JP4895507B2

JP4895507B2 - ストレプトマイセス属細菌の培養方法及びこれを利用する有用物質の製造方法

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Publication number: JP4895507B2
Application number: JP2005029073A
Authority: JP
Inventors: 豪人加藤; 喜作志村; 正士酒井
Original assignee: Yakult Honsha Co Ltd
Current assignee: Yakult Honsha Co Ltd
Priority date: 2005-02-04
Filing date: 2005-02-04
Publication date: 2012-03-14
Anticipated expiration: 2025-02-04
Also published as: JP2006211974A

Description

本発明は、ストレプトマイセス属細菌の培養方法に関し、更に詳細には、培地中の炭素源の量を涸渇しないよう維持しつつ培養することにより、同細菌からの抗菌物質の副生を抑制するストレプトマイセス属細菌の培養方法およびこれを利用した当該微生物に由来する有用物質の製造方法に関する。

ストレプトマイセス属細菌は、抗生物質を産生することで知られる放線菌の一種であるが、この微生物を培養することにより種々の有用な物質が産生されることもよく知られている。この微生物から取得できる代表的なものとしては、塩基交換反応を触媒する酵素であるホスホリパーゼD（以下、「PLD」という）を挙げることができる。このPLDは、ホスファチジルセリン（PS）やホスファチジルグリセロール（PG）といった特異的な生理作用を有し、医薬品や食品素材として使用されるリン脂質製造の反応触媒として利用できることが報告されている（特許文献１〜３）。

通常、PLDのような微生物から得られる有用物質は、これを産生する微生物を培養して得られた培養物から分離・精製される。このときの微生物の培養方法や培養条件などは、微生物の培養によって、目的とする有用物質が効率よく産生されるように適宜設定することが望ましいが、一般的には、適当な炭素源、窒素源及びミネラル等の栄養分を含有する培地を用いた既存の方法で行われていることが多い。

しかしながら、微生物は、その種類によってそれぞれ固有の性質を有しており、一般的な既存の培養方法が必ずしも好ましい方法であるとはいえないため、培養する微生物に応じた好適な培養条件を設定することは必要であり、このことは微生物由来の有用物質を取得するための重要な要素の一つとなるものである。

このため、微生物の培養においては、従来から様々な検討がなされており、微生物の増殖因子となり得る素材等を添加することにより、栄養価に富んだ培地を調製し、これを用いて微生物を培養する方法等が報告されている。

一方で、ＦＡＯ（国連食糧農業機構）とＷＨＯ（世界保健機構）とで構成される食品添加物合同専門家委員会（以下、「ＪＥＣＦＡ」という）のガイドラインにおいて、「食品加工に用いる微生物由来の酵素は抗菌活性が陰性であること」と示されていることから、食品素材として、または、これらを製造するための触媒として利用する目的で、微生物から酵素を取得する場合には、抗菌活性を有さないことが必須の要件となっている（非特許文献１）。

しかしながら、微生物から酵素等の有用物質を取得する方法が数多く報告されているにもかかわらず、抗菌活性の発現を低減又は抑制する方法についての報告はほとんどなされていない。そのため、実際に食品への利用を目的とした微生物由来の有用物質を得るには、当該微生物を培養して得られる培養物を溶媒分画やクロマト精製など別途処理して抗菌活性を除去する必要があるが、製造工程の複雑化や収率の低下を招く原因となるため、手間とコストが掛かるという問題がある。

特公平５−４２９１７号特公平５−６０３５７号特開２００２−２１８９９１号公報 JECFA 「The Guide to specifications (FNP5, Rev.2) Vmethods for enzyme preparations」

本発明者らは、食品素材製造用に使用することを目的として、塩基交換反応を触媒することで知られる酵素であるＰＬＤを、同酵素を産生することで知られるストレプトマイセス属細菌から取得する方法を検討したところ、この微生物を培養して得られるＰＬＤを含有する培養物は、抗菌物質を含み、強い抗菌活性を示すことが明らかとなった。そのため、この培養物に認められた抗菌活性を簡便に低減する方法を見出すことが必要となっていた。

