JPH0378115B2 - - Google Patents

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JPH0378115B2
JPH0378115B2 JP58063306A JP6330683A JPH0378115B2 JP H0378115 B2 JPH0378115 B2 JP H0378115B2 JP 58063306 A JP58063306 A JP 58063306A JP 6330683 A JP6330683 A JP 6330683A JP H0378115 B2 JPH0378115 B2 JP H0378115B2
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phospholipid
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Shigeaki Kato
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Meito Sangyo KK
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Description

【発明の詳細な説明】
本発明は、酵素法によるリン脂質糖類誘導体の
製法に関し、従来酵素法によつて製造できないと
されていたリン脂質糖類誘導体を包含して広い範
囲のリン脂質糖類誘導体の製造を可能とした酵素
法リン脂質糖類誘導体の製法に関する。更に詳し
くは、従来酵素法で使用されたキヤベツ由来のホ
スホリパーゼＤ（至適温度40℃以下、至適PH5.4〜
5.6）とは異なつて、至適温度60〜70℃、至適PH
７付近のホスホリパーゼDMの存在下で、リン脂
質と糖類もしくはそのフエノール配糖体とを反応
させるリン脂質糖類誘導体の製法に関する。 尚、本発明に於て、リン脂質糖類誘導体とは、
出発物質であるリン脂質のリン酸構造部分とアル
コール構造部分とのエステル結合を、ホスホリパ
ーゼDMの作用で加水分解すると同時に、上記反
応に用いる糖類もしくはそのフエノール配糖体を
転移させて誘導した、出発物質とは異なる新しい
リン脂質を意味する。 特に、本発明は、下記式（） 但し式中、 Ａは を示し、ここで、R1及びR2はそれぞれ−Ｏ−
COR11又は−Ｏ−R12であり、或いはR1とR2は一
緒になつて
【式】［ここで、ｎ は11〜19の数を示す］を表わし、上記において、
R11及びR12は同一もしくは相異り各々C7〜C21の
飽和もしくは不飽和の脂肪族炭化水素基を示し、 Ｂは−（CH2）2Ｎ＋（CH3）3、−（CH2）2NH2、 −CH2CH（NH2）COOH、 −CH2CH2NH（CH3）、 −CH2CH2N（CH3）2、 −CH2CHOHCH2OH又は−（CH2）mH［ここで、
ｍは１〜５の数を示す］を示す、 で表わされるリン脂質と、 (b) 少なくとも１個の一級アルコール基を含み且
つ該一級アルコール基のOHを含めて合計で３
個以上の水酸基を有する、アミノ基もしくはア
セチルアミノ基で置換されていてもよい、炭素
数５〜７の単糖類及び二糖類から選ばれる糖
類、又は該糖類のフエノール配糖体とを、リン
脂質と糖類又は糖類のフエノール配糖体との間
の転位反応を触媒しうるホスホリパーゼＤ、例
えばホスホリパーゼDMの存在下に反応させる
ことを特徴とする下記式（） 但し式中、 Ｒは上記糖類又は該糖類のフエノール配糖体
の一級アルコール基からOHを１個又は２個除
いた残基を示し、 ｑは１または２であり、 Ａは前記定義のとおりである、 で表わされるリン脂質糖類誘導体の製法に関す
る。 従来、ホスホリパーゼＤが、リン脂質たとえば
ホスフアチジルコリンのコリン塩基−リン酸エス
テルを加水分解し、遊離塩基とホスフアチジン酸
を生ずる反応を触媒することが知られている
〔M.Kates Can.J.Biochem physiol 32571
（1954）〕。 更に、リン脂質たとえばレシチンとエチルアル
コールとをホスホリパーゼＤの存在下に反応させ
ると、リン脂質のリン酸構造部分と該リン脂質の
アルコール構造部分とのエステル結合が加水分解
されると同時にホスフアチジル基転移作用によ
り、ホスフアチジルエタノールを生成することが
報告されている〔Dawson；Biochem.J.、102、
205（1967）〕：〔Yang；J.Biol.Chem.、242、477
（1967）〕。 上述のようなホスホリパーゼＤのホスフアチジ
ル基転移作用が知られて以来、この分野における
研究が進められ、英国特許No.1581810（対応西ドイ
ツ国公開No.2717547）の提案が知られている。 この提案によれば、この提案の一般式で示され
たリン脂質と、水酸基、ハロゲン、アミノその他
の置換基で置換されていてもよいC5までの直鎖
もしくは分枝のアルキル基を有する一級アルコー
ルとの前記キヤベツ由来のホスホリパーゼＤの酵
素作用を利用した一級アルコール転移反応につい
て開示されている。そして、該反応は、５を超え
る炭素原子を含有しない一級アルコールでのみ起
り、若し、５を超える炭素原子を含有する該アル
コールの場合には、反応の主生成物は対応するホ
スフアチジン酸であると記載されている。更に、
該提案にはアルコール成分の選択は、上記の要求
を満した一級アルコールである限りとくべつな制
約のないことも記載されている。糖類もしくはそ
のフエノール配糖体については、勿論、全く記載
も示唆もされていない。 更に、R.M.Dawsonは、リン脂質としてレシチ
ンを用い、糖類として、シユクロース、グルコー
ス及びガラクトースを夫々用い、キヤベツ由来の
公知ホスホリパーゼＤによる実験の結果、レシチ
ン基質のホスフアチジル基のこれら糖類への転移
は起らなかつたことを報告している〔Biochem.、
J.vol.102、205〜209（1967）〕。 又、S.F.Yangは、グルコース及びイノシトー
ルを用いて上記と同様な実験の結果、糖類への転
移は起らなかつたことを報告している〔J.Biol.
Chem.、vol.242、477−484（1967）〕。 上述のように、従来ホスホリパーゼＤによるリ
ン脂質とアルコールとの間の転移反応は、一級ア
ルコールとくに炭素原子の比較的小さな一級アル
コールの場合にしか生起せず、糖類との間には生
じないというのが技術常識であつた。 本発明者等は、従来公知のホスホリパーゼＤと
は、その至適温度、至適PH等で異なるホスホリパ
ーゼＤ生産能を有する微生物の存在を発見して、
既に、特願昭56−161076号（特開昭58−63388号
公報）及び特願昭56−163475号（特開昭58−
67183号公報）に提案した。 更に、研究を進めた結果、該ホスホリパーゼＤ
生産性微生物の生産する酵素は、従来、リン脂質
糖類誘導体は形成できないとなされていたにも拘
わらず、広い範囲のリン脂質と糖類もしくはその
フエノール配糖体間の転移反応を可能とする酵素
的触媒作用を示すという驚くべき事実を発見し
た。 本発明者等は研究によれば、リン脂質とたとえ
ばフラクトースとの間におけるリン脂質等類誘導
体の形成を触媒する本発明に於て新たにホスホリ
パーゼDMと呼称する酵素が存在し、このホスホ
リパーゼDMの存在下に、前記式（）で表わさ
れるリン脂質と前記の糖類もしくはそのフエノー
ル配糖体とを反応させることにより、従来製造で
きないと云われたリン脂質糖類誘導体を包含して
新しい誘導体が製造できることが発見された。 斯くて、煩雑且つ不利益な化学的合成手段を要
することなしに、温和且つ容易な条件及び手段
で、副反応を伴うおそれもなしに、酵素法によつ
て新しいリン脂質糖類誘導体を好収率で製造でき
ることがわかつた。 従つて、本発明の目的は新しい酵素法リン脂質
糖類誘導体の製法を提供するにある。 本発明の上記目的及び更に多くの他の目的なら
