JPS6362195B2 - - Google Patents
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- JPS6362195B2 JPS6362195B2 JP56161076A JP16107681A JPS6362195B2 JP S6362195 B2 JPS6362195 B2 JP S6362195B2 JP 56161076 A JP56161076 A JP 56161076A JP 16107681 A JP16107681 A JP 16107681A JP S6362195 B2 JPS6362195 B2 JP S6362195B2
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Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
本発明は微生物によるホスホリパーゼDの製造
法に関するものである。すなわち、本発明はノカ
ルデイオプシス(Nocardiopsis)属に属するホ
スホリパーゼD生産菌を培地に培養し、培養物か
らホスホリパーゼDを採取することを特徴とする
ホスホリパーゼDの製造法である。 ホスホリパーゼD(E.C.3.1.4.4)は、グリセロ
燐脂質のリン酸と含窒素塩基とのエステル結合を
分解し、ホスフアチジン酸と塩基とを遊離する酵
素である。またホスホリパーゼDは、エタノー
ル、グリセロール、エタノールアミン等のアルコ
ール基を有する化合物の共存下で、グリセロ燐脂
質に作用させると、ホスフアチジン酸をアルコー
ル基へ転移することも知られている。 ホスホリパーゼDは、キヤベツ、ニンジン等の
植物界に広く存在することが古くより知られ、主
としてキヤベツの組織中より抽出して製造されて
いる。又、最近では、微生物によるホスホリパー
ゼDの製造方法として、ストレプトマイセス属
(特公昭52−39918号公報)や、ミクロモノスポラ
属(特開昭54−44094号公報)に属する放線菌を
用い、発酵法により製造する方法が知られてい
る。 ホスホリパーゼDは、燐脂質の代謝に関連する
研究用試薬や血清中に含まれるリン脂質の定量用
試薬等に利用される他、各種リン脂質よりのホス
フアチジン酸製造にも利用出来る。 本発明者等は、自然界の土壌中より広く微生物
を分離し、ホスホリパーゼDを生産する菌株を検
索した。その結果、東京都八王子市の土壌より分
離した菌株(ノカルデイオプシス属NO779と称
する)を培地に培養すると、培地中にグリセロ燐
脂質に作用してホスフアチジン酸と塩基とを遊離
する作用がある酵素が生成されるとを確認し、本
菌がホスホリパーゼDを生産することを見出し
た。またこの酵素を、エタノール、ソルビトー
ル、エタノールアミン、グリセロール等の適当な
アルコール基を有する化合物の共存下で、グリセ
ロ燐脂質に作用させた場合、ホスフアチジン酸を
アルコール基へ転移することも認められた。 上記菌株の菌学的性状は次に示す通りである。 (a) 形態 グルコースアスパラギン寒天、グリセリンアス
パラギン寒天、酵母麦芽寒天培地等では良好に、
また澱粉無機塩培地では中程度に生育して気菌糸
の集落を着生する。 胞子を着生した菌叢の色は培地の種類、観察時
期により若干変化するが、おおむね白色ないし灰
白色から明るい灰色を呈する。 シユークロース硝酸塩寒天、栄養寒天、オート
ミール寒天培地では気菌糸を着生しないか、貧弱
にしか着生しない。 寒天培地上に生育させた本菌株を顕微鏡で観察
すると、気菌糸は0.5〜0.8μで直線状でゆるく波
形又は屈曲を混じえながら分枝をもつて長く伸
び、気菌糸全体は数10から100ケ以上のすべて胞
子からなる連鎖によつて形成されている。 胞子の大きさは0.5〜0.8×0.7×1.0μで、ほぼ短
円筒形で大きさはやや不規則である。 基生菌糸は巾0.5〜0.8μで分枝をもつて伸長し、
寒天培地上ではかならずしも分断しないが、液体
培養することによりほとんどの場合細かく分断す
る。 しかし遊走胞子、胞子のう、菌核等は形成され
ない。 (b) 各種培地上での性状 以下に記載する実験方法は主としてイー・ビ
ー・シヤーリング(Int.J.Syst.Bacteriol.16巻,
313〜340,1966年)の方法にしたがつて行つた。 色調は「色の標準」(財団法人日本色彩研究所,
1964年)を用いて決定し、色相名とともに括弧内
に色相名、彩度番号、明度番号の順に色相記号を
記入した。 培養は25℃で行い、最も生育の旺盛な2〜3週
間目の各培地上における観察結果を第1表に示し
た。但し第1表中、生育項目に記載した基生菌糸
表面の色は胞子着生前の培養一週間目における観
察結果を示しており、胞子着生が早く基生菌糸表
面の色の判定困難な培地については、記載してい
ない。
法に関するものである。すなわち、本発明はノカ
ルデイオプシス(Nocardiopsis)属に属するホ
スホリパーゼD生産菌を培地に培養し、培養物か
らホスホリパーゼDを採取することを特徴とする
ホスホリパーゼDの製造法である。 ホスホリパーゼD(E.C.3.1.4.4)は、グリセロ
燐脂質のリン酸と含窒素塩基とのエステル結合を
分解し、ホスフアチジン酸と塩基とを遊離する酵
素である。またホスホリパーゼDは、エタノー
ル、グリセロール、エタノールアミン等のアルコ
ール基を有する化合物の共存下で、グリセロ燐脂
質に作用させると、ホスフアチジン酸をアルコー
ル基へ転移することも知られている。 ホスホリパーゼDは、キヤベツ、ニンジン等の
植物界に広く存在することが古くより知られ、主
としてキヤベツの組織中より抽出して製造されて
いる。又、最近では、微生物によるホスホリパー
ゼDの製造方法として、ストレプトマイセス属
(特公昭52−39918号公報)や、ミクロモノスポラ
属(特開昭54−44094号公報)に属する放線菌を
用い、発酵法により製造する方法が知られてい
る。 ホスホリパーゼDは、燐脂質の代謝に関連する
