JPH0387191A - ホスファチジルイノシトールの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、混合リン脂質からホスファチジルイノシトー
ルを高純度で製造する方法に関するものである。本願発
明によって得られる高純度ホスファチジルイノシトール
は、食品、化粧品、農薬、水産などの分野で乳化剤とし
て、また医薬分野では乳化剤、リポソーム形成基材など
として幅広く利用される。

こ従来の技術〕 リン脂質は動物、植物、微生物、藻類などの生体中に含
まれ、主に細飽膜の構成成分として生体中で種々の重要
な働きをしている。天然物由来のリン脂質は、通常、ホ
スファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン
、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン
、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリンｔヨどの混合
物からなり、これから特定のリン脂質を分画するために
、メタノール、エタノールやイソプロピルアルコール、
ヘキサン、クロロホルムなどの単一溶剤による抽出や混
合溶剤を用いた再詰晶などの溶剤分別法、シリカゲル、
アルミナ、イオン交換樹脂ｔ；どの吸着剤を用いたカラ
ムクロマト分画法、ＣｄＣ１２複合体やアセチル化など
の誘導体による分画法などが利用されている。

しかしながら、これらの溶剤分別法や誘導体！ごよる分
画法では、リン脂質を高純度に濃縮することはできなか
った。また、これらの方法とカラムクロマトによる分画
法を組み合わせることによって純度を高めることはでき
るが、収率が極めて悪いという欠点を有しており、この
ために製品が高価となり、産業上の利用が限定されてい
た。特にホスファチジルイノシトールは、通常の溶剤抽
出ではホスファチジルエタノールアミンやホスファチジ
ン酸等との分離が困難であり、多種類の溶剤と各種のカ
ラム分画を組み合わせることによってはじめて高純度に
精製することが可能であるが、収率は極めて悪いという
問題があった。

一方、高純度のリン脂質は、化学的合成法によっても製
造が可能であり、産業的にはこれらの方法から製造され
た種々の製品が利用されている。

しかしながら、化学的合成法によれば最終的に単−成分
のリン脂質を製造することが可能であるが、合成反応時
の熱Ｈ歴などのために不飽和結合を有する構成脂肪酸や
リン酸エステルが劣化、着色するので、その精製には極
めて煩雑かつ経済的に不利な工程を採用せざるを得ない
のが現状である。

上記方法の他に、リン脂質を酵素的に変換する試みも従
来から行なわれている。例えば、特開昭６２−４８３９
０号には、混合リン脂質にキャベツあるいは米ヌカ由来
のホスホリパーゼＤを作用させ、ホスファチジルイノシ
トール以外のリン脂質成分を加水分解し、次いでこの反
応物をヘキサン抽出し、抽出物を５％酢酸エタノールで
洗浄して高純度のホスファチジルイノシトールを得る方
法が開示されている。この方法によると酵素の特質をう
まく利用してホスファチジルイノシトールを製造してい
るが、より一層高純度のホスファチジルイノシトールを
製造できる方法が望まれている。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明は劣化や変質などを伴うことがなく、簡易に高純
度のホスファチジルイノシトールを製造できる方法を提
供することを目的とする。

〔課題を解決するための手段〕

特開昭６２−４８３９０号には、混合リン脂質にホスホ
リパーゼＤを作用させてホスファチジルイノシトール以
外のリン脂質成分を加水分解し、生成したホスファチジ
ン酸とホスファチジルイノシトールを分離する方法が記
載されているが、本発明はこれをさらに発展させ、ホス
ホリパーゼＤの作用により生成したホスファチジン酸を
特定のホスファターゼで分解すると、極めて効率よくホ
スファチジルイノシトールを高純度に精製することがで
きるとの知見に基づいてなされたのである。

すなわち、本発明は、混合リン脂質にホスホリパーゼＤ
を作用させた後、アルカリまたは酸性ホスファターゼを
作用させ、未反応のホスファチジルイノシトールを採取
することを特徴とする高純度ホスファチジルイノシトー
ルの製造方法を提供する。