すなわち、本発明は、ストレプトマイセス属細菌由来のＰＬＤのような有用物質を、抗菌活性を有さない状態で簡便に製造する方法を提供することをその課題とするものである。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、ストレプトマイセス属細菌の培養の際に、抗菌活性の原因となる抗菌物質の産生能が、培地中に含まれる特定の炭素源の含有量と関連すること、具体的には、培地中に含まれる特定の炭素源が涸渇した場合に抗菌物質の産生が促進されるという知見を得た。そして、この知見に基づき、培地中に含まれる特定の炭素源の量を涸渇させることなく当該微生物を培養すれば、抗菌物質の産生を抑制することができ、ＰＬＤ等の有用物質を、抗菌活性を有さない安全な状態で、簡便に取得することができることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、ストレプトマイセス属細菌を培地中の炭素源が涸渇しないよう維持しつつ培養を行うストレプトマイセス属細菌の培養方法である。

また、本発明は、ストレプトマイセス属細菌を培地中の炭素源が涸渇しないよう維持しつつ培養を行い、当該培養物中から有用物質を採取する実質的に抗菌物質を含まない有用物質の製造方法である。

更にまた、本発明は、ストレプトマイセス属細菌を培地中の炭素源が涸渇しないよう維持しつつ培養を行うことによるストレプトマイセス属細菌からの抗菌物質の産生抑制方法である。

本発明の培養方法によれば、微生物由来の有用物質の産生量を損なうことなく、当該微生物からの抗菌物質の産生を簡便に抑制することができるため、別途抗菌物質を除去する処理を必要とせず、製造過程を簡素化し、かつ、効率よく安価に安全性の優れたストレプトマイセス属細菌由来の有用物質を取得することができる。

本発明の方法においては、培地に添加した炭素源がストレプトマイセス属細菌を培養している際に涸渇しないよう維持することが必要である。

このように培養中の培地に含まれる炭素源を涸渇しないように維持するための方法としては、培養に用いる培地を調製する際に炭素源を過剰に添加しておき、培養終了時までこれが涸渇しないようにしてもよく、また、培養中に適当な間隔で或いは連続的に炭素源を培地に添加し、培養終了時までこれを涸渇させないようにしてもよい。

本発明において、炭素源が「培養中に涸渇しない程度」とは、ストレプトマイセス属細菌の培養開始時から培養終了時までの間に、培地中に含まれる炭素源の量が少なくとも０.１質量％以上残存していることを意味し、このような状態を維持できるように炭素源を培地に添加しておけばよい。

培地に添加する具体的な炭素源の量は、培養するストレプトマイセス属細菌の種類、培地の組成などによって異なる場合があるので、実験的に確認することが望ましいが、ストレプトマイセス属細菌の培養中に適当な間隔或いは連続的に炭素源を培地に添加しない場合には、少なくとも当該微生物の培養に用いる培地に対して２〜３質量％以上添加することが好ましい。

なお、培地に添加する炭素源の量が少なすぎると、ストレプトマイセス属細菌を培養中に培地中の炭素源が涸渇してしまうおそれがあり、それと同時に当該微生物から抗菌物質が産生されてしまうので、好ましくない。

ここで、ストレプトマイセス属細菌から産生される抗菌物質を抑制する目的で、培地中に添加することができる炭素源としては、通常培地の調製に使用されるものであれば特に制限されることなく使用することができる。

具体的には、グリセロール、グルコース、果糖、ショ糖、乳糖、ハチミツ、デンプン、デキストリン等の炭素源、また、脂肪酸、油脂、レシチン、アルコール類等の炭化水素類を挙げることができ、これらは、単独或いは２種類以上を併用して用いてもよい。

また、中でも特に、炭素源としてグリセロールとグルコースをそれぞれ単独で或いは併用して培地に添加すると、ストレプトマイセス属細菌が産生する抗菌物質の抑制効果が顕著に得られるので好ましい。

本発明方法においては、ストレプトマイセス属細菌の培養中に上述するような炭素源を涸渇しない程度に添加する以外は、この分野で通常使用される成分を配合して調製された培地を用いることができる。

