JPS6336790A - リン脂質の塩基交換反応法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は酵素を利用したリン脂質の塩基交換反応法に関
し、特にホスファチジルコリンにホスホリパーゼＤを作
用させる塩基交換反応法に関する。

（従来の技術と発明が解決しようとする問題点）酵素を
利用したリン脂質の塩基交換反応において、ホスファチ
ジルコリンにホスホリパーゼＤを作用させ、塩基交換反
応により目的とする塩基を持つリン脂質を製造する技術
は公知である。Ｃ５゜Ｆ、Ｙａｎｇ、　ｅｔ　ａｌ、、
　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　　２４２＋（３）　４７
７〜４８４　（１９６７））、（Ｒ，Ｍ、Ｃ，Ｄａｗｓ
ｏｎ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｌ、■。

則Ｌ２０５〜２１０　（１９６７）　）これらの技術で
は、主としてキャベツ由来ホスホリパーゼＤを用いて塩
基交換反応を行っているが、その変換率は１３％以下で
あった。また交換反応に使用できるアルコールは、炭素
数５以下の一級アルコールに限られていた。特に、含窒
素アルコールに関しては変換率が非常に低く、高いもの
でも１２％であった。また、単糖については交換反応が
認められなかった。本発明は、これらの点を改善し、使
用できるアルコールの範囲を広げ、しかも高収率で目的
物が得られるリン脂質の塩基交換反応法を提供すること
を目的とする。

（問題点を解決するための手段） 本発明では、基質としてホスファチジルコリンを用い、
ストレプトマイセス屈由来のホスホリパーゼＤを、含窒
素アルコール類またはポリオール頷のアルコールの存在
下に反応せしめ、塩基交換を進行させることを特徴とす
る。

本発明で使用するホスファチジルコリンは、天然から抽
出精製したもの、合成したちのいずれでも良い。

本発明に用いるストレプトマイセス属由来のホスホリパ
ーゼＤは、ストレプトマイセス・クロモホスカス（Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃｈｒｏｍｏｆｏｓｃｕｓ）菌
等のホスホリパーゼＤ生産菌から得られるホスホリパー
ゼＤであり、市販品を使用することができる。

反応はストレプトマイセス属由来のホスホリパーゼＤの
存在下で、ホスファチジルコリンと含窒素アルコール類
またはポリオール類のアルコールを接角虫させることに
より行うことができる。含窒素アルコール類としては、
セリン、エタノールアミン、Ｎ−メチルエタノールアミ
ンおよびＮ、　　Ｎ−ジメチルエタノールアミンの群か
ら、また、ポリオール類としては、グリセロールおよび
単主店の群から選ぶことが好ましい。単糖としてはアル
ドース、ゲトースいずれも用いられ、リボース、アラビ
ノース等のペント−ス、グルコース、フラクトース等の
ヘキソース等が挙げられる。

反応に使用する溶媒は水のみ、あるいは氷と有ｎ、溶媒
である。有機溶媒としてはｎ−ヘプタン、ｎ−ヘキサン
、石油エーテル等の脂肪族炭化水素、シクロベンクン、
シクロ−・キサン等の脂環族炭化水素、ジエチルエーテ
ル、テトラヒドロフラン等のエーテル類、酢酸メチル、
酢酸エチル等のエステル類、四塩化炭素、クロロボルム
等のハロゲン化炭化水素類を挙げることができる。水と
有機溶媒を混合して用いる場合は、水と有ａ？Ｍ媒の比
は適宜に選択できるが、例えば水：有機溶媒を重量比で
ｌ＝Ｉ〜ｏ、ｘ：ｔｏの範囲で用いることができ、副反
応を抑え目的物を高収率で得るためには反応系内の水の
含量は、１０重量％以下で行うのが好ましい。

ホスファチジルコリンとアルコールのモル比はアルコー
ルの種類により適宜選択しなければならないが、一般に
ホスファチジルコリン１モルに対し、５〜１００倍モル
が適当である。

ストレプトマイセス屈由来のホスホリパーゼＤの使用量
は、ホスファチジルコリン１ｇに対して、例えば１００
〜５００単位の範囲で選ぶことができる。

これらの条件で仕込んだものを、例えば２０°Ｃ〜６０
℃の範囲で回転攪拌あるいは超音波による攪拌で３０分
から５時間反応させる。

（発明の効果） 本発明は、ホスファチジルコリンにホスホリパーゼＤを
作用させて行う塩基交換反応において、従来のキャベツ
由来ホスホリパーゼＤのかわりにストレプトマイセス属
由来のホスホリパーゼＤを用いたので、これにより、所
望のアルコールに変換されたリン脂質を高収率で得るこ
とが可能となった。また、キャベツ由来ホスホリパーゼ
Ｄでは交換不可能であったグルコース等の単糖類も交換
可能となった。従って、交換可能なアルコールの範囲を
広げると共に、リン脂質の変換率を改善することができ
る。

