換クロマトグラフィー
において、KC−Ｉは0.1〜0.17M NaClにより、KC−IIは
0.08〜0.15M NaClにより溶出される（第６図）。

〔発明の効果〕

本発明により、弱酸性領域に於いてCMCの他、リン酸
膨潤セルロース、セルロース粉末、アビセルなどに良く
作用し、且つ広いpH領域、温度領域において安定なセル
ラーゼを容易に高純度、高収率で得ることができる。

〔実施例〕

以下、実施例を挙げ、本発明を具体的に説明する。

実施例１ 栃木県真岡市の土壌1gを滅菌生理食塩水10mlに懸濁
し、80℃で30分間加熱処理した。この熱処理液を適当に
希釈してＰ寒天プレート培地（ポリペプトン1.0％，酵
母エキス0.5％,KH₂PO₄0.1％,Na₂HPO₄・12H₂O0.25％,MgS
O₄・7H₂O0.02％、バクト寒天1.5％）に塗抹し30℃で３
日間培養し、集落を形成させた。これを、上記Ｐ寒天プ
レート培地と同じ組成の培地に２％CMCを加えたものに
レプリカ法を用い移植し、30℃で３〜４日間培養して再
び集落を形成させた後、コンゴー・レッド法（Teather
ら，Appl．Environ．Microbio.,43巻,777頁，（198
2））によって、集落周辺のCMCを分解する能力のある菌
株を検出した。当該する集落をマスタープレートより選
択しセルラーゼ生産菌を分離した。

上述に手法より、バチルス エスピーKSM−330（FERM
P−11223）を取得した。

実施例２ 10mlのＰ培地（Ｐ寒天培地からバクト寒天を除いたも
の）中、30℃で24時間振盪培養したバチルス エスピー
KSM−330（FERM P−11223）を第４表に示した各炭素源
（0.5或いは1.0％）を含むＰ培地に接種し、30℃で24時
間振盪培養した。遠心分離によって菌体を除去した後、
各上清液のセルラーゼ活性を測定したところ、いずれの
炭素源を用いた場合にも特に炭素源を含ませなかった場
合と同様にセルラーゼの生産性が認められたが、特に麦
芽糖1.0％を用いた場合に最も生産性が高く、培養液１
あたり、約1860Uの酵素活性が認められた（第４
表）。

実施例３ 10mlのＰ培地中、30℃で24時間振盪培養したバチルス
エスピーKSM−330（FERM P−11223）を1.0％の麦芽糖
を含むＰ培地に接種し、30℃で24時間振盪培養した。そ
の培養上清液１を限外濾過（ホローファイバーH1P3−
20、アミコン社製）によって約５倍に濃縮後、10mMリン
酸緩衝液（pH7.2）に対して透析し、これを粗酵素溶液
とした。

