KR100225669B1

KR100225669B1 - 효소를 이용한 고순도 인지질의 생산방법

Info

Publication number: KR100225669B1
Application number: KR1019970014346A
Authority: KR
Inventors: 정국훈; 김선기; 이준식; 김정균
Original assignee: 유병택; 주식회사두산
Priority date: 1997-04-18
Filing date: 1997-04-18
Publication date: 1999-10-15
Also published as: KR970043059A

Abstract

본 발명은 미생물로부터 생산된 인지질 가수분해 효소를 이용하여 인지질중의 플라스말로젠(Plasmalogen)을 고순도로 농축, 정제하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세히는 인지질중에 함유되어 있는 플라스말로젠을 분리하기 위해 세라시아종(Serratia spp) MK1으로 부터 생산된 포스포리파제(Phospholipase) A1을 이용하여 인지질중에 함유된 플라스말로젠 이외의 인지질을 가수분해하여 제거함에 의해 고순도의 플라스말로젠을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

효소를 이용한 고순도 인지질의 생산방법

본 발명은 미생물로부터 생산된 인지질 가수분해 효소를 이용하여 인지질중의 플라스말로젠(Plasmalogen)을 고순도로 농축, 정제하는 방법에 관한 것이다. 이를 상세히 설명하면 인지질중에 함유되어 있는 플라스말로젠을 분리하기 위해 세라시아종 (Serratia spp) MK1으로부터 생산된 포스포리파제(Phospholipase) A1을 이용하여 인지질중에 함유된 플라스말로젠 이외의 인지질을 가수분해하여 제거함에 의해 고순도의 플라스말로젠을 생산하는 방법에 관한 것이다.

인지질(Phospholipid)은 동물세포막의 주요 구성성분중의 하나이며, 에테르성 인지질(ether glycerophospholipid)은 이들 인지질중의 주요 구성성분중의 하나이다. 이들은 식물을 제외한 여러 생물체에서 발견되었으며 혐기성 세균(anaerbic bacteria) , 원생동물(protozoa) 등에서도 발견된다. 플라스말로젠은 에테르성 인지질의 주요 구성인자로서 뇌세포, 심장, 근육세포, 적혈구 및 혈소판등에서 많이 발견된다. 천연에서 발견되는 플라스말로젠은 주로 콜린 플라스말로젠(Choline plasmalogen)과 에탄올아민 플라스말로젠(Ethanolamine plasmalogen)의 형태로 나타나며, 이들은 1,2-디아실(diacyl)과 1-알킬-2-아실(1-alkyl-2acyl)-글리세로 인지질(glycerphosphlip id)의 혼합체로서 존재한다. 이들 1,2-디아실과 1-알킬-2-아실-글리세로 인지질 (glycerophospholipid)의 혼합체들은 구조 및 그 물리적 특성이 플라스말로젠과 매우 유사하므로 일반적 분리법으로는 이들 혼합물로부터 플라스말로젠을 고순도로 분리하는 것은 매우 어려운 공정이다. 따라서 플라스말로젠을 고순도로 얻기 위한 여러 가지 방법들이 제안되고 있다.

일반적으로 고순도 플라스말로젠을 얻기 위한 방법은 화학적 혹은 생화학적으로 플라스말로젠이 함유되어 있는 혼합물중의 디아실인지질(diacylglycerophospholipid)을 선택적으로 가수분해함에 의해 이루어진다. 디아실인지질 플라스말로젠이나 1-알킬 -2-아실-글리세로 인지질보다 화학적으로 더 빨리 가수분해된다. 따라서 이를 이용하여 플라스말로젠을 농축할 수 있다(Renkonen, O.Isolation of Native Plasmalogen (1963) Acta Chem. Scand 17,pp 634-640. : Frosolono, M.F. et al., Preparation and Properties of Phosphatidyl Ethanolamine from Bovine White Matter (1973) Chem, Phys. Lipid 10,pp 203-214). 보다 일반적인 플라스말로젠의 농축법은 효소를 이용하는 방법이다.