本発明に用いる混合リン脂質は、目的とするリン脂質を
含むものであれば、動物、植物、微生物、藻類などの起
源は問題でなく、また化学合成法で得られたものでもよ
い。さらに、これらにはジアシル型およびモノアシル型
（リゾ体）を含み、アシル基の鎖長および不飽和の結合
の有無や個数には関係なく、いずれのリン脂質でも使用
できる。

尚、天然物由来の混合リン脂質には、概してリン脂質以
外の成分、例えばグリセリド等の中性脂質や糖ないし糖
脂質も含まれていることが多く、これらが含まれていて
もさしつかえないが、本発明の方法を適用する前に、ク
ロロホルム／メタノール溶媒などによりこれらを除去し
ておくのがよい。

この溶媒を使用すると、ホスファチジルコリンをも同時
に除くことができる。

本発明では上記原料の混合リン脂質にホスホリパーゼＤ
を作用させる。ホスホリパーゼＤは、ホスファチジルイ
ノシトールにほとんど作用せず、換言すると実質的にホ
スファチジルイノシトールを加水分解せず、他のリン脂
質成分、例えばホスファチジルコリン、ホスファチジル
エタノールアミン等を選択的に加水分解する。具体的に
は、ホスファチジルエタノールアミンをホスファチジン
酸に加水分解する。この基質特異性を有するホスホリパ
ーゼＤの例としては、キマベツ、米ヌカ、大豆、菜種、
ヒマワリ、ゴマ、ニンジン、ビーナツツ、ホウレン草、
綿実等の植物中に存在するホスホリパーゼＤ、ラット脳
ミクロソーム、肝臓など動物由来のホスホリパーゼＤ、
微生物起源のものとしてはストレプトマイセス属たとえ
ばＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃｈｒｏｍｏｆｕｓｃｕ
ｓ、　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ。

（特開昭５８−１５２４８１号に開示、微工研菌寄第６
１００号）など、アクチノマデューラ属、例えばＡｃｔ
ｉｎｏｍａｄｕｒａ　ｓｐ、　（特開昭５８−６７１８
３号に開示、微工研菌寄第　６１３２号）など、ノカル
デイオプシス属、例えばＮｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ　ｓ
ｐ（特開昭５８−６３３８８号に開示、微工研菌寄第５
１２号）などのほか、ミクロモノスポラ属等の微生物が
生産するホスホリパーゼＤ、チノリモ（Ｐｏｒｐｈｙｒ
ｉｄｉｕｍ　ｃｒｕｅｎｔｕｍ）、ウミゾウメン（Ｎｅ
ｍａｌｉｏｎ　Ｖｅｒ＋＋＋１ｃｕｌａｒｅ）　　など
の紅藻類に存在するホスホリパーゼＤなどがあげられ、
これらの１種又は２種以上の混合物を使用できる。尚、
本発明は上記例示に何ら制限を受けるものではない。

本発明では、次いで上記加水分解物にアルカリまたは酸
性ホスファターゼを作用させる。該ホスファターゼは、
ホスファチジン酸およびその塩を加水分解するが、ホス
ファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、
ホスファチジルイノシトールなどのリン脂質成分には作
用しない。この基質特異性を有するアルカリホスファタ
ーゼとしては、ヒトの小腸、胎盤、肝臓、ウシの小腸、
腎臓、ミルク、ブタの腎臓、ラットの肝臓、小腸などの
動物臓器あるいは分泌液に由来するもの、大腸菌（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）起源のものなどが例示
でき、また酸性ホスファターゼとしては、ヒトの前立腺
、ウシのミルク、精液など動物に由来するもの、小麦胚
芽、ジアガイモ、サツマイモなど植物起源のもの、Ｃｌ
ｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ。

Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ
などの微生物に由来するものなどがあげられるが、本発
明はこれらの例示に何ら制限されない。

かかるホスホリパーゼＤ１アルカリホスフアクーゼ、酸
性ホスファターゼは、通常、市販品を用いてもよく、必
要に応じて精製し、あるいは前記天然物から常法により
単離・精製したものを用いてもよい。