研究用試薬や血清中に含まれるリン脂質の定量用
試薬等に利用される他、各種リン脂質よりのホス
フアチジン酸製造にも利用出来る。 本発明者等は、自然界の土壌中より広く微生物
を分離し、ホスホリパーゼDを生産する菌株を検
索した。その結果、東京都八王子市の土壌より分
離した菌株(ノカルデイオプシス属NO779と称
する)を培地に培養すると、培地中にグリセロ燐
脂質に作用してホスフアチジン酸と塩基とを遊離
する作用がある酵素が生成されるとを確認し、本
菌がホスホリパーゼDを生産することを見出し
た。またこの酵素を、エタノール、ソルビトー
ル、エタノールアミン、グリセロール等の適当な
アルコール基を有する化合物の共存下で、グリセ
ロ燐脂質に作用させた場合、ホスフアチジン酸を
アルコール基へ転移することも認められた。 上記菌株の菌学的性状は次に示す通りである。 (a) 形態 グルコースアスパラギン寒天、グリセリンアス
パラギン寒天、酵母麦芽寒天培地等では良好に、
また澱粉無機塩培地では中程度に生育して気菌糸
の集落を着生する。 胞子を着生した菌叢の色は培地の種類、観察時
期により若干変化するが、おおむね白色ないし灰
白色から明るい灰色を呈する。 シユークロース硝酸塩寒天、栄養寒天、オート
ミール寒天培地では気菌糸を着生しないか、貧弱
にしか着生しない。 寒天培地上に生育させた本菌株を顕微鏡で観察
すると、気菌糸は0.5〜0.8μで直線状でゆるく波
形又は屈曲を混じえながら分枝をもつて長く伸
び、気菌糸全体は数10から100ケ以上のすべて胞
子からなる連鎖によつて形成されている。 胞子の大きさは0.5〜0.8×0.7×1.0μで、ほぼ短
円筒形で大きさはやや不規則である。 基生菌糸は巾0.5〜0.8μで分枝をもつて伸長し、
寒天培地上ではかならずしも分断しないが、液体
培養することによりほとんどの場合細かく分断す
る。 しかし遊走胞子、胞子のう、菌核等は形成され
ない。 (b) 各種培地上での性状 以下に記載する実験方法は主としてイー・ビ
ー・シヤーリング(Int.J.Syst.Bacteriol.16巻,
313〜340,1966年)の方法にしたがつて行つた。 色調は「色の標準」(財団法人日本色彩研究所,
1964年)を用いて決定し、色相名とともに括弧内
に色相名、彩度番号、明度番号の順に色相記号を
記入した。 培養は25℃で行い、最も生育の旺盛な2〜3週
間目の各培地上における観察結果を第1表に示し
た。但し第1表中、生育項目に記載した基生菌糸
表面の色は胞子着生前の培養一週間目における観
察結果を示しており、胞子着生が早く基生菌糸表
面の色の判定困難な培地については、記載してい
ない。
【表】
【表】
(c) 生理的性質
生育温度:5℃〜30℃附近で生育し、20〜30
℃で最もよく生育する。 ゼラチンの液化:液化しない(グルコース・
ペプトン・ゼラチン培地上、25℃、3週間培
養)。 スターチの加水分解:分解する(スターチ寒
天培地上、25℃、3週間培養)。 脱脂牛乳の凝固、ペプトン化:凝固、ペプト
ン化共にせず(30℃、3〜4週間培養)。 メラニン様色素の生成:ペプトンイースト鉄
寒天、チロシン寒天で生成する(25℃、2〜4
日間)。 (d) 炭素源の同化性(30℃、10〜16日培養) L―アラビノース − シユークロース − D―キシロース − イノシトール − D―グルコース + L―ラムノース − D―フラクトース − ラフイノース − (e) 細胞の化学分析 本菌株のデイアミノピメリン酸はメソ型であ
り、ヒドロキシデイアミノピメリン酸を含まな
い。細胞壁の糖組成は、アラビノース、キシロー
ス、マデユロース、ラムノース等を有せず、ガラ
クトース、マンノース等を有する。又本菌株はノ
カルドミコール酸を有しない。 以上の分析結果についてBergey′s Manual of
the Determinative Bacteriology第8版,657頁
〜658頁(1974年)や、レシエバリエ(Inter.J.
System.Bacteriol.20巻,435頁〜443頁,1970
年)、メイヤー(Int.J.Syst.Bacteriol.26巻,487
頁〜493頁1976年)らの分類法にしたがつて判定
すると、本菌は細胞壁類型(cell wall type)
型、糖組成類型(cell wall sugar pattern)C
型となる。 以上本菌は、細胞壁類型が、糖組成類型がC
であることから、レシエバリエの分類法によれば
ダソンビレイタイプのアクチノマデユーラ属、サ
ーモアクチノミセス属、アクチノビイフイダス
属、ゲオダーマトフイラス属のいづれかに属す
る。 しかし本菌は、その形態において気菌糸のすべ
てが胞子の長い連鎖から成り、基生菌糸を細かく
分断するが、内生胞子、遊走胞子、胞子のうが見
い出されないことにより、ダソンビレイタイプの
アクチノマデユーラ属(Genus Actinomadura
dassonvillei type)に同定するのが分類上妥当で
ある。なお、近年ダソンビレイタイプのアクチノ
マデユーラ属はメイヤーの提起した新属ノカルデ
イオプシス属に統合され、ノカルデイオプシス属
の名称で取り扱われることが一般的である。 そこで本菌は、ノカルデイオプシス属NO779
(Genus Nocardiopsis sp NO779)と称するこ
とにした。そして本菌は工業技術院微生物工業技
術研究所に寄託されており、その受託番号は「微
工研条寄第512号(FERM BP―512)」である。 本発明における使用菌としては、ノカルデイオ
プシス属NO779および本菌株を変異処理した変
異株だけでなく、ノカルデイオプシス属(旧属名
アクチノマデユーラ ダソンビレイタイプ属)に
属しホスホリパーゼDを生産する菌であれば全て
用いることが出来る。 本発明を実施するに当り、その培養形態として
は、液体培養、固体培養いづれも用いることが出
来るが、工業的には深部通気撹拌培養を行うのが
有利である。 また使用する培養源としては、一般に微生物培