びに利点は、以下の記載から一層明らかとなるで
あろう。 本発明方法で利用する原料リン脂質は下記式
（）で表わされる。 但し式中、 Ａは を示し、ここで、R1及びR2は共に−Ｏ−COR11
であるか、もしくは共に−Ｏ−R12であるか、も
しくは式（）においてR1とR2は一緒になつて
【式】 〔ここで、ｎは11〜19の数を示す〕を表わし、上
記に於て、R11及びR12は同一でも異つていても
よく、夫々、C7〜C21の飽和もしくは不飽和の脂
肪族炭化水素基を示し、Ｂは−（CH2）2Ｎ＋
（CH3）3、−（CH2）2NH2、−CH2CH（NH2）
COOH、−CH2CH2NH（CH3）、−CH2CH2N
（CH3）2、−CH2CHOHCH2OHもしくは−（CH2）
mH〔ここで、ｍは１〜５の数を示す〕を示す。 上記式（）原料リン脂質は公知化合物であつ
て、市場でも入手可能であり、それ自体公知の方
法によつて天然物より抽出採取又は合成すること
ができる。例えば、動植物組織から公知の手段で
抽出して得られるレシチン、ケフアリン、ホスフ
アチジルセリン、ホスフアチジル−Ｎ−メチルエ
タノールアミン、ホスフアチジルグリセロール、
ホスフアチジル−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタノールア
ミン、ホスフアチジン酸アルキルエステル等の単
独或るいは混合物をそのまま若しくは精製して用
いることができるし、β型リン脂質やアルキルエ
ーテル型リン脂質についても、それ自体公知の方
法によつてその構造の一部もしくは全部を化学合
成して利用することができる。 本発明方法に於て、上記式（）原料リン脂質
とホスホリパーゼDMの存在下に反応せしめる糖
類もしくはそのフエノール配糖体は、少なくとも
１ケの一級アルコール基を含み、且つ全体で３ケ
以上の水酸基を有する炭素数５〜７の単糖類及び
二糖類から選ばれた糖類、ここで該糖類はアミノ
基もしくはアセチルアミノ基で置換されていても
よい、又はこれら糖類のフエノール配糖体であ
る。 このような糖類もしくはそのフエノール配糖体
の具体例としては、以下の如き糖類もしくはその
フエノール配糖体を例示することができる。 すなわち、ペントースとしては、Ｄ及びＬ−ア
ラピノース、Ｄ−リボース、２−デオキシ−Ｄ−
リボース、Ｄ−リキソース、Ｄ−キシロース、Ｄ
及びＬ−リプロース、Ｄ及びＬ−キシルロース、
α又はβ−メチルキシロサイド、２−Ｏ−メチル
キシロース、β−メチル−Ｄ又はＬ−アラビノサ
イド、ヘキソースとしては、２−デオキシ−Ｄ−
グルコース、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトー
ス、Ｄ−マンノース、Ｌ−ソルボース、Ｄ−タロ
ース、Ｄ−フラクトース、α又はβ−メチルガラ
クトサイド、α又はβ−メチルグルコサイド、α
又はβ−メチルマンノサイド、３−Ｏ−メチルグ
ルコース、１−チオ−β−ガラクトース、β−チ
オグルコース、５−チオグルコース、メチル−β
−チオガラクトサイド、エチル−β−チオグルコ
サイド、ハイドロキシエチル−１−チオ−ガラク
トサイド、２−デオキシガラクトース、α−クロ
ラロース、ヘプトースとしては、Ｄ−α−グルコ
ヘプトース、セドヘプツロース、−Ｄ−グルコヘ
プツロース、Ｄ−マンノヘプツロースなどを例示
でき、また、アミノ糖としては、Ｄ−ガラクトサ
ミン、Ｄ−グルコサミン、Ｄ−マンノサミン、Ｎ
−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル
−Ｄ−グルコサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノ
サミン、メチル−３−アミノ−３−デオキシ−β
−グルコサイド、メチル−３−アミノ−３−デオ
キシ−β−マンノサイド、ストレプトゾトシンな
どを例示でき、更に、フエノール配糖体として
は、サリシン、アルブチン、１−Ｏ−フエニルα
又はβ−グルコサイド、 １−Ｏ−フエニルα又はβ−ガラクトサイド、 ｏ−ニトロフエニルα又はβ−ガラクトサイ
ド、 ｍ−ニトロフエニルα又はβ−ガラクトサイ
ド、 ｐ−ニトロフエニルα又はβ−ガラクトサイ
ド、 ｐ−ニトロフエニルα又はβ−グルコサイド、 ｏ−ニトロフエニルα又はβ−グルコサイド、 ｐ−ニトロフエニルα又はβ−マンノサイド、 ｐ−ニトロフエニル−１−チオ−β−ガラクト
サイド、 ｏ−ニトロフエニル−１−チオ−β−ガラクト
サイド、 ｐ−ニトロフエニル−１−チオ−β−グルコサ
イド、 ｏ−ニトロフエニル−β−キシロサイド、 ｐ−ニトロフエニル−β−キシロサイド、 フエニル−α又はβ−チオガラクトサイド、 マンデルニトリルグルコサイドなどが例示で
き、又更に、二糖類としてはサツカロース、マル
トース、セロビオース、ゲンチビオース、ラクト
ース、メリビオース、イソマルトース、Ｎ，
N′−ジアセチルキトビオースなどがあげられる。 上記例示の如き糖類もしくはそのフエノール配
糖体は、天然物、合成品のいずれでも利用できる
が、目的とする以外の糖類もしくはそのフエノー
ル配糖体を含まないように予め適当な公知手段を
利用して精製して利用するのが好ましい。このよ
うな精製手段の例としては、たとえば、セルロー
ス、シリカゲル、アルミナ、活性炭その他各種イ
オン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフイ
ー、セフアデツクスなどによるゲル過法及びこ
れらの適当な組み合わせ精製手段を例示できる。 本発明方法によれば、前記例示の如き式（）
リン脂質と上記例示の如き糖類もしくはそのフエ
ノール配糖体とをホスホリパーゼDMの存在下に
反応させる。 この際利用するホスホリパーゼDMとしては、
従来公知のキヤベツ由来のホスホリパーゼＤの至
適温度40℃以下、至適PH5.4〜5.6に対して、至適
温度60〜70℃、至適PH７付近である点で公知ホス
ホリパーゼＤと区別できるホスホリパーゼDM生
産菌の生産するホスホリパーゼDMが例示でき
る。該ホスホリパーゼDMは、フラクト−ス式
（）リン脂質レシチンとの間におけるリン脂質
糖類誘導体の形成を触媒する点でも公知ホスホリ
パーゼＤと区別できる。 このようなホスホリパーゼDM生産菌の例とし
ては、同一出願人の出願に係わる特願昭56−
161076号に開示されたノカルデイオプシス
（Nocardiopsis）属に属するホスホリパーゼDM
生産菌たとえばノルカデイオプシス属No.779株
〔FERM−ＰNo.6133〕、同一出願人の出願に係わ
る特願昭56−163475号に開示されたアクチノマデ
ユーラ（Actinomadura）属に属するホスホリパ
ーゼDM生産菌たとえばアクチノマデユーラ属No.
362株〔FERM−ＰNo.6132〕等を挙げることがで
きる。至適温度及び至適PHの相違と共に他のいく
つかの相違点と共に、下掲第１表に、本発明方法
で利用するホスホリパーゼDMと公知ホスホリパ
ーゼＤとの酵素学的性質の差異を示した。
【表】
【表】 公知ホスホリパーゼＤを用いては得られなかつ
たリン脂質糖類誘導体が、本発明方法で形成でき
る理由には、この酵素的触媒反応に関与する公知
ホスホリパーゼＤと本発明方法で用いるホスホリ
パーゼDMとの上記の如き酵素学的性質の差異が
関与しているものと推測される。勿論、本発明方
法は、このような作用の推測によつて何等の制約
もうけるものではない。 本発明方法で利用できるホスホリパーゼDMを
生産する前記ホスホリパーゼDM生産菌ノカルデ
イオプシス属No.779株［FERM−Ｐ No.6133］及
びアクチノマデユーラ属No.362株［FERM−Ｐ
No.6132］の菌学的性状及びそれらが生産するホス
ホリパーゼDMの力価測定法、理化学的性質につ
いて以下に述べる。 ノカルデイオプシス属No.779株［FERM−ＰNo.