本発明の方法によって、混合リン脂質から高純度リン脂
質を得る手順を次に例示する。すなわち、前記混合リン
脂質をそのままあるいは前処理としてメタノール、エタ
ノール、イソプロパツール、エーテル、クロロホルム、
ヘキサンなどの有機溶剤の単独もしくは混合溶剤で、目
的とするリン脂質以外の成分の一部を抽出分離した原料
をジメチルエーテル、ジエチルエーテル、酢酸エチル、
ヘキサン、ベンゼンなどの溶媒に溶かし、もしくは無溶
媒で必要に応じて酵素の賦活剤として公知の添加剤、例
えばドデシル硫酸ソーダ、コール酸、デオキシコール酸
もしくはそれらの塩、硫酸マグネシウム、塩化マグネシ
ウム、塩化カルシウム、陰イオン界面活性剤など、また
酢酸、リン酸、クエン酸、塩酸などの緩衝剤を共存させ
、振とうあるいは適当な攪拌状態で、ｐｆ１３〜１０好
ましくはｐＨ４〜８．１０〜７０℃、好ましくは２０〜
４０℃で、１時間〜４８時間反応させ、ホスホリパーゼ
Ｄによりホスファチジルイノシトール以外のリン脂質成
分を加水分解する。次いで、溶媒を使用した場合はそれ
を回収し、常法により留去する。

また無溶媒で反応させた場合は、リン脂質類をエーテル
等適当な溶媒で抽出し、常法により溶媒を除去する。こ
れを必要に応じて前記と同様の添加剤を配合した緩衝液
中に分散させ、アルカリホスファターゼまたは酸性ホス
ファターゼの共存下で、通常の至適もしくはそれに近い
条件下で、すなわち、アルカリホスファターゼの場合に
はｐＨ７〜１２、好ましくはｐｌ（７〜１０、酸性ホス
ファターゼの場合はｐＨ４〜７、好ましくはｐＨ５〜６
、いずれも１０〜６０℃、好ましくは２０〜４０℃で、
１時間〜４８時間反応させ、ホスファチジン酸お０ よびその塩を加水分解する。次いで、常法により前記と
同様の有機溶剤を用いて洗浄、抽出、分別することによ
って、あるいは膜分離、あるいはカラムクロマト分画：
こまって目的とする高純度ホスファチジルイノシトール
を得ることができる。特にアルカリまたは酸性ホスファ
ターゼで処理した反応物は、これを通常のアセトン分別
することにより、アセトン不溶物として加水分解されな
い目的のリン脂質であるホスファチジルイノシトールが
高純度かつ容易に得られるので好ましい。なお、かかる
反応により目的の高純度ホスファチジルイノシトールが
生成する反応過程は、例えばＴＬＣ（薄層クロマトグラ
フィー）、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトクラフィー）　
、ＴＬＣ／Ｆ　ＩＤ　（ヤトロスキャン）などの分析手
段により経過を把握でき、これによって反応時間をコン
トロールすることができる。

本発明は上記工程を採用することを特徴とするものであ
り、ホスホリパーゼＤ１アルカリまたは酸性ホスファタ
ーゼはこれらの酵素が混合リン脂１ 質に充分作用する量で使用することができるが、混合リ
ン脂質１ｇ当たり、ホスホリパーゼＤを０．１〜５００
ユニツト、好ましくは１〜１００ユニツト、アルカリま
たは酸性ホスファターゼを１〜１．０００ユニント、好
ましくは１０〜５００ユニツト１吏用するのがよい。

〔発明の効果〕

本発明によれば、種々の混合リン脂質を基質特異性のあ
るホスホリパーゼＤおよびアルカリまたは酸性ホスファ
ターゼで加水分解することにより、ホスファチジルイノ
シトールを容易に、かつ高純度（例えば８０〜９５％）
で、収率よく分離することができるようになった。特に
、従来、多種の混合溶剤による分別、カラムクロマト分
画もしくはそれらを組み合わせた複雑な技術によっても
極めて低い収率でしか得られていなかったホスファチジ
ルイノシトールを、ヘキサン、エタノール、アセトン、
クロロホルムのような汎用性の高い、安価な溶剤を使用
するだけで精製でき、高純度で得られるという優れた利
点を有する。

２ 次に、実施例により本発明を説明する。尚、実施例中、
リン脂質成分のうち、ホスファチジルコリンをＰＣ，ホ
スファチジルエタノールアミンをＰＥ、ホスファチジル
イノシトールをＰＩ、ホスファチジルセリンをｐ３、ホ
スファチジン酸をＰＡと略称する。