養に用いられる炭素源、窒素源、無機塩、及びそ
の他の微量栄養素の他、ノカルデイオプシス属に
属する微生物の利用することの出来る栄養源であ
れば、すべて使用することが出来る。 培地の炭素源としては、例えばブドウ糖、果
糖、シヨ糖、乳糖、澱粉、グリセリン、デキスト
リン、糖蜜、ソルビトール等の他、脂肪酸、油
脂、粗レシチン、アルコール、有機酸などが単独
でまたは組合せて用いられる。 窒素源としては、無機窒素源、有機窒素源いづ
れでも利用可能であり、無機窒素源としては、例
えば硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、尿
素、硝酸ソーダ、燐酸1アンモニウム、燐酸2ア
ンモニウム、塩化アンモニウム等が挙げられ、ま
た有機窒素源としては、大豆、米、とうもろこ
し、綿実、菜種、小麦などの粉、糠、脱脂粕をは
じめ、コンスチープリカー、ペプトン、酵母エキ
ス、肉エキス、カゼイン、アミノ酸等が用いられ
る。 無機塩及び微量栄養素としては、例えばリン
酸、マグネシウム、カリウム、鉄、アルミニウ
ム、カルシウム、マンガン、亜鉛等の塩類の他、
ビタミン、非イオン界面活性剤、消泡剤等菌の生
育やホスホリパーゼDの生産を促進する物であれ
ば、必要に応じて使用出来る。 培養は好気的条件で行なわれる。培養温度は菌
が発育し、ホスホリパーゼDを生産する温度範囲
で適宜変更出来るが、特に好ましいのは20〜35℃
である。 培養時間は条件により異なるが、ホスホリパー
ゼDが最高生成量に達するまで培養すればよい。
液体培養の場合は通常1〜3日程度である。 培養物中に生成したホスホリパーゼDは、液内
培養では主として培養液中に溶けているので、培
養終了液より固形物を別して得られる培養液
よりホスホリパーゼDを採取する。 培養液中よりホスホリパーゼDを採取するに
当つては、通常酵素精製に用いられるあらゆる方
法が使用出来る。例えば硫安、食塩等による塩
析、アセトン、エタノール、メタノール等の有機
溶剤による沈澱、透析、イオン交換クロマトグラ
フイー、吸着クロマトグラフイー、ゲル過、吸
着剤、等電点沈澱等の方法が使用出来る。さらに
これ等の方法を適当に組み合せることによつて、
ホスホリパーゼDの精製効果が上る場合には、組
合せて行うことが出来る。 これ等の方法により得られた酵素は、安定化剤
として各種塩類、糖質、蛋白質、脂質、界面活性
剤等を加えるか、もしくは加えることなく減圧濃
縮、減圧乾燥、凍結乾燥等の方法により液状又は
固形のホスホリパーゼDにすることが出来る。 ホスホリパーゼDの酵素活性測定法は、基質グ
リセロ燐脂質に作用してリン酸と含窒素塩基との
エステル結合を分解して生ずる塩基の量を測定し
て求める。ホスホリパーゼDの活性は、特に記載
しないかぎり、以下に記載するコリンオキシダー
ゼ法により測定した。 力価測定法: 1%卵黄精製レシチンエマルジヨン(0.1gレ
シチン、1mlエチルエーテル、10ml蒸留人の超音
波乳化液)0.1mlに、0.2MPH7.2トリス―塩酸緩衝
液0.1ml、0.1M CaCl2水溶液0.05ml、蒸留水0.15
mlを混合し、これに酵素液0.1mlを加え、37℃で
20分反応後、50mM EDTA―2Naを含む1Mトリ
ス―塩酸緩衝液(PH8.0)0.2mlを加え、直ちに5
分間煮沸して反応を完全に停止する。次にコリン
エステラーゼ測定用試薬〔日本商事(株)製造〕のキ
ツトに含まれるコリン呈色剤を呈色溶解液に溶解
した溶液4mlを加え、37℃で20分間反応させた
後、500nmの吸光度を測定する。 対照としては、あらかじめ熱失活した酵素液を
用いて同様に反応させたものの吸光度を測定す
る。 そして1時間に1μモルのコリンを遊離する酵
素活性を1単位とする。 次に実施例3に記載した方法により精製した酵
素標品を用いたホスホリパーゼDの理化学的性質
について述べる。 作 用 グリセロリン脂質のリン酸と含窒素塩基とのエ
ステル結合を分解してホスフアチジン酸と塩基を
遊離する。 基質特異性 基質としてレシチン、リゾレシチン、スフイン
ゴミエリンのいづれか1つを0.5μモル含むエマル
ジヨン0.1mlを用い、蒸留水の代りに1%Triton
X―100を含む水溶液を用いる以外は、上記力価
測定法と同様にして反応させ遊離したコリン量を
測定し、各基質に対するホスホリパーゼD活性を
測定した。その結果、レシチンに対する活性を
100とした時の相対活性は、リゾレシチン4.9、ス
フインゴミエリン0.3であつた。 至適PH 力価測定法において用いる緩衝液の代りにPH
3.0〜4.0では蟻酸・蟻酸ソーダ緩衝液、PH4.0〜
5.5では酢酸・酢酸ソーダ緩衝液、PH5.5〜8.5では
トリス・マレイン酸・苛性ソーダ緩衝液、PH7.0
〜9.0ではトリス・塩酸緩衝液、PH9.0〜10.0では
グリシン、苛性ソーダ緩衝液を用いてホスホリパ
ーゼDの活性を測定し、至適PHを求めた。また同
測定法で用いる蒸溜水0.15mlの代りに1%Triton
X―100(和光純薬)水溶液0.15mlを用いた時の至
適PHについても求めた。 その結果は第1図に示す通りで、蒸留水を用い
た場合の至適PHは6.5〜7.0付近であり、1%
Triton X―100水溶液を用いた場合の至適PHは
5.0付近に認められた。 至適温度 力価測定法において、反応温度条件を10,20,
25,37,40,50,55,60,70,80および90℃で酵
素活性を測定した。その結果は第2図に示す通り
であつて、至適温度は60℃から80℃の範囲である
と認められる。 PH安定性 酵素溶液0.1mlに0.2mlの0.1Mの各種緩衝液、す
なわちPH3.0〜3.5ではグリシン・塩酸緩衝液、PH
3.5〜7.0では酢酸・酢酸ソーダ緩衝液、PH5.0〜
8.0ではトリス・マレイン酸・苛性ソーダ緩衝液、
PH7.0〜9.0ではトリス・塩酸緩衝液、PH9.0〜9.5
ではグリシン・苛性ソーダ緩衝液を夫々加え、25
℃で2時間保つた。その後、これら酵素緩衝溶液