6133］の菌学的性状：− (a) 形態 グルコースアスパラギン寒天、グリセリンア
スパラギン寒天、酵母麦芽寒天培地等では良好
に、また澱粉無機塩培地では中程度に生育して
気菌糸の集落を着生する。 胞子を着生した菌叢の色は培地の種類、観察
時期により若干変化するが、おおむね白色ない
し灰白色から明るい灰色を呈する。 シユークロース硝酸塩寒天、栄養寒天、オー
トミール寒天培地では気菌糸を着生しないか、
貧弱にしか着生しない。 寒天培地上に生育させた本菌株を顕微鏡で観
察すると、気菌糸は0.5〜0.8μで直線上でゆる
く波形又は屈曲を混じえながら分枝をもつて長
く伸び、気菌糸全体は数10から100ケ以上のす
べて胞子からなる連鎖によつて形成されてい
る。 胞子の大きさは0.5〜0.8×0.7×1.0μで、ほぼ
短円筒形で大きさはやや不規則である。 基生菌糸は巾0.5〜0.8μで分枝をもつて伸長
し、寒天培地上ではかならずしも分断しない
が、液体培養することによりほとんどの場合細
かく分断する。 しかし遊走胞子、胞子のう、菌核等は形成さ
れない。 (b) 各種培地上での性状 以下に記載する実験方法は主としてイー・ビ
ー・シヤーリング（Int.J.Syst.Bacteriol.16巻、
313〜340、1966年）の方法にしたがつて行つ
た。 色調は「糸の標準」（財団法人日本色彩研究
所、1964年）を用いて決定し、色相名とともに
括弧内に色相名、彩度番号、明度番号の順に色
相記号を記入した。 培養は25℃で行い、最も生育の旺盛な２〜３
週間目の各培地上における観察結果を第２表に
示した。但し第２表中、生育項目に記載した基
生菌糸表面の色は胞子着生前の培養一週間目に
おける観察結果を示しており、胞子着性が早く
基生菌糸表面の色の判定困難な培地について
は、記載していない。
【表】 ト・ブラウンウイシユ・
グレイ(rO−1−17)
可溶性色素 生産しない
【表】 可溶性色素 生産しない
(c) 性理的性質 １ 生育温度：５℃〜30℃附近で生育し、20〜
30℃で最もよく生育する。 ２ ゼラチンの液化：液化しない（グルコー
ス・ヘプトン・ゼラチン培地上、25℃、３週
間培養）。 ３ スターチの加水分解：分解する（スターチ
寒天培地上、25℃、３週間培養）。 ４ 脱脂牛乳の凝固、ペプトン化：凝固、ヘプ
トン化共にせず（30℃、３〜４週間培養）。 ５ メラニン様色素の生成：ペプトンイースト
鉄寒天、チロシン寒天で生成する（25℃、２
〜４日間）。 (d) 炭素源の同化性（30℃、10〜16日培養） Ｌ−アラビノース − シユークロース − Ｄ−キシロース − イノシトール − Ｄ−グルコース ＋ Ｌ−ラムノース − Ｄ−フラクトース − ラフイノース − (e) 細胞の化学分析 本菌株のデイアミノピメリン酸はメソ型であ
り、ヒドロキシデイアミノピメリン酸を含まな
い。細胞壁の糖組成は、アラビノース、キシロ
ース、マデユロース、ラムノース等を有せず、
ガラクトース、マンノース等を有する。又本菌
株はノカルドミコール酸を有しない。 以上の分析結果についてBergey′s Manual
of the Determinative Bacteriology 第８
版、657頁〜658頁（1974年）や、レシエバリエ
（Inter.J.System.Bacteriol.20巻、435頁〜443
頁、1970年）、メイヤー（Int.J.Syst.
Bacteriol.26巻、487頁〜493頁1976年）から分
類法にしたがつて判定すると、本菌は細胞壁類
型（cell wall type）型、糖組成類型（cell
wall sugar pattern）Ｃ型となる。 以上本菌は、細胞壁類型が、糖組成類型がＣ
であることから、レシエバリエの分類法によれば
ダソンビレイタイプのアクチノマデユーラ属、サ
ーモアクチノミセス属、アクチノビイフイダス
属、ゲオダーマトフイラス属のいづれかに属す
る。 しかし本菌は、その形態において気菌糸のすべ
てが胞子の長い連鎖から成り、基生菌糸を細かく
分断するが、内生胞子、遊走胞子、胞子のうが見
い出されないことより、ダゾンビレイタイプのア
クチノマデユーラ属（Genus Actinomadura
dass−onvillei type）に固定するのが分類上妥当
である。なお、近年ダソンビレイタイプのアクチ
ノマデユーラ属はメイヤーの提起した新属メカル
デイオプシス属に統合され、ノカルデイオプシス
属の名称で取り扱われることが一般的である。 そこで本菌は、メカルデイオプシス属No.779
（Genus Nocardiopsis sp No.779）と称すること
にした。そして本菌は工業技術院微生物工業技術
研究所に寄託されており、その受託番号は「微工
研菌寄第6133号（FERM−PNo.6133」である。
本菌は昭和59年３月21日に微工研条寄第512号
（FERM BP−512）としてブダベスト条約に基
づく国際寄託に移管された。 本発明で用いるホスホリパーゼDMを生産する
のに様いる使用菌としては、ノカルデイオプシス
属No.779および本菌株を変異処理した変異株だけ
でなく、ノカルデイオプシス属（旧属名アクチノ
マデユーラ ダソンビレイタイプ属）に属しホス
ホリパーゼDMを生産する菌であれば全て利用で
きる。 アクチノマデユーラ属No.362株［FERM−ＰNo.
6132］の菌学的性状：− (a) 形態 澱粉無機塩寒天、チロシン寒天、酵母・麦芽
寒天、オートミール寒天培地等では良好に、ま
たグリセリンアスパラギン寒天では中程度に生
育して気菌糸の集落を着生する。 胞子を着生した菌叢の色は培地の種類、観察
時期により若干変化するが、おおむねやや紫味
を持つた灰白色から灰色を呈する。 シユークロース硝酸塩寒天、栄養寒天、グル
コースアスパラギン寒天では気菌糸を着生しな
いか、貧弱にしか着生しない。 寒天培地上に生育させた本菌株を顕微鏡で観
察すると、気菌糸は巾0.8〜1.2μで分枝し、一
部ループ状又は螺旋状をなし、屈曲を混じえな
がら主として直線状に長く伸び、先端はループ
状にゆるく巻いている場合が多い。 胞子は数10から100以上の連鎖状をなして着
生し、ほぼ気菌糸全体を形成する。 胞子の大きさは0.8〜1.2×1.2〜1.7μで、短円
筒又は卵形で、大きさ形ともやや不規則であ
る。 基生菌糸は巾0.6〜1.0μで、不規則な分枝を
もつて屈曲しながら伸長し、遊走胞子、胞子の
う、菌核等は形成されない。 また通常、隔壁、菌糸の分断は見られない
が、液体培養により菌糸の分断が見られること
もある。 (b) 各種培地上での性状 以下に記載する実験方法は、主としてイー・
ビー・シヤーリング（Int.J.Syst.Bacteriol.16
巻、313〜340、1966年）の方法にしたがつて行
つた。 色調は「色の標準」（財団法人日本色彩研究
所、1964年）用いて決定し、色相名とともに括
弧内に色相名、彩度番号、明度番号の順に色相
記号を記入した。 培養は25℃で行い、最も生育の旺盛な２〜３
週間目の各培地上における観察結果を第３表に
示した。但し第３表中、生育項目に記載した基
生菌糸表面の色は胞子着生前の培養一週間目に
おける観察結果を示しており、胞子着性が早く
基性菌糸表面の色の判定困難な培地については
記載していない。
【表】 気菌糸 厚く粉状に着生、ライト〓
グレイ(18)
可溶性色素 生産しない
【表】 可溶性色素 生産しない
(c) 性理的性質 １ 生育温度：10℃〜37℃附近で生育し、20〜
30℃で最もよく生育する。 ２ ゼラチンの液化：液化しない（グルコー
ス・ペプトン・ゼラチン培地上、25℃、３週
間培養）。 ３ スターチの加水分解：分解する（スターチ
寒天培地上、25℃、３週間培養）。 ４ 脱脂牛乳の凝固、ペプトン化：凝固せず、
ヘプトン化する（30℃、３〜４週間培養）。 ５ メラニン様色素の生成：ペプトンイースト
鉄寒天、チロシン寒天で生成する（25℃、２
〜４日）。 (d) 炭素源の同化性（30℃、10〜16日培養） Ｌ−アラビノース ＋ シユークロース − Ｄ−キシロース ＋ イソシトール ± Ｄ−グルコース ＋ Ｌ−ラムノース − Ｄ−フラクトース − ラフイノース − (e) 細胞の化学分析 本菌株のデイアミノピメリン酸はメソ型であ
り、細胞壁の糖組成は、アラビノース、キシロ
ース、ラムノース等を有せず、マデユロース、
ガラクトース、マンノース等を有する。 以上の分析結果についてBergey′s Manual
