JP2799622B2 - ホスホリパーゼｄおよびその製造法 - Google Patents
ホスホリパーゼｄおよびその製造法Info
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- JP2799622B2 JP2799622B2 JP2118051A JP11805190A JP2799622B2 JP 2799622 B2 JP2799622 B2 JP 2799622B2 JP 2118051 A JP2118051 A JP 2118051A JP 11805190 A JP11805190 A JP 11805190A JP 2799622 B2 JP2799622 B2 JP 2799622B2
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、水中または各種有機溶媒を含有する反応系
において、高いホスファチジル基転移活性を有するホス
ホリパーゼＤおよびその製造法に関するものである。
において、高いホスファチジル基転移活性を有するホス
ホリパーゼＤおよびその製造法に関するものである。
ホスホリパーゼＤは、大豆や卵黄等に含まれるホスフ
ァチジルコリンやホスファチジルエタノールアミン等の
リン脂質と各種アルコール性水酸基を有する化合物か
ら、乳化剤、分散剤、農薬、医薬、工業用試薬等に有用
な、リン脂質誘導体を製造するのに使われる。また血清
中に含まれるリン脂質の定量用試薬にも利用される。
ァチジルコリンやホスファチジルエタノールアミン等の
リン脂質と各種アルコール性水酸基を有する化合物か
ら、乳化剤、分散剤、農薬、医薬、工業用試薬等に有用
な、リン脂質誘導体を製造するのに使われる。また血清
中に含まれるリン脂質の定量用試薬にも利用される。
従来の技術 ホスホリパーゼ（EC3.1.4.4）は、グリセロリン脂質
のホスファチジル基と塩基との間のエステル結合を加水
分解してホスファチジン酸および塩基を遊離させる酵素
があるが、その起源によっては加水分解反応以外に、グ
リセロール、セリン、エタノール等のアルコール性水酸
基を有する化合物の共存下でグリセロリン脂質のホスフ
ァチジル基を上記アルコール性水酸基を有する化合物に
転移させ、新たなリン酸エステルの生成する反応（ホス
ファチジル基転移反応）を生起させる。
のホスファチジル基と塩基との間のエステル結合を加水
分解してホスファチジン酸および塩基を遊離させる酵素
があるが、その起源によっては加水分解反応以外に、グ
リセロール、セリン、エタノール等のアルコール性水酸
基を有する化合物の共存下でグリセロリン脂質のホスフ
ァチジル基を上記アルコール性水酸基を有する化合物に
転移させ、新たなリン酸エステルの生成する反応（ホス
ファチジル基転移反応）を生起させる。
この酵素は、キャベツ、ニンジン、ホウレンソウ、綿
実等の植物体からの抽出あるいはストレプトマイセス
属、ミクロノスポラ属、ノルカディオプシス属、アクチ
ノマデューラ属、ノカルディア属等の微生物を用いた発
酵法により製造できる（特公昭52−39918号、特公昭58
−52633号、特開昭58−63388号、特開昭58−67183号、
特開昭60−164483号）。また市販品では、植物起源のも
のとしてキャベツ、ピーナッツ、微生物起源のものとし
てStreptomyces chromofuscus等がある。
実等の植物体からの抽出あるいはストレプトマイセス
属、ミクロノスポラ属、ノルカディオプシス属、アクチ
ノマデューラ属、ノカルディア属等の微生物を用いた発
酵法により製造できる（特公昭52−39918号、特公昭58
−52633号、特開昭58−63388号、特開昭58−67183号、
特開昭60−164483号）。また市販品では、植物起源のも
のとしてキャベツ、ピーナッツ、微生物起源のものとし
てStreptomyces chromofuscus等がある。
しかしながら、これら従来の製造法により得られるホ
スホリパーゼＤはホスファチジル基転移活性が低く、ま
た加水分解反応も速やかに進行し、ホスファチジン酸が
生成するため、効率よく転移反応を行わせることができ
ないという問題点があった。
スホリパーゼＤはホスファチジル基転移活性が低く、ま
た加水分解反応も速やかに進行し、ホスファチジン酸が
生成するため、効率よく転移反応を行わせることができ
ないという問題点があった。
最近、ホスホリパーゼＤの微生物利用製造法で、酵素
の安定性、生産性などに関しては改良が試みられている
例もあるが、高いホスファチジル基転移活性を有するホ
スホリパーゼＤの製造法の開発については未だ満足でき
るものが無いのが現状である。
の安定性、生産性などに関しては改良が試みられている
例もあるが、高いホスファチジル基転移活性を有するホ
スホリパーゼＤの製造法の開発については未だ満足でき
るものが無いのが現状である。
発明が解決しようとする問題点 本発明は、ホスファチジル基転移活性を有する従来の