に0.5Mトリス・塩酸緩衝液(PH7.2)1.2mlを加
え、PHを7.0〜7.3とした。この溶液0.1mlを用い、
力価測定法に従つて力価を測定し、安定PH範囲を
調べた結果、第3図に示した通り本酵素の特に安
定なPH範囲は4.0〜7.0であると認められた。 また力価測定法で用いる蒸溜水0.15mlの代りに
1%Triton X―100水溶液0.15mlを用いる他は、
上記と同様に操作してPH安定範囲を調べたが、結
果は第3図と殆んど変らなかつた。 熱安定性 酵素溶液0.1mlに0.1Mトリス―塩酸緩衝液(PH
7.2)4mlを加え、20,30,37,40,50,60およ
び65℃に30分間放置した後、残存する酵素活性を
測定した。その結果は第4図に示す通りで、30℃
で30分の熱処理では殆んど失活せず、50℃で30分
の熱処理で80%の活性が残存した。 各種物質による影響 力価測定法においてCaCl2水溶液の代りに各種
物質の水溶液を0.05ml加え、酵素反応系中で
1mM濃度に成るようにして活性を測定した。そ
の結果は水添加の時の活性を100とし、相対活性
として賦活作用のあつた物は、例えばAlCl3、
CuSO4、ZnSO4、CoCl2、CaCl2、FeCl3、
FeSO4、MgCl2、SnCl2、デオキシコール酸ソー
ダ、エタノール,イソプロパノール,t―ブタノ
ールの如き第1級、第2級、又は第3級アルコー
ル、Triton X―100等であり、一方阻害作用の
あつたものとしてはドデシル硫酸ソーダ、セチル
ピリジニウムクロライド等である。 力価の測定法 前述したとおりである。 精製方法 前述したとおりであり、その具体例は実施例3
に記載のとおりである。 等電点 4.85±0.1(アンホライン電気泳動法により測
定) 転移作用 キヤベツのホスホリパーゼDはレシチンからホ
スフアチジン酸を生成し、これを炭素数1から6
までの直鎖の1級アルコールに転移してエステル
を形成することが知られている。本酵素について
も同様に転移作用を調べた結果、本酵素では更に
広範囲のアルコールに転移が起りエステルが形成
することが判明した。基質となるリン脂質として
もレシチン以外のジアシルエステル型、モノアシ
ルエステル型、プラスマローゲン型、シクロアル
キリデン型、ジアルキルエーテル型、モノアルキ
ルエーテル型のα―グリセロリン脂質、及びβ―
グリセロリン脂質が用いられ、またスフインゴリ
ン脂質もよい基質となる。 転移の起るアルコールとしては次の分類ものが
あげられる。 A 1級アルコール (1) 炭素数1から22までの脂肪族アルコール及び
それに第1級、第2級、第3級アミン、ハロゲ
ン、水酸基、カルボン酸とそのエステル、エー
テル、アルデヒド、ケトン等の置換基を有する
もの (2) ペントース、ヘキソース及びそれにアミノ
基、酸アマイド等の置換基を有するもの (3) 糖アルコール及び多価アルコール (4) 二糖類 (5) 芳香族アルコール及びそれにアミノ基、ハロ
ゲン、カルボン酸等の置換基を有するもの (6) 脂環式アルコール (7) 炭素多環式アルコール (8) フラン環、フタルイミド環、ピロール環、イ
ンドール環、ピリジン環、モルホリン環、ピリ
ミジン環、ピペラジン環、イミダゾピリミジン
環等の複素環アルコール B 第2級アルコール (1) 炭素数3から10までの脂肪族アルコール及び
それに各種置換基を有するもの (2) 芳香族アルコール (3) 脂環式アルコール これらの基質とアルコールを組合わせて転移作
用が起つたかどうかを調べた結果が第2表であ
る。第2表では、転移(エステル)の生成が認め
られたものを+少量の生成があつたものを±、生
成の認められなかつたものを−で示した。また各
アルコールの前の記号は上記アルコールの分類番
号を示す。これと同様の検査を市販のキヤベツか
ら得られたホスホリパーゼDを用いて行つたが、
転移物(エステル)の生成したものは全くなかつ
た。 次に転移作用の実験方法を述べる。 0.4M、PH5.7酢酸緩衝液0.1ml、0.1M CaCl2水
溶液0.05ml、ホスホリパーゼD250単位を含む酵
素液0.1ml、1%リン脂質エマルジヨン(0.1gリ
ン脂質、1mlエーテル、10ml蒸留水の超音波乳化
液)0.1ml及び10%アルコール溶液(溶解度に応
じて水、エーテルまたはアセトンを用いる)0.15
mlを混合し、37℃で1〜5時間反応させた。反応
終了後、50ミリモルのEDTAを含む1モル、PH
8.0のトリス塩酸緩衝液0.2mlとクロロホルム―メ
タノール混液(2:1)5mlを加え、混合して転
移生成(エステル)を抽出した。静置後、下層を
分取し、減圧乾燥後少量のクロロホルム―メタノ
ール混液(1:1)に溶かし、薄層クロマトグラ
フイーにて転移生成物(エステル)の検出を行つ
た。その結果を第2表に示す。
℃で最もよく生育する。 ゼラチンの液化:液化しない(グルコース・
ペプトン・ゼラチン培地上、25℃、3週間培
養)。 スターチの加水分解:分解する(スターチ寒
天培地上、25℃、3週間培養)。 脱脂牛乳の凝固、ペプトン化:凝固、ペプト
ン化共にせず(30℃、3〜4週間培養)。 メラニン様色素の生成:ペプトンイースト鉄
寒天、チロシン寒天で生成する(25℃、2〜4
日間)。 (d) 炭素源の同化性(30℃、10〜16日培養) L―アラビノース − シユークロース − D―キシロース − イノシトール − D―グルコース + L―ラムノース − D―フラクトース − ラフイノース − (e) 細胞の化学分析 本菌株のデイアミノピメリン酸はメソ型であ
り、ヒドロキシデイアミノピメリン酸を含まな
い。細胞壁の糖組成は、アラビノース、キシロー
ス、マデユロース、ラムノース等を有せず、ガラ
クトース、マンノース等を有する。又本菌株はノ
カルドミコール酸を有しない。 以上の分析結果についてBergey′s Manual of
the Determinative Bacteriology第8版,657頁
〜658頁(1974年)や、レシエバリエ(Inter.J.
