JPS60164483A - ホスホリパ−ゼｄの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は微生物によるホスホリパーゼＤの製造法に関す
るものである。すなわち、本発明はノカルディア（Ｎｏ
ｃａｒｄｉａ　）属に属するホスホリパーゼＤ生産菌を
培地に培養し、培養物からホスホリパーゼＤを採取する
ことを特徴とするホスホリパーゼＤの製造法である。

ホスホリパーゼＤ　（Ｅ、Ｃ０３−ｉ、ｔｔ、ｔｔ）は
、グリセロ燐脂質のリン酸と含窒素塩基とのエステル結
合を分解し、ホスファチジン酸と塩基とを遊離する酵素
である。またホスホリパーゼＤは、エタノール、グリセ
ロール、エタノールアミン等のアルコール基を有する化
合物の共存下で、グリセロ燐脂質に作用させると、ホス
ファチジン酸をナルコール基へ転移することも知られて
いる。

ホスホリパーゼＤは、キャベツ、ニンジン等の植物界に
広（存在することが古（より知られ、主としてキャベツ
の組織中より抽出して製造されている０又、最近では、
微生物によるホスホリ、パー七Ｄの製造方法として、ス
トレプトマイセス属（特公昭ｊノー３９９１８号公報）
、ミクロモノスポラ属（特開昭３１ｔ−＜ｔ１１０９η
号公報）、ノカルディオプシス属（特開昭３ｇ−１，３
３１１号公報）、アクチノマデューラ属（特開昭６ｇ−
６７１１，３号公報）に属する放線菌を用い、発酵法に
より製造する方法が知られている。

ホスホリパーゼＤは、燐脂質の代謝に関連する研究用試
薬や血清中に含まれるリン脂質の定量用試薬等に利用さ
れる他、各種リン脂質よりのホスファチジン酸、リゾホ
スファチジン酸製造にも利用出来る。

本発明者等は、自然界の土壌中より広（微生物を分離し
、ホスホリパーゼＤを生産する菌株を検索した。その結
果、東京都八王子市の土壌より分離した菌株（ノカルデ
ィア属ＮＱ／９ＪＪ−と称する）を培地に培養すると、
培地中にグリセロ燐脂質に作用してホスファチジン酸と
塩基とを遊離する作用がある酵素が生成されることを確
認し、木菌がホスホリパーゼＤを生産することを見出し
た。またこの酵素は、エタノールアミン、ｌ−アミン−
コープロバノール等の適当なアルコール基を有する化合
物の共存下で、グリセロ燐脂質に作用させた場合、ホス
ファチジン酸をアルコール基へ転移する作用を有する。

上記菌株の菌学的性状は次に示す通りである。

（ａ）形態 本菌株は後記培養性状（第１表）に示す如（、殆んどの
培地で白色乃至灰白色を呈する。菌叢の表面は乾いたカ
サカサした感じで、気菌糸の下は固い皮状の層を形成す
る。イーストエキス・麦芽エキス寒天培地上で２７Ｕ、
ｊ〜３０日間培養し観察した所見は次の通りである。

■気菌糸：ろう状のコロニーの中心附近より白色い気菌
糸を生じ全体に広ろがる。気菌糸の直径はＯ，ユｊ−Ｑ
、ｌＪ−μとａ（、分岐をもって直線又は曲線状に伸長
し、多数の断片に分断した連鎖を形成する。

■気菌糸断片：細い桿状で、大きさＱ、−１ｊ〜０、’
ｌ×Ｏ，ｇ−／、２μ、表面は平滑。

■基土菌糸１公岐をなして伸長し、直径ｏ、３μ、古い
培養では断裂が起る。

■鞭毛胞子、胞子のう：形成せず。

■酸素に対する態度：好気的に生育する〇（ｂ）各神培
地上での性状 以下に記載する実験方法は主としてイー・ビー・シャー
リング（Ｉｎｔ、　Ｊ、　５ｙｓｔ、Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ、　／　４巻、３７３〜３．ＪＱ、／９４／、年）の
方法にしたがって行った。