〔実施例〕

実施例１ 大豆リン脂質（ＰＣ：３２．９％、ＰＥ：２２．４％、
ＰＩ：２３．６％、ＰＡ：１３，７％、その他：２．４
％）５ｇをビーカーにとり、水冷クロロホルム５０証に
溶解し、水冷メタノール６０−を加え、攪拌混合して生
じた沈澱を１０秒以内に遠心分離（５０００ｒｐｍ、２
℃）で集めた。これに水冷クロロホルム２５−を加えて
溶解し、さらに水冷メタノール６０−を加え、同様にし
て攪拌混合後、遠心分離して沈澱物を得た。この操作を
２回繰り返し、減圧下に溶媒を留去し乾燥した。得られ
た抽出リン脂質の組成はＰＥ：３５．９％、ＰＩ：４０
．５％、ＰＡ：２３．７％であった。次に、該３ 抽出リン脂質すなわちＰＣを含まないリン脂質１００ｍ
ｇをガラス製反応容器中でジエチルエーテル１０−に溶
解し、これに常法（Ｌｅｅ、　Ｓ、Ｙ、　等、Ｊ、　Ｆ
ｅｒｍｅｎｔ、　Ｔｅｃｈｎｏｌ、、　　６３．　３７
　　（１９８５）　）によって精取したキアベン由来の
ホスホリパーゼＤ　０．０６　ｕｎｉｔ／　ｍｇおよび
０．０８モルカルシウムイオンを含む０．２モル酢酸緩
衝液（ｐＨ５，６）　５ｍｉ！を添加し、３０℃にてｇ
ｏｏｒｐｍで攪拌しながら３時間反応させた。この反応
物の組成をＨＰＬＣで分析したところ、ＰＩ：５６．５
％、ＰＡ：４１．４％であった。反応後、エーテルを減
圧留去して得られた上記ＰＩおよびＰＡ混合物を超音波
によって０．０６モルのマレート緩衝液（ｐＨ６，０）
に分散させ、さらに反応液１−当たり酸性ホスファター
ゼ（シグマ社製試薬、ポテト起源）　ｌ　２ｕｎｉｔを
溶解させた０、０６モルのマレート緩衝液２０−を、２
５℃、１ｏｏｏｒｐｍで攪拌しながら、ミセル状態で１
０時間反応させた。この反応液の組成をＴＬＣ／Ｆ　Ｉ
　Ｄで分析したところ、ＰＩ：５５．５％、ＰＡ：１．
Ｑ％、ジグリセリドニ４１．５％であった。

４ さらにこの反応液を常法によりＦｏｌｃｈ溶液で抽出し
、溶媒を減圧留去後、アセトンを添加して生じた沈殿を
遠心分離し、アセトンで洗浄した後、乾燥して白色固形
物３５■を得た。ＰＩ線純度９８．５％であった。また
ＰＩ回収率は８７．５％と極めて高い値を示した。

実施例２ 実施例１に記載のＰＣを含まないリン脂質６５ｒｎｇを
使用し、かつＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃｈｒｏｍｏ
ｆｕｓｃｕｓ由来のホスホリパーゼＤ（東洋醸造■製）
を用いて実施例１と同様にして加水分解を行った。ただ
し４０ｍＭカルンウムイオンを含む０．１　Ｍ　）　Ｉ
Ｊス塩酸緩衝液（ｐｆ１８．０　）中で５時間加水分解
く反応）した。反応物のリン脂質組成はＰＩ：５５．０
％、ＰＡ：４４．５％であった。

この反応物を、デオキシコール酸ソーダ４００ｍｇ１　
ヒト胎盤アルカリホスファターゼ（シクマ社製）　４　
Ｑｕｎｉｔを含むトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，８）４０
ｄ中、３７℃のミセル系で５時間反応させた後、実施例
１と同様にしてＦｏｌｃｈ溶液、クロロホ５ ルム抽出、アセトン分別処理を行い、白色固形物１２ｍ
ｇを得た。、Ｐ工純度は９８．０％であり、Ｐ１回収率
は７８．４％であった。