培地を構成する炭素源以外の成分としては、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、尿素、硝酸ナトリウム、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カザミノ酸、全脂大豆粉、脱脂大豆粉、大豆蛋白、デスチラーズソリュブル等の窒素源、食塩、カリウム塩、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩、各種ビタミン類等を挙げることができる。特に全脂大豆粉はストレプトマイセス属放線菌からのPLD産生量を高めるため、好ましい。また、これらの組成物を配合して得られる培地のｐＨは、５〜８、好ましくは６〜７の範囲に調整されたものであることが好ましい。

更に、本発明において、培養中に涸渇しない程度の炭素源を添加した培地を用いることによる抗菌物質産生抑制効果は、当該培地の組成のいかんにかかわらず認められるので、培地の組成として挙げられる一般的な上記組成物以外にもストレプトマイセス属細菌の培養において使用することができる増殖活性因子等も培地に配合することが可能である。

一方、本発明で培養するストレプトマイセス属細菌とは、抗生物質を産生することで知られる放線菌の１種であり、具体的なものとしては、Streptomyces prunicolor、Streptomyces cinnamoneus、Streptomyces chromofuscusが知られている。本発明において、これらのストレプトマイセス属細菌を培養するに当っては、上記した培地を使用する以外は特に制限されず、一般的に知られている方法で培養を行えばよい。

例えば、培養方法としては、深部培養法や固体培養法を採用し、培養温度としては、約２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃程度とすればよい。また、培養時間は、当該微生物の培養によって得られる目的物（有用物質）の生産が最大となる段階で停止すればよい。この培養時間は、培地の組成や培養するストレプトマイセス属細菌の種類によっても異なるが、通常１〜６日間程度である。

本発明の方法を用いれば、ストレプトマイセス属細菌の種類に制限されず、当該微生物からの抗菌物質の産生を有意に抑制する効果を得ることができるが、特に培養中に産生される抗菌物質の抑制効果が顕著に認められるStreptomyces prunicolor、Streptomyces cinnamoneusを本発明の方法を用いて培養することが好ましい。

以上説明した本発明の方法を使用することにより、ストレプトマイセス属細菌から実質的に抗菌物質を含まない各種の有用物質を得ることが可能となる。ここで、ストレプトマイセス属細菌から得られる有用物質とは、抗生物質以外の物質を指し、代表的なものとして良く知られているものとしては、特公昭５２−３９９１８号に開示されている塩基交換反応を触媒するホスホリパーゼＤを挙げることができる。また、これ以外にも、ストレプトマイセス属細菌が産生することが知られる物質として、β-アミラーゼ、キチナーゼ、グルコースイソメラーゼ、セルラーゼ、トランスグルタミナーゼ、プロテアーゼ、ムラミダーゼ、リパーゼ等の各種食品、医薬品等に利用できる各種酵素を挙げることができる。

以下、実験例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらになんら制約されるものではない。

実施例１
＜シードの作製＞
(１) 500mlの坂口フラスコに、表１に示す酵母エキス培地100mlを取り、これにStreptomyces prunicolor の凍結保存菌液2ml接種し、28℃、120spmの振盪速度で24時間培養を行った。

酵母エキス培地の組成：

なお、酵母エキス培地は、121℃で15分間オートクレーブ滅菌して使用した。

(２) 500mlの坂口フラスコに、表２に示す大豆粉培地100mlを取り、これに(１)で得た培養液を0.3ml接種し、28℃、120spmの振盪速度で24時間培養してシードを得た。

大豆粉培地の組成：

なお、大豆粉培地は、NaOHでｐHを6.8に調整し、121℃で15分間オートクレーブ滅菌して使用した。

＜ストレプトマイセス属細菌の培養＞
3Lジャーに、表１に示す酵母エキス培地に組成中、グリセロールの添加量が1〜3％となるように調製した酵母エキス培地を1.5L入れ、これに前記(２)で調製したシードを30ml接種し、28℃、500rpmの攪拌速度、0.5vvmの通気量で、24時間培養を行った。このとき、培養の途中で、培養液を一部採取し、経時的に培地中のグリセロール濃度、PLDの産生量及び抗菌活性についてその変化を調べた。その結果を、図1〜3に示す。なお、グリセロール濃度、PLDの産生量及び抗菌活性は、次に示す方法により測定した。