이는 디아실인지질이 플라스말로젠이나 1-알킬-2-아실-글리세로 인지질보다 효소에 의해 쉽게 가수분해된다는 사실을 이용한 것이다. Gottfried등은 (Gottfrid, E.L. et al, Idolation and Characterization of Phosphatidyl Choline , a pure Native Plasmalogen (1962) J. Biol, Chem. 237, pp 329-3330 Crotalus atrox의 뱀독에서 분리한 포스포리파제 A2를 소심장에서 추출한 심장 레시틴에 반응시켜 콜린 플라스말로젠을 정제할 수 있음을 보고하였다.

이것은 소심장내에 존재하는 포스파티딜 콜린(디아실인지질)이 콜린 플라스말로젠보다 포스포리파제 A2에 보다 쉽게 가수분해되는 성질을 이용하는 것이다. 유사하게 Warner 등은(Waner, H.R. et al, The Configuration of the Double Bond in Naturally- occurring Alkenyl Ethers (1962) J.Am. Chem. Soc. 85,pp 60-64) 미생물로부터 생산된 포스포리파제 C를 이용하여 그리고 Land등은 (Lands, W.E.M et al, Relative Reactivities of Acyl and Alkenyl Derivatives of Glyderol-3-phosphorylcholine (1965) Biophys. Acta. 98,pp 532-538) 양배추로부터 생산된 포스포리파제 D를 이용하여 콜린 플라스말로젠을 정제할 수 있음을 보고한 바 있다. 그러나 상기 방법들은 디아실인지질과 에테르성 인지질간의 반응속도차에 근거를 방법들로서 부반응에 의해 원하는 플라스말로젠의 가수분해에 의한 손실을 막을 수 없어 수율이 매우 떨어지고 플라스말로젠을 고순도로 얻기가 곤란하다.

또 다른 플라스말로젠 정제법으로 리파제를 이용한 방법들이 보고되었다. (Woelk, H.et al. Preparation of Pure Choline and Ethanolamine Plasmalogens with the Use of Purified Lipase from porcine Pancreas (1973) Hoppe-Seler's Z.Physiol, Chem. 354, pp 1265-1270., ox, J.W. preparration of purified

Ethanolamine Plasmalogen with Rhizopes delemar Lipase(1977) Fed. Proc, 36, p 852). 이는 속도론적인 선택적 가수분해에 의존하던 기존의 방법과는 달리 플라스말로젠이 인지질의 sn-1 위치에 에테르 결합을 하고 있어 리파제에 의한 공격을 받지 않는다는 것을 이용한 것이다. 이를 위해 주로 돼지 췌장 리파제, 미생물 리파제등이 이용되었다. 그러나 리파제는 포스포리파제와 달리 인지질에 대한 선택성이 크지 않아 디아실인지질의 가수분해를 위해 많은 효소량과 긴 반응시간을 요구한다. 이러한 리파제 이용의 단점은 포스포리파제 A1을 이용함에 의해 극복할 수 있다.

포스포리파제는 인지질의 에스테르 결합을 가수분해하는 반응을 촉진하는 효소군을 통칭하며, 인지질의 에스테르 결합을 공격하는 위치 특이성에 따라 포스포리파제 A1, A2, B, C, D로 분류된다. 포스포리파제 A1은 인지질의 sn-1 위치를 가수분해하는 특이성을 가지며, A2는 sn-2 위치. B는 sn-1과 sn-2를 동시에 가수분해하는 특이성을 가지고 있다. 포스포리파제 C는 글리세롤과 인산기간의 포스포에스테르 결합을 가수분해하는 특징을 가지고 있으며 포스포리파제 D는 포스파티딜산과 염기간의 에스테르 결합을 가수분해하는 성질을 가지고 있다.

포스포리파제 A1은 디아실인지질의 sn-1위치의 에스테르 결합을 가수분해함에 의해 유리 지방산 (free fatty acid) 과 라이소인지질(Lysophospholipid)로 전환하는 활성을 지니고 있다.

따라서 본 발명에서는 상기의 문제점을 해결하고 포스포리파제 A1의 특성을 이용하여 디아실인지질의 sn-1 위치에 에스테르 결합을 가수분해 함으로서 인지질중의 플라스말로젠을 고순도로 농축 정제하는 방법을 개발하게 되었다. 특히 본 발명자들은 Serriatia spp MK1에서 분비되는 것으로 알려진 포스포리파제 A1을 이용하여 효과적으로 인지질중의 플라스말로젠을 고순도로 농축 정제하는 방법을 개발하게 된 것이다.