色調は「色の標準」（財団法人日本色彩研究所。

／９６４年）を用いて決定し、色相名とともに括弧内に
色相名、彩度番号、明度番号の順に色相記号を記入した
。

培養はコｊＣで行い、最も生育の旺盛な一１〜３週間目
の各培地上における観察結果を第１表に示した。但し第
１表中、生育項目に記載した基土菌糸表面の色は胞子着
生前の培養−週間目における観察結果を示した。

（ｃ）生理的性質 ■生育温度：／２Ｕ−＜ｔｏ’ｃ附近で生育し、コ！〜
３７Ｃで最もよ（生育する。ｇｔｃでは生育しない。

■ゼラチンの液化：液化する（グルコース−ペプトン−
ゼラチン培地上、２ＩＣ１３週間培養）。

■スターチの加水分解：僅かに分解する（スターチ寒天
培地上１．２ＩＣ１３週間培養）０■脱脂牛乳の凝固、
ペプトン化：凝固せず、ペプトン化する（３０Ｃ，３〜
４週間培養）。

■メラニン様色素の生成：ペプトンイースト鉄寒天、チ
ロシン寒天で生成しないＣ２ＩＣ，２〜４日間）。

■ダラム染色：陽性 ■抗酸性菌染色：陰性 （ｄ）炭素源の同化性（３ＤＣ，１０〜７６日培養）Ｌ
−アラビノース　＋　シュークロース　＋Ｄ−キシロー
ス　＋　イノシトール　＋Ｄ−グルコース　＋　Ｌ−ラ
ムノース　十〇−フラクトース　＋　ラフィノース　＋
（ｅ）細胞の化学分析 本菌株のディアミノピメリン酸はメン型である。

細胞壁の糖組成は、キシロース、マデュロース等を肩せ
ず、アラビノース、ガラクトース、グルコース等を有す
るＯ 以上の菌学的性状を総括すると、氷雨は好気的条件下に
生育し、気菌糸を着生してイ申長し、多数の断片に分断
した長い連鎖状気菌糸を形成し、ジアミノピメリン酸が
メゾ型であり、力・つ細胞壁のｗ組成ｕマデュロース、
キシロースを有せず、アラビノース、ガラクトース、グ
ルコース等を有し、基土菌糸を断裂し、鞭毛胞子や、胞
子のうを形成しない０このような性状を有する本菌株に
ついてＢｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ
　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂｅｃｔｅｒｉｏｌｏ
ｇｙ第ｇ版、６ｊ２頁〜ｂｓｇ頁（７９２α年）や、レ
シエパリエ（Ｉｎｔｅｒ、　Ｊ、　Ｓｙｓｔｅｍ、Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ。

−〇巻、＜ｔ３ｊ頁〜り４３頁、１９７０年）、メイヤ
ー（Ｉｎｔ、　Ｊ、５ｙｓｔ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、
コロ巻、４ｇ７頁〜１１９３頁、／９７６年）らの分類
法にした力ぶって判定すると、氷雨は細胞壁類型（ｃｅ
ｌｌ　ｗａｌｌｔｙｐｅ　）　ＩＶ型、糖組成類型（ｃ
ｅｌｌ　ｗａｌｌ　ｓｕｇａｒｉ）ａｔｔｅｒｎ　）　
Ａ型であり、ノカルディア属に属するものであると同定
された。

ソコで氷雨は、ノカルディア属Ｎｏ　ｔ　ｔｐ　ｘ　ｓ
　（Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｓｐ　ＮＯ／　ｑ　ａ　ｓ　）
と称することにした０そして氷雨は工業技術院微生物工
業技術研究７ツ１に寄託されており、その受託番号は［
微工研菌寄第７３１）号（ＦＥＢＭ　Ｐ−７３ｇ／）Ｊ
である０木発明における使用舊としては、ノカルディア
属Ｎｏ／９コ！および本菌株を変異処理した変異株だけ
て゛な（、ノカルディア属に属しホスホリパーゼＤを生
産する菌であれば全て用いることが出来る。