粗酵素液約150mlをCM−バイオ・ゲルＡ カラム（3.2
×20cm）に通し、非吸着画分を350mlの10mMリン酸緩衝
液（pH7.2）によって溶出後、NaClの直線濃度勾配（０
〜0.2 M）による溶出を行うことによって、２種のセル
ラーゼ（KC−Ｉ（0.1〜0.17M NaClで溶出）及びKC−II
（0.08〜0.15M NaClで溶出））に分画された（第６
図）。両酵素はレームリの方法（Laemmli,Nature,227
巻,680頁，（1097））に従ってドデシル硫酸ナトリウム
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、ゲルを電気
泳動用銀染色キット（関東化学社製）を用いて染色した
ところ、いずれも単一のバンドを与えた（第７図）。得
られた２種類の精製セルラーゼの構成比（KC−I:KC−I
I）は約14:1であり、生産されるセルラーゼの主成分はK
C−Ｉであることが認められた（第５表）。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の精製セルラーゼKC−ＩとKC−IIの反
応pHと相対活性の関係を示す図面である。 第２図は、本発明の精製セルラーゼKC−ＩとKC−IIの処
理pHと残存活性の関係を示す図面である。 第３図は、本発明の精製セルラーゼKC−ＩとKC−IIの反
応温度と相対活性の関係を示す図面である。 第４図は、本発明の精製セルラーゼKC−ＩとKC−IIの処
理温度と残存活性の関係を示す図面である。 第５図は、本発明の精製セルラーゼKC−ＩとKC−IIのUV
吸収スペクトルを示す図面である。 第６図は、CM−バイオゲルによる陽イオン交換クロマト
グラフィーに於ける、本発明のセルラーゼの溶出パター
ンを示す図面である。 第７図は、本発明の精製セルラーゼKC−ＩとKC−IIのド
デシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動の結果を示す図面である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:07） (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 9/42 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】次の物理化学的性質を有するセルラーゼKC
   −Ｉ。 （１）作用 セルロース類に作用し、これらを加水分解してセロビオ
   ース等の還元糖を生成する。 （２）基質特異性 CMCに対する活性を主活性として有する他に、リン酸膨
   潤セルロース、アビセル及びセルロース粉末に対する活
   性を有している。一方、ｐ−ニトロフェニルセロビオシ
   ド（PNPC）、及びｐ−ニトロフェニルグルコシド（PNP
   G）に対しては殆ど作用しない。 （３）作用pH及び至適作用pH 作用pHは4.5〜6.5、最適作用pHは5.0〜5.5に認められ
   る。 （４）安定pH領域 ５℃で24時間放置した時の安定pH領域は3.0〜11.0の範
   囲である。 （５）作用温度範囲及び作用至適温度 10℃から60℃の広い範囲で作用するが、作用至適温度に
   は約45℃に認められる。 （６）熱安定性 クエン酸緩衝液（pH5）の下で、各温度で10分間加熱処
   理した場合、50℃以下で殆ど失活せず、55℃で約50％の
   残存活性を有するが、60℃ではほぼ完全に失活する。 （７）分子量 バイオゲルＰ−100（バイオ・ラド社製）を用いたゲル
   濾過法により約39000±3000、ドデシル硫酸ナトリウム
   −ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（SDS−PAGE）に
   より約42000±3000と推定される。 （８）UV吸収スペクトル UV吸収スペクトルは約280nmに最大吸収を示し、また、
   約290nmに肩吸収の存在が認められる。 （９）金属による影響 水銀イオン（1mM）による酵素活性の阻害が認められ
   る。一方、酵素活性はコバルトイオン（1mM）によって
   若干活性化される。 （10）各種薬剤の影響 ３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（MOPS）−
   水酸化ナトリウム緩衝液（pH7.2）中でＮ−ブロモコハ
   ク酸イミド（1mM）による処理（30℃、20分間）を行っ
   た場合、酵素の失活が認められる。 （11）陽イオン交換クロマトグラフィー CM−バイオゲルによるイオン交換クロマトグラフィーに
   おいて、0.1〜0.17M NaClにより溶出される。
2. 【請求項２】次の物理化学的性質を有するセルラーゼKC
   −II。 （１）作用 セルロース類に作用し、これらを加水分解してセロビオ
   ース等の還元糖を生成する。 （２）作用pH及び至適作用pH 作用pHは4.5〜6.5、最適作用pHは5.0〜5.5に認められ
   る。 （３）安定pH領域 ５℃で24時間放置した時の安定pH領域は3.0〜11.0の範
   囲である。 （４）作用温度範囲及び作用至適温度 10℃から60℃の広い範囲で作用するが、作用至適温度は
   45℃に認められる。 （５）熱安定性 クエン酸緩衝液（pH5）の下で、各温度で10分間加熱処
   理した場合、50℃以下で殆ど失活せず、55℃で約50％の
   残存活性を有するが、60℃では、ほぼ完全に失活する。 （６）分子量 バイオゲルＰ−100（バイオ・ラド社製）を用いたゲル
   濾過法により約39000±3000、ドデシル硫酸ナトリウム
   −ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（SDS−PAGE）に
   より約42000±3000と推定される。 （７）UV吸収スペクトル UV吸収スペクトルは約280nmに最大吸収を示し、約290nm
   に肩吸収の存在が認められる。 （８）各種薬剤の影響 ３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（MOPS）−
   水酸化ナトリウム緩衝液（pH7.2）中でＮ−ブロモコハ
   ク酸イミド（1mM）による処理（30℃、20分間）を行っ
   た場合、酵素の失活が認められる。 （９）陽イオン交換クロマトグラフィー CM−バイオゲルによるイオン交換クロマトグラフィーに
   おいて、0.08〜0.15M NaClにより溶出され、かつ、その
   溶出位置はKC−Ｉよりも前である。
3. 【請求項３】バチルス属に属する、請求項１記載のセル
   ラーゼKC−Ｉ及び請求項２記載のセルラーゼKC−II生産
   菌。
4. 【請求項４】バチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM
   −330と命名され微工研菌寄第11223号として寄託された
   請求項３の生産菌。
5. 【請求項５】請求項３又は４記載の生産菌を培養し、そ
   の培養物から請求項１記載のセルラーゼKC−Ｉ又は請求
   項２記載のセルラーゼKC−IIを取得することを特徴とす
   る、請求項１記載のセルラーゼKC−Ｉ又は請求項２記載
   のセルラーゼKC−IIの製造法。