제1도는 소심장에서 추출·정제하여 반응기질로 이용한 콜린 인지질의 HPLC 크로마토그램이다.

제2도는 소심장에서 추출한 콜린 인지질중 플라스말로젠 함량을 조사한 HPLC 크로마토그램으로, 반응기질로 이용된 콜린 인지질을 10분간 염산가스로 처리후의 HPLC 크로마토그램이다.

따라서 본 발명은 동물에 존재하는 인지질을 전처리하여 분리된 콜린 인지질과 에탄올아민 인지질을 포스포리파제 A1을 이용하여 가수분해시키고 고순도의 플라스말로젠을 농축 제조하는 방법에 관한 것이다.

이때 분리된 콜린 인지질과 에탄올아민 인지질을 포스포리파제 A1과 가수분해 반응시, 5~100mM의 칼슘이온 또는 칼슘염이 함유된 수용액 상에서 반응시키거나 물과 에틸 아세테이트(ethyl acetate), 부틸 아세테이트(Bytyl acetate), 이소프로필 에테르 (isopropyk ether), 클로로포름(chloroform), 부틸 에테르(butyl ether), 시클로헥산(cydlohexane), 헥산(hexane). 헵탄(heptane), 이소옥탄(isooctane), 에틸알코올(ethl alcohol), 데칸(decane), 도데칸(dodecane)에서 선택된 1종 이상의 유기 용매와의 혼합용액을 사용하여 반응시킬 수 있다.

또한 본 발명에 사용되는 포스포리파제 A1은 세균, 효모, 곰팡이등의 여러 미생물들로부터 발견된다. 특히 아스퍼르질러스(Aspergillus)속의 곰팡이로부터 포스포리파제 A1이 생성되는 것으로 알려져 있으나. 본 발명에서는 본 발명자들이 토양으로부터 스크리닝한 세라시아 속(Serratia spp) MK1 균주를 배양하여 생산된 포스포리파제 A1을 이용하였다. 즉, NaHPO4·12H₂O 14~16g, KH₂PO₄2.5~3.5g, NaCl 0.4~0.6g, MgSO₄·7H₂O 0.2~0.3g, CaCl₂0.01~0.02g을 물1L에 녹인 배지에 자일로스(xylose) 4~6g/L와 황산암모늄 0.9~1.1g을 에 첨가한 다음 여기에 균주를 접종하여 28~32℃에서 13~15시간동안 흔들어 주면서 플라스크 배양한다. 배양한 후 5,600 x g에서 18~22분간 원심분리함에 의해 미생물을 제거하여 얻어진 포스포리파제 용액을 사용하였다. 이때 효소의 역가는 약 50 IU/ml 이었다.

이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명은 동물에 존재하는 인지질을 전처리하여 분리된 콜린 인지질과 에탄올아민 인지질에 포스포리파제 A1을 반응시켜 디아실형 인지질을 가수분해하여 제거하고 플라스말로젠만을 정제 농축시키는 방법에 관한 것이다.

이때 동물에 존재하는 인지질을 클로로포름과 메탄올 혼합 용액으로 추출하고 균질화 한 후, 아세톤등을 첨가하여 중성지질을 제거한다. 이렇게 생성된 조인지질을 실리카겔이 들어있는 컬럼에 통과시켜 포스파티딜 콜린 또는 포스파티딜 에탄올아민을 용출시킨다. 이렇게 용출된 콜린 인지질 또는 에탄올아민 인지질을 본 발명의 플로스말로젠 생산을 위한 시료로 사용한다.

콜린 인지질 또는 에탄올아민 인지질을 포스포리파제 A1과 5~100mM의 칼슘이온 또는 칼슘염이 함유된 수용액 상에서 반응시키거나 물과 유기용매의 혼합용액서 반응시킨다.

통상적으로 효소에 의한 지질의 가수분해반응에는 물과 유기용매계로 구성된 반응시스템인 이상계(2상계) 용매가 많이 이용된다. 이것은 이상계에서 기질과 반응생산물의 농도를 높일 수 있고 생산성(productivity)를 증가시킬 수 있기 때문이다. 이외에도 효소와 반응물의 분리가 용이하고 기질이나 생산물에 의한 효소억제를 감소시킬 수 있는 장점이 있다.