ホスホリパーゼＤが上述のような欠点を持つことに鑑
み、高いホスファチジル基転移活性を示し、反応生成物
中にホスファチジン酸が全く無いかあるいは簡単な精製
操作で除去できる程度しか生成しないホスホリパーゼＤ
とその効率良い製造法を提供しようとするものである。
ホスホリパーゼＤが上述のような欠点を持つことに鑑
み、高いホスファチジル基転移活性を示し、反応生成物
中にホスファチジン酸が全く無いかあるいは簡単な精製
操作で除去できる程度しか生成しないホスホリパーゼＤ
とその効率良い製造法を提供しようとするものである。
問題を解決するための手段 本発明者らは、自然界中の土壌より広く微生物を分離
し、多数のホスホリパーゼＤ生産菌を得た。更に、それ
らの生産するホスホリパーゼＤについて精査し、高いホ
スファチジル基転移活性を示すホスホリパーゼＤを生産
する菌株を探索した。その結果、神奈川県横浜市で採取
した土壌から分離されたストレプトマイセス属に属する
菌株（ストレプトマイセス属Ｓ−170株と称する）がす
ぐれた性能を有することを知り本発明を完成するに至っ
た。
し、多数のホスホリパーゼＤ生産菌を得た。更に、それ
らの生産するホスホリパーゼＤについて精査し、高いホ
スファチジル基転移活性を示すホスホリパーゼＤを生産
する菌株を探索した。その結果、神奈川県横浜市で採取
した土壌から分離されたストレプトマイセス属に属する
菌株（ストレプトマイセス属Ｓ−170株と称する）がす
ぐれた性能を有することを知り本発明を完成するに至っ
た。
すなわち本発明は上記ストレプトマイセス属Ｓ−170
株を用いるホスホリパーゼＤの製造法およびそれにより
得られる高いホスファチジル基転移活性を有するホスホ
リパーゼＤを提供するものである。
株を用いるホスホリパーゼＤの製造法およびそれにより
得られる高いホスファチジル基転移活性を有するホスホ
リパーゼＤを提供するものである。
本発明の製造において使われるストレプトマイセス属
Ｓ−170株は、次のような菌学的性質を示す。
Ｓ−170株は、次のような菌学的性質を示す。
細胞壁成分 a.アミノ酸:LL−ジアミノピメリン酸を含有する。
b.脂肪酸組成：イソＣ15:0、アンテイソＣ15:0、イソＣ
16:0、イソＣ17:0、アンテイソＣ17:0が主である。
16:0、イソＣ17:0、アンテイソＣ17:0が主である。
ミコール酸の生成：なし 胞子鎖（spore chain）の形態：螺旋状が主であ
る。
る。
色調 a.気菌糸：灰色 b.可溶性色素の生産：なし 窒素源利用性： DL−α−アミノ−酪酸 − Ｌ−フェニルアラニン ＋ Ｌ−システィン − Ｌ−ヒスチジン ＋ Ｌ−バリン − Ｌ−ヒドロキシプロリン ＋ 炭素源の利用性： スクロール ＋ ラフィノース ＋ アドニトール − マンニトール − キシリトール ＋ Ｌ−ラムノース − メソ−イノシトール ＋ 各種物質に対する性質： キサンチン 分解する アルブチン 分解する ペクチン 分解しない エラスチン 分解しない 脂肪分解活性 あり レシチナーゼ活性 なし 硝酸の還元 なし 硫化水素の生成 なし 生育阻害： 45℃培養 ＋ アジ化ナトリウム（0.01％W/V） − NaCl（７％W/V） − フェノール（0.1％W/V） ± ネオマイシン（50μg/ml） ＋ リファンピシリン（50μg/ml） ＋ オレアンドマイシン（100μg/ml） ＋ ペニシリンＧ（10i.u.） − 他の微生物に対する抗生： Bacillus subtilis NCIB 3610 − Micrococcus luteus NCIB 169 ＋ Candida albicans CBS 562 − Saccharomyces cerevisiae CBS 1171 ＋ Streptomyces murinus ISP 5091 ＋ Aspergillus niger LIV 131 ＋ この菌株がストレプトマイセス属に属することは、上
述の性質をBergey's Manual第８版、第657〜650頁、Pro
ceedings of the 1st International Conference on Cu
lture Collections、第457〜458頁等の各記載と照合す
ることにより確認された。また、上述〜の性質はS.
T.Williamsらの数値分類法［J.Gen.Microbiol.129,1815
（1983）］に従い試験したが、その結果によればWillco
x probability 0.943でストレプトマイセス・アンチバ
イオティカス（streptomyces antibioticus）に分類さ
れるものである。
述の性質をBergey's Manual第８版、第657〜650頁、Pro
ceedings of the 1st International Conference on Cu
lture Collections、第457〜458頁等の各記載と照合す
ることにより確認された。また、上述〜の性質はS.