比較例１ 特開昭６２−４８３９０号公報に記載の方法に準じてホ
スファチジルイノシトールを製造した。

すなわち、実施例１に記載の大豆リン脂質（ＰＩ線純度
２３．６％）５ｇを前記キャベツ由来のホスホリパーゼ
Ｄ　（０，５ｕｎｉｔ／　ｍｇ大豆リン脂質）を用いて
実施例１と同様１こ加水分解（１０時間）した。

この反応物Ａ（４，５ｇ）の組成は、ＰＩ：２６．０％
、ＰＡニア１．２％、その他、２．８％であった。

この反応物Ａ２．０ｇをヘキサン２０−で２回抽出し、
ヘキサン層を集め、濃縮、乾燥した後、５％酢酸エタノ
ールで洗浄し、次いで乾燥して０．４０ｇの白色固形物
を得た。このものの組成はＰＩニア００％、ＰＡ：２９
．０％、その他：１０％であり、ＰＩ回収率は５３．８
％であった。

実施例３ 比較例１て製造した反応物Ａ’２．０　ｇを、前記ポ６ テト由来の酸性ホスファターゼを用′ｌ）、実施例１と
ほぼ同条件下で反応させ、得られた反応物をヘキサン２
０−で２回抽出し、ヘキサン層を濃縮後、５％酢酸エタ
ノールで洗浄し、白色固形物０．４５ｇを得た。組成は
ＰＩ：９７．５％、Ｐ、Ａ：０．５％、その他：１．０
％であり、Ｐ１回収率！２８４．４％であった。このよ
うに、本発明によれば、比較例１に比べて目的とするＰ
Ｉが高純度に精製され、かつ高収率で得られることがわ
かる。

実施例４ 常法により、サフラワ一種子から混合リン脂質（組成は
、ＰＣ：１５．８％、ＰＥ：９．７％、ＰＩ：２２゜７
％、ＰＡ：１５．８％、リゾＰＣ：３．４％、その他：
３２．６％）を得た。このサフラワー混合リン脂質５０
ｇを原料として、実施例１の手順により、実質的にＰＣ
を含まない抽出リン脂質（組成は、ＰＥ：２５．０％、
ＰＩ：４８．５％、ＰＡ：２６．１％、リゾＰＣ：０．
４％）を２３ｇ得た。次いで、この抽出リン脂質を、実
施例１と同様の方法で、キャベツ由来のホスホリパーゼ
Ｄで反応さ７ せ、さらに実施例２で用いたヒト胎盤由来のアルカリホ
スファターゼで反応させ、反応液を実施例１の手順で抽
出し、次いてアセトン分別して白色物質（ＰＩ線純度９
８．０％）を８．０ｇ得た。、Ｐ■回収率（ま７０３％
であった。

実施例５ 大豆レシチンＬＰ−２０（日清製油□□□〕製、組成は
ＰＣ：ＩＬ、０％、ＰＥ：２３．５％、ＰＩ：１３．５
％、ＰＡ：８．５％、その他：４３．５％）ＬｏｇにＳ
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｒｕｎｉｃｏｌｏｒ起源の
ホスホリパーゼ、Ｄ　（ヤクルト■製）を原料１ｇ当た
り３Ｑｕｎｉｔ加え、０．２モルリン酸緩衝液（ｐＨ７
，０）酢酸エチル（１００＋ｄ）の２相系で、３０℃、
１０時間反応させ、溶媒留去後、これにさらにウシ精液
起源の酸性ホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ社製〉を反応液
ｌ−当たり２　Ｑｕｎｉｔ加え、０．２　Ｍ酢酸緩衝液
（ｐ）１５．５　＞中、ミセル系で、２５℃、２４時間
反応させた。この反応物をクロロホル玄／メタノール３
００−で３回抽出し、クロロホルム層を濃縮、乾燥し、
さらにアセトンで沈殿物を生じせ８ しめ、 遠心分離して沈殿物を集め、 乾燥して白色 固形物上 ０ｇを得た。

ＰＩ線純度９７．５％、ＰＩ 回収率は７２．２％であった。

９

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 混合リン脂質にホスホリパーゼＤを作用させた後、アル
   カリまたは酸性ホスファターゼを作用させ、未反応のホ
   スファチジルイノシトールを採取することを特徴とする
   ホスファチジルイノシトールの製造方法。