본 발명에서도 유기용매를 이용한 이상계를 구성하여 플라스말로젠을 정제하였다. 사용된 유기용매로서는 에틸 아세테이트, 부틸 아세테이트, 이소프로필에테르, 클로로포름, 부틸 에테르, 시클로헥산, 헥산, 헵탄. 이소옥탄. 에틸알코올, 데칸, 도데칸등 이었으며 이들 중 부틸 아세테이트에서 포스포리파제 A1의 활성이 가장 좋았다.

반응계에 유기용매를 첨가하여 반응시키는 경우에는 CaCl₂를 반응계에 첨가하지 않아도 반응은 진행되며 이는 본 발명의 또 다른 장점이다.

이하 실시예를 통해 본 발명의 구성을 보다 구체적으로 설명하기로 한다.

이들 실시예들은 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명이 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

소심장 1kg에 클로로포름과 메탄올 혼합용액(클로로포름 : 메탄올 = 2 : 1) 3L를 첨가하고 25,000rpm에서 균질화한다. 이과정을 2회 더 진행한 후 여과하여 생성된 용액을 농축한다. 생성된 조지질에 200mL의 아세톤을 첨가하여 중성지질을 제거한다. 생산된 조인지질 30g을 300g의 실리카겔이 들어있는 컬럼에 투입한다. 클로로포름 : 메탄올 : 물 = 65 : 25 : 4의 혼합용매를 사용하여 콜린 인지질을 용출시킨다. 생산된 콜린 인지질을 High Performance Liquid Chomatogaphy (이하 HPLC)로 분석한 결과 98.76%였다, 이 시료 10mg을 8mL 용기에 넣고 농축 염산가스로 10분간 처리하여 플라스말로젠을 가수분해한 다음 HPLC로 분석하였다. 콜린 인지질내에 존재하는 플라스말로젠은 sn-1위치에 비닐에테르 결합(vinyl ether bond)지니고 있어 염산가스를 처리하는 경우 플라스말로젠만 선택적으로 가수분해된다. 이와 같은 특성을 이용하여 분석결과 이 콜린 인지질 생산물중에는 45±0.6% (n=3)의 콜린 플라스말로젠을 함유하였다.(제1도 및 제2도). 본 발명에서는 이 콜린 인지질을 플라스말로젠 생산을 위한 시료로 사용하였다.

즉, 25mL의 반응기에 Tris-HCl (50mM, pH 8.0)완충용액 2.5mL를 넣고 CaCl₂을 0~200 mM 수준이 되도록 맞춘다. 이때 CaCl₂을 첨가하지 않는 경우에는 효소에 의한 인지질의 가수분해가 진행되지 않는다. 본 발명에서는 CaCl₂을 10mM이 되도록 첨가하여 반응시켰다. 기질인 콜린 인지질은 최종농도가 반응액의 0.5~90% (w/v)가 가능하나 본 발명에서는 1%가 되도록 첨가한 다음 40℃, 400rpm에서 교반하면서 반응시켰다. 90분간 반응시킨 다음, 클로로포름과 메탄올 혼합용액(클로로포름 : 메탄올 = 2 : 1)혹은 헥산 : 이소프로필알코올(3 :2)의 혼합용액으로 추출한 후 진공 건조하였다. HPLC에 의해 시료에 있는 인지질중 플라스말로젠의 농도를 조사해 본 결과는 표 1과 같다.

[표 1]

[실시예 2]

25mL의 반응기에 Tris-HCl (50 mM, pH 8.0) 완충용액 1.25 mL를 넣고 여기에 부틸 아세테이트(butyl adetate) 1.25 mL를 넣는다. 여기에 실시예 1에서 생산된 콜린 인지질을 총 반응액의 1~90%가 첨가되게 하고 여기에 Serratia spp MK1에서 분리한 포스포리파제 A1 5유니트를 첨가한 다음 40℃, 400rpm에서 교반하면서 반응시킨다. 45분간 반응시킨 다음, 클로로포름과 메탄올 혼합용액(클로로포름 : 메탄올 = 2 : 1) 혹은 헥산 : 이소프로필알코올(3 : 2)의 혼합용액으로 추출한 후 진공 건조하였다. HPLC에 의해 시료에 있는 인지질중의 플라스말로젠 농도를 조사해 본 결과는 표-2와 같다. 반응계에 유기용매를 첨가하여 반응시키는 경우에는 CaCl₂을 반응계에 첨가하지 않아도 반응은 진행되었다.