T.Williamsらの数値分類法［J.Gen.Microbiol.129,1815
（1983）］に従い試験したが、その結果によればWillco
x probability 0.943でストレプトマイセス・アンチバ
イオティカス（streptomyces antibioticus）に分類さ
れるものである。
ストレプトマイセス属Ｓ−170株は、工業技術院微生
物工業技術研究所に寄託されており、その寄託番号は、
11422号である。
物工業技術研究所に寄託されており、その寄託番号は、
11422号である。
本発明のホスホリパーゼＤを製造するための上記スト
レプトマイセス属Ｓ−170株の培養は放射菌一般の培養
に通常採用される方法に従って行うことができる。すな
わち、倍地には炭素源として、例えばブドウ糖，果糖，
デンプン，糖蜜，グリセリン等を単独で、または組み合
わせて適宜用いることができる。また窒素源として、例
えば硫酸アンモニウム，塩化アンモニウム，尿素，ペプ
トン，肉エキス，酵母エキス，コーンスチープリカー，
脱脂大豆粉，大豆蛋白質等を用いることができる。倍地
には、ほかにリン酸，マグネシウム，カリウム，鉄，ア
ルミニムウ，カルシウム等の塩類や、各種ビタミン類，
消泡剤等，菌の生育やホスホリパーゼＤの生産促進に有
効な物質を適宜添加することができる。好ましい倍地pH
は５〜８で、特に好ましくは６〜７である。培養法とし
ては通常液体培養で行うが、工業的には深部撹拌通気培
養で行うのが有利である。培養温度は、菌が生育し、ホ
スホリパーゼＤを生産する温度範囲で適宜変更できる
が、特に好ましいのは25〜35℃である。培養時間は条件
により異なるが、ホスホリパーゼＤの生産が最大になる
まで培養すればよい。液体培養では通常１〜５日程度で
ある。
レプトマイセス属Ｓ−170株の培養は放射菌一般の培養
に通常採用される方法に従って行うことができる。すな
わち、倍地には炭素源として、例えばブドウ糖，果糖，
デンプン，糖蜜，グリセリン等を単独で、または組み合
わせて適宜用いることができる。また窒素源として、例
えば硫酸アンモニウム，塩化アンモニウム，尿素，ペプ
トン，肉エキス，酵母エキス，コーンスチープリカー，
脱脂大豆粉，大豆蛋白質等を用いることができる。倍地
には、ほかにリン酸，マグネシウム，カリウム，鉄，ア
ルミニムウ，カルシウム等の塩類や、各種ビタミン類，
消泡剤等，菌の生育やホスホリパーゼＤの生産促進に有
効な物質を適宜添加することができる。好ましい倍地pH
は５〜８で、特に好ましくは６〜７である。培養法とし
ては通常液体培養で行うが、工業的には深部撹拌通気培
養で行うのが有利である。培養温度は、菌が生育し、ホ
スホリパーゼＤを生産する温度範囲で適宜変更できる
が、特に好ましいのは25〜35℃である。培養時間は条件
により異なるが、ホスホリパーゼＤの生産が最大になる
まで培養すればよい。液体培養では通常１〜５日程度で
ある。
培養物中に生成したホスホリパーゼＤは、液体培養で
は主として培養液中に存在するので培養終了液から固形
物を濾別し、ホスホリパーゼＤを採取する。
は主として培養液中に存在するので培養終了液から固形
物を濾別し、ホスホリパーゼＤを採取する。
濾液からさらにホスホリパーゼＤを濃縮するにあたっ
ては、各種酵素の分離精製に通常採用される方法を適宜
組み合わせて使用できる。例えば塩析、有機溶媒沈殿、
透析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、吸着
クロマトグラフィー、ゲル濾過、凍結乾燥、等電点電気
泳動等の方法を、後述する本発明のホスホリパーゼＤの
理化学的性質を考慮した条件下で採用すればよい。
ては、各種酵素の分離精製に通常採用される方法を適宜
組み合わせて使用できる。例えば塩析、有機溶媒沈殿、
透析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、吸着
クロマトグラフィー、ゲル濾過、凍結乾燥、等電点電気
泳動等の方法を、後述する本発明のホスホリパーゼＤの
理化学的性質を考慮した条件下で採用すればよい。
ストレプトマイセス層Ｓ−170株の生産する本発明の
ホスホリパーゼＤは、次のような理化学的性質を有する
ものである。
ホスホリパーゼＤは、次のような理化学的性質を有する
ものである。
（ａ）作用 加水分解反応 下記一般式［Ｉ］ （但し、式中R1,R2はアシル基またはアルキル基、Ｘは
水酸基を含有する塩基の水酸基１個を除いた後に残る有
機基を示す）で表わされるリン脂質を加水分解し、ホス
ファチジン酸と塩基とを遊離させる。
水酸基を含有する塩基の水酸基１個を除いた後に残る有
機基を示す）で表わされるリン脂質を加水分解し、ホス
ファチジン酸と塩基とを遊離させる。
ホスファチジル基転移反応 上記一般式［Ｉ］で表されるリン脂質のホスファチジ