本発明を実施するに当り、その培養形態としては、液体
培養、固体培養いづれも用いることが出来るが、工業的
には深部通気攪拌培養を行うのが有利である。

また使用する培養源としては、一般に微生物培養に用い
られる炭素源、窒素源、無機塩、及びその仙の活量−半
善累の他−）力ルディア属に属する微生物の利用するこ
との出来る栄養源であれば、すべて使用することが出来
る。

培地の炭素源としては、例えばブドウ糖、果糖、ショ糖
、乳糖、澱粉、グリセリン、デキストリン、糖蜜、ソル
ビトール等の他、脂肪酸、油脂、粗レシチン、アルコー
ル、有機酸などが矩独でまたは組合せて用いられる。

窒素源としては、無機窒素源、有機窒素蒜いづれでも利
用可能であり、無機窒素源としては、例えば硝酸アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム、尿素、硝酸ソーダ、燐酸１
アンモニウム、燐酸２アンモニウム、塩化アンモニウム
等が挙げられ、また有機窒素係としては、大豆、米、と
うもろこし、綿実、菜種、小麦などの粉、糠、脱脂粕を
はじめ、コンスチーブリカー、ペプトン、酵母エキス、
肉エキス、カゼイン、アミノ酸等が用いられる０無機塩
及び微量栄養素としては、例えばリン酸、マグネシウム
、カリウム、鉄、アルミニウム、カルシウム、マンガン
、亜鉛等の塩類の他、ビタミン、非イオン界面活性剤、
消泡剤等菌の生育やホスホリバーゼＤの生産を促進する
物であれば、必要に応じて使用出来る。

培養は好気的条件で行なわれる。培養温度は菌が発育し
、ホスホリパーゼＤを生産する温度範囲で適宜変更出来
るが、特に好ましいのはコ夕〜３ＩＣである。

培養時間は条件により異なるが、ホスホリパーゼＤが最
高生成量に達するまで培養すればよい。

液体培養の場合は通常７〜３日程度である。

培養物中に生成したホスホリパーゼＤは、液内培養では
主として培養液中に溶けているので、培養終了液より固
形物をｆ別して得られる培養Ｐ液よりホスホリパーゼＤ
を採取する。

培養ｅ液中よりホスホリパーゼＤを採取するに当っては
、通常酵素精製に用いられるあらゆる方法が使用出来る
。例えば硫安、食塩等による塩析、アセトン、エタノー
ル、メタノール等の有機溶剤による沈澱、透析、イオン
交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、ゲ
ルｆ過、吸着剤、等電点沈澱等の方法が使用出来る。さ
らにこれ等の方法を適当に組み合せることによって、ホ
スホリパーゼＤの精製効果が上る場合には、組合せて行
うことが出来る。

これ等の方法により得られる酵素は、安定化剤として各
種塩類、糖質、蛋白質、脂質、界面活性剤等を加えるか
、もしくは加えることなど減圧濃縮、減圧乾燥、凍結乾
燥等の方法により液状又は固形のホスホリパーゼＤにす
ることが出来る。

ホスホリパーゼＤの酵素活性測定法は、基質グリセロ燐
脂質に作用してリン酸と含窒素塩基とのエステル結合を
分解して生ずる塩基の量を測定してめろ。ホスホリパー
ゼＤの活性は、特に記載しないかぎり、以下に記載する
コリンオキシダーゼ法により測定した。