（実施例） 以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明する。

実施例１ シバルミ）・イルホスファチジルコリン４０■を１ｍｌ
の水に）Δ濁させたものを１００μ１．０．５　Ｍ凸臀
変バッファー（ｐ）１５）５０μ！、エタノールアミン
（０゜５Ｎ　ｌｌＣｌにてｐＨ５にしたもの）５０ミリ
モル、ジエチルエーテル１ｍｌ、　ストレプトマイセス
屈の菌由来のホスホリパーゼＤ（東洋醸造（）（ト）製
のホスホリパーゼＤＰ）５０単位／　ｍｌ水溶液１０μ
！を３７°Ｃにて１時間５００ｒｐｍの回転で撹拌し、
反応終了後クロロホルムにてリン脂質を抽出した。

得られた抽出物について薄層クロマトグラフィーにて分
析を行った。展開溶媒は、クロロホルム：アセトン：メ
タノール：酢酸：水＝５０：２０：１０：１５：５を用
い、ディソトマー試薬を用いて発色させ、デンジ；・メ
トリーにより生成物の組成比を測定した。

その結果、ホスファチジルエタノールアミン９０％、ホ
スファチジン酸１０％であった。

実施例２ エタノールアミンのかわりにセリンを１００ミリモル加
え、その他は実施例１と同様の組成、条件で反応を行っ
た。反応終了後実施例１と同じ操作にて抽出、分析を行
った。

その結果、ホスファチジルセリン７０％、ホスファチジ
ン酸２０％、ホスファチジルコリン１０％であった。

実施例３ エタノールアミンのかわりにグルコースを１″５０ミリ
モル加え、その他の反応条件、操作は実施例１と全く同
様に行った。

分析結果は、ホスファチジルグルコース６３％。

ホスファチジン酸２１％、ホスファチジルコリン１６％
であった。

実施例４ エタノールアミンのかわりにグリセロールを７０ミリモ
ル加え、その他の反応条件、操作は実施例１と全く同様
に行った。

分析結果は、ホスファチジルグリセロール８１％。

ホスファチジン酸１１％、ホスファチジルコリン８％で
あった。

実施例５ ストレプトマイセス屈由来のホスホリパーゼＤ（東洋醸
造（４１′？ＡのホスホリパーゼＤＰ）のかわりにスト
レプトマイセス・クロモホスカス由来のホスホリパーゼ
Ｄ（ベーリンガーマンハイム社製）に変えた以外は、実
施例１と同様の組成、条件で反応を行った。反応終了後
実施例１と同じ操作にて抽出、分析を行った。

その結果、ホスファチジルエタノールアミン８３％、ホ
スファチジン酸１０％、ホスファチジルコリン７％であ
った。

実施例６ 実施例５において、エタノールアミンのかわりにグルコ
ースを１５０ミリモル加えた以外は、同様の３．■成、
条件で反応を行った。反応終了後実施例１と同じ操作に
て抽出、分析を行った。

その結果、ホスファチジルグルコース５１％、ホスファ
チジン酸１２％、ホスファチジルコリン３７％であった
。

比較例１〜４ ストシブ１−マイセス屈由来のホスホリパーゼＤのかわ
りにキャベツ由来ホスホリパーゼＤを用い、活性化の為
に塩化カルシウムを１０ミリモルを加えた以外は、添加
アルコールとしてエタノールアミン（比較例１）、セリ
ン（比較例２）、グルコース（比較例３）、グリセロー
ル（比較例４）を用い、実施例１〜４までと同様に行っ
た。

実施例および比較例の分析結果を下表に示す。

表から明らかなように、実施例では、比較例よりも、す
べて各アルコールについて著しく高収率で目的物が得ら
れる。

これに対して比較例では、キャベツ由来ホスホリパーゼ
Ｄを使用したので、添加アルコールがエタノールアミン
（比較例１）およびグリセロール（比較例４）の場合、
交換反応による生成物、ホスファチジルエタノールアミ
ンおよび゛ホスファチジルグリセロールへの変換率が実
施例１および４に比較して低い。特に、セリン（比較例
２）およびグルコース（比較例３）の場合には、生成物
のホスファチジルセリンおよびホスファチジルグルコー
スが全く得られなかった。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）酵素を利用してリン脂質の塩基交換反応を行うに
   際し、基質としてホスファチジルコリンを用いストレプ
   トマイセス属由来のホスホリパーゼＤを含窒素アルコー
   ル類またはポリオール類のアルコールの存在下に反応せ
   しめ、塩基交換を進行させることを特徴とするリン脂質
   の塩基交換反応法。
2. （２）含窒素アルコール類がセリン、エタノールアミン
   、Ｎ−メチルエタノールアミンおよびＮ，Ｎ−ジメチル
   エタノールアミンの群から、ポリオール類がグリセロー
   ルおよび単糖の群から選ばれる特許請求の範囲第１項記
   載の塩基交換反応法。
3. （３）反応系内の水の含量が１０重量％以下である特許
   請求の範囲第１項記載の塩基交換反応法。