ル基を下記一般式［II］ R3−OH ………［II］ （但し、R3はアルコール性水酸基に結合した有機基を示
す）で表されるグリセロール、セリン、エタノール等の
アルコール性水酸基を有する化合物の共存下、アルコー
ル性水酸基にホスファチジル基を転移させ、下記一般式
［III］ （但し、R1,R2,R3は前記と同様の基を示す）で表される
リン脂質誘導体を生成する。
ル基を下記一般式［II］ R3−OH ………［II］ （但し、R3はアルコール性水酸基に結合した有機基を示
す）で表されるグリセロール、セリン、エタノール等の
アルコール性水酸基を有する化合物の共存下、アルコー
ル性水酸基にホスファチジル基を転移させ、下記一般式
［III］ （但し、R1,R2,R3は前記と同様の基を示す）で表される
リン脂質誘導体を生成する。
（ｂ）基質特異性 ホスファチジルコリンに対する加水分解活性を100と
した場合の相対活性は、リゾホスファチジルコリンに対
し2.3、スフィンゴミエリンに対しては0.9である。
した場合の相対活性は、リゾホスファチジルコリンに対
し2.3、スフィンゴミエリンに対しては0.9である。
（ｃ）至適pH:約5.5 （ｄ）pH安定性:pH4〜８で安定 （ｅ）至適温度:55〜65℃ （ｆ）熱安定性 pH5.5において50℃、30分間の熱処理で全く失活せ
ず、70℃、30分間でも約50％の活性が残存する。
ず、70℃、30分間でも約50％の活性が残存する。
（ｇ）種々の物質の影響 濃度1mMの種々の物質を共存させた場合、加水分解活
性は塩化セチルピリジニウムのとき若干阻害されるが、
CaCl2,FeCl3,FeSO4,BaCl2,MnCl2,MgCl2,CuCl2,ZnCl2,Sn
Cl2,AlCl3,CoCl2,CdCl2,LiCl,KCl,NaCl,コール酸ナトリ
ウム，デオキシコール酸ナトリウム，エチエンジアミン
四酢酸・二ナトリウムのときは阻害されない。
性は塩化セチルピリジニウムのとき若干阻害されるが、
CaCl2,FeCl3,FeSO4,BaCl2,MnCl2,MgCl2,CuCl2,ZnCl2,Sn
Cl2,AlCl3,CoCl2,CdCl2,LiCl,KCl,NaCl,コール酸ナトリ
ウム，デオキシコール酸ナトリウム，エチエンジアミン
四酢酸・二ナトリウムのときは阻害されない。
（ｈ）分子量 6.4万（SDS・PAGE法による）。
（ｉ）等電点 pH6.4〜6.5（等電点電気泳動法による）。
なお、ホスホリパーゼＤの酵素活性は基質であるリン
脂質に作用してリン酸と塩基との間のエステル結合を分
解したときに生じる塩基を定量することによって求め
る。この明細書に記載した酵素活性は、ホスンファチジ
ルコリンを基質として用いる下記の方法により測定され
たものであって、１分間に１μmolのコリンを遊離する
酵素活性１ユニット（Ｕ）としている。
脂質に作用してリン酸と塩基との間のエステル結合を分
解したときに生じる塩基を定量することによって求め
る。この明細書に記載した酵素活性は、ホスンファチジ
ルコリンを基質として用いる下記の方法により測定され
たものであって、１分間に１μmolのコリンを遊離する
酵素活性１ユニット（Ｕ）としている。
［ホスファチジルコリン分解活性測定法］ ホスファチジルコリン0.5gに対してジエチルエーテル
1ml、蒸留水10mlを添加し、超音波処理によって得られ
たエマルジョン100μｌと、0.1M塩化カルシウム溶液50
μl,0.1Mトリス−マレンイン酸−水酸化ナトリウム緩衝
液（pH5.5）100μｌ、7.5％W/VトリトンＸ−100水溶液1
50μｌとの混合液に酵素溶液100μｌを加え、37℃で10
分間反応させる。その後、0.05Mエチレンジアミン四酢
酸・二ナトリウムを含む1.0Mトリス−塩酸緩衝液（pH8.
0）200μｌを添加し、直ちに100℃で５分間煮沸して完
全に反応を停止させる。室温まで冷却した後、コリン測
定用試薬（コリンオキシダーゼ100U、パーオキシダーゼ
100U、４−アミノアンチピリン50mg、フェノール25mg、
トリトンＸ−100 500mgをpH8.0の0.01Mトリス−塩酸緩
衝液100mlに溶解したもの）4mlを添加し、37℃で20分間
反応させた後、あらかじめ熱失活させた酵素を用いて同
様に反応させたものを対照とし、500nmの吸光度を測定
する。
1ml、蒸留水10mlを添加し、超音波処理によって得られ
たエマルジョン100μｌと、0.1M塩化カルシウム溶液50
μl,0.1Mトリス−マレンイン酸−水酸化ナトリウム緩衝
液（pH5.5）100μｌ、7.5％W/VトリトンＸ−100水溶液1
50μｌとの混合液に酵素溶液100μｌを加え、37℃で10
分間反応させる。その後、0.05Mエチレンジアミン四酢
酸・二ナトリウムを含む1.0Mトリス−塩酸緩衝液（pH8.