力価測定法： １％卵黄精’Ｍレシチンエマルジョン（０，ｌｆ−レシ
チン、１ｍｌ；エチルエーテル、ｔｏ罰Ｈ水の超音波乳
化液）ｏ、ｔｍＡに、ｏ　、−２Ｍ　ｐＨｇ、ｊトリス
−塩酸緩衝液０．ｌａｄ、０　、　／　Ｍ　ＣａＣｌ２
水溶液０．０！−１蒸留水０．／ｊａｌを混合し、これ
に酵素液ｏ、／ｍｌｔを加え、３７Ｃで２０分反応後、
ｊ　ＯｍＭ　ＥＤＴＡ−２Ｎａを含む／　Ｍ　トＩＪ　
ス−塩酸緩衝液（ｐＨｇ、０）０．−ｍＡを加え、直ち
に５分間煮沸して反応を完全に停止する。次にコリンエ
ステラーゼ測定用試薬〔日本商事（株）製造〕のキット
に含まれるコリン呈色剤を呈色溶解液に溶解した浴液Ｉ
Ｉ　ｍ６を加え、３７Ｃで一θ分ｔＨＪ反応させた後、
ｓ　ｏ　ｏ　ｎｍの吸光度を測定する。

対照としては、あらかじめ熱失活した酵素液を用いて同
様に反応させたものの吸光度を測定する。

そして１時間に７μモルのコリンを遊Ｒｆ＃　スる酵素
活性をｌ単位とする。

次に実施例２に記載した方法により精製した酵素神品を
用いたホスホリパーゼＤの理化学的性質について述べる
。

０作用 グリセロリン脂質のリン酸と含窒素塩基とのエステル結
合を分解してホスファチジン酸と塩基を遊離する。

Ｊ’（４ ■基質特異性 基質トしてレシチン、リゾレシチン、スフィンリに／％
Ｔｒｊｔｏｎ　Ｘ　−／　００を含む水溶液ヲ用イ、上
記力価測定法と同様にして反応させ遊離したコリン量を
測定し、各基質に対するホスホリパーゼＤ１′活性を測
定した。その結果、蒸留水の場合は、レシチンに対する
活性な１００とした時の相対活性は、リゾレシチン３ｊ
Ｏ、スフィンゴミエリン０−／以下であり、１％Ｔｒｉ
ｔｏｎ　Ｘ　’−ｔ　ｏ　ｏの場合は、レシチンに対す
る活性な／ＤＯとした時の相対活性は、リゾレシチン、
１！０．スフィンゴミエリンｏ、ｉ以下であった。

■至適ｐＨ 力価測定法において用いる緩衝液の代りにｐＨ３，ｏ−
ａ−ｏでは塩酸・酢酸ソーダ緩衝液、ｐＨｑ　Ｏ〜ｊ、
ｊでは酢酸・酢酸ソーダ緩衝液、ｐＨオ、！〜ｇ、ｊで
はトリス・マレイン酸・苛性ソーダ緩衝液、ｐＨ７，０
〜９．０ではトリス・塩酸緩衝液、ｐＨ９−Ｄ〜ｌ００
０ではグリシン・苛性ソーダ緩衝液ｐ）（／　／　、　
０〜ノコ、０ではリン酸２ナトリウム・苛性ソーダ緩衝
液を用いてホスホリパーゼＤの活性を測定し、至適ｐＨ
をめた０また同測定法で用いる蒸溜水０．／ｊｍｂの代
りに１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ　−ｔ　ｏ　ｏ　（和光紬薬
）水浴液ｏ、ｉｔｍｂを用いた時の至適ｐＨについても
めた０その結果は第７図に示す通りで、蒸留水を１［１
いた場合の至適ｐＨは９．０付近であり、１％Ｔｒｉｔ
ｏｎＸ−／ＤＯ水溶液を用いた場合の至適ｐＨはｇ、６
付近に認められた。

■至適温度 力価測定法において、反応温度条件を１７、λ！、３２
、μタ、タ０，１夕、乙０，２０、ｇＯおよび９０Ｃで
酵素活性を測定した。その結果は第１図に示す通りであ
って、至適温度はりＯＣから４ｊＣの範囲であると認め
られる。