＜グリセロール濃度の測定＞
市販されている測定キット（F−キットグリセロール；ロシュ社製）を用いて常法により測定した。

＜PLD産生量の測定＞
以下のとおり、ホスファチジルコリンの加水分解活性を指標に測定した。
酵素溶解液^※1で適当な濃度に希釈した測定サンプル16.7μlが入った試験管に、ホスファチジルコリンを含む基質溶液^※233.3μlを加え、37℃で正確に10分間反応させた。反応後、予め130℃に加熱したブロックヒーターで10分間加熱し、酵素を失活させた後、1.5mlの発色液^※3を加えて37℃で20分間反応させ、得られた溶液の500nmの吸光度を測定した。同時に、既知量の塩化コリンに発色液を加えて反応させ、得られた溶液の500nmの吸光度を測定して検量線を作製し、そこから測定サンプルの加水分解活性を測定した。なお、事前に基質溶液を加える前の測定サンプルを130℃、10分間加熱失活したものの吸光度をブランクとして、測定サンプルの吸光度の値から差し引いた。また、加水分解活性は、1分間に1μmolのコリンを遊離させる活性を１unitと定義して求めた。

※1酵素溶解液；0.5％のTriton-X100を含む100mM酢酸ナトリウム緩衝液 (pH 6.0)
※2基質溶液；ホスファチジルコリンを1.5％、2-プロパノールを13.5％、Triton-X100
を0.6％含有する酵素溶解液
※3発色液；1.5mlあたり、塩化カルシウム（無水）を0.74mg、4-アミノアンチ
ピリンを0.3mg、フェノールを0.47mg、コリンオキシダーゼを1.5
単位、ペルオキシダーゼを30単位及びTriton-X100を1.5mg含有
する50mM Tris-HCl緩衝液 (pH 8.0)

＜抗菌活性の測定＞
10mlのトリプチケースソイブロス培地に、検定菌をスラントから1白金耳接種し、30℃で24時間静置培養した。一方、滅菌シャーレ（直径9cm）にトリプチケースソイ寒天培地を15ml加え、凝固させた。（基層）検定菌液10mlを50℃のトリプチケースソイ寒天培地100mlに加え、混和後10mlを基層の上に重層した。重層した寒天培地が個化後、滅菌した直径13mmの抗生物質試験用ろ紙をシャーレの中央に置き、そこに0.1mlの測定サンプルを染み込ませ、4℃で一晩放置し、ついで37℃で24時間培養し、ろ紙周囲の発育阻止円を観察し、その発育阻止円の直径を抗菌活性の指標として評価した。

なお、測定サンプルは、培養液から遠心分離により菌体を除去し、上清を凍結乾燥したのちに10質量％になるように滅菌水で溶解したものを使用した。また、抗菌活性の有無は、Bacillus circulansに対する発育阻止円の検出の有無で評価した。

まず、図１の結果から、ストレプトマイセス属細菌は炭素源であるグリセロールを消費しながら増殖していることがわかる。また、図２からも明らかなとおり、培養中に産生されるPLDの量は、グリセロールの量に関係なく、ほぼ同一であった。一方で、図３から明らかなとおり、グリセロールを１％含有する培地で培養した場合にのみ、培養液に抗菌活性が認められた。

なお、グリセロールを2又は3％添加した培地で培養したストレプトマイセス属細菌の培養終了後の培養液について、Staphylococcus aureus、 Escherichia coli、Bacillus cereus、Streputococcus pyrogenes、Serratia marcescensの５菌株に対する発育阻止円の検出の有無を評価したが、いずれも陰性であった。また、グリセロールを１％添加した培地で培養したストレプトマイセス属細菌の培養終了後の培養液について、観察される発育阻止円が溶菌活性によるものでないことを確認した。

ここで、図３の結果と図１の結果を比べると、培地中のグリセロールが涸渇したとほぼ同時に培養液から抗菌活性が認められていることがわかった。すなわち、このことは、ストレプトマイセス属細菌の培養において、培地中のグリセロールの涸渇を防ぐが抗菌活性の誘発に密接な関連性を有することを示唆している。