0）200μｌを添加し、直ちに100℃で５分間煮沸して完
全に反応を停止させる。室温まで冷却した後、コリン測
定用試薬（コリンオキシダーゼ100U、パーオキシダーゼ
100U、４−アミノアンチピリン50mg、フェノール25mg、
トリトンＸ−100 500mgをpH8.0の0.01Mトリス−塩酸緩
衝液100mlに溶解したもの）4mlを添加し、37℃で20分間
反応させた後、あらかじめ熱失活させた酵素を用いて同
様に反応させたものを対照とし、500nmの吸光度を測定
する。
実 施 例 次に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、
本発明はそれによって制限されるものではない。
本発明はそれによって制限されるものではない。
実施例 １ 倍地として、ブドウ糖1.0％、アスパラギン0.05％、
リン酸二カリウム0.05％、酵母エキス0.7％、コーンス
チープリカー溶液（10％W/Vコーンスチープリカー懸濁
液をpH7.0に調整し不純物を濾別したもの）10％を含むp
H7.2のものを用意し、その100mlを500ml容の坂口フラス
コに入れ、蒸気滅菌後Ｓ−170株の前培養液5mlを植菌し
30℃で３日間振とう培養した。
リン酸二カリウム0.05％、酵母エキス0.7％、コーンス
チープリカー溶液（10％W/Vコーンスチープリカー懸濁
液をpH7.0に調整し不純物を濾別したもの）10％を含むp
H7.2のものを用意し、その100mlを500ml容の坂口フラス
コに入れ、蒸気滅菌後Ｓ−170株の前培養液5mlを植菌し
30℃で３日間振とう培養した。
培養終了後菌体を濾別し、酵素活性が3.8U/mlの培養
濾液100mlを得た。次いで、上記濾液に硫酸アンモニウ
ム61gを撹拌しながら徐々に加え、生成した沈殿を遠心
分離により集め、得られた沈殿を0.01M酢酸緩衝液（pH
4.5）に溶解し、同緩衝液に対して透析した。これを同
緩衝液で平衡化した陽イオン交換体CM−トヨパール650M
［東ソー（株）製］を加えて撹拌することによりホスホ
リパーゼＤをCM−トヨパールに吸着させた。CM−トヨパ
ールを回収し、0.5M NaClを含む0.01M酢酸緩衝液（pH5.
5）により活性画分を溶出し、凍結乾燥して茶褐色のホ
スホリパーゼD 22mg、302Uを得た。培養濾液からのホス
ホリパーゼＤの活性回収率は78％であった。
濾液100mlを得た。次いで、上記濾液に硫酸アンモニウ
ム61gを撹拌しながら徐々に加え、生成した沈殿を遠心
分離により集め、得られた沈殿を0.01M酢酸緩衝液（pH
4.5）に溶解し、同緩衝液に対して透析した。これを同
緩衝液で平衡化した陽イオン交換体CM−トヨパール650M
［東ソー（株）製］を加えて撹拌することによりホスホ
リパーゼＤをCM−トヨパールに吸着させた。CM−トヨパ
ールを回収し、0.5M NaClを含む0.01M酢酸緩衝液（pH5.
5）により活性画分を溶出し、凍結乾燥して茶褐色のホ
スホリパーゼD 22mg、302Uを得た。培養濾液からのホス
ホリパーゼＤの活性回収率は78％であった。
実施例 ２ 実施例１を用いた倍地51で、実施例１と同様の操作を
経てCM−トヨパールから活性画分を溶出した。
経てCM−トヨパールから活性画分を溶出した。
この溶出液に25％飽和となるように硫酸アンモニウム
を加え、同じく25％飽和とした0.02Mトリス−塩酸緩衝
液（pH7.5）で平衡化した疎水性クロマト用担体ブチル
−トヨパール650M［東ソー（株）製］のカラムに通液
し、ホスホリパーゼＤを吸着させた。15〜25％飽和の0.
02Mトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）を、硫酸アンモニウム
濃度を段階的に落として通液することにより洗浄し、硫
酸アンモニウムを含まない緩衝液で活性画分を溶出し
た。
を加え、同じく25％飽和とした0.02Mトリス−塩酸緩衝
液（pH7.5）で平衡化した疎水性クロマト用担体ブチル
−トヨパール650M［東ソー（株）製］のカラムに通液
し、ホスホリパーゼＤを吸着させた。15〜25％飽和の0.
02Mトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）を、硫酸アンモニウム
濃度を段階的に落として通液することにより洗浄し、硫
酸アンモニウムを含まない緩衝液で活性画分を溶出し
た。
限外濾過膜（10 PM10）［アミコン社製］により0.01M
トリス−塩酸緩衝液（pH8.0）に置換し、同緩衝液で平
衡化した陰イオン交換体DEAE−トヨパール650M［東ソー
（株）製］のカラムに通し、食塩濃度勾配（０〜0.3M）
により活性画分を溶出した。
トリス−塩酸緩衝液（pH8.0）に置換し、同緩衝液で平
衡化した陰イオン交換体DEAE−トヨパール650M［東ソー
（株）製］のカラムに通し、食塩濃度勾配（０〜0.3M）
により活性画分を溶出した。
コロジオンバッグ［ザルトリウス社製］により溶出液
を濃縮し、0.025Mトリス−塩酸緩衝体（pH7.5）で平衡
化したゲル濾過用担体トヨパールHW−55F［東ソー
（株）製］のカラムに通し、活性画分を回収した。
を濃縮し、0.025Mトリス−塩酸緩衝体（pH7.5）で平衡
化したゲル濾過用担体トヨパールHW−55F［東ソー
（株）製］のカラムに通し、活性画分を回収した。
この溶出液を0.025Mイミダゾール−酢酸緩衝液（pH7.