System.Bacteriol.20巻,435頁〜443頁,1970
年)、メイヤー(Int.J.Syst.Bacteriol.26巻,487
頁〜493頁1976年)らの分類法にしたがつて判定
すると、本菌は細胞壁類型(cell wall type)
型、糖組成類型(cell wall sugar pattern)C
型となる。 以上本菌は、細胞壁類型が、糖組成類型がC
であることから、レシエバリエの分類法によれば
ダソンビレイタイプのアクチノマデユーラ属、サ
ーモアクチノミセス属、アクチノビイフイダス
属、ゲオダーマトフイラス属のいづれかに属す
る。 しかし本菌は、その形態において気菌糸のすべ
てが胞子の長い連鎖から成り、基生菌糸を細かく
分断するが、内生胞子、遊走胞子、胞子のうが見
い出されないことにより、ダソンビレイタイプの
アクチノマデユーラ属(Genus Actinomadura
dassonvillei type)に同定するのが分類上妥当で
ある。なお、近年ダソンビレイタイプのアクチノ
マデユーラ属はメイヤーの提起した新属ノカルデ
イオプシス属に統合され、ノカルデイオプシス属
の名称で取り扱われることが一般的である。 そこで本菌は、ノカルデイオプシス属NO779
(Genus Nocardiopsis sp NO779)と称するこ
とにした。そして本菌は工業技術院微生物工業技
術研究所に寄託されており、その受託番号は「微
工研条寄第512号(FERM BP―512)」である。 本発明における使用菌としては、ノカルデイオ
プシス属NO779および本菌株を変異処理した変
異株だけでなく、ノカルデイオプシス属(旧属名
アクチノマデユーラ ダソンビレイタイプ属)に
属しホスホリパーゼDを生産する菌であれば全て
用いることが出来る。 本発明を実施するに当り、その培養形態として
は、液体培養、固体培養いづれも用いることが出
来るが、工業的には深部通気撹拌培養を行うのが
有利である。 また使用する培養源としては、一般に微生物培
養に用いられる炭素源、窒素源、無機塩、及びそ
の他の微量栄養素の他、ノカルデイオプシス属に
属する微生物の利用することの出来る栄養源であ
れば、すべて使用することが出来る。 培地の炭素源としては、例えばブドウ糖、果
糖、シヨ糖、乳糖、澱粉、グリセリン、デキスト
リン、糖蜜、ソルビトール等の他、脂肪酸、油
脂、粗レシチン、アルコール、有機酸などが単独
でまたは組合せて用いられる。 窒素源としては、無機窒素源、有機窒素源いづ
れでも利用可能であり、無機窒素源としては、例
えば硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、尿
素、硝酸ソーダ、燐酸1アンモニウム、燐酸2ア
ンモニウム、塩化アンモニウム等が挙げられ、ま
た有機窒素源としては、大豆、米、とうもろこ
し、綿実、菜種、小麦などの粉、糠、脱脂粕をは
じめ、コンスチープリカー、ペプトン、酵母エキ
ス、肉エキス、カゼイン、アミノ酸等が用いられ
る。 無機塩及び微量栄養素としては、例えばリン
酸、マグネシウム、カリウム、鉄、アルミニウ
ム、カルシウム、マンガン、亜鉛等の塩類の他、
ビタミン、非イオン界面活性剤、消泡剤等菌の生
育やホスホリパーゼDの生産を促進する物であれ
ば、必要に応じて使用出来る。 培養は好気的条件で行なわれる。培養温度は菌
が発育し、ホスホリパーゼDを生産する温度範囲
で適宜変更出来るが、特に好ましいのは20〜35℃
である。 培養時間は条件により異なるが、ホスホリパー
ゼDが最高生成量に達するまで培養すればよい。
液体培養の場合は通常1〜3日程度である。 培養物中に生成したホスホリパーゼDは、液内
培養では主として培養液中に溶けているので、培
養終了液より固形物を別して得られる培養液
よりホスホリパーゼDを採取する。 培養液中よりホスホリパーゼDを採取するに
当つては、通常酵素精製に用いられるあらゆる方
法が使用出来る。例えば硫安、食塩等による塩
析、アセトン、エタノール、メタノール等の有機
溶剤による沈澱、透析、イオン交換クロマトグラ
フイー、吸着クロマトグラフイー、ゲル過、吸
着剤、等電点沈澱等の方法が使用出来る。さらに
これ等の方法を適当に組み合せることによつて、
ホスホリパーゼDの精製効果が上る場合には、組
合せて行うことが出来る。 これ等の方法により得られた酵素は、安定化剤
として各種塩類、糖質、蛋白質、脂質、界面活性
剤等を加えるか、もしくは加えることなく減圧濃
縮、減圧乾燥、凍結乾燥等の方法により液状又は
固形のホスホリパーゼDにすることが出来る。 ホスホリパーゼDの酵素活性測定法は、基質グ
リセロ燐脂質に作用してリン酸と含窒素塩基との
エステル結合を分解して生ずる塩基の量を測定し
て求める。ホスホリパーゼDの活性は、特に記載
しないかぎり、以下に記載するコリンオキシダー
ゼ法により測定した。 力価測定法: 1%卵黄精製レシチンエマルジヨン(0.1gレ
シチン、1mlエチルエーテル、10ml蒸留人の超音
波乳化液)0.1mlに、0.2MPH7.2トリス―塩酸緩衝
液0.1ml、0.1M CaCl2水溶液0.05ml、蒸留水0.15
mlを混合し、これに酵素液0.1mlを加え、37℃で
20分反応後、50mM EDTA―2Naを含む1Mトリ
ス―塩酸緩衝液(PH8.0)0.2mlを加え、直ちに5
分間煮沸して反応を完全に停止する。次にコリン
エステラーゼ測定用試薬〔日本商事(株)製造〕のキ
ツトに含まれるコリン呈色剤を呈色溶解液に溶解
した溶液4mlを加え、37℃で20分間反応させた
後、500nmの吸光度を測定する。 対照としては、あらかじめ熱失活した酵素液を
用いて同様に反応させたものの吸光度を測定す
る。 そして1時間に1μモルのコリンを遊離する酵
素活性を1単位とする。 次に実施例3に記載した方法により精製した酵
素標品を用いたホスホリパーゼDの理化学的性質
について述べる。 作 用 グリセロリン脂質のリン酸と含窒素塩基とのエ
ステル結合を分解してホスフアチジン酸と塩基を
遊離する。 基質特異性 基質としてレシチン、リゾレシチン、スフイン
ゴミエリンのいづれか1つを0.5μモル含むエマル
ジヨン0.1mlを用い、蒸留水の代りに1%Triton