[표 2]

[실시예 3]

소골 1Kg에 클로로포름과 메탄올 혼합용액(클로로포름 : 메탄올 = 2 :1) 3L를 첨가하고 5,000 rpm에서 혼합한 다음 여과하거나 원심분리하여 인지질용액을 얻는다. 이 과정을 2회 더 진행한 후 여과하여 생성된 용액을 농축한다. 생성된 조지질에 3L의 아세톤을 첨가하여 중성지질을 제거한다. 생산된 조인지질 30g을 300g의 실리카겔이 들어있는 컬럼에 투입한다. 클로로포름 : 메탄올 : 물 =65 : 25 : 4의 혼합용매를 사용하여 에탄올아민 인지질을 용출시킨다. 생산된 에탄올아민 인지질을 HPLC로 분석한 결과 99.2%였다. 이 시료 100mg을 8mL 용기에 넣고 농축 염산가스로 10분간 처리하여 플라스말로젠을 가수분해한 다음 HPLC로 분석하였다. 분석결과 이 에탄올아민 인지질 생산물중에는 64±0.9% (n=3)의 에탄올아민 플라스말로젠을 함유하였다. 본 발명에서는 이 에탄올아민 인지질을 플라스말로젠 생산을 위한 시료로 사용하였다.

즉,25mL의 반응기에 Tris-HCl (50 mM, pH 8.0) 완충용액 1.25 mL를 넣고 여기에 부틸 아세테이트(butyl acetate) 1.25 mL를 넣는다. 여기에 생산된 에탄올아민 인지질을 총 반응액의 1~90%가 첨가되게 하고 여기에 Serratia spp MK1에서 분리한 포스포리파제 A1 5유니트를 첨가한 다음 40℃, 400rpm에서 교반하면서 반응시킨다. 이 반응용액에 30분간 반응시킨 다음 클로로포름과 메탄올 혼합용액(클로로포름: 메탄올 =2 :1) 혹은 헥산 : 이소프로필알코올(3: 2)의 혼합용액으로 추출한 후 진공 건조하였다. HPLC에 의한 시료에 있는 인지질중의 플라스말로젠의 농도를 조사해 본 결과 에탄올아민 플라스말로젠의 농도는 96.2%였다.

본 발명은 미생물로부터 생산된 인지질 가수분해 효소를 이용하여 인지질중의 플라스말로젠(Plasmalogen)을 고순도로 농축, 정제하는 방법에 관한 것으로, 인지질중에 함유되어 있는 플라스말로젠을 분리하기 위해 세라시아종(Serratai spp)MK1으로부터 생산된 포스포리파제(Phospholipase) A1을 이용하여 인지질중에 함유된 플라스말로젠 이외의 인지질을 가수분해하여 제거함으로서 간편하고 효율적인 방법으로 고순도의 플라스말로젠을 생산할 수 있다.

Claims

동물에 존재하는 인지질을 클로로포름과 메탄올 혼합 용액으로 추출하고 균질화 한 후, 아세톤등을 첨가하여 중성지질을 제거하고, 생성된 조인지질을 실리카겔이 들어있는 컬럼에 통과시켜 콜린 인지질 또는 에탄올아민 인지질을 용출시킨 후, 분리된 콜린 인지질과 에탄올아민 인지질을 5~100 mM의 칼슘이온 또는 칼슘염이 함유된 수용액 상 또는 물과 유기용매의 혼합용액 상에서 포스포리파제 A1을 반응시켜 디아실형 인지질을 가수분해하여 제거하고 플라스말로젠만 정제 농축시킴을 특징으로 하는 고순도 플라스말로젠의 제조방법.

제1항에 있어서, 유기용매는 에틸 아세테이트, 부틸 아세테이트, 이소프로필 에테르, 클로로포름, 부틸 에테르, 시클로헥산. 헥산, 헵탄, 이소옥탄, 에틸알코올, 데칸, 도데칸에서 선택된 1종 이상의 유기 용매임을 특징으로 하는 고순도 플라스말로젠의 제조방법.