of the Determinative Bacteriology 第８
版、657頁〜658頁（1974年）や、レシエバリエ
（Inter.J.System.Bacteriol.20巻、435頁〜443
頁、1970年）等の分類法にしたがつて判定する
と、本菌は細胞壁類型（cell wall type）
型、糖組成類型（cell wall sugar pattern）
Ｂ型となる。 以上本菌は、細胞壁類型が、糖組成類型が
Ｂであることから、ミクロピスポラ属、ストレ
プトスポランギウム属、スピリロスポラ属、ブ
ラノモノスポラ属、デルマトフイラス属、アク
チノマデユーラ属のいづれかに属する。しかし
本菌はその形態において多数の胞子から成る胞
子連鎖を着生し、菌核、胞子嚢、遊走胞子が見
い出されないことより、アクチノマデユーラ属
（Genus Actinomadura）に同定するのが分類
学上、最も妥当である。 そこで本菌は、アクチノマデラーラ属No.362
（Actinomadura sp No.362）と称することに
した。そして本菌は工業技術院微生物工業技術
研究所に寄託されており、その受託番号は「微
工研菌寄第6132号（FERM Ｐ−6132）」であ
る。本菌は昭和59年３月21日に微工研条寄第
511号（FERM BP−511）としてブダベスト
条約に基づく国際寄託に移管された。 本発明で用いるホスホリパーゼDMを生産する
のに利用する使用菌としては、上記したアクチノ
マデユーラ属No.362、及び本菌株を変異処理した
変異株だけでなく、アクチノマデユーラ属に属し
てホスホリパーゼDMを生産する菌であれば全て
用いる事ができる。 本発明方法で利用するホスホリパーゼDMを、
上記例示の如きホスホリパーゼDM生産菌を用い
て製造するには、上記例示の如きホスホリパーゼ
DM生産菌を培地に培養し、培養物よりホスホリ
パーゼDMを採取すればよい。その培養形態とし
ては、液体培養、固体培養いづれも用いることが
出来るが、工業的には深部通気撹拌培養を行うの
が有利である。 また使用する培養源としては、一般に微生物培
養に用いられる炭素源、窒素源、無機塩、及びそ
の他の微量栄養素の他、ノカルデイオプシス属や
アクチノマデユーラ属に属するホスホリパーゼ
DM生産微生物の利用することの出来る栄養源で
あれば、すべて使用することが出来る。 培地の炭素源としては、例えばブドウ糖、果
糖、シヨ糖、乳糖、澱粉、グリセリン、デキスト
リン、糖蜜、ソルビトール等の他、脂肪酸、油
脂、粗レシチン、アルコール、有機酸などを例示
でき、これらは単独でまたは組合せて用いること
ができる。 窒素源としては、無機窒素源、有機窒素源いづ
れでも利用可能であり、無機窒素源としては、例
えば硝酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿
素、硝酸ソーダ、燐酸１アンモニウム、燐酸２ア
ンモニウム、塩化アンモニウム等が挙げられ、ま
た有機室素源としては、大豆、米、とうもろこ
し、綿実、菜種、小麦などの粉、糖、脱脂粕をは
じめ、コーンスチープリカー、ペプトン、酵母エ
キス、肉エキス、カゼイン、アミノ酸等が例示で
きる。 無機塩及び微量栄養素としては、例えばリン
酸、マグネシウム、カリウム、鉄、アルミニウ
ム、カルシウム、マンガン、亜鉛等の塩類の他、
ビタミン、非イオン界面活性剤、消泡剤等菌の生
育やホスホリパーゼDMの生産を促進する適当な
物質を例示でき、必要に応じて使用出来る。 培養は好気的条件で行なわれる。培養温度は菌
が発育し、ホスホリパーゼDMを生産する温度範
囲で適宜変更選択できるが、特に好ましいのは約
20〜約35℃である。 培養時間は条件により異なるが、ホスホリパー
ゼDMが最高生成量に達するまで培養すればよ
い。液体培養の場合は例えば１〜３日程度であ
る。 培養中に生成したホスホリパーゼDMは、液内
培養では主として培養液中に溶けているので、培
養終了液より固形物を別して得られる培養液
よりホスホリパーゼDMを採取できる。 培養液中よりホスホリパーゼDMを採取する
に当つては、通常酵素精製に用いられるあらゆる
方法が利用出来る。例えば硫安、食塩等による塩
析、アセトン、エタノール、メタノール等の有機
溶剤による沈澱、透析、イオン交換クロマトグラ
フイー、吸着クロマトグラフイー、ゲル過、吸
着剤、等電点沈澱等の方法が使用出来る。さらに
これ等の方法を適当に組み合せることによつて、
ホスホリパーゼDMの精製効果が上る場合には、
組合せて行うことが出来る。 上述のようにして得ることのできる本発明方法
で利用できるホスホリパーゼDMは、たとえば安
定化剤として各種塩類、糖質、蛋白質、脂質、界
面活性剤等を加えるか、もしくは加えることな
く、減圧濃縮、減圧乾燥、凍結乾燥等の方法によ
り液状又は固形のホスホリパーゼDMの形態にす
ることが出来る。本発明方法で利用するホスホリ
パーゼDMの酵素活性測定法は、基質グリセロ燐
脂質に作用してリン酸と含室素塩基とのエステル
結合を分解して生ずる塩基の量を測定して求め
る。ホスホリパーゼDMの活性は、特に記載しな
いかぎり、以下に記載するコリンオキシダーゼ法
により測定した。 力価測定法： １％卵黄精製レシチンエマルジヨン（0.1ｇレ
シチン、１mlエチルエーテル、10ml蒸留水の超音
波乳化液）0.1mlに0.2MPH7.2トリス−塩酸緩衝液
0.1ml、0.1M CaCl2水溶液0.05ml、蒸留水0.15ml
を混合し、これに酵素液0.1mlを加え、37℃で20
分反応後、50ｍＭ EDTA−2Naを含む1Mトリ
ス−塩酸緩衝液（PH8.0）0.2mlを加え、直ちに５
分間煮沸して反応を完全に停止する。次にコリン
エステラーゼ測定用試薬〔日本商事(株)製造〕のキ
ツトに含まれるコリン呈色剤を呈色溶解液に溶解
した溶液４mlを加え、37℃で20分間反応させた
後、500nｍの吸光度を測定する。 対照としては、あらかじめ熱失活した酵素液を
用いて同様に反応させたものの吸光度を測定す
る。 そして１分間に1μモルのコリンを遊離する酵
素活性を１単位とする。 前述したノカルデイオプシス属No.779株及びア
クチノマデユーラ属No.362株の夫々を用い、後記
９精製方法に記載した方法により精製した酵素標
品を用いた本発明方法で利用できるホスホリパー
ゼDMを理化学的性質について以下にのべる。 １ 作用 グリセリン脂質のリン酸と含窒素塩基とのエ
ステル結合を分解してホスフアチジン酸と塩基
を遊離する。 ２ 基質持異性 基質としてレシチン、リゾレシチン、スフイ
ンゴミエリンのいづれか１つを0.5μモル含むエ
マルジヨン0.1mlを用い、蒸留水の代りに１％
Triton Ｘ−100を含む水溶液を用いる以外は、
上記力価測定法と同様にして反応させ遊離した
コリン量を測定し、各基質に対するホスホリパ
ーゼDM活性を測定した。その結果、レシチン
に対する活性を100とした時の相対活性は、 ノカルデイオプシス属ホスホリパーゼDM：−
リゾレシチン4.9；スフインゴミエリン0.3、 アクチノマデユーラ属ホスホリパーゼDM：−
リゾレシチン3.6：スフインゴミエリン0.3、
であつた。 ３ 至適PH 力価測定法において用いる緩衝液の代りにPH
3.0〜4.0では蟻酸・蟻酸ソーダ緩衝液、PH4.0〜
5.5では酢酸・酢酸ソーダ緩衝液、PH5.5〜8.5で
はトリス・マレイン酸・苛性ソーダ緩衝液、PH
7.0〜9.0ではトリス・塩酸緩衝液、PH9.0〜10.0
ではグリシン・苛性ソーダ緩衝液を用いてホス
ホリパーゼDMの活性を測定し、至適PHを求め
た。また同測定法で用いる蒸留水0.15mlの代り
に１％Triton Ｘ−100（和光純薬）水溶液0.15
mlを用いた時の至適PHについても求めた。 その結果、蒸留水を用いた場合、 ノカルデイオプシス属ホスホリパーゼDM：−
至適PH７付近（6.5〜7.0）、 アクチノマデユーラ属ホスホリパーゼDM：−
至適PH７付近、 であり、１％Triton Ｘ−100水溶液を用いた
場合、 ノカルデイオプシス属ホスホリパーゼDM：−
至適PH５付近、 アクチノマデユーラ属ホスホリパーゼDM：−
至適PH5.5付近、 であつた。 ４ 至適温度 力価測定法において、反応温度条件を10、
20、25、37、40、50、55、60、70、80および90
℃で酵素活性を測定した。その結果、 ノカルデイオプシス属ホスホリパーゼDM：−