4）に置換後、ポリバッファ交換体PBETM94［ファルマシ
ア・ファインケミカルス社製］のカラムに通し、同社製
ポリバッファ（pH5.0）を用いpH勾配により溶出した。
得られた活性画分のポリバッファの除去はトヨパールHW
−55Fのゲル濾過を行った。
4）に置換後、ポリバッファ交換体PBETM94［ファルマシ
ア・ファインケミカルス社製］のカラムに通し、同社製
ポリバッファ（pH5.0）を用いpH勾配により溶出した。
得られた活性画分のポリバッファの除去はトヨパールHW
−55Fのゲル濾過を行った。
かくしてSDS電気泳動で単一なホスホリパーゼD7486U
を得た。上記精製操作におけるホスホリパーゼＤの活性
回収率は約39％で、得られた精製品の比活性は1437U/mg
タンパンであった。
を得た。上記精製操作におけるホスホリパーゼＤの活性
回収率は約39％で、得られた精製品の比活性は1437U/mg
タンパンであった。
次に、精製品について下記のような理化学的性質の試
験を行った。
験を行った。
至適pH 前述の酵素活性測定法における緩衝液を、他の種々の
緩衝液にかえて酵素活性を測定することにより、本酵素
のpH依存性を調べた。その結果は第１図のとおりであ
り、至適pHは5.5付近にある。
緩衝液にかえて酵素活性を測定することにより、本酵素
のpH依存性を調べた。その結果は第１図のとおりであ
り、至適pHは5.5付近にある。
pH安定性 本酵素を0.1M濃度の種々のpHの緩衝液に溶解し、37℃
で２時間静置した。その後、各pHの試料に対して20倍容
の0.1Mトリス−マレイン酸−水酸化ナトリウム緩衝液
（pH5.5）を加え、酵素活性を測定した。結果は第２図
のとおりであり、本酵素はpH4〜８で安定であることが
わかる。
で２時間静置した。その後、各pHの試料に対して20倍容
の0.1Mトリス−マレイン酸−水酸化ナトリウム緩衝液
（pH5.5）を加え、酵素活性を測定した。結果は第２図
のとおりであり、本酵素はpH4〜８で安定であることが
わかる。
至適温度 前述の酵素活性測定法における酵素反応の温度を種々
に変更して酵素活性を測定することにより、本酵素の温
度依存性を調べた。その結果は第３図のとうりであり、
至適温度は55〜65℃にある。
に変更して酵素活性を測定することにより、本酵素の温
度依存性を調べた。その結果は第３図のとうりであり、
至適温度は55〜65℃にある。
熱安定性 本酵素を0.05Mトリス−マレイン酸−水酸化ナトリウ
ム緩衝液（pH5.5）中で、25〜75℃に30分間静置した
後、残存する酵素活性を測定した。その結果は第４図の
とうりであり、55℃まで安定であることがわかる。
ム緩衝液（pH5.5）中で、25〜75℃に30分間静置した
後、残存する酵素活性を測定した。その結果は第４図の
とうりであり、55℃まで安定であることがわかる。
種々の物質の影響 前述の酵素活性測定法において、塩化カルシム溶液を
他の金属塩等の各種の水溶液にかえて、酵素反応系中の
物質濃度が1mMになるようにして、酵素活性を測定し
た。各種物質無添加のときの活性と比較すると、CaCl2,
FeCl3,FeSO4,BaCl2,MnCl2,MgCl2,CuCl2,ZnCl2,SnCl2,Al
Cl3,CoCl2,CdCl2,LiCl,KCl,NaCl,コール酸ナトリウム，
デオキシコール酸ナトリウム，エチレンジアミン四酢酸
・二ナトリウムでは、活性の変化は認められなかった。
塩化セチルピリジニウムでは、若干の活性が阻害され
た。
他の金属塩等の各種の水溶液にかえて、酵素反応系中の
物質濃度が1mMになるようにして、酵素活性を測定し
た。各種物質無添加のときの活性と比較すると、CaCl2,
FeCl3,FeSO4,BaCl2,MnCl2,MgCl2,CuCl2,ZnCl2,SnCl2,Al
Cl3,CoCl2,CdCl2,LiCl,KCl,NaCl,コール酸ナトリウム，
デオキシコール酸ナトリウム，エチレンジアミン四酢酸
・二ナトリウムでは、活性の変化は認められなかった。
塩化セチルピリジニウムでは、若干の活性が阻害され
た。
分子量 濃縮ゲル4.5％Ｔ、分離ゲル10％ＴのSDS−ポリアクリ
ルアミドで電気泳動をおこなった。分子量マーカーとし
てAlbumin（bovine）,Catalase,Ovalbumin,Glyceraldeh
yde−３−phosphate dehydrogenase,Lactate dehydro−
genaseも同時に泳動し、Coomassie Brilliant Blue G−
25により染色した。各分子量マーカーの移動度と分子量
の関係から算出した結果、本酵素の分子量は6.4万であ
った。
ルアミドで電気泳動をおこなった。分子量マーカーとし
てAlbumin（bovine）,Catalase,Ovalbumin,Glyceraldeh
yde−３−phosphate dehydrogenase,Lactate dehydro−
genaseも同時に泳動し、Coomassie Brilliant Blue G−
25により染色した。各分子量マーカーの移動度と分子量
の関係から算出した結果、本酵素の分子量は6.4万であ