X―100を含む水溶液を用いる以外は、上記力価
測定法と同様にして反応させ遊離したコリン量を
測定し、各基質に対するホスホリパーゼD活性を
測定した。その結果、レシチンに対する活性を
100とした時の相対活性は、リゾレシチン4.9、ス
フインゴミエリン0.3であつた。 至適PH 力価測定法において用いる緩衝液の代りにPH
3.0〜4.0では蟻酸・蟻酸ソーダ緩衝液、PH4.0〜
5.5では酢酸・酢酸ソーダ緩衝液、PH5.5〜8.5では
トリス・マレイン酸・苛性ソーダ緩衝液、PH7.0
〜9.0ではトリス・塩酸緩衝液、PH9.0〜10.0では
グリシン、苛性ソーダ緩衝液を用いてホスホリパ
ーゼDの活性を測定し、至適PHを求めた。また同
測定法で用いる蒸溜水0.15mlの代りに1%Triton
X―100(和光純薬)水溶液0.15mlを用いた時の至
適PHについても求めた。 その結果は第1図に示す通りで、蒸留水を用い
た場合の至適PHは6.5〜7.0付近であり、1%
Triton X―100水溶液を用いた場合の至適PHは
5.0付近に認められた。 至適温度 力価測定法において、反応温度条件を10,20,
25,37,40,50,55,60,70,80および90℃で酵
素活性を測定した。その結果は第2図に示す通り
であつて、至適温度は60℃から80℃の範囲である
と認められる。 PH安定性 酵素溶液0.1mlに0.2mlの0.1Mの各種緩衝液、す
なわちPH3.0〜3.5ではグリシン・塩酸緩衝液、PH
3.5〜7.0では酢酸・酢酸ソーダ緩衝液、PH5.0〜
8.0ではトリス・マレイン酸・苛性ソーダ緩衝液、
PH7.0〜9.0ではトリス・塩酸緩衝液、PH9.0〜9.5
ではグリシン・苛性ソーダ緩衝液を夫々加え、25
℃で2時間保つた。その後、これら酵素緩衝溶液
に0.5Mトリス・塩酸緩衝液(PH7.2)1.2mlを加
え、PHを7.0〜7.3とした。この溶液0.1mlを用い、
力価測定法に従つて力価を測定し、安定PH範囲を
調べた結果、第3図に示した通り本酵素の特に安
定なPH範囲は4.0〜7.0であると認められた。 また力価測定法で用いる蒸溜水0.15mlの代りに
1%Triton X―100水溶液0.15mlを用いる他は、
上記と同様に操作してPH安定範囲を調べたが、結
果は第3図と殆んど変らなかつた。 熱安定性 酵素溶液0.1mlに0.1Mトリス―塩酸緩衝液(PH
7.2)4mlを加え、20,30,37,40,50,60およ
び65℃に30分間放置した後、残存する酵素活性を
測定した。その結果は第4図に示す通りで、30℃
で30分の熱処理では殆んど失活せず、50℃で30分
の熱処理で80%の活性が残存した。 各種物質による影響 力価測定法においてCaCl2水溶液の代りに各種
物質の水溶液を0.05ml加え、酵素反応系中で
1mM濃度に成るようにして活性を測定した。そ
の結果は水添加の時の活性を100とし、相対活性
として賦活作用のあつた物は、例えばAlCl3、
CuSO4、ZnSO4、CoCl2、CaCl2、FeCl3、
FeSO4、MgCl2、SnCl2、デオキシコール酸ソー
ダ、エタノール,イソプロパノール,t―ブタノ
ールの如き第1級、第2級、又は第3級アルコー
ル、Triton X―100等であり、一方阻害作用の
あつたものとしてはドデシル硫酸ソーダ、セチル
ピリジニウムクロライド等である。 力価の測定法 前述したとおりである。 精製方法 前述したとおりであり、その具体例は実施例3
に記載のとおりである。 等電点 4.85±0.1(アンホライン電気泳動法により測
定) 転移作用 キヤベツのホスホリパーゼDはレシチンからホ
スフアチジン酸を生成し、これを炭素数1から6
までの直鎖の1級アルコールに転移してエステル
を形成することが知られている。本酵素について
も同様に転移作用を調べた結果、本酵素では更に
広範囲のアルコールに転移が起りエステルが形成
することが判明した。基質となるリン脂質として
もレシチン以外のジアシルエステル型、モノアシ
ルエステル型、プラスマローゲン型、シクロアル
キリデン型、ジアルキルエーテル型、モノアルキ
ルエーテル型のα―グリセロリン脂質、及びβ―
グリセロリン脂質が用いられ、またスフインゴリ
ン脂質もよい基質となる。 転移の起るアルコールとしては次の分類ものが
あげられる。 A 1級アルコール (1) 炭素数1から22までの脂肪族アルコール及び
それに第1級、第2級、第3級アミン、ハロゲ
ン、水酸基、カルボン酸とそのエステル、エー
テル、アルデヒド、ケトン等の置換基を有する
もの (2) ペントース、ヘキソース及びそれにアミノ
基、酸アマイド等の置換基を有するもの (3) 糖アルコール及び多価アルコール (4) 二糖類 (5) 芳香族アルコール及びそれにアミノ基、ハロ
ゲン、カルボン酸等の置換基を有するもの (6) 脂環式アルコール (7) 炭素多環式アルコール (8) フラン環、フタルイミド環、ピロール環、イ
ンドール環、ピリジン環、モルホリン環、ピリ
ミジン環、ピペラジン環、イミダゾピリミジン
環等の複素環アルコール B 第2級アルコール (1) 炭素数3から10までの脂肪族アルコール及び
それに各種置換基を有するもの (2) 芳香族アルコール (3) 脂環式アルコール これらの基質とアルコールを組合わせて転移作
用が起つたかどうかを調べた結果が第2表であ
る。第2表では、転移(エステル)の生成が認め
られたものを+少量の生成があつたものを±、生
成の認められなかつたものを−で示した。また各
アルコールの前の記号は上記アルコールの分類番
号を示す。これと同様の検査を市販のキヤベツか
ら得られたホスホリパーゼDを用いて行つたが、
転移物(エステル)の生成したものは全くなかつ
た。 次に転移作用の実験方法を述べる。 0.4M、PH5.7酢酸緩衝液0.1ml、0.1M CaCl2水
溶液0.05ml、ホスホリパーゼD250単位を含む酵
素液0.1ml、1%リン脂質エマルジヨン(0.1gリ
ン脂質、1mlエーテル、10ml蒸留水の超音波乳化
液)0.1ml及び10%アルコール溶液(溶解度に応
じて水、エーテルまたはアセトンを用いる)0.15
mlを混合し、37℃で1〜5時間反応させた。反応
終了後、50ミリモルのEDTAを含む1モル、PH