至適温度60℃〜80℃、とくには60℃〜70℃、 アクチノマデユーラ属ホスホリパーゼDM：−
至適温度55℃〜80℃、とくには60℃〜70℃、 と認められた。 ５ PH安定性 酵素溶液0.1mlに、ノカルデイオプシス属ホ
スホリパーゼDMの場合は0.2mlのアクチノマ
デユーラ属ホスホリパーゼDMの場合には0.9
mlの0.1Mの各種緩衝液、すなわちPH3.0〜3.5で
はグリシン・塩酸緩衝液、PH3.5〜7.0では酢
酸・酢酸ソーダ緩衝液、PH5.0〜8.0ではトリ
ス・マレイン酸・苛性ソーダ緩衝液、PH7.0〜
9.0ではトリス・塩酸緩衝液、PH9.0〜9.5ではグ
リシン・苛性ソーダ緩衝液を夫々加え、25℃で
２時間保つた。その後、これら酵素緩衝溶液に
0.5Mトリス・塩酸緩衝液（PH7.2）を、ノカル
デイオプシス属ホスホリパーゼDMの場合には
1.2ml、マクチノマデユーラ属ホスホリパーゼ
DMの場合には9.0ml加え、PHを7.0〜7.3とし
た。この溶液0.1mlを用い、力価測定法に従つ
て力価を測定し、安定PH範囲を調べた結果、 ノカルデイオプシス属ホスホリパーゼDM：−
特に安定したPH4.0〜7.0 アクチノマデユーラ属ホスホリパーゼDM：−
特に安定なPH4.0〜8.0、 と認められた。 また、力価測定法で用いる蒸留水0.15mlの代
りに１％Triton Ｘ−100水溶液0.15mlを用いる
他は、上記と同様に操作してPH安定範囲を調べ
たが、結果は上記したところと殆んど変らなか
つた。 ６ 熱安定性 酵素溶液0.1mlに0.1Mトリス−塩酸緩衝液
（PH7.2）を、ノカルデイオプシス属ホスホリポ
ーゼDMの場合には４ml、アクチノマデユーラ
属ホスホリパーゼDMの場合には9.9ml加え、
20、30、37、40、50、60および65℃に30分間放
置した後、残存する酵素活性を測定した。 その結果、 ノカルデイオプシス属ホスホリパーゼDM：−
30℃で30分の熱処理では殆んど失活せず、50
℃で30分の熱処理で80％の活性が残存、 アクチノマデユーラ属ホスホリパーゼDM：−
30℃で30分の熱処理では殆んど失活せず、50
℃で30分の熱処理で60％の活性が残存、 という結果であつた。 ７ 各種物質による影響 力価測定法においてCaCl2水溶液の代りに各
種物質の水溶液を0.05ml加え、酵素反応系中で
１ｍＭ濃度に成るようにして活性を測定した。
その結果は水添加の時の活性を100とし、相対
活性として賦活作用のあつたものは、 ノカルデイオプシス属ホスホリパーゼDM：−
例えば、AlCl3、CuSO4、ZnSO4、CoCl2、
CaCl2、FeCl3、FeSO4、MgCl2、SnCl2、デ
オキシコール酸ソーダ、エタノール、イソプ
ロパノール、５−ブタノール、triton Ｘ−
100、 アクチノマデユーラ属ホスホリパーゼDM：−
例えば、AlCl3、CaCl2、FeSO4、FeCl3、
MgCl2、SnCl2、デオキシコール酸ソーダ、
エタノール、イソプロパノール、ｔ−ブタノ
ール、で、一法、阻害作用のあつたものは、 ノカルデイオプシス属ホスホリパーゼDM：−
例えば、ドデシル硫酸ソーダ、セチルピリジ
ニウムクロライド、 アクチノマデユーラ属ホスホリパーゼDM：−
例えば、セチルピリジニウムクロ ライド、 であつた。 ８ 力価の測定 前述したとおりである。 ９ 精製方法 きな粉3.0ｇ、コーンスチープリカー1.0％、
ペプトン0.5ｇ、粉末酵母エキス0.1％、グルコ
ース1.0ｇ、NH4No.30.25％、K2HPO40.4％、
MgSO4・7H2O0.01％、ツウイン（Tween）−
85 0.1％から成る培地（PH6.0）約15を30
ジヤーフアーメンターに入れ、120℃で15分間
減菌後、シー培養液1.51を植菌し、27℃で40時
間培養を行つた。 尚、上記シード培養液は、澱粉１％、
（NH4）H2PO40.25％、ペプトン0.25％、
K2HPO40.2％、MgSO4、7H2O0.01％を含む水
溶液培地（PH6.8）100mlを500ml坂口フラスコ
に入れ、蒸気殺菌後、ノカルデイオプシス属No.
779株［FERM−Ｐ No.6133］又はアクチノマ
デユーラ属No.362株［FERM−Ｐ No.6132］の
胞子を一白金耳接種し、培養温度30℃、120回
転／分の条件で２日間振盪培養して調製した。 培養後、菌体固形物を遠心分離により除去
し、遠心上清13（ノカルデイオプシス属
FERM−Ｐ No.6133株を用いた場合は0.54u／
ml；アクチノマデユーラ属FERM−Ｐ No.
6132株を用いた場合は1.7u／mlであつた。）を
得た。この遠心上清を５℃に冷却した後、−20
℃のアセトンを加えてアセトン濃度30〜70％画
分に相当するホスホリパーゼDMを含む沈澱物
を遠心分離により集めた。この沈澱物を、ノカ
ルデイオプシス属FERM−Ｐ No.6133株を用
いた場合にはPH6.0、アクチノマデユーラ属
FERM−Ｐ No.6132株を用いた場合はPH6.5の
トリス−マレイン酸緩衝液に溶解し、0.02Mの
同緩衝液に対して透析した後、同緩衝液で平衡
化したDEAE−セルロースに通塔し、通過区分
を集めた。次に堀内等の方法〔J.Biochem.81、
1639（1977）］で調整したパルミトイルガーゼを
カラムに充填し、充分に水洗してから上記
DEAE−セルロース通過液を注入し、活性を吸
着した。これを0.05Mトリス−塩酸緩衝液（PH
7.2）で洗浄後、0.2％Triton Ｘ−100を含む同
緩衝液を加え活性を溶出した。活性区分を集め
てバイオエンジニアリング社製の限外過膜
（Type Ｇ−10T）を溶いて濃縮した後、ゲル
過担体としてトヨパールHW−55F〔東洋曹
達(株)製〕充填カラムに注入し、蒸留水を用いて
通塔し、活性区分を集め凍結乾燥を行つた。 この乾燥粉末を、ノカルデイオプシス属ホス
ホリパーゼDMの場合には0.025Mイミダゾー
ル−塩酸（PH7.4）に溶解後、アクチノマデユ
ーラ属ホスホリパーゼDMの場合には0.025M
トリス−酢酸（PH8.3）に溶解後、フアルマシ
ア・フアインケミカルス社製のポリバツフア交
換体PBETN94（20ml）充填カラムに通塔して活
性を吸着後、同社製の溶出用ポリバツフア（PH
5.0）を用いてPH勾配により溶出した。溶出し
たホスホリパーゼDMの活性区分を集めて限外
過膜にて濃縮し、セフアデツクスＧ−75充填
カラムに通塔し、ホスホリパーゼDM活性区分
を集めて凍結乾燥した。 斯くて、ノカルデイオプシス属ホスホリパー
ゼDMの場合には、約40％の活性回収率で、比
活性178.3u／mg蛋白質として、アクチノマデユ
ーラ属ホスホリパーゼDMの場合には約43％の
活性回収率で、比活性218.3u／mg蛋白質とし
て、ホスホリパーゼDMが回収された。 等電点 ノカルデイオプシス属ホスホリパーゼDM：−
4.85±0.1（アンホライン電気泳動法により測
定） アクチノマデユーラ属ホスホリパーゼDM：−
6.4±0.1（アンホライン電気泳動法により測
定） Ｎ＋ 転移作用 従来公知のホスホリパーゼＤは、既述のよう
に、レシチンからホスフアチジン酸を生成し、
これを炭素数１から５までの直鎖の１級アルコ
ールに転移してエステルを形成するが、糖類た
とえばフラクトースとの間には形成することは
知られていない。ホスホリパーゼDMについて
も同様な転移作用を調べた結果、本酵素では更
に広範囲のアルコールに転移が起りエステルが
形成するほかに、前記糖類もしくはそのフエノ
ール配糖体にも転移してエステル形成すること
が判明した。 本発明方法で利用するホスホリパーゼDMは、
後記転移作用の実験方法〔TLCによる転移生成
物の生成確認方法〕に従つて反応を行つて、フラ
クトースとリン脂質レシチンとの間におけるリン
脂質糖類誘導体形成反応を触媒して、該リン脂質
の該糖類誘導体を形成する。公知ホスホリパーゼ
Ｄは、上記誘導体を形成しない。 本発明方法によれば、前記例示の如き式（）
リン脂質と前記例示の如き糖類もしくはそのフエ
ノール配糖体とを、上記に詳しく述べたホスホリ
パーゼDMの存在下に反応させることにより、リ
ン脂質糖類誘導体を製造することができる。この
際、ホスホリパーゼDMは精製品として使用する
必要はなく粗製品であつてもよい。更に、適当な
固定化担体たとえばポリプロピレン膜、セライト
粒、ガラスビーズなどの如き各種の重合体樹脂類