■ｐＨ安定性 酵素溶液０．／’ｍ８に０．−ｍｂの０．１Ｍの各種緩
衝液、すなわちｐＨ，３，０〜３．夕ではグリシン−塩
酸緩衝ｌ傑、ｐＨ３，ｊ〜７．０では酢酸曝酢酸ソーダ
緩衝液、ｐＨ３，０〜ｇ、０ではトリス・マレイン酸・
苛性ソーダ緩衝液、ｐＨ７，０〜９．０ではトリス・塩
酸緩衝液、ｐＨ９，０〜）０．０ではグリシンダ苛性ソ
ーダ緩衝液、ｐ）（／／、θ〜１２．０では燐酸２ナト
リウム・苛性ソーダ緩衝液を夫々加え、３７Ｃで一時間
保った。その後、これら酵素緩衝浴液にｏ、ｓＭトリス
・塩酸緩衝ＩＰｉＬ　（ｐＨｇ　、ｔ）　／　、　２＋
＋＋Ａを加え、ｐＨをｇ、ｏ〜ｇ、ｔとした。この溶液
Ｊ／ｍ８を用い、力価測定法に従って力価を測定し、安
定ｐＨ範囲を調べた結果、第３図に示した通り本酵素の
特に安定なｐＨ範囲は３．！〜ｌ０００であると認めら
れた。

土だ力価測定法で用いる蒸溜水Ｑ、ｌ夕ｒｕｂの代りに
１％ＴｒｉｔｏｎＸ　−１００＊溶液ｏ、／ｒｕｂを用
いる他は、上記と同様に操作してｐＨ安定範囲を調べた
が、結果は第３図と殆Ｘ７ど変らなかった。

■熱安定性 酵素溶液／　、ＯｍｂＫＯ，１Ｍ）リス−塩酸緩衝液（
ｐＨ７，、！；　）　ｌｉｍｂを加え１．２０．３θ、
３２、ａ、ｔ、ｓｏ、ｊ！、６０、乙！および７０Ｃに
３０分間放置した後、残存する酵素活性を測定した。

その結果は纂ｌＩ−図に示す通りで、３０Ｃで３０分の
熱処理″ｒ″は殆んど失活せず、ＳＯＣ″′Ｃ″３０分
の熱処理でｇＯ係の活性が失活した。

■各種物質による影響 力価測定法においてＣａＣｌ２水溶液の代りに各種物質
の水浴液をｏ、ｏ３ｍｂ加え、酵素反応系中で／　ｍＭ
　１ｌｌｉ度に成るようにして活性を測定した。その結
果は水添加の時の活性をｌＯＯとし、相対活性として賦
活作用のあった物は、ｆｌｌえばＣａＣ１ｚ、５ｎＣ１
２、コール酸ソーダ、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ　−ｔ　ｏ　ｏ
等であり、一方阻害作用のあったものとしてｕＺｎｃ１
２、ＣａＣ１２、ＮｉＣ１，−ＥＤＴＡ　−２Ｎａ　（
：ｒ−チレンジアミン四酢酸２ナトリウム）等である。

■力価の測定法 前述したとおりである。

■精製方浩 前述したとおりであり、その具体例は実施例２にＪ己載
のとおりである。

θΦ等電点 一、オλ±Ｑ、／（アンホライン電気泳動法により測定
） ０分子量 クオ万以上（セファロース６Ｂによるゲル濾過法） 次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発
明はこれによって制限されるものではない０ 実施例　１ シード培地としてグリセリン０．５％、ＮＨ，ｂｌｏ。

００．２ｊ％、ペプトン０．ｊ％、Ｋ２ＨＰＯ４０’＋
　／係、Ｍｇ１３０４０　、０　／％、酵母エキスＱ、
／係を含む水溶液培地（ｐＨ４，＆　）１００ｒａＬを
ｔｏｏｒｎｅ坂ロフラスコロフラスコ侭殺菌後、ノカル
ディア属ＮＯ／　９ｕ、を菌株の胞子を一白金耳接種し
、培養温度３０Ｔ：：、／、２０回回転弁で一日間振盪
培養してシード培養液を得た。