った。
等電点 本酵素を、『蛋白質・酵素の基礎実験法』（南江堂）
III.3.7に従いゲル等電点電気泳動にかけ、泳動終了後
ディスクを等間隔に切断し、得られた切片の蒸留水によ
る抽出液について、pHおよび酵素活性を測定した。その
結果、本酵素の等電点はpH6.4〜6.5であった。
III.3.7に従いゲル等電点電気泳動にかけ、泳動終了後
ディスクを等間隔に切断し、得られた切片の蒸留水によ
る抽出液について、pHおよび酵素活性を測定した。その
結果、本酵素の等電点はpH6.4〜6.5であった。
実施例 ３ 大豆性ホスファチジルエタノールアミン2.5mg、ジエ
チルエーテル170μｌ、グリセロール79mg、1M CaCl26.8
μｌ、0.8M酢酸緩衝液（pH5.6）17μｌ、実施例１で得
たホスホリパーゼD 1Uを含む0.1％牛血清アルブミン（B
SA）溶液83.5μｌを混合し、室温で撹拌しながら12時間
反応した。ジエチルエーテル：エタノール（3:2）210μ
ｌを添加してよく混合し、上層中のリン脂質組成を日本
油化学協会編基準油脂分析試験法2.2.8.4a−86に従い分
析した。その結果は第１表のとおりで、96.2％のホスフ
ァチジルグリセロールを生成した。
チルエーテル170μｌ、グリセロール79mg、1M CaCl26.8
μｌ、0.8M酢酸緩衝液（pH5.6）17μｌ、実施例１で得
たホスホリパーゼD 1Uを含む0.1％牛血清アルブミン（B
SA）溶液83.5μｌを混合し、室温で撹拌しながら12時間
反応した。ジエチルエーテル：エタノール（3:2）210μ
ｌを添加してよく混合し、上層中のリン脂質組成を日本
油化学協会編基準油脂分析試験法2.2.8.4a−86に従い分
析した。その結果は第１表のとおりで、96.2％のホスフ
ァチジルグリセロールを生成した。
また第１表には、キャベツ,Streptomyces chromofusc
us（S.C.）,streptomyces hachijoensis（S.H.）を起源
とするホスホリパーゼＤを同条件下で用いたときの分析
値も合わせて示した。
us（S.C.）,streptomyces hachijoensis（S.H.）を起源
とするホスホリパーゼＤを同条件下で用いたときの分析
値も合わせて示した。
実施例 ４ 大豆製ホスファチジルコリン10g、ジエチルエーテル6
50ml、グリセロール620g、0.4M酢酸緩衝液（pH5.6）130
ml、実施例１で得たホスホリパーゼD4000U、蒸留水42ml
を混合し、撹拌しながら８時間反応した。ジエチルエー
テル800mlを添加して抽出し、エーテル相を3MNaCl、蒸
留水で洗浄した後、実施例３と同様にリン脂質組成を分
析した。その結果、反応生成物中の95.4％がホスファチ
ジルグリセロールであり、ホスファチジン酸は検出され
なかった。また、未反応のホスファチジルコリン0.2
％、不純物4.4％が存在した。
50ml、グリセロール620g、0.4M酢酸緩衝液（pH5.6）130
ml、実施例１で得たホスホリパーゼD4000U、蒸留水42ml
を混合し、撹拌しながら８時間反応した。ジエチルエー
テル800mlを添加して抽出し、エーテル相を3MNaCl、蒸
留水で洗浄した後、実施例３と同様にリン脂質組成を分
析した。その結果、反応生成物中の95.4％がホスファチ
ジルグリセロールであり、ホスファチジン酸は検出され
なかった。また、未反応のホスファチジルコリン0.2
％、不純物4.4％が存在した。
発明の効果 本発明のホスホリパーゼＤは、上述のように従来の製
造法により得られるものと比較して、高いホスファチジ
ル基転移活性を有している。また本酵素によるホスファ
チジル基転移反応では、ホスファチジン酸はほとんど生
成せず、リン脂質誘導体を効率よく製造することができ
る。
造法により得られるものと比較して、高いホスファチジ
ル基転移活性を有している。また本酵素によるホスファ
チジル基転移反応では、ホスファチジン酸はほとんど生
成せず、リン脂質誘導体を効率よく製造することができ
る。
本酵素を使用してホスファチジル基転移反応を行え
ば、目的のリン脂質誘導体を、従来よりはるかに高い収
率で製造でき、極めて簡易な精製操作で製品の純度を向
上させることができるという利点がある。
ば、目的のリン脂質誘導体を、従来よりはるかに高い収
率で製造でき、極めて簡易な精製操作で製品の純度を向
上させることができるという利点がある。
本発明に使用されるストレプトマイセス属Ｓ−170株
は、安価な倍地成分で十分量の本酵素を生成することが
でき、培養物から、本酵素を簡単に採取することができ
る。また、本酵素は特に精製を必要とせず、培養濾液そ
のままでもよいし、必要に応じて、単に濃縮するだけで
も使用できる。すなわち、低コストで、高いホスファチ
ジル基転移活性を有する本酵素を生産することが可能で
ある。
は、安価な倍地成分で十分量の本酵素を生成することが
でき、培養物から、本酵素を簡単に採取することができ
る。また、本酵素は特に精製を必要とせず、培養濾液そ
のままでもよいし、必要に応じて、単に濃縮するだけで