や無機材料の粒状物やフイルム状物に担持固定化
して利用することもできる。 反応は、ホスホリパーゼDMの存在下で、好ま
しくは溶媒の存在下に、式（）リン脂質と前記
糖類もしくはその配糖体とを接触せしめることに
より行うことができる。利用する溶媒の例として
は、水性溶媒及び水性溶媒と有機溶媒との混合溶
媒を例示することができる。また、ホスホリパー
ゼDMの酵素学的触媒作用を阻害しない任意の他
の添加剤を含む溶媒も利用でき、たとえば該作用
を促進したり、酵素の安定化に役立つ適当な添加
剤を含有した溶媒であることができる。例えば、
酢酸、クエン酸、リン酸などの緩衝剤を含有した
り、塩化カルシウムその他の中性塩を含有したり
した水性溶媒であることができる。更に、有機溶
媒の例としては、例えば、ｎ−ヘプタン、ｎ−ヘ
キサンなどの如き脂肪族炭化水素類；シクロペン
タン、シクロヘキサン、シクロブタンなどの如き
脂環族炭化水素類；ベンゼン、トルエン、キシレ
ンなどの如き芳香族炭化水素類；アセトン、メチ
ルイソプロピルケトンなどの如きケトン類；ジメ
チルエーテル、ジエチルエーテル、ジイソプロピ
ルエーテルなどの如きエーテル類；酢酸メチル、
酢酸エチルなどの如きエステル類；四塩化炭素、
クロロホルム、塩化メチレンなどの如きハロゲン
化炭化水素類；ジメチルホルムアミドの如きアミ
ド溶媒類；ジメチルスルホキシドの如きスルホキ
シド溶媒類などを例示することができる。 水性溶媒と有機溶媒との混合溶媒の形で利用す
る場合の両者の混合比は適当に選択できるが、例
えば水性溶媒：有機溶媒（Ｖ／Ｖ比）の比で50：
１〜１：10の如き混合比を例示することができ
る。 反応モル比、ホスホリパーゼDMの使用量、溶
媒の使用量などは、適宜に選択できるが、例え
ば、式（）リン脂質１モルに対して前記糖類も
しくはそのフエノール配糖体約１：１〜約１：
1000、好ましくは約１：10〜約１：100モルの反
応モル比を例示することができる。また、ホスホ
リパーゼDMの使用量としては、例えば、式
（）リン脂質１ｇ当り約10〜約100000、好まし
くは約100〜約1000単位程度の使用量を例示する
ことができる。さらに、溶媒の使用量としては、
例えば、式（）リン脂質に対して約10〜約500
容量倍程度の使用量を例示できる。 反応は、室温で進行するので、とくに冷却或い
は加熱の必要はないが、所望により適宜に冷却も
しくは加温条件を採用することができる。例え
ば、約０℃〜約90℃、好ましくは約20〜約60℃の
如き反応温度を例示することができる。また反応
時間も適宜に選択できるが、例えば約１分〜約10
日、好ましくは約0.1時間〜約72時間、更に好ま
しくは約１時間〜約72時間、とくに好ましくは約
１時間〜約24時間の如き反応時間を例示すること
ができる。所望により、たとえばTLC（薄層クロ
マトグラフイー）などの手法を利用して反応経過
を追跡し、所望の目的物の形成を確認することに
より反応時間を適宜に変更することができる。 ホスホリパーゼDMの存在下で式（）リン脂
質と前記糖類もしくはそのフエノール配糖体とを
接触せしめる態様は適宜に選択できるが、撹拌も
しくは振盪条件下で行うのが普通である。又、前
記のように適当な粒状物やフイルム状物担体に担
持固定化した固定化酵素の形でホスホリパーゼ
DMを利用する場合には、例えば、固定化酵素膜
もしくは固定化酵素粒子層を介して反応組成液を
循環ポンプを用いて通過させる態様で行うことが
できる。 上述のようにして反応を行つた後、形成された
リン脂質糖類誘導体は、そのまゝ又は塩の形で分
離して利用することができる。更に、ケイ酸カラ
ムクロマト、アルミナカラムクロマト、高速液体
クロマト、向流分配、ゲル過、吸着クロマト等
の適当な公知の方法を利用して分離精製すること
ができる。 ホスホリパーゼDMによるリン脂質の糖への転
移は、たとえばグルコース、ガラクトース、マン
ノースなどの如く一級アルコール基を有する糖類
については生起するが、たとえばフコース、ラム
ノースなどの如く６−位がデオキシ化され、一級
アルコール基を持たない糖類では起らない事、グ
ルコース、ガラクトース及びマンノースのリン脂
肪糖類誘導体はいずれもTLCで分離した時に生
成物のスポツトが一つである事、さらに、グルコ
ースをピリジン溶液中でトリフエニルクロルメタ
ンにより処理して、該グルコースの一級アルコー
ル基をトリフエニルメタンで置換しておくと転移
が生じないこと等の点からみて、ホスホリパーゼ
DMによるリン脂質の糖への転移は糖の一級アル
コール基の位置へ生ずるものと推定される。 本発明方法によれば、上述したようにして、式
（）リン脂質と前記糖類もしくはそのフエノー
ル配糖体とを、ホスホリパーゼDMの存在下に反
応させてリン脂質糖類誘導体を製造することがで
きる。得られるリン脂質糖類誘導体は、すぐれた
界面活性作用を有し細胞膜の透過性に大きな影響
を持つ。この意味から、本発明リン脂質糖類誘導
体はリポソーム形成基材として、又、化粧品たと
えばクリーム、乳液に配合して皮膚生理に役立つ
乳化剤として、更に脂肪系薬剤の乳化剤、殺虫
剤、除草剤などの如き農薬の乳化剤などの広い乳
化剤用途に有用である。 更に、多くの場合、リン脂質はそれぞれ特異な
生理活性を有することが知られているが、本発明
方法で得られる誘導体の多くは、その近似的構造
を有するところから、各種の生理活性が期待でき
る。又、各種医薬品をはじめとする化学合成の中
間体として有用であり、更に又三重水素や 14Cで
ラベルした糖類を転移することによつてラベルさ
れたリン脂質誘導体が得られ、リン脂質の代謝経
路の解明に利用する事も出来る。 以下、実施例により本発明方法実施の数態様に
ついて、更に詳しく例示する。 参考例 １ ホスホリパーゼDMの調製。 前記精製方法の項に従つて、ノカルデイオプ
シス属No.779株〔FERM−ＰNo.6133〕及びアクチ
ノマデユーラ属No.362株〔FERM−ＰNo.6132〕の
夫々を用いて、該項に記載したとおりの活性回収
率及び比活性でホスホリパーゼDMを得た。 実施例 １ （RumNo.１〜No.55） 後掲第４表に示した下記式（）リン脂質 基質：Ｌ−α−レシチン．β.γ−ジミリストイ
ル（シグマ社） （１，２−ジテトラデカノイル−Sn−グリセ
ロール−３−ホスホリルコリン） 基質：Ｌ−α−レシチン．β.γ−ジヘキサデシ
ル（カルビオケム−ベーリング社）（１，２−
ジヘキサデシル−Sn−グリセロール−３−ホ
スホリルコリン） 基質：Ｌ−α−レシチンβ.γ−ヘキサデシリジ
ン（同上） （１，２−シクロヘキシデシリデン−Sn−グ
リセロール−３−ホスホリルコリン） と、後掲第４表に示した多数種の糖類とを、後掲
TLCによる転移生成物（リン脂質糖類誘導体）
の生成確認方法に従つて、ホスホリパーゼDMの
存在下で反応させて、転移生成物の形成を確認し
た。そのRf値を後掲第４表に示した。 TLCによる転移生成物の生成確認方法：− 下記組成 １％リン脂質乳化液 0.1ml 0.4M酢酸緩衝液（PH5.7） 0.1ml 0.1M塩化カルシウム水溶液 0.05ml 蒸留水 0.1ml 10％糖類水溶液 0.1ml の反応液に、ホスホリパーゼDM水溶液0.1ml
（0.2〜1.2u／0.1ml）を加え、37℃で１〜５時間静
置した。 尚、上記１％リン脂質乳化液は、リン脂質100
mgにジエチルエーテル１ml及び蒸留水10mlを加
え、氷冷条件下に、600W、20KHzの条件で５分
間超音波処理して形成する。 上記静置後、50ｍＭのEDTA（エチレンジアミ
ン四酢酸）水溶液0.2mlを加え、更にクロロホル
ム−メタノール混液（２：1V／Ｖ）５mlを加え
て激しく撹拌し、脂質（生成物）を抽出した。こ
の懸濁液を2000×ｇの条件で10分間遠心処理し、
下層のクロロホルム層を分取し、30℃で減圧乾固
した後、クロロホルム−メタノール混液（１：
1V／Ｖ）75μに溶解してTLCの試料とした。
このうち10μをシリカゲル薄層（フナゲル60
Ｎ＋、20cm×20cm、フナコシ薬品）にスポツトし、
ジイソブチルケトン−酢酸−水（40：25：５）を
展開溶媒として展開した。スポツトの検出には下
記の試薬の用いた。検出されたスポツトで未分解
の基質及びその加水分解物（ホスフアチジン酸及
びその類縁体）以外のリン脂質のスポツトが検出
された場合、これを転移生成物と認めた。 検出試薬 リン酸の呈色：Zinzadeの試薬（BeissU.J.