つぎに、木培地すなわちグリセリン７．０％、コーンス
チープリカー／、Ｑ％、ペプトンＯ０！係、粉末酵母エ
キス０．１％、ＮＨ，ＮＯ３０、２Ｊ−係、Ｋ２ＨＰＯ
４０、コ％、Ｍｇ５Ｏ，＊　７Ｈ２００、Ｄ　／幅から
なる培地（ｐＨ７，０）夕Ｏ祷をｊθＯｍｌ容坂ロフラ
スコに入れ、／１．２７Ｃで１０分蒸気殺菌後、シード
珊養液ｊｒｎ６を移植し、２６７：Ｊ：’″Ｃ′λ日間
培養したＯ 培養後、遠心分離して固形物を除去し、培養ｉＥパーゼ
Ｄを沈澱させた。遠心分離により沈澱を集め、ｏ−ｏ、
２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨｇ、Ｊ−）に溶解してホ
スホリパーゼＤ活性を測定した。

この時の培養Ｐ液に対するホスホリパーゼＤの活性回収
率は６７係であった。

実施例　２ きな粉３．０％、コーンスチーブリ力−／、Ｑ％、ペプ
トンｏ、３ｔｆｌ）、粉末酵母エキスｏ、１（１）、グ
リセリンｉ、ｏ％、ＮＨ４Ｎ０．０　＋＋２４−係、Ｋ
２ＨＰＯ４０，−２６％、Ｍｇ５Ｏ，−７Ｈ２００，０
１％、ＦｅＳＯ４・７　Ｈ２Ｏ０、０Ｏｊ係、シリコー
ンＫＭ　−７２９，１％から成る培地（ｐＨ６，り約ｉ
ｍＢを３０！ジャーファーメンタ−に入れ、／　２ＤＣ
でｌ１分間滅菌後、実施例１に記載したシード培養液／
、Ｊ−Ａを植菌し１．２２Ｃで７２時間培養を行った０ 培養後、菌体固形物を遠心分離により除去し、遠心上清
１３ｐ（ｔｏ、ｏｕ７’ｍｂ）を得た。この遠心上清を
ｔＣに冷却した後、−２ｏ　７：：のアセトンを加えて
アセトン濃度ｏ−ｇｏ％画分に相当するホスホリパーゼ
Ｄを含む沈澱物を遠心分離により集めた。この沈澱物を
ｐＨ４，４７）リス−マレイン酸に溶解し、０．０２Ｍ
の同緩衝液に対して透析した後、同緩衝液で平衡化した
ＤＥＡＥ−トヨパールに通塔し活性を吸着後、食塩濃度
勾配法により活性区分を溶出分離した。

次にバイオエンジニアリング社製の限外ｉ１′３過膜（
ＴＹｐｅＧ−１０Ｔ）を用いて濃縮した後、セファロー
ス（５ｅｐｈａｒｏｓｅ　）　Ａ　Ｂ充填カラムに注入
し、蒸留水を用いて通塔し、活性区分を集めて凍結乾燥
した。かぐして約３ｏｄ／）の活性回収率でホスホリパ
ーゼＤを回収し、この時の比活性は６４１ｔＯｕ／ｍｔ
ｉ蛋白ｇｆあった。

【図面の簡単な説明】

図面は本発明方法によって得られるホスホリパーゼＤに
関するもので、第７図は至適ｐＨを示す曲線、＠−図は
至適温度を示す曲線、第３図はｐＨ安定性を示す曲線、
第４図は熱安定性を示す曲線である。 一菟ｖ７１（ Ｈ ＋３図 ＰＨ

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ノカルディア属に属するホスホリパーゼＤ生産菌を培地
   に培養し、培養物からホスホリパーゼＤを採取すること
   を特徴とするホスホリパーゼＤの製造法。