実施例２
500mlの坂口フラスコに、グリセロール濃度を１％、２％又は３％、若しくはグルコース濃度を１％、２％又は３％とした表1に示す酵母エキス培地100mlを取り、これにStreptomyces prunicolor又はStreptomyces cinnamoneusのスラントから１白金耳を接種した。これを28℃、120spmの振盪速度で最大116時間培養を行った。このとき、培養の途中で、培養液を一部採取し、経時的に培地中のグリセロール又はグルコース濃度、PLDの産生量及び抗菌活性についてその変化を実施例１の場合と同様に調べた。なお、グルコース濃度は、グルコースCII-テストワコー（和光純薬社製）を用いて測定した。その結果を、図４〜９に示す。

図８に示すとおり、培地に添加する炭素源がグルコースであった場合でも、培地中の炭素源を涸渇しないように培養すれば、グリセロールを添加したときと同様に培養後の培養液に発現する抗菌活性を抑制する効果が認められた。また、培養する微生物が、Streptomyces cinnamoneusの場合であっても、ほぼ同等の効果を得られることも明らかとなった。

本発明においては、炭素源が涸渇しないよう維持しつつストレプトマイセス属細菌を培養することにより、特別に培養条件を設定することなく、ストレプトマイセス属細菌からの抗菌物質の産生を抑制することができ、当該微生物から得られる各種有用物質を安全に医薬品や食品等の分野で利用することが可能となる。

従って、本発明により、実質的に抗菌活性を有さないストレプトマイセス属細菌由来のＰＬＤに代表される有用物質を簡便に得ることができる。

培養開始時のグリセロール濃度が異なるStreptomyces prunicolor培養物についての培養時間と培養物中のグリセロール濃度の関係を示した図面培養開始時のグリセロール濃度が異なるStreptomyces prunicolor培養物についての培養時間とＰＬＤ活性の関係を示した図面培養開始時のグリセロール濃度が異なるStreptomyces prunicolor培養物についての培養時間と発育阻止円の大きさの関係を示した図面培養開始時のグルコース濃度が異なるStreptomyces prunicolor培養物についての培養時間と培養物中の炭素源濃度の関係を示した図面培養開始時のグリセロール濃度が異なるStreptomyces cinnamoneus 培養物についての培養時間とＰＬＤ活性の関係を示した図面培養開始時グルコース濃度が異なるStreptomyces prunicolor培養物についての培養時間と発育阻止円の関係を示した図面培養開始時のグリセロール濃度が異なるStreptomyces cinnamoneus 培養物についての培養時間と培養物中の炭素源濃度の関係を示した図面培養開始時のグルコース濃度が異なるStreptomyces prunicolor培養物についての培養時間とＰＬＤ活性の関係を示した図面培養開始時のグリセロール濃度が異なるStreptomyces cinnamoneus 培養物についての培養時間と発育阻止円の関係を示した図面

Claims

ストレプトマイセス・プルニカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｐｒｕｎｉｃｏｌｏｒ）およびストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）からなる群から選択される１種以上のストレプトマイセス属細菌を、２質量％以上の炭素源を添加した培地中で、培地中の炭素源が涸渇しないよう、その量を少なくとも０．１質量％以上に維持しつつ培養を行い、当該培養物中から有用物質を採取することを特徴とする、実質的に抗菌物質を含まない有用物質の製造方法。
有用物質が、ホスホリパーゼＤである請求項１記載の実質的に抗菌物質を含まない有用物質の製造方法。
ストレプトマイセス・プルニカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｐｒｕｎｉｃｏｌｏｒ）およびストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）からなる群から選択される１種以上のストレプトマイセス属細菌を、２質量％以上の炭素源を添加した培地中で培養するにあたり、培地中の炭素源が涸渇しないよう、その量を少なくとも０．１質量％以上に維持しつつ培養を行うことを特徴とするストレプトマイセス属細菌培養培地中での抗菌物質の産生抑制方法。
炭素源が、グリセロール及び／又はグルコースである請求項１〜３のいずれかに記載の方法。