Chromatog13、104、1964） 糖の呈色：ナフトレゾルシノール−リン酸試薬
（HagG.W.らＪ Chromatog11、479、1963） アミノ糖の呈色：アセチルアセトン−エールリツ
ヒ試薬（エルソン−モルガン反応、
PartridgeS.M.BiochemJ.42、238、1948） 比較例 １ 実施例１に於て、ホスホリパーゼDMの代り
に、キヤベツ由来の公知ホスホリパーゼＤ（Ｐ−
LBiochemicals Ine、）を用いるほかは、実施例
１と同様に行つた。その結果、後掲第４表に示し
たすべての糖類について転移生成物の生成は認め
られなかつた。
【表】
【表】
【表】
【表】 実施例 ２ （RunNo.１〜No.13） Ｌ−α−レシチン．β.γ−ジミリストイル（シ
グマケミカルカンパニー製98％）400mg、ジエチ
ルエーテル１ml、蒸留水10mlを超音波用セルに入
れ、氷冷しながら600W、20KHzで５分間超音波
処理をし、乳白色の乳化液を得た。 このレシチン乳化液２ml（レシチン80mg）、
0.4M酢酸緩衝液（PH5.7）２ml、0.1M塩化カルシ
ウム水溶液１ml、及び10％Ｄ−グルコサミン塩酸
塩水溶液２mlを共栓付試験管中に入れ、ホスホリ
パーゼDM水溶液（8u／ml）２mlを加えてよく混
合した後、37℃で４時間静置した。その後、この
反応液に0.5N塩酸を0.5ml加えて反応を停止し、
クロロホルム−メタノール（２：１）混液15mlを
加えて激しく振つてリン脂質を抽出した。この混
合液を2000×ｇ、10分間遠心し、下層のクロロホ
ルム層を分取した。上層の水には、更にクロロホ
ルム10mlを加えて同様の抽出操作を行ない、クロ
ロホルム層を合わせ、次いでこれに10mlの0.02N
塩酸を加えて洗浄した。この混合液から遠心によ
つて再びクロロホルム層を分取し、減圧乾固した
後、１mlのｎ−ヘキサン−２−プロパノール−水
（60：80：７）混液に溶解した。 この試料20μをシリカゲル薄層（フナゲル、
フナコシ薬品）にスポツトし、ジイソブチルケト
ン−酢酸−水（40：25：５）の溶媒系で展開した
ところ、３種類のリン脂質が検出された。そのう
ちの二つはホスフアチジン酸及びレシチンとRf
値が一致し、残りの一つはニンヒドリン試薬及び
アセチルアセトン−エールリツヒ試薬で呈色し
た。 そこでこのリン脂質混合物を高速液体クロマイ
グラフイーによる精製に供した。カラムはラジア
ルパツクカートリツジシリカ８mm×10cm（ウオー
ターズ社製）、溶離液はｎ−ヘキサン−２−プロ
パノール−水（60：80：７）、ピークの検出には
441型紫外線検出器（ウオーターズ社）による214
mmの吸収、及びR401型示差屈析計（同）を用い
た。試料は４回に分け、0.25mlづつ注入した。こ
の操作によつてホスフアチジン酸と、ホスフアチ
ジン酸のグルコミサンエステルの２種類のリン脂
質を分画し、次いで溶離液をｎ−ヘキサン−２−
プロパノール−水（60：80：14）に変えて、カラ
ムに吸着しているレシチンを溶出した。得られた
３種類のリン脂質は薄層クロマイグラフイー及び
高速液体クロマトグラフイーによつていずれも単
一であることが確認された。 その３種類の比率（モル比）はホスフアチジン
酸約40％、転移生成物約20％、レシチン約40％で
あり、約12mgのホスフアチジン酸−グルコサミン
エステルが得られた。この化合物のIRスペクト
ルは、日本分光A202型赤外分光光度計を用い、
液膜法で測定した。 その結果を第５表に示した（RunNo.３）。 第５表に示した他の糖類を用いて、上記と同様
に行つた。その結果を第５表に示した（RunNo.１
〜２及び４〜13）。
【表】
【表】 実施例 ３ （RunNo.１〜No.６） Ｌ−α−レシチン、β.γ−ジヘキサデシル（カ
ルビオケムーベーリング社製）400mgジエチルエ
ーテル１ml及び蒸留水10mlの混合物を実施例２と
同様の方法で乳化させ、この乳化液２mlを用い
て、以下、実施例２と同様の方法で反応を行なつ
た。ただし、糖類として、リボースの10％水溶液
を用いた。 この反応液を実施例２と同様に処理して、転移
生成物10mgを得た。 この化合物のIRスペクトルを第６表に示した
（RunNo.１）。また、第６表に示した他の糖類を用
いて、上記と同様に行なつた。その結果を第６表
に示した（RunNo.２〜６）。
【表】 実施例 ４ （RunNo.１〜No.６） Ｌ−α−レシチンβ.γ−ヘキサデシリジン（カ
ルビオケムーベーリング社製）400mgを実施例２
と同様の方法で乳化し、80mg相当の乳化液を用
い、転移反応を受容体としてフラクトースを加え
以下、実施例２と同様の方法で反応、抽出、精製
を行なつた。その結果転移生成物12mgを得た。そ
のIRスペクトルを第７表に示した（RunNo.２）。
第７表に示した他の糖類を用いて上記と同様に行
なつた。その結果を第７表に示した（RunNo.１及
びNo.３〜６）。
【表】 実施例 ５ （RumNo.１〜No.５） Ｌ−α−ホスフアチジルエタノールアミン、β.
γ−ジミリストイル（）、Ｌ−α−ホスフアチ
ジルＮ−メチルエタノールアミン、β.γ−ジミリ
ストイル（）、Ｌ−α−ホスフアチジル−DL−
グリセロールβ.γ−ジミリストイル（）（以上、
いずれもカルビオケム−ベーリング社）Ｌ−α−
ホスフアチジルセリン（）（シグマ社）及びS.
F.Yangら（J.Biol Chem.242、477、1967）の方
法で調整したＬ−α−ホスフアチジエタノールβ.