も使用できる。すなわち、低コストで、高いホスファチ
ジル基転移活性を有する本酵素を生産することが可能で
ある。
また、本酵素はpH、温度等に対する安定性が良好で、
工業的な利用に有利である。
工業的な利用に有利である。
以上のように、本発明は、ホスファチジル基転移反応
でリン脂質誘導体を従来より効率的に、しかも低コスト
で製造できるようにする優れたものである。
でリン脂質誘導体を従来より効率的に、しかも低コスト
で製造できるようにする優れたものである。
第１図：本発明の酵素のホスファチジルコリン分解活性
のpH依存性を示すグラフ。 第２図：本発明の酵素の安定性に及ぼすpHの影響を示す
グラフ。 第３図：本発明の酵素のホスファチジルコリン分解活性
の温度依存性を示すグラフ。 第４図：本発明の酵素の安定性に及ぼす温度の影響を示
すグラフ。
のpH依存性を示すグラフ。 第２図：本発明の酵素の安定性に及ぼすpHの影響を示す
グラフ。 第３図：本発明の酵素のホスファチジルコリン分解活性
の温度依存性を示すグラフ。 第４図：本発明の酵素の安定性に及ぼす温度の影響を示
すグラフ。
Claims (2)
- 【請求項１】下記の理化学的性質を有するホスホリパー
ゼD: （ａ）作用 加水分解反応 下記一般式［Ｉ］ （但し、式中R1,R2はアシル基またはアルキル基、Ｘは
水酸基を含有する塩基の水酸基１個を除いた後に残る有
機基を示す）で表わされるリン脂質を加水分解し、ホス
ファチジン酸と塩基とを遊離させる； ホスファチジル基転移反応 上記一般式［Ｉ］で表されるリン脂質のホスファチジル
基を下記一般式［II］ R3OH ………［II］ （但し、R3はアルコール性水酸基に結合した有機基を示
す）で表されるグリセロール、セリン、エタノール等の
アルコール性水酸基を有する化合物の共存下、アルコー
ル性水酸基にホスファチジル基を転移させ、下記一般式
［III］ （但し、R1,R2,R3は前記と同様の基を示す）で表される
リン脂質誘導体を生成する； （ｂ）基質特異性 ホスファチジルコリンに対する加水分解活性を100とし
た場合の相対活性は、リゾホスファチジルコリンに対し
2.3、スフィンゴミエリンに対しては0.9である； （ｃ）至適pH:約5.5 （ｄ）pH安定性:pH4〜８で安定 （ｅ）至適温度:55〜65℃ （ｆ）熱安定性 pH5.5において50℃、30分間の熱処理で全く失活せず、7
0℃、30分間でも約50％の活性が残存する； （ｇ）種々の物質の影響 濃度1mの種々の物質を共存させた場合、加水分解活性は
塩化セチルピリジニウムのとき若干阻害されるが、CaCl
2,FeCl3,FeSO4,BaCl2,MnCl2,MgCl2,CuCl2,ZnCl2,SnCl2,
AlCl3,CoCl2,CdCl2,LiCl,KCl,NaCl,コール酸ナトリウ
ム，デオキシコール酸ナトリウム，エチレンジアミン四
酢酸・二ナトリウムのときは阻害されない； （ｈ）分子量 6.4万（SDS・PAGE法による）。 （ｉ）等電点 pH6.4〜6.5（等電点電気泳動法による）。 - 【請求項２】ストレプトマイセス属に属するＳ−170株
を培養し、培養物からホスホリパーゼＤを採取すること
を特徴とするホスホリパーゼＤの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2118051A JP2799622B2 (ja) | 1990-05-08 | 1990-05-08 | ホスホリパーゼｄおよびその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2118051A JP2799622B2 (ja) | 1990-05-08 | 1990-05-08 | ホスホリパーゼｄおよびその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04166084A JPH04166084A (ja) | 1992-06-11 |
| JP2799622B2 true JP2799622B2 (ja) | 1998-09-21 |
Family
ID=14726809
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2118051A Expired - Fee Related JP2799622B2 (ja) | 1990-05-08 | 1990-05-08 | ホスホリパーゼｄおよびその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2799622B2 (ja) |
-
1990
- 1990-05-08 JP JP2118051A patent/JP2799622B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04166084A (ja) | 1992-06-11 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
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