8.0のトリス塩酸緩衝液0.2mlとクロロホルム―メ
タノール混液(2:1)5mlを加え、混合して転
移生成(エステル)を抽出した。静置後、下層を
分取し、減圧乾燥後少量のクロロホルム―メタノ
ール混液(1:1)に溶かし、薄層クロマトグラ
フイーにて転移生成物(エステル)の検出を行つ
た。その結果を第2表に示す。
【表】
【表】
分子量
約35000(Ultrogel ACA34ゲル濾過法により測
定) 次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明する
が、本発明はこれによつて制限されるものではな
い。 実施例 1 脱脂小麦胚芽10gに硫安0.1g、ペプトン0.1
g、及び水8mlを500ml容三角フラスコに入れ、
121℃で15分間蒸気殺菌後、ノカルデイオプシス
属NO779の胞子水懸濁液2mlを接種した。そし
て培養温度25℃で静置30日間培養した。 培養終了後、100mlの水を加えてホスホリパー
ゼDを抽出した後、固形物を別し、液中のホ
スホリパーゼDの活性を測定した。その結果は
3.5u/mlであつた。 実施例 2 シード培地として澱粉1%、(NH4)
H2PO40.25%、ペプトン0.25%、K2HPO40.2%、
MgSO40.01%を含む水溶液培地(PH6.8)100mlを
500ml坂口フラスコに入れ、蒸気殺菌後、ノカル
デイオプシス属NO779菌株の胞子を一白金耳接
種し、培養温度30℃、120回転/分で2日間振盪
培養しシード培養液を得た。 つぎに本培地すなわちグルコース1.0%、コー
ンスチープリカー1.0%、ペプトン0.5%、粉末酵
母エキス0.1%、NH4NO30.5%、K2HPO40.2%、
MgSO4・7H2O0.01%からなる培地(PH6.0)50ml
を500ml容坂口フラスコに入れ、121℃で10分蒸気
殺菌後、シード培養液5mlを移植し、25℃で2日
間培養した。 培養後、遠心分離して固形物を除去し、培養
液50ml(5.2u/ml)を得た。これに硫安22.7gを
撹拌しながら徐々に加えてホスホリパーゼDを沈
澱させた。遠心分離により沈澱を集め、0.02Mト
リス―塩酸緩衝液(PH7.2)に溶解してホスホリ
パーゼD活性を測定した。 この時の培養液に対するホスホリパーゼDの
活性回収率は56%であつた。 実施例 3 きな粉3.0%、コーンスチープリカー1.0%、ペ
プトン0.5%、粉末酵母エキス0.1%、グルコース
1.0%、NH4NO30.25%、K2HPO40.4%、
MgSO4・7H2O0.01%、ツウイン(Tween)―
850、1%から成る培地(PH6.0)約15を30ジ
ヤーフアーメンターに入れ、120℃で15分間滅菌
後、実施例2に記載したシード培養液1.5を植
菌し、27℃で40時間培養を行つた。 培養後、菌体固形物を遠心分離により除去し、
遠心上清13(32.2u/ml)を得た。この遠心上
清を5℃に冷却した後、−20℃のアセトンを加え
てアセトン濃度30〜70%画分に相当するホスホリ
パーゼDを含む沈澱物を遠心分離により集めた。
この沈澱物をPH6.0トリスーマレイン酸に溶解し、
0.02Mの同緩衝液に対して透析した後、同緩衝液
で平衝化したDEAE―セルロースに通塔し、通過
区分を集めた。次に堀内等の方法〔J・
Biochem.81,1639(1977)〕で調整したパルミト
イルガーゼをカラムに充填し、充分に水洗してか
ら上記DEAE―セルロース通過液を注入し、活性
を吸着した。これを0.05Mトリス―塩酸緩衝液
(PH7.2)で洗浄後、0.2%Triton X―100を含む
同緩衝液を加え活性を溶出した。活性区分を集め
てバイオエンジエアリング社製の限外過膜
(Type G―10T)を用いて濃縮した後、ゲル
過担体としてトヨパールHW―55F〔東洋曹達(株)
製〕充填カラムに注入し、蒸留水を用いて通塔
し、活性区分を集めて凍結乾燥を行つた。 この乾燥粉末を0.025Mイミダゾール―塩酸
(PH7.4)に溶解後、フアルマシア・フアインケミ
カルス社製のポリバツフア交換体PBETM94(20ml)
充填カラムに通塔して活性を吸着後、同社製の溶
出用ポリバツフア(PH5.0)を用いてPH勾配によ
り溶出した。溶出したホスホリパーゼDの活性区
分を集めて限外過膜にて濃縮し、セフアデツク
スG―75充填カラムに通塔し、ホスホリパーゼD
活性区分を集めて凍結乾燥した。 かくして約40%の活性回収率でホスホリパーゼ
Dを回収し、この時の比活性は10700u/mg蛋白
質であつた。
定) 次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明する
が、本発明はこれによつて制限されるものではな
い。 実施例 1 脱脂小麦胚芽10gに硫安0.1g、ペプトン0.1
g、及び水8mlを500ml容三角フラスコに入れ、
121℃で15分間蒸気殺菌後、ノカルデイオプシス
属NO779の胞子水懸濁液2mlを接種した。そし
て培養温度25℃で静置30日間培養した。 培養終了後、100mlの水を加えてホスホリパー
ゼDを抽出した後、固形物を別し、液中のホ
スホリパーゼDの活性を測定した。その結果は
3.5u/mlであつた。 実施例 2 シード培地として澱粉1%、(NH4)
H2PO40.25%、ペプトン0.25%、K2HPO40.2%、
MgSO40.01%を含む水溶液培地(PH6.8)100mlを
500ml坂口フラスコに入れ、蒸気殺菌後、ノカル
デイオプシス属NO779菌株の胞子を一白金耳接
種し、培養温度30℃、120回転/分で2日間振盪
培養しシード培養液を得た。 つぎに本培地すなわちグルコース1.0%、コー
ンスチープリカー1.0%、ペプトン0.5%、粉末酵
母エキス0.1%、NH4NO30.5%、K2HPO40.2%、
MgSO4・7H2O0.01%からなる培地(PH6.0)50ml
を500ml容坂口フラスコに入れ、121℃で10分蒸気
殺菌後、シード培養液5mlを移植し、25℃で2日
間培養した。 培養後、遠心分離して固形物を除去し、培養
液50ml(5.2u/ml)を得た。これに硫安22.7gを
撹拌しながら徐々に加えてホスホリパーゼDを沈