γ−ジミリストイル（）を実施例２と同様の方
法で乳化した。各リン脂質50mgを含む乳化液1.5
mlをそれぞれ別の供栓付試験管に入れ、アルコー
ルとしてリボースの10％水溶液１ml、0.4M酢酸
緩衝液１ml、蒸留水１ml、0.01M塩化カルシウム
水溶液0.5mlを加えて、更に、この反応液を
600W、20KHz、１分間超音波処理した。次いで
各反応液にホスホリパーゼDM水溶液（8u／ml）
１mlづつ加え、37℃で６時間静置した。以下、イ
ン脂質の抽出及び精製は実施例２と同様に処理
し、共通の転移生成物であるホスフアチジン酸−
リボースエステルを得た。収量はに対して９
mg、に対して６mg、に対して９mg、に対し
て４mg、Ｖに対して６mgであつた。そのIRスペ
クトルを第８表に示した。
【表】

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ (a) 下記式（） 式中、 Ａは を示し、ここで、R1及びR2はそれぞれ−Ｏ−
    COR11又は−Ｏ−R12であり、或いはR1とR2は
    一緒になつて 【式】［ここで、ｎは11〜19 の数を示す］を表わし、上記において、R11及
    びR12は同一もしくは相異り各々C7〜C21の飽
    和もしくは不飽和の脂肪族炭化水素基を示し、 Ｂは−（CH2）2Ｎ＋（CH3）3、 −（CH2）2NH2、 −CH2CH（NH2）COOH、 −CH2CH2NH（CH3）、 −CH2CH2N（CH3）2、 −CH2CHOHCH2OH又は−（CH2）mH ［ここで、ｍは１〜５の数を示す］を示す、 で表わされるリン脂質と、 (b) 少なくとも１個の一級アルコール基を含み且
    つ該一級アルコール基のOHを含めて合計で３
    個以上の水酸基を有する、アミノ基もしくはア
    セチルアミノ基で置換されていてもよい、炭素
    数５〜７の単糖類及び二糖類から選ばれる糖
    類、又は該糖類のフエノール配糖体とを、リン
    脂質と糖類又は糖類のフエノール配糖体との間
    の転位反応を触媒しうるホスホリパーゼＤの存
    在下に反応させることを特徴とする下記式
    （） 式中、 Ｒは上記糖類又は該糖類のフエノール配糖体
    の一級アルコール基からOHを１個又は２個除
    いた残基を示し、 ｑは１または２であり、 Ａは前記定義のとおりである、 で表わされるリン脂質糖類誘導体の製法。
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Families Citing this family (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4873322A (en) * 1986-01-24 1989-10-10 Ciba-Geigy Corporation Saccharide derivatives and processes for their manufacture
JPS6336790A (ja) * 1986-08-01 1988-02-17 Nippon Oil & Fats Co Ltd リン脂質の塩基交換反応法
US5166139A (en) * 1987-02-26 1992-11-24 Indena, S.P.A. Complexes of saponins and their aglycons with phospholipids and pharmaceutical and cosmetic compositions containing them
IT1203515B (it) * 1987-02-26 1989-02-15 Indena Spa Complessi di saponine con fosfolipidi e composizioni farmaceutiche e cosmetiche che li contengono
JPS63245684A (ja) * 1987-03-31 1988-10-12 Japanese Res & Dev Assoc Bio Reactor Syst Food Ind ホスフアチジン酸誘導体の製造法
JPH02227132A (ja) * 1988-11-22 1990-09-10 Kao Corp リポソーム形成剤及びリポソーム
US5153000A (en) * 1988-11-22 1992-10-06 Kao Corporation Phosphate, liposome comprising the phosphate as membrane constituent, and cosmetic and liposome preparation comprising the liposome
JPH02273536A (ja) * 1989-04-13 1990-11-08 Yakult Honsha Co Ltd 界面活性剤およびその製造法
JPH0387191A (ja) * 1989-08-30 1991-04-11 Nisshin Oil Mills Ltd:The ホスファチジルイノシトールの製造方法
BR9106345A (pt) 1990-04-16 1993-04-20 Univ Pennsylvania Composicoes de sacarideos,processos e aparelhos para sua sintese
WO1991016449A1 (en) 1990-04-16 1991-10-31 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Saccharide compositions, methods and apparatus for their synthesis
US5260051A (en) * 1990-12-17 1993-11-09 Lever Brothers Company, Division Of Conopco, Inc. Compositions comprising phosphate ester compounds containing a beneficial reagent component
FR2674128A1 (fr) * 1991-03-19 1992-09-25 Patrinove "vecteurs de structure capsulaire" et leurs applications dans le transport de substances ou principes actifs.
US6518051B1 (en) 1991-04-11 2003-02-11 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Saccharide compositions, methods and apparatus for their synthesis
SE9101709L (sv) * 1991-06-03 1992-12-04 Karlshamns Lipidteknik Ab Lipidderivat som diagnostikum eller kontrastmedel
US5164375A (en) * 1991-09-27 1992-11-17 Merck & Company, Inc. Antifungal agent
US5385750A (en) * 1992-05-14 1995-01-31 Henkel Corporation Alkyl glycoside compositions with improved wetting properties
US5354853A (en) * 1993-03-12 1994-10-11 Genzyme Corporation Phospholipid-saccharide conjugates
US5441876A (en) * 1993-07-30 1995-08-15 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Process for the preparation of headgroup-modified phospholipids using phosphatidylhydroxyalkanols as intermediates
US6071532A (en) * 1996-10-15 2000-06-06 Emory University Synthesis of glycophospholipid and peptide-phospholipid conjugates and uses thereof
US6063916A (en) * 1996-11-27 2000-05-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Transesterification of insoluble polysaccharides
US6204254B1 (en) 1997-09-12 2001-03-20 Baxter International, Inc. Biocompatible surfaces and a method for their preparation
US20070141181A1 (en) * 1998-02-13 2007-06-21 Nutramax Laboratories, Inc. Use of anabolic agents, anti-catabolic agents, antioxidant agents, and analgesics for protection, treatment and repair of connective tissues in humans and animals
US6797289B2 (en) * 1998-02-13 2004-09-28 Nutramax Laboratories, Inc. Use of anabolic agents, anti-catabolic agents, antioxidant agents, and analgesics for protection, treatment and repair of connective tissues in humans and animals
US6451771B1 (en) 1999-02-12 2002-09-17 Nutramax Laboratories, Inc. Use of anabolic agents anti-catabolic agents and antioxidant agents for protection treatment and repair of connective tissues in humans and animals
US6228997B1 (en) 1998-07-10 2001-05-08 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Transesterification of insoluble polysaccharides
US7393938B2 (en) * 2000-01-10 2008-07-01 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Use of lipid conjugates in the treatment of diseases
US20060189569A1 (en) * 2000-01-10 2006-08-24 Saul Yedgar Use of lipid conjugates in the treatment of infection
US8076312B2 (en) * 2000-01-10 2011-12-13 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd Use of lipid conjugates in the treatment of disease
US20090325876A1 (en) * 2004-09-29 2009-12-31 Saul Yedgar Use of lipid conjugates in the treatment of diseases associated with vasculature
US9040078B2 (en) 2000-01-10 2015-05-26 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Use of lipid conjugates in the treatment of diseases of the nervous system
US8501701B2 (en) * 2000-01-10 2013-08-06 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Use of lipid conjugates in the treatment of disease
US7608598B2 (en) * 2000-01-10 2009-10-27 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Use of lipid conjugates in the treatment of conjunctivitis
US8304395B2 (en) * 2000-01-10 2012-11-06 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Lipid conjugates in the treatment of disease
US7772196B2 (en) 2000-01-10 2010-08-10 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Use of lipid conjugates in the treatment of diseases
US7811999B2 (en) 2000-01-10 2010-10-12 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem, Ltd. Use of lipid conjugates in the treatment of diseases
US7893226B2 (en) * 2004-09-29 2011-02-22 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem, Ltd. Use of lipid conjugates in the treatment of diseases
US8916539B2 (en) * 2000-01-10 2014-12-23 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Use of lipid conjugates in the treatment of disease
GB0014437D0 (en) * 2000-06-14 2000-08-09 Porter William L Immune response stimulation
US8883761B2 (en) * 2001-01-10 2014-11-11 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Use of lipid conjugates in the treatment of diseases associated with vasculature
US6878532B1 (en) 2003-04-28 2005-04-12 Sioux Biochemical, Inc. Method of producing phosphatidylserine
CN104546891A (zh) * 2005-08-03 2015-04-29 塞尔索斯治疗公司 脂质结合物在囊性纤维化病中的用途及其应用
US8906882B2 (en) 2005-11-17 2014-12-09 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Lipid conjugates in the treatment of allergic rhinitis
US8859524B2 (en) 2005-11-17 2014-10-14 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Lipid conjugates in the treatment of chronic rhinosinusitis
US20080183282A1 (en) * 2006-03-09 2008-07-31 Saul Yedgar Use of lipid conjugates for the coating of stents and catheters
CA2705785A1 (en) * 2006-11-14 2008-05-22 Saul Yedgar Use of lipid conjugates in the treatment of diseases or disorders of the eye
KR100829595B1 (ko) 2006-12-11 2008-05-14 한국화학연구원 당이 결합된 인지질로 수식된 리포솜 및 이의 제조방법
AU2010247814B2 (en) 2009-05-11 2015-08-13 Celsus Therapeutics Plc Lipid-polymer conjugates, their preparation and uses thereof
CN114214377B (zh) * 2021-12-24 2024-03-08 中国海洋大学 磷脂酰-琼胶寡糖及其制备方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2052029A (en) * 1935-12-31 1936-08-25 Benjamin R Harris Phosphoric acid esters
US3142620A (en) * 1961-03-23 1964-07-28 Ciba Geigy Corp Immunizing composition containing mesoinosito-tri-alpha-d-mannoside
DE2717547A1 (de) * 1977-04-20 1978-11-02 Max Planck Gesellschaft Verfahren zur umesterung von phospholipiden mit phospholipase d

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