澱させた。遠心分離により沈澱を集め、0.02Mト
リス―塩酸緩衝液(PH7.2)に溶解してホスホリ
パーゼD活性を測定した。 この時の培養液に対するホスホリパーゼDの
活性回収率は56%であつた。 実施例 3 きな粉3.0%、コーンスチープリカー1.0%、ペ
プトン0.5%、粉末酵母エキス0.1%、グルコース
1.0%、NH4NO30.25%、K2HPO40.4%、
MgSO4・7H2O0.01%、ツウイン(Tween)―
850、1%から成る培地(PH6.0)約15を30ジ
ヤーフアーメンターに入れ、120℃で15分間滅菌
後、実施例2に記載したシード培養液1.5を植
菌し、27℃で40時間培養を行つた。 培養後、菌体固形物を遠心分離により除去し、
遠心上清13(32.2u/ml)を得た。この遠心上
清を5℃に冷却した後、−20℃のアセトンを加え
てアセトン濃度30〜70%画分に相当するホスホリ
パーゼDを含む沈澱物を遠心分離により集めた。
この沈澱物をPH6.0トリスーマレイン酸に溶解し、
0.02Mの同緩衝液に対して透析した後、同緩衝液
で平衝化したDEAE―セルロースに通塔し、通過
区分を集めた。次に堀内等の方法〔J・
Biochem.81,1639(1977)〕で調整したパルミト
イルガーゼをカラムに充填し、充分に水洗してか
ら上記DEAE―セルロース通過液を注入し、活性
を吸着した。これを0.05Mトリス―塩酸緩衝液
(PH7.2)で洗浄後、0.2%Triton X―100を含む
同緩衝液を加え活性を溶出した。活性区分を集め
てバイオエンジエアリング社製の限外過膜
(Type G―10T)を用いて濃縮した後、ゲル
過担体としてトヨパールHW―55F〔東洋曹達(株)
製〕充填カラムに注入し、蒸留水を用いて通塔
し、活性区分を集めて凍結乾燥を行つた。 この乾燥粉末を0.025Mイミダゾール―塩酸
(PH7.4)に溶解後、フアルマシア・フアインケミ
カルス社製のポリバツフア交換体PBETM94(20ml)
充填カラムに通塔して活性を吸着後、同社製の溶
出用ポリバツフア(PH5.0)を用いてPH勾配によ
り溶出した。溶出したホスホリパーゼDの活性区
分を集めて限外過膜にて濃縮し、セフアデツク
スG―75充填カラムに通塔し、ホスホリパーゼD
活性区分を集めて凍結乾燥した。 かくして約40%の活性回収率でホスホリパーゼ
Dを回収し、この時の比活性は10700u/mg蛋白
質であつた。
図面は本発明方法によつて得られるホスホリパ
ーゼDに関するもので、第1図は至適PHを示す曲
線、第2図は至適温度を示す曲線、第3図はPH安
定性を示す曲線、第4図は熱安定性を示す曲線で
ある。
ーゼDに関するもので、第1図は至適PHを示す曲
線、第2図は至適温度を示す曲線、第3図はPH安
定性を示す曲線、第4図は熱安定性を示す曲線で
ある。
Claims (1)
- 1 ノカルデイオプシス属に属するホスホリパー
ゼD生産菌を培地に培養し、培養物からホスホリ
パーゼDを採取することを特徴とするホスホリパ
ーゼDの製造法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP56161076A JPS5863388A (ja) | 1981-10-12 | 1981-10-12 | ホスホリパ−ゼdの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP56161076A JPS5863388A (ja) | 1981-10-12 | 1981-10-12 | ホスホリパ−ゼdの製造法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS5863388A JPS5863388A (ja) | 1983-04-15 |
JPS6362195B2 true JPS6362195B2 (ja) | 1988-12-01 |
Family
ID=15728165
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP56161076A Granted JPS5863388A (ja) | 1981-10-12 | 1981-10-12 | ホスホリパ−ゼdの製造法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS5863388A (ja) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5867183A (ja) * | 1981-10-15 | 1983-04-21 | Meito Sangyo Kk | ホスホリパ−ゼdの製造方法 |
JPS6188891A (ja) * | 1984-10-08 | 1986-05-07 | Meito Sangyo Kk | 酵素法スフインゴリン脂質複素環化合物誘導体の製法 |
JPS6188886A (ja) * | 1984-10-08 | 1986-05-07 | Meito Sangyo Kk | 酵素法リン脂質長鎖アルコ−ル誘導体の製法 |
JPS6188890A (ja) * | 1984-10-08 | 1986-05-07 | Meito Sangyo Kk | 酵素法リン脂質複素環化合物誘導体の製法 |
JPS6188887A (ja) * | 1984-10-08 | 1986-05-07 | Meito Sangyo Kk | 酵素法1−o−アルキル−2−アシルグリセロリン脂質誘導体の製法 |
JPS6336790A (ja) * | 1986-08-01 | 1988-02-17 | Nippon Oil & Fats Co Ltd | リン脂質の塩基交換反応法 |
-
1981
- 1981-10-12 JP JP56161076A patent/JPS5863388A/ja active Granted
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS5863388A (ja) | 1983